רקמות ראשוניות המתקבלות מחולים בעקבות ארתרופלסטיקה כוללת בברך מספקות מודל ניסיוני למחקר דלקת מפרקים ניוונית עם תרגום קליני מקסימלי. פרוטוקול זה מתאר כיצד לזהות, לעבד ולבודד RNA משבע רקמות ברכיים ייחודיות כדי לתמוך בחקירה מכנית בדלקת מפרקים ניוונית אנושית.
דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלת מפרקים כרונית וניוונית המשפיעה לרוב על הברך. מכיוון שאין כרגע תרופה, ארתרופלסטיקה מוחלטת בברך (TKA) היא התערבות כירורגית נפוצה. ניסויים באמצעות רקמות OA אנושיות ראשוניות המתקבלות מ- TKA מספקים את היכולת לחקור מנגנוני מחלה ex vivo. בעוד OA נחשב בעבר להשפיע בעיקר על הסחוס, זה ידוע עכשיו להשפיע על רקמות מרובות במפרק. פרוטוקול זה מתאר בחירת מטופלים, עיבוד מדגם, הומוגניזציה של רקמות, מיצוי RNA ובקרת איכות (המבוססת על טוהר RNA, שלמות ותשואה) מכל אחת משבע רקמות ייחודיות לתמיכה בחקירת מנגנון המחלה במפרק הברך. בהסכמה מדעת, התקבלו דגימות מחולים שעברו TKA עבור OA. רקמות נותחו, נשטפו ואוחסנו תוך 4 שעות מהניתוח על ידי הקפאת הבזק עבור RNA או קיבעון פורמלין להצטולוגיה. רקמות שנאספו כללו סחוס מפרקי, עצם תת-כונדרלית, מניסקוס, כרית שומן אינפר-פטלר, רצועה צולבת, סינוביום ושריר האלכסוני vastus medialis. פרוטוקולי מיצוי RNA נבדקו עבור כל סוג רקמה. השינוי המשמעותי ביותר כלל את שיטת ההתפוררות המשמשת לרקמות קשות בעלות תאים נמוכים, גבוהים, (הנחשבים לסחוס, עצם ומניסקוס) לעומת תאים גבוהים יחסית, מטריצה נמוכה, רקמות רכות (נחשבות כרית שומן, רצועה, סינוביום ושרירים). נמצא כי ריכוך היה מתאים לרקמות קשות, והומוגניזציה מתאימה לרקמות רכות. נצפתה נטייה של נבדקים מסוימים להניב ערכי שלמות RNA גבוהים יותר (RIN) מאשר נבדקים אחרים באופן עקבי על פני רקמות מרובות, דבר המצביע על כך שגורמים הבסיסיים כגון חומרת המחלה עשויים להשפיע על איכות ה- RNA. היכולת לבודד RNA באיכות גבוהה מרקמות OA אנושיות ראשוניות מספקת מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לניסויי ביטוי גנים מתוחכמים, כולל רצף, שיכול להוביל לתובנות קליניות שתורגמו בקלות רבה יותר לחולים.
הברך היא המפרק הסינוביאלי הגדול ביותר בגוף האדם, הכולל את מפרק הטיביו-דימורל בין השוקה לירך ומפרק הפטלו-מורל בין פיקת הברך לירך1. העצמות בברך מרופדים בסחוס מפרקי ונתמכות על ידי רקמות חיבור שונות, כולל מנישי, שומן, רצועות ושרירים, וממברנה סינוביאלית מתמצתת את כל המפרק כדי ליצור חלל מלא נוזלים סינוביאלי1,2,3 ( איור1). ברך בריאה מתפקדת כמפרק ציר נייד המאפשר תנועה ללא חיכוך במישור הקדמי1,3. בתנאים פתולוגיים, התנועה יכולה להיות מוגבלת וכואבת. מחלת מפרק הברך הניוונית הנפוצה ביותר היא דלקת מפרקים ניוונית (OA)4. מגוון גורמי סיכון ידועים נטייה להתפתחות OA, כולל גיל מבוגר יותר, השמנת יתר, מין נשי, טראומה משותפת, וגנטיקה, בין היתר5,6. ישנם כיום כ -14 מיליון אנשים בארה”ב עם OA ברך סימפטומטי, עם השכיחות גדלה עקב עלייה בגיל האוכלוסייה ושיעורי השמנת יתר7,8. בתחילה נחשב למחלה של הסחוס, OA הוא עכשיו הבין כמחלה של המפרק כולו9. שינויים פתולוגיים שנצפו בדרך כלל ב- OA כוללים שחיקת סחוס מפרקי, היווצרות אוסטאופית, עיבוי עצם תת-ביתית ודלקת של הסינוביום9,10. מאז אין תרופה ידועה עבור OA, טיפולים מתמקדים בעיקר סימפטום (למשל, כאב) ניהול11,12, ולאחר OA התקדם לשלב הסופי, ניתוח החלפת מפרקים הוא ציין לעתים קרובות13.
ניתוחי החלפת מפרקים יכולים להיות חלקיים או כוללים של החלפת ברך, עם ארתרופלסטיקה כוללת בברך (TKA) כולל החלפת כל הניסוח הטיביו-מורלי והמפרק הפטלו-מורלי. נכון לשנת 2020, כמיליון TKAs מבוצעים בארה”ב מדי שנה14. במהלך TKA, מנתח אורטופדי חוצה את החלק העליון של רמת הטיבי ואת חמצת הירך התחתונה (איור 2A, 2B) כדי להיות מצויד בשתלים תותבים. לפעמים לא לפרש על ידי חולים, ב TKA, רק 8-10 מ”מ נפלט מקצה כל עצם, אשר לאחר מכן כתרים או צף מחדש, עם מתכת. אניה פוליאתילנית משולבת יוצרת את משטח הנושא (כלומר, ריפוד) בין שני שתלי המתכת. בנוסף, מספר רכיבי רקמות רכות של המפרק הם excised באופן מלא או חלקי כדי להשיג איזון משותף נכון. בין הרקמות הללו ניתן למנות המנישי המהודל והקטנוני (איור 2C), כרית שומן אינפרא-פטלרית (איור 2D), רצועה צולבת חיצונית (ACL; איור 2E, סינוביום (איור 2F) ושריר האלמוני של vastus medialis (VMO; איור 2G) 15.למרות TKAs הם בדרך כלל מוצלחים לטיפול OA, סביב 20% מהחולים מדווחים על reoccurrence של כאב לאחר הניתוח16. יחד עם העלות הגבוהה והפולשניות היחסית של ההליך, מגבלות אלה מצביעות על הצורך במחקר נוסף כדי לזהות טיפולים חלופיים כדי למתן את התקדמות OA.
כדי לחקור מנגנוני מחלה ב- OA שעשויים להציג אפיקים חדשים להתערבות טיפולית, ניתן להשתמש במערכות ניסיוניות, כולל תאים, מגרשי רקמות ומודלים של בעלי חיים. תאים הם בדרך כלל מתורבתים monolayer נגזרים רקמות האדם או בעלי החיים העיקריים (למשל, chondrocytes מבודד סחוס) או תאים מונצחים (למשל, ATDC517 ו- CHON-00118). בעוד תאים יכולים להיות שימושיים למניפולציה משתנים ניסיוניים בסביבת תרבות מבוקרת, הם אינם ללכוד את התנאים של המפרק הטבעי אשר ידועים להשפיע פנוטיפים התא19. כדי לשחזר טוב יותר את המפל המורכב של תקשורת כימית, מכנית ותא לתא שבבסיס OA, חלופה נמצאת בדגימות ראשוניות של רקמת אדם או בעלי חיים, בין אם נעשה שימוש ב- ex vivo טרי או מתורבת כאקספלנטים, כדי לשמר את מבנה הרקמות ואת microenvironment התא20. על מנת ללמוד את המפרק ב vivo, קטן (למשל, עכבר21)וגדול (למשל, סוס22) מודלים בעלי חיים עבור OA (למשל, באמצעות אינדוקציה כירורגית, שינוי גנטי, או הזדקנות) הם גם שימושיים. עם זאת, תרגום מודלים אלה למחלות אנושיות יכול להיות מוגבל על ידי הבדלים אנטומיים, פיזיולוגיים ומטבוליים, בין היתר23. בהתחשב ביתרונות ובחסרונות של מערכות ניסיוניות, נקודות החוזק העיקריות של היותן ספציפיות למינים ושמירה על הנישה החוץ-תאית המוצעת על ידי רקמות OA האנושיות העיקריות ממקסמות את הפוטנציאל התרגומי של ממצאי המחקר.
רקמות OA אנושיות ראשוניות ניתן להשיג בקלות בעקבות TKA, מה שהופך את התדירות הגבוהה של TKAs משאב בעל ערך למחקר. בין היישומים הניסיוניים הפוטנציאליים הם ביטוי גנים וניתוחים היסתולוגיים. כדי לממש את הפוטנציאל של רקמות OA אנושיות ראשוניות עבור גישות מחקר אלה ואחרים, המתוארים הם השיקולים העיקריים הבאים. ראשית, השימוש בדגימות מטופלים כפוף לרגולציה אתית, והפרוטוקולים חייבים לעמוד באישורי ועדת הביקורת המוסדית (IRB)24. שנית, ההטרוגניות הטבועה של רקמות החולים העיקריות האנושיות והשפעת משתנים כגון גיל ומין, בין היתר, יוצרות את הצורך בבחירת מטופלים זהירה (כלומר, יישום קריטריוני זכאות) ופרשנות נתונים. שלישית, התכונות הביולוגיות הייחודיות של רקמות שונות במפרק (למשל, תאיות נמוכה של סחוס ומניסקוס25) יכולות להציג אתגרים במהלך ניסויים (למשל, בידוד איכות גבוהה וכמות של RNA). דוח זה מתייחס לשיקולים אלה ומציג פרוטוקול לבחירת מטופלים, עיבוד מדגם, הומוגניזציה של רקמות, מיצוי RNA ובקרת איכות (כלומר, הערכת טוהר ושלמות ה-RNA; איור 3) כדי לעודד את השימוש ברקמות OA האנושיות העיקריות בקהילת המחקר.
הפרוטוקול שהוצג הוכח כמוצלח לאיסוף שבע רקמות OA אנושיות עיקריות להפקת RNA (טבלה 1) ועיבוד היסתולוגי (איור 4). לפני איסוף דגימות המטופל, יש צורך להקים פרוטוקול שאושר על ידי IRB, באופן אידיאלי בשיתוף פעולה עם מנתח או צוות כירורגי. החלת פרוטוקול מתוקנן עבור אוסף דגימות (לדו?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים למשתתפי המחקר שאפשרו את המחקר ומקדישים את הדו”ח הזה למדענים חדשים בתחום דלקת מפרקים ניוונית.
1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05 402 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
10% Formalin | Cardinal Health | C4320-101 | Store in chemical cabinet when not in use. |
100% Chloroform (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | ICN19400290 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
100% Ethanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | BP2818500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water. |
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | AC327272500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
100% Reagent Alcohol | Cardinal Health | C4305 | Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes. |
15 cm sterile culture dishes | Thermo Scientific | 12-556-003 | Sterile, nuclease-free. |
15 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 14 959 53A | Sterile, nuclease-free. |
2 mL cryovials (externally threaded) | Fisher Scientific | 10 500 26 | Sterile, nuclease-free. |
5 mL round-bottom tubes | Corning | 352052 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
50 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 12 565 271 | Sterile, nuclease-free. |
Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | For RNA integrity measurement. |
Biosafety Cabinet | General lab equipment | ||
Bone Cutters | Fisher Scientific | 08 990 | Sterilized with 70% EtOH. |
Chemical Fume Hood | General lab equipment | ||
Disposable Scalpels (No.10) | Thermo Scientific | 3120032 | Sterile, nuclease-free. |
EDTA | Life Technologies | 15-576-028 | 10% solution with dH2O. |
Forceps | Any vendor | Sterilized with 70% EtOH. | |
Glycoblue Coprecipitant | Fisher Scientific | AM9516 | Reserved for RNA work only, store at -20 °C. |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
Liquid Nitrogen | Any vendor | ||
Liquid Nitrogen Dewar | General lab equipment | ||
Mortar and Pestle | Any vendor | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. | |
Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA purity and yield measurements. |
Nuclease-free/DEPC-treated water | Fisher Scientific | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. | |
PBS (Sterile) | Gibco | 20 012 050 | Sterile, nuclease-free. |
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips | Any vendor | Sterile, nuclease-free. | |
Plasma/Serum Advanced miRNA kit | Qiagen | 217204 | |
Refrigerated Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
RNAlater | Thermo Scientific | 50 197 8158 | Sterile, nuclease-free. |
RNAse Away/RNAseZap | Fisher Scientific | 7002 |
|
Spatula (semimicro size) | Any vendor | Reserved for RNA work only. | |
Tissue homogenizer | Pro Scientific | 01-01200 | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. |
TRIzol Reagent | Fisher Scientific | 15 596 026 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |