Summary
Ett mycket exakt in vitro-petroleum assay system utvecklades för att utvärdera anticancer läkemedel med hjälp av patient-härledda tumör organoider (PDU), liknar cancer vävnader men är olämpliga för in vitro hög-genomströmning assay system med 96-väl och 384-well plattor.
Abstract
Patient-härledda tumör organoider (PDU) förväntas vara en preklinisk cancer modell med bättre reproducerbarhet av sjukdom än traditionella cell kultur modeller. PDU har framgångsrikt genererats från en mängd mänskliga tumörer för att rekapitulera arkitekturen och funktionen av tumör vävnad korrekt och effektivt. PDO: er är dock olämpliga för ett in vitro-high-throughput assay system (HTS) eller cellanalys med 96-brunns- eller 384-brunnsplattor när man utvärderar cancerläkemedel eftersom de är heterogena i storlek och bildar stora kluster i kulturen. Dessa kulturer och analyser använder extracellulära matriser, såsom Matrigel, för att skapa tumörvävnadsställningar. Därför har PDO:er ett lågt genomströmnings- och högt pris, och det har varit svårt att utveckla ett lämpligt analyssystem. För att ta itu med detta problem inrättades en enklare och mer exakt HTS med hjälp av PDU för att utvärdera styrkan hos cancerläkemedel och immunterapi. En in vitro HTS skapades som använder PDU fastställt från solida tumörer odlade i 384-brunnsplattor. En HTS utvecklades också för bedömning av antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet aktivitet för att representera immunsvaret med hjälp av PDO odlade i 96-brunnsplattor.
Introduction
Mänskliga cancer cellinjer är allmänt accepterade för att studera cancerbiologin och utvärdera cancermedel. Dessa cellinjer bevarar dock inte nödvändigtvis de ursprungliga egenskaperna hos deras källvävnad eftersom deras morfologi, genmutation och genuttrycksprofil kan förändras under kultur under långa perioder. Dessutom odlas de flesta av dessa cellinjer i ett monoskikt eller används som murin xenograft, varav ingen fysiskt representerar tumörvävnad1,2. Den kliniska effekten av cancerläkemedel kan således inte vara densamma som den som observerats i cancer cellinjer. Därför har in vitro-system, såsom ex vivo-analyser med hjälp av patient-härledda tumör xenografts eller patient-härledda tumör organoider (PDU) och tumör sfäroid modeller som exakt reproducerar strukturen och funktionen av tumör vävnader, utvecklats. Ökande bevis tyder på att dessa modeller förutsäger patienternas svar på cancerläkemedel genom att vara direkt jämförbara med motsvarande cancervävnad. Dessa in vitro-system har upprättats för olika tumörvävnadstyper, och tillhörande höggenomströmningsanalyssystem (HTS) för läkemedelsscreening har också utvecklats3,4,5,6,7. Heterogena ex vivo organoid kulturer av primära tumörer som erhållits från patienter eller patient-härledda tumör xenografts har fått betydande dragkraft under de senaste åren på grund av deras lätthet i kultur och förmåga att upprätthålla komplexiteten hos celler i stromal vävnad8,9,10. Dessa modeller förväntas öka förståelsen för cancerns biologi och underlätta utvärderingen av läkemedelseffekt in vitro.
En serie nya PDO skapades nyligen från olika typer av tumörvävnad, betecknade som F-PDO, under Fukushima Translational Research Project. PDU: er bildar stora cellkluster med en morfologi som liknar källtumörens och kan odlas i mer än sex månader11. Den jämförande histologin och omfattande genuttryck analyser visade att funktionerna i PDO är nära dem av deras källa tumör vävnader, även efter långvarig tillväxt under kultur förhållanden. Dessutom inrättades en lämplig HTS för varje typ av sub sub i 96-brunns- och 384-brunnsplattor. Dessa analyser användes för att utvärdera flera molekylära riktade medel och antikroppar. Här utvärderades standard kemoterapeutik (paklitaxel och karboplatin) som används för endometriecancer med hjälp av F- PDO som härrör från en patient som inte svarade på paklitaxel och karboplatin. Följaktligen var celltillväxthämmande aktiviteten hos paklitaxel och karboplatin mot denna subpa subgistr svag (IC50:>10 μM). Dessutom har tidigare forskning rapporterat att känsligheten hos vissa F-PDO: er för kemoterapeutiska medel och molekylära riktade medel överensstämmer med den kliniska effekten11,12,13. Slutligen analyserades förändringar i den högre ordningens struktur av PDO: er orsakade av cancermedel med hjälp av ett tredimensionellt cellanalyssystem12,13. Resultaten av utvärderingen av cancerläkemedel med hjälp av en PDO-baserad HTS är jämförbara med de kliniska resultat som erhållits för dessa agenser. Här presenteras ett protokoll för en enklare och mer exakt HTS som kan användas för att utvärdera styrkan hos cancerläkemedel och immunterapi med hjälp av PDO-modellerna.
Protocol
Alla experiment med material som härrör från människor utfördes enligt Helsingforsdeklarationen och godkändes i förväg av etikkommittén vid Fukushima Medical University (godkännandenummer 1953 respektive 2192; godkännandedatum 18 mars 2020 respektive 26 maj 2016). Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter som tillhandahöll de kliniska exemplar som användes i denna studie.
1. Kultur av PDO: er
OBS: F-PDO: er bildar cellkluster som uppvisar en mängd heterogena morfologier och växer i suspensionskultur (figur 1). Dessutom kan F-PDO: er odlas i mer än 6 månader och kan kryopreserveras för framtida användning.
- Upptining av lagrade PDO:er (dag 0)
- Tina och frö-PDU :er (t.ex. RLUN007, lungandenocarcinom) dag 0 (figur 1). Tillsätt först 15 ml medium för PDU (se tabell över material)som innehåller 1% B-27 tillägg och 30 ng/ml epidermal tillväxtfaktor till ett sterilt 50 ml centrifugrör.
- När du har tagit bort den frysta injektionsflaskan från lagring av flytande kväve ska du försiktigt omröra pdo:erna i ett 37 °C vattenbad i 2 minuter. Ta sedan bort injektionsflaskan från vattenbadet, torka injektionsflaskan med 70% etanol och flytta sedan injektionsflaskan till ett biologiskt säkerhetsskåp.
- Överför innehållet i injektionsflaskan till röret som innehåller 15 ml medium för PDO: er. Blanda PDO:erna och mediet genom att försiktigt pipettera upp och ner fem gånger med en 3 ml överföringspipett. Centrifugera röret vid 200 x g i 3 min vid ~25 °C och kassera supernatanten. Återanvänd PDO-pelleten i 5 ml färskt medium och överför till en 25 cm2 kolv (se Materialtabellen)med skonsam pipettering. Slutligen odla de pdo som pdo:er i en inkubator vid 37 °C i 5% CO2.
- Byt medium två gånger i veckan (dag 3-7). Centrifugera den subdo-suspensionen för att fälla ut cellklustren och ersätt 4 ml av mediet (80 % volym). Återanvänd cellerna i det färska mediet.
OBS: Majoriteten av RLUN007 visas som cellkluster som är 100-500 μm i diameter. När färgen på fenolrött i mediet ändras till gult som visas i figur 1A, byt ut mediet oftare. Om mediet blir gult dagen efter bytet och varje cellkluster sammanfogas till större kluster som >500 μm i diameter, passerar det med ett delat förhållande på 1:2. - Subkultur (dag 8-28) av PDO:er
OBS: Med tanke på svårigheten att faktiskt mäta antalet enstaka celler bestäms tidpunkten för passagen baserat på en lämplig cellklustertäthet och storleken på den subpaste pelleten efter centrifugering(figur 1B). När det gäller RLUN007 når volymen av PDO-pelleten 30 μL (mättad densitet i 25 cm2 flaskor) ungefär 2 veckor efter upptining.- För överföring från en 25 cm2 kolv till två 25 cm2 flaskor (P1), överför den sub sub-suspensionen till ett centrifugrör och centrifug vid 200 x g i 2 min vid cirka 25 °C. Uppskatta volymen på PDO-pelleten och kassera supernatanten. Återanvänd PDO-pelleten med en 5 ml pipett i 5 ml färskt medium. Pipett försiktigt upp och ner fem gånger vid låg hastighet. Överför sedan hälften av volymen av den subdo-suspensionen (2,5 ml) till två flaskor och tillsätt 2,5 ml färskt medium till varje kolv. Odla cellerna vid 37 °C i 5% CO2.
- För överföring från två 25 cm2 kolvar till en 75 cm2 kolv (P2), överför den sub subepensionationen från två kolvar till två centrifugrör och centrifugera den subga vid 200 x g i 2 min vid cirka 25 °C. Uppskatta sedan volymen av PDO-pelleten och återanvända pelleten i 2,5 ml färskt medium (per rör). Kombinera därefter den subdo-suspensionen i ett rör med den i den andra och överför den till en 75 cm2 kolv som innehåller 10 ml färskt medium. Odla cellerna vid 37 °C i 5% CO2. Överför de underjordade pdodatorerna från två 25 cm2 flaskor till en 75 cm2 kolv ungefär 1 vecka efter den första passagen(figur 1C).
2. Tillväxthämning HTS
OBS: Anticancermedels tillväxthämmande aktivitet mot PDO utvärderas genom att mäta det intracellulära ATP-halten, vilket visas i figur 2. Det här steget utförs med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt analyskit för cellviabilitet (se Tabell över material).
- På dag 0 odlas de pdotruer (t.ex. RLUN007) i kolvar tills tillräckligt många cellkluster finns tillgängliga för analysen. En dag före sådd, överför den subdo-suspensionen från en 75 cm2-kolv till ett 15 ml rör och centrifugera vid 200 x g i 2 minuter för att mäta den subdo-pelletvolymen. Återanvänd sedan PDO-pelleten i 15 ml färskt medium och överför den tillbaka till en 75 cm2 kolv. Odla cellerna vid 37 °C i 5% CO2.
OBS: Den erforderliga PDO-pelletvolymen beror på varje sub subs utspädningshastighet och antalet 384-brunnsplattor som används för analysen. För RLUN007 krävs en 200 μL cellpelletvolym för sådd i tio 384-brunnsplattor. - På dag 1 (24 h efter byte av medium) hackar du pdoerna med hjälp av cellfragmenterings- och spridningsutrustning (se Materialtabellen)med en filterhållare som innehåller ett nätfilter på 70 μm. Späd sedan ut 15 ml av den subdo-suspensionen med 10x. Frö 40 μL av den subdo-suspensionen till 384-brunns ultralåga fästformade (rundbottnade) mikroplattor (se Materialtabell)med hjälp av en cellupphängningsdispenser (se Materialtabell).
OBS: För att hacka cellkluster rekommenderas att du använder den kommersiellt tillgängliga cellfragmenterings- och spridningsutrustningen (se Tabell över material). - Behandla pdoktorerna med 0,04 μL testmedelslösningar vid 20 μM till 1,0 nM (10 seriella utspädningar) vid 24 timmar efter sådd (dag 2) med hjälp av en vätskehanterare (se Materialtabell).
- På dag 8 (144 h efter behandling av testämnet) tillsätt intracellulär ATP-mätreagens i testbrunnarna. Blanda plattorna med en mixer och inkubera i 10 min vid 25 °C. Mät det intracellulära ATP-innehållet som luminiscens med hjälp av en plattläsare (se Tabell över material).
- För att beräkna cellens livskraft, dela upp mängden ATP i provningsbrunnarna med den i kontrollbrunnarna som innehåller fordonet, med bakgrunden subtraherad. För att beräkna tillväxttakten under 6 dagar, dela upp mängden ATP i fordonets kontrollbrunnar med den i fordonets kontrollbrunnar 24 h efter sådd.
- Beräkna 50% hämmande koncentration (IC50) och område under kurvan (AUC) värden från dos-respons kurvorna med hjälp av biologisk dataanalys programvara (se tabell över material). Z-faktorn är en dimensionslös parameter som sträcker sig från 1 (oändlig separation) till <0, definierad som Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, där σc+, σc-, μc+, och μc- är standardavvikelserna (σ) och medelvärdena (μ) för de höga (c+) och låga (c−)kontrollerna 14.
3. HTS med ett cellplocknings- och bildsystem för tillväxthämning
OBS: Om det finns en stor avvikelse (när variationskoefficienten [CV] vid analysen är mer än 20%) i data som använder protokoll 2, kan PDO av vald storlek sås till 96-brunns- eller 384-brunnsplattor med hjälp av ett cellplocknings- och bildsystem(figur 2). Protokollet är detsamma som det som beskrivs i steg 2.1 och 2.2 i föregående avsnitt. Det här steget utförs med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt cellplocknings- och bildsystem (se Tabell över material).
- På dag 1 ställer du in en 384-brunns ultralåg fastsättningssfäroid mikroplatta med 40 μL medium/well samt en destinationsplatta på cellplocknings- och bildsystemet.
- Fyll plockkammaren (se Materialtabellen) med 6 ml odlingsmedium och centrifugera vid 1 500 x g i 2 minuter för att avlägsna luftbubblor. Tillsätt de pdo-system som är upphängda i mediet (PDO-pelletvolym, 4 μL) i plockkammaren och ställ in på systemet.
- Stå kammaren i minst 1 minut, följt av dispersion, så att cellklustren sätter sig längst ner i kammaren; utför sedan skanning av kammaren.
- Ställ in plockstorleken på 140-160 μm (område 15 386-20 000 μm2) på systemet för automatisk val av cellkluster. Kontrollera sedan kvaliteten på de markerade cellklustren på de skannade bilderna och överför tio cellkluster per brunn med hjälp av plocktips (se Tabell över material)till målplattan.
- Utför protokollstegen från steg 2.3 och framåt.
4. HTS för antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet
OBS: Detta steg utförs med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt system (se Tabell över material), som är ett elektriskt impedansmätinstrument. Det används för att utvärdera cytolys av PDO: er genom antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC) med monoklonala antikroppar och naturliga mördarceller (NK)(figur 3). NK-celler framställs av mononukleära celler i perifert blod med hjälp av NK-cellproduktionssatsen (se Materialförteckningen),enligt tillverkarens instruktioner.
- Mätning av ADCC-aktivitet
- På dag 0 belägga en 96-brunnsplatta (se Materialtabellen)med 50 μL 10 μg/ml fibronectinlösning (0,5 μg/brunn) vid 4 °C över natten.
- På dag 1, efter att ha tagit bort fibronectinlösningen, tillsätt 50 μL av odlingsmediet till varje brunn för att mäta bakgrundsimpedansen.
- Före sådd, tillsätt 5 ml reagens för cellodlingsdissociation (se materialtabell)till PDO:erna (RLUN007: 100 μL av PDO-pelleten i en 75 cm2 kolv) och inkubera i en CO2-inkubator vid 37 °C i 20 minuter för att skingra PDO:erna. För att stoppa trypsinisering, tillsätt 5 ml medium, centrifugera och ta bort dissociation reagens. Skölj PDO:erna med färskt medium och filtrera genom en 40 μm cellsil (se Materialtabell).
- Räkna antalet celler med hjälp av en cellviabilitetsanalysator (se Tabell över material).
- Överför den subdo-fjädringen till en behållare och blanda med en flerkanalig pipetor. Tillsätt PDO-suspensionen i brunnar vid 5 x 104 celler/brunn i en 96-välplatta. Varje brunn innehåller en slutlig volym på 100 μL. Placera sedan plattan i ett biologiskt säkerhetsskåp vid ca 25 °C i 30 min.
- Överför plattan till instrumentet i en CO2-inkubator vid 37 °C. Registrera förändringar i impedanssignalerna var 15:e minut som cellindex.
- Tina NK-cellerna i ett vattenbad på 37 °C samma dag som den subdo-sådd. Överför cellerna från injektionsflaskan till ett 15 ml-rör som innehåller 10 ml medium för NK-celler (se Materialförteckning) och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid cirka 25 °C. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i 10 ml färskt medium. Efter cellräkning justerar du celltätheten till 1 x 106 celler/ml och överför till en 75 cm2 kolv. Odla NK-cellerna i en 5% CO2 inkubator vid 37 °C.
- På dag 2, förbered antikroppslösningarna (fosfatbuffrad saltlösning) vid 10 gånger den slutliga koncentrationen i sterila V-botten 96-brunnsplattor.
- Ta bort 60 μL medium från varje brunn och tillsätt 10 μL trastuzumab- eller cetuximablösning (10 μg/mL, 1 μg/ml och 0,1 μg/ml) till PDO: erna. Överför plattorna tillbaka till instrumentet i en inkubator och registrera cellindexet i 1 h.
- Överför NK-cellupphängningen till ett 50 ml-rör och räkna cellnumret. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter och justera NK-celltätheten till 1 x 106 celler/ml och 2 x 106 celler/ml med mediet för PDO:erna.
- Tillsätt 50 μL NK-cellfjädring till effektorcellerna (NK) vid ett målcellförhållande (RLUN007) på 1:1 eller 2:1. De slutliga koncentrationerna av antikropparna är 1 μg/ml, 0,1 μg/ml och 0,01 μg/ml. Håll plattan vid ca 25 °C i 15 minuter och sätt tillbaka plattorna till instrumentet.
- Datainsamling och analys
- Konvertera cellindexet till procent cytolysvärden med hjälp av analysprogramvara (se Tabell över material).
- Procentcylysen avser andelen målceller som dödas av NK-celler kontra målceller (PDU) enbart som en kontroll. Subtrahera cellindexen för brunnarna som endast innehåller NK-celler från indexet för provbrunnarna vid varje tidpunkt. Normalisera varje värde till cellindexet omedelbart före tillsats av antikroppar. Konvertera det normaliserade cellindexet till procent cytolys med följande ekvation: % cytolys = (1 - normaliserat cellindex [provbrunn]) / normaliserat cellindex (målbrunn) x 100.
Representative Results
En mycket exakt HTS utvecklades med hjälp av PDU och 384-brunns mikroplattor för att utvärdera cancerläkemedel, och utvecklingen av en HTS för varje subdo rapporterades tidigare10,11,12,13. HTS prestanda utvärderades genom beräkning av CV:n och Z'-faktorn. Z'-faktorn är en allmänt accepterad metod för validering av analyskvalitet och prestanda, och analysen är lämplig för HTS om detta värde är >0,514. Kontrolldatumpunkterna i 384-brunnsplåtsanalysen med RLUN007 visade liten variabilitet, med CV-värden på 5,8% och beräknade Z-faktorer på 0,83, som visas i figur 4. Dessa resultat tyder på att denna analys har hög prestanda för HTS. För att undersöka känsligheten hos PDU: er för anticancermedel med HTS, utvärderades tillväxthämning med hjälp av RLUN007 behandlad med åtta cancerläkemedel, särskilt egfr-hämmare (epidermal tillväxtfaktorreceptorer) (afatinib, erlotinib, gefitinib, lapatinib, osimertinib och rociletinib) och paklitaxel, som är standard kliniska behandlingar för icke-småcellig lungcancer, och mitomycin C. IC50- och AUC-värdena för cancermedlen för varje sube sub visas i figur 4. RLUN007 visade hög känslighet (IC50 < 2 μM, AUC < 282) för alla EGFR-hämmare och andra cancerläkemedel. Sigmoidkurvor beräknade för alla data indikerade att anticancermedlens tillväxthämmande aktivitet kunde mätas korrekt.
Cellplocknings- och bildsystemet används när data varierar avsevärt med hjälp av ovanstående metodik. Cellplocknings- och bildsystemet, som plockar cellkluster exakt utan att skada dem, möjliggör exakta HTS-analyser genom att justera cellklusterstorleken för att utesluta cellskrot från analyssystemet. När systemet inte användes var CV-värdet 26,0% och Z'-faktorvärdet var 0,23 (data visas inte). CV- och Z-faktorvärdena förbättrades dock med 6,4% respektive 0,81 med hjälp av systemet.
För att undersöka cytolys av PDO: er med ADCC-aktivitet med hjälp av det elektriska impedansmätinstrumentet, som övervakar antalet, morfologin och fastsättningen av celler under lång tid, bedömdes förändringar i impedanssignaler med hjälp av RLUN007 som behandlats med antikropparna (trastuzumab och cetuximab) och NK-celler som effektorceller i en 96-välplatta. Jämfört med kontrollen som endast bestod av målceller ökade procentcylysen med tiden. Det nådde 45% eller 75% efter 6 h med ett E:T-förhållande på 1:1 (figur 5A,C)eller 2:1(figur 5B,D)utan antikropparna. NK cellmedierad cytolys med trastuzumab var cirka 60% respektive 90% vid ett förhållande av 1:1(figur 5A,1 μg/mL) respektive 2:1(figur 5B,1 μg/ml), vid 6 h. Cetuximab hade däremot en dosberoende inverkan på NK-cellmedierad cytolys (figur 5C,D). Vid den högsta koncentrationen av cetuximab förstördes RLUN007 vid 90% respektive 100% i ett förhållande av 1:1 respektive 2:1 (figur 5C,D). Effekten av trastuzumab var svagare än cetuximab, med endast 60% cytotoxicitet. Dessa resultat visar att PDO-analyssystemet kan utvärdera ADCC-aktivitet med hjälp av impedansbaserad teknik i realtid.
Figur 1: Kritiska punkter för sub-kulturen. (A) Färgförändring i mediet. b)Mätning av mängden pdo-pmo från pelletstorleken genom att fodra ett centrifugrör som innehåller pdo-provrören med rör märkta med halter för 50–200 μL.(C)subdotäthet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Sammanfattning av det protokoll som används för att skapa ett analyssystem med hög genomströmning med hjälp av 384-brunnsmikroplattor. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Sammanfattning av protokollet för analys av ADCC-verksamhet med hög genomströmning. ADCC, antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet; NK, naturlig mördare. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Analyssystem med hög genomströmning för tillväxthämning med cancermedel. Dos-responskurvan för RLUN007 till cancerläkemedel. De malda PDO: erna såddes i 384-brunnsplattor. Dessa behandlades i 6 dagar med tio olika koncentrationer av cancerläkemedel (mellan 10 μM och 1, 5 nM). Uppgifterna representerar medelvärdet ± standardavvikelsen för tredubbelt experiment. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Analys med högt genomströmning för ADCC-aktivitet. (A,B) Trastuzumab. (C,D) Cetuximab. (A,C) Ett 1:1-förhållande mellan RLUN007 och effektorceller. (B,D) Cytolys med ett förhållande av RLUN007: effektorceller på 1:2. Aktiviteten mättes 12 h efter tillsats av effektorcellerna. Data presenteras som medelvärdet ± standardavvikelsen för tre replikatprover. ADCC, antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Det unika kännetecknet för PDO: er är att de inte enzymatiskt separeras i enskilda celler under kultur eller analys och upprätthåller cellkluster i kulturen. Därför kan antalet celler inte räknas exakt under ett mikroskop. För att lösa detta problem bestäms antalet celler visuellt genom att fodra ett centrifugrör som innehåller cellerna med rör märkta med nivåer för 50-200 μL (figur 1B). Eftersom det är svårt att mäta pelletsvolymen av cellkluster som odlas i en 25 cm2-kolv visuellt, bestämdes tidpunkten för passagen med hjälp av medelfärgförändringen från rött till gult och den märkbara ökningen av enstaka celler eller skräpjämfört med tiden för passaging som indikatorer (figur 1A,C). Detta är poängen med att passa för PDO: er. Mängden subp pelletmedel mäts visuellt efter centrifugering vid varje mediumförändring. När pelletsvolymen slutar öka och mediet blir gult dagen efter medelbytet anses mediet vara mättat med densitet och passaging utförs. Pelletvolymen definieras för varje sub sub. Om de pdo:er som inte ökar ändras mängden medium från 80 % till 50 % vid tidpunkten för det medelstora utbytet, och tätheten av PDO:er ökar i kulturen.
En HTS lämplig för PDO utvecklades. Dess genomströmning är minst tio till tjugo 384-brunnsplattor som utförs med en 75 cm2 kolv subdo, och antalet bearbetade plattor per dag är minst 50. Dessutom har resultaten av utvärderingen av olika cancerläkemedel av HTS med hjälp av PDO redan rapporterats.
Vid utförandet av HTS åtgärdas först igensättning av nätfiltret som orsakas av malning av F-PDO:erna med hjälp av cellfragmenterings- och spridningsutrustningen genom att filterstorleken ändras till 100 μm. Nästa steg är att minska volymen av den subdo-suspension som appliceras på glaskärlet. Vid beredning av testämneslösningar för HTS löses lågmolekylära föreningar vanligtvis i dimetylsulfoxid och antikropparna löses upp i fosfatbuffrad saltlösning. Det lämpliga lösningsmedlet används som testämne och kontrolldata erhålls från det använda lösningsmedlet.
Följande är en beskrivning av hur man hanterar variabilitet i analysdata. Om det finns stor variation i data i testet med hjälp av 384-brunnsplattor, bör analysplattan ändras till ett 96-väl plåtformat. Den subdo-utspädningsfaktorn (antal sådda cellkluster) undersöks också efter sådd av plattan. Slutligen kan cellplocknings- och bildsystemet användas för att välja storleken på PDO:er för analysen. Innan du lägger till PDO: er i kammaren bör enstaka celler och små cellkluster avlägsnas genom låghastighetscentrifugering för att korrekt kunna känna igen PDO: er. Om enstaka celler eller små cellkluster är synliga efter att du har lagt till PDO:er i kammaren kan flera dispersioner utföras för att ta bort de enskilda cellerna. Därefter, även om cellplocknings- och bildsystemet har en funktion som gör att plattan kan hållas varm, används denna funktion inte på grund av avdunstning av odlingsmediet när systemet fungerar under en lång tid. Slutligen är volymen av cellkluster okänd eftersom den känns igen av en plan avbildning. Om två eller flera PDO:er överlappar varandra kan en enda subdo inte heller identifieras korrekt. Det är dock möjligt att ta bort oönskade PDO: er med hjälp av borttagningsfunktionen genom att kontrollera dem på den skannade bilden efter flytten.
Mätinstrumentet för elektrisk impedans används vanligtvis för vidhäftande målcancerceller för att övervaka förändringar i impedans under cellproliferation. Därför identifieras inte en ändring i cellindexet för icke-vidhäftande PDO: er. I ett försök att lösa detta problem är det nödvändigt att undersöka såddförhållandena såsom subdotäthet och enzymatisk behandling (cell dissociation enzym och behandlingstid) beroende på typ av subdo. Brunnarna i plattan måste också beläggas med en lämplig extracellulär matris för sådd av PDO: er. PDO:er sås utan enzymatisk behandling, beroende på typen av subdo. RLUN007 användes för att mäta impedansen genom att så pduren på en 96-välplatta efter att ha spridit dem genom enzymatisk behandling. RLUN007 behandlades med cellkulturen dissociation reagens i 20 min vid 37 °C för att skingra cellerna och fästa dem på brunnarna i en 96-väl platta. Med tanke på att dissocierade RLUN007-celler omedelbart bildar aggregat är det önskvärt att så på plattorna strax efter filtrering med hjälp av en sil. Efter att ha överfört cellupphängningen från röret till en reservoar flyttades behållaren försiktigt från höger till vänster två till tre gånger och pipettades upp och ner fem gånger innan sådd på plattan. Suspensionen blandades också med varje tillägg till brunnen. Plattan placerades sedan i ett biologiskt säkerhetsskåp i 30 min (för PDO) eller 15 min (för NK-celler) för att cellerna skulle kunna fördelas jämnt i brunnen. Den andra viktiga punkten är att behandling med antikroppar och NK-celler bör ske innan cellindexet når en platå och värdet inte är mindre än 0,5. När det gäller RLUN007 är den optimala tiden att starta analysen 20-22 h efter plätering, och cellnumret för sådd är 5 x 104 celler/brunn.
I allmänhet använder kulturen och analyserna för tumörorganoider extracellulära matriser som Matrigel för att skapa tumörvävnadsställningar eller enzymer som trypsin och kollagenas för att störa organoiderna3,4,5,6,7. Fördelen med denna metod är att ingen extracellulär matris eller enzymatisk behandling krävs under kultur och analys (förutom analyser som använder det elektriska impedansmätinstrumentet), vilket avsevärt minskar arbetskraven och kostnaderna. Dessutom är denna metod relativt enkel att anpassa till HTS-analyssystem och olika mätsystem. Användningen av en extracellulär matris är dock önskvärt för vissa forskningsändamål eftersom det kan fungera som en byggnadsställning för celler och påverka morfogenes, differentiering och homeostas i vävnader.
I denna studie användes PDU (RLUN007) med en EGFR-mutation (L858R) som är kliniskt känslig för EGFR-hämmare och högt uttryck för EGFR-genen (data som inte visas) för att utvärdera EGFR-hämmare. Det visades att känsligheten hos RLUN007 för EGFR-hämmare var högre än för andra lungcancer-härledda F-PDU13 (figur 4). Således är en HTS med hjälp av PDU, som behåller egenskaperna hos tumörvävnad, överlägsen för utvärdering av potentiella cancermedel och presenterar möjligheter till läkemedelsbedömning och framsteg inom personlig medicin. Även om HTS är lämpligt för den första screeningen av medel, reproducerar det inte tumörmikromiljön och kan därför inte utvärdera effekten av läkemedel in vivo. Därför är ett in vitro-system som kan efterlikna mänsklig tumörvävnad in vivo genom samkultur med vaskulär endotelceller och andra stromala celler eller organ-på-ett-chip-teknik i avsaknad av djurmodeller nu under utveckling.
Disclosures
Fujifilm Wako Bio Solutions Corporation är ett dotterbolag till Fujifilm Wako Pure Chemicals, kommersiell ägare av F-PDO och F-PDO-media genom licensöverföring.
Acknowledgments
Vi vill tacka de patienter som tillhandahöll de kliniska exemplar som används i denna forskning. Denna forskning stöds av bidrag från Translational Research Program of Fukushima Prefecture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate | Corning | 4516 | Plates for HTS |
| 40-µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| AdoptCell-NK kit | Kohjin Bio | 16030400 | Kit for NK cell production |
| Cancer Cell Expansion Media plus | Fujifilm Wako Pure Chemical | 032-25745 | Medium for F-PDO |
| ALyS505N-175 | Cell Science & Technology institute | 10217P10 | Medium for NK cells |
| CELL HANDLER | Yamaha Motor | - | Cell picking and imaging system |
| CellPet FT | JTEC | - | Cell fragmentation and dispersion equipment |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9683 | Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent |
| Echo 555 | Labcyte | - | Liquid handler |
| EnSpire | PerkinElmer | - | Plate reader |
| E-plate VIEW 96 | Agilent | 300601020 | Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System |
| Fibronectin Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical | 063-05591 | Plate coating for xCELLigence RTCA System |
| F-PDO | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | - | The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International |
| Morphit software, version 6.0 | The Edge Software Consultancy | Biological data analysis software | |
| Multidrop Combi | ThermoFisher Scientific | 5840300 | Cell suspension dispenser |
| Precision Chamber | Yamaha Motor | JLE9M65W230 | Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| Precision Tip | Yamaha Motor | JLE9M65W300 | Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| RLUN007 | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | Lung tumor derived F-PDO | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604021 | Cell culture dissociation reagent |
| Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask | Corning | 4616 | Culture flask for PDO |
| Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask | Corning | 3814 | Culture flask for PDO |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System | Beckman coulter | - | Cell viability analyzer |
| xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 | ACEA Bioscience | - | Analysis software for xCELLigence RTCA System |
| xCELLigence RTCA System | ACEA Bioscience | - | Electrical impedance measuring instrument for cytolysis |
References
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 241-253 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
- Palechor-Ceron, N., et al. Conditional reprogramming for patient-derived cancer models and next-generation living biobanks. Cells. 8 (11), 1327 (2019).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 630-643 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Inoue, A., et al. Current and future horizons of patient-derived xenograft models in colorectal cancer translational research. Cancers (Basel). 11 (9), 1321 (2019).
- Hum, N. R., et al. Comparative molecular analysis of cancer behavior cultured in vitro, in vivo, and ex vivo. Cancers (Basel). 12 (3), 690 (2020).
- Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncology Reports. 40 (2), 635-646 (2018).
- Takahashi, N., et al. An in vitro system for evaluating molecular targeted drugs using lung patient-derived tumor organoids. Cells. 8 (5), 481 (2019).
- Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
