Ett mycket exakt in vitro-petroleum assay system utvecklades för att utvärdera anticancer läkemedel med hjälp av patient-härledda tumör organoider (PDU), liknar cancer vävnader men är olämpliga för in vitro hög-genomströmning assay system med 96-väl och 384-well plattor.
Patient-härledda tumör organoider (PDU) förväntas vara en preklinisk cancer modell med bättre reproducerbarhet av sjukdom än traditionella cell kultur modeller. PDU har framgångsrikt genererats från en mängd mänskliga tumörer för att rekapitulera arkitekturen och funktionen av tumör vävnad korrekt och effektivt. PDO: er är dock olämpliga för ett in vitro-high-throughput assay system (HTS) eller cellanalys med 96-brunns- eller 384-brunnsplattor när man utvärderar cancerläkemedel eftersom de är heterogena i storlek och bildar stora kluster i kulturen. Dessa kulturer och analyser använder extracellulära matriser, såsom Matrigel, för att skapa tumörvävnadsställningar. Därför har PDO:er ett lågt genomströmnings- och högt pris, och det har varit svårt att utveckla ett lämpligt analyssystem. För att ta itu med detta problem inrättades en enklare och mer exakt HTS med hjälp av PDU för att utvärdera styrkan hos cancerläkemedel och immunterapi. En in vitro HTS skapades som använder PDU fastställt från solida tumörer odlade i 384-brunnsplattor. En HTS utvecklades också för bedömning av antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet aktivitet för att representera immunsvaret med hjälp av PDO odlade i 96-brunnsplattor.
Mänskliga cancer cellinjer är allmänt accepterade för att studera cancerbiologin och utvärdera cancermedel. Dessa cellinjer bevarar dock inte nödvändigtvis de ursprungliga egenskaperna hos deras källvävnad eftersom deras morfologi, genmutation och genuttrycksprofil kan förändras under kultur under långa perioder. Dessutom odlas de flesta av dessa cellinjer i ett monoskikt eller används som murin xenograft, varav ingen fysiskt representerar tumörvävnad1,2. Den kliniska effekten av cancerläkemedel kan således inte vara densamma som den som observerats i cancer cellinjer. Därför har in vitro-system, såsom ex vivo-analyser med hjälp av patient-härledda tumör xenografts eller patient-härledda tumör organoider (PDU) och tumör sfäroid modeller som exakt reproducerar strukturen och funktionen av tumör vävnader, utvecklats. Ökande bevis tyder på att dessa modeller förutsäger patienternas svar på cancerläkemedel genom att vara direkt jämförbara med motsvarande cancervävnad. Dessa in vitro-system har upprättats för olika tumörvävnadstyper, och tillhörande höggenomströmningsanalyssystem (HTS) för läkemedelsscreening har också utvecklats3,4,5,6,7. Heterogena ex vivo organoid kulturer av primära tumörer som erhållits från patienter eller patient-härledda tumör xenografts har fått betydande dragkraft under de senaste åren på grund av deras lätthet i kultur och förmåga att upprätthålla komplexiteten hos celler i stromal vävnad8,9,10. Dessa modeller förväntas öka förståelsen för cancerns biologi och underlätta utvärderingen av läkemedelseffekt in vitro.
En serie nya PDO skapades nyligen från olika typer av tumörvävnad, betecknade som F-PDO, under Fukushima Translational Research Project. PDU: er bildar stora cellkluster med en morfologi som liknar källtumörens och kan odlas i mer än sex månader11. Den jämförande histologin och omfattande genuttryck analyser visade att funktionerna i PDO är nära dem av deras källa tumör vävnader, även efter långvarig tillväxt under kultur förhållanden. Dessutom inrättades en lämplig HTS för varje typ av sub sub i 96-brunns- och 384-brunnsplattor. Dessa analyser användes för att utvärdera flera molekylära riktade medel och antikroppar. Här utvärderades standard kemoterapeutik (paklitaxel och karboplatin) som används för endometriecancer med hjälp av F- PDO som härrör från en patient som inte svarade på paklitaxel och karboplatin. Följaktligen var celltillväxthämmande aktiviteten hos paklitaxel och karboplatin mot denna subpa subgistr svag (IC50:>10 μM). Dessutom har tidigare forskning rapporterat att känsligheten hos vissa F-PDO: er för kemoterapeutiska medel och molekylära riktade medel överensstämmer med den kliniska effekten11,12,13. Slutligen analyserades förändringar i den högre ordningens struktur av PDO: er orsakade av cancermedel med hjälp av ett tredimensionellt cellanalyssystem12,13. Resultaten av utvärderingen av cancerläkemedel med hjälp av en PDO-baserad HTS är jämförbara med de kliniska resultat som erhållits för dessa agenser. Här presenteras ett protokoll för en enklare och mer exakt HTS som kan användas för att utvärdera styrkan hos cancerläkemedel och immunterapi med hjälp av PDO-modellerna.
Det unika kännetecknet för PDO: er är att de inte enzymatiskt separeras i enskilda celler under kultur eller analys och upprätthåller cellkluster i kulturen. Därför kan antalet celler inte räknas exakt under ett mikroskop. För att lösa detta problem bestäms antalet celler visuellt genom att fodra ett centrifugrör som innehåller cellerna med rör märkta med nivåer för 50-200 μL (figur 1B). Eftersom det är svårt att mäta pelletsvolymen av cellkluster som odlas i en 25 cm2-kolv visuellt, bestämdes tidpunkten för passagen med hjälp av medelfärgförändringen från rött till gult och den märkbara ökningen av enstaka celler eller skräpjämfört med tiden för passaging som indikatorer (figur 1A,C). Detta är poängen med att passa för PDO: er. Mängden subp pelletmedel mäts visuellt efter centrifugering vid varje mediumförändring. När pelletsvolymen slutar öka och mediet blir gult dagen efter medelbytet anses mediet vara mättat med densitet och passaging utförs. Pelletvolymen definieras för varje sub sub. Om de pdo:er som inte ökar ändras mängden medium från 80 % till 50 % vid tidpunkten för det medelstora utbytet, och tätheten av PDO:er ökar i kulturen.
En HTS lämplig för PDO utvecklades. Dess genomströmning är minst tio till tjugo 384-brunnsplattor som utförs med en 75 cm2 kolv subdo, och antalet bearbetade plattor per dag är minst 50. Dessutom har resultaten av utvärderingen av olika cancerläkemedel av HTS med hjälp av PDO redan rapporterats.
Vid utförandet av HTS åtgärdas först igensättning av nätfiltret som orsakas av malning av F-PDO:erna med hjälp av cellfragmenterings- och spridningsutrustningen genom att filterstorleken ändras till 100 μm. Nästa steg är att minska volymen av den subdo-suspension som appliceras på glaskärlet. Vid beredning av testämneslösningar för HTS löses lågmolekylära föreningar vanligtvis i dimetylsulfoxid och antikropparna löses upp i fosfatbuffrad saltlösning. Det lämpliga lösningsmedlet används som testämne och kontrolldata erhålls från det använda lösningsmedlet.
Följande är en beskrivning av hur man hanterar variabilitet i analysdata. Om det finns stor variation i data i testet med hjälp av 384-brunnsplattor, bör analysplattan ändras till ett 96-väl plåtformat. Den subdo-utspädningsfaktorn (antal sådda cellkluster) undersöks också efter sådd av plattan. Slutligen kan cellplocknings- och bildsystemet användas för att välja storleken på PDO:er för analysen. Innan du lägger till PDO: er i kammaren bör enstaka celler och små cellkluster avlägsnas genom låghastighetscentrifugering för att korrekt kunna känna igen PDO: er. Om enstaka celler eller små cellkluster är synliga efter att du har lagt till PDO:er i kammaren kan flera dispersioner utföras för att ta bort de enskilda cellerna. Därefter, även om cellplocknings- och bildsystemet har en funktion som gör att plattan kan hållas varm, används denna funktion inte på grund av avdunstning av odlingsmediet när systemet fungerar under en lång tid. Slutligen är volymen av cellkluster okänd eftersom den känns igen av en plan avbildning. Om två eller flera PDO:er överlappar varandra kan en enda subdo inte heller identifieras korrekt. Det är dock möjligt att ta bort oönskade PDO: er med hjälp av borttagningsfunktionen genom att kontrollera dem på den skannade bilden efter flytten.
Mätinstrumentet för elektrisk impedans används vanligtvis för vidhäftande målcancerceller för att övervaka förändringar i impedans under cellproliferation. Därför identifieras inte en ändring i cellindexet för icke-vidhäftande PDO: er. I ett försök att lösa detta problem är det nödvändigt att undersöka såddförhållandena såsom subdotäthet och enzymatisk behandling (cell dissociation enzym och behandlingstid) beroende på typ av subdo. Brunnarna i plattan måste också beläggas med en lämplig extracellulär matris för sådd av PDO: er. PDO:er sås utan enzymatisk behandling, beroende på typen av subdo. RLUN007 användes för att mäta impedansen genom att så pduren på en 96-välplatta efter att ha spridit dem genom enzymatisk behandling. RLUN007 behandlades med cellkulturen dissociation reagens i 20 min vid 37 °C för att skingra cellerna och fästa dem på brunnarna i en 96-väl platta. Med tanke på att dissocierade RLUN007-celler omedelbart bildar aggregat är det önskvärt att så på plattorna strax efter filtrering med hjälp av en sil. Efter att ha överfört cellupphängningen från röret till en reservoar flyttades behållaren försiktigt från höger till vänster två till tre gånger och pipettades upp och ner fem gånger innan sådd på plattan. Suspensionen blandades också med varje tillägg till brunnen. Plattan placerades sedan i ett biologiskt säkerhetsskåp i 30 min (för PDO) eller 15 min (för NK-celler) för att cellerna skulle kunna fördelas jämnt i brunnen. Den andra viktiga punkten är att behandling med antikroppar och NK-celler bör ske innan cellindexet når en platå och värdet inte är mindre än 0,5. När det gäller RLUN007 är den optimala tiden att starta analysen 20-22 h efter plätering, och cellnumret för sådd är 5 x 104 celler/brunn.
I allmänhet använder kulturen och analyserna för tumörorganoider extracellulära matriser som Matrigel för att skapa tumörvävnadsställningar eller enzymer som trypsin och kollagenas för att störa organoiderna3,4,5,6,7. Fördelen med denna metod är att ingen extracellulär matris eller enzymatisk behandling krävs under kultur och analys (förutom analyser som använder det elektriska impedansmätinstrumentet), vilket avsevärt minskar arbetskraven och kostnaderna. Dessutom är denna metod relativt enkel att anpassa till HTS-analyssystem och olika mätsystem. Användningen av en extracellulär matris är dock önskvärt för vissa forskningsändamål eftersom det kan fungera som en byggnadsställning för celler och påverka morfogenes, differentiering och homeostas i vävnader.
I denna studie användes PDU (RLUN007) med en EGFR-mutation (L858R) som är kliniskt känslig för EGFR-hämmare och högt uttryck för EGFR-genen (data som inte visas) för att utvärdera EGFR-hämmare. Det visades att känsligheten hos RLUN007 för EGFR-hämmare var högre än för andra lungcancer-härledda F-PDU13 (figur 4). Således är en HTS med hjälp av PDU, som behåller egenskaperna hos tumörvävnad, överlägsen för utvärdering av potentiella cancermedel och presenterar möjligheter till läkemedelsbedömning och framsteg inom personlig medicin. Även om HTS är lämpligt för den första screeningen av medel, reproducerar det inte tumörmikromiljön och kan därför inte utvärdera effekten av läkemedel in vivo. Därför är ett in vitro-system som kan efterlikna mänsklig tumörvävnad in vivo genom samkultur med vaskulär endotelceller och andra stromala celler eller organ-på-ett-chip-teknik i avsaknad av djurmodeller nu under utveckling.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka de patienter som tillhandahöll de kliniska exemplar som används i denna forskning. Denna forskning stöds av bidrag från Translational Research Program of Fukushima Prefecture.
384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate | Corning | 4516 | Plates for HTS |
40-µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
AdoptCell-NK kit | Kohjin Bio | 16030400 | Kit for NK cell production |
Cancer Cell Expansion Media plus | Fujifilm Wako Pure Chemical | 032-25745 | Medium for F-PDO |
ALyS505N-175 | Cell Science & Technology institute | 10217P10 | Medium for NK cells |
CELL HANDLER | Yamaha Motor | – | Cell picking and imaging system |
CellPet FT | JTEC | – | Cell fragmentation and dispersion equipment |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9683 | Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent |
Echo 555 | Labcyte | – | Liquid handler |
EnSpire | PerkinElmer | – | Plate reader |
E-plate VIEW 96 | Agilent | 300601020 | Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System |
Fibronectin Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical | 063-05591 | Plate coating for xCELLigence RTCA System |
F-PDO | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | – | The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International |
Morphit software, version 6.0 | The Edge Software Consultancy | Biological data analysis software | |
Multidrop Combi | ThermoFisher Scientific | 5840300 | Cell suspension dispenser |
Precision Chamber | Yamaha Motor | JLE9M65W230 | Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER |
Precision Tip | Yamaha Motor | JLE9M65W300 | Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER |
RLUN007 | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | Lung tumor derived F-PDO | |
TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604021 | Cell culture dissociation reagent |
Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask | Corning | 4616 | Culture flask for PDO |
Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask | Corning | 3814 | Culture flask for PDO |
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System | Beckman coulter | – | Cell viability analyzer |
xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 | ACEA Bioscience | – | Analysis software for xCELLigence RTCA System |
xCELLigence RTCA System | ACEA Bioscience | – | Electrical impedance measuring instrument for cytolysis |