यहां हम कोशिका ढेर और आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी शुद्धिकरण में उगाई जाने वाली अनुयायी एचईके 293 कोशिकाओं का उपयोग करके अनुसंधान-ग्रेड एएवी वैक्टर के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल लगातार >1 x 1013 वेक्टर जीनोम/एमएल की पैदावार करता है, जो बड़े पशु अध्ययनों के लिए उपयुक्त वेक्टर मात्रा प्रदान करता है ।
Adeno से जुड़े वायरस (AAV) वैक्टर सबसे चिकित्सकीय उन्नत जीन थेरेपी वैक्टर के बीच में हैं, तीन AAV जीन मनुष्यों के लिए मंजूरी दे दी चिकित्सा के साथ । एएवी के लिए उपन्यास अनुप्रयोगों की नैदानिक उन्नति में छोटे पशु मॉडलों से संक्रमण शामिल है, जैसे चूहों, कुत्तों, भेड़ और अमानवीय वानरों सहित बड़े पशु मॉडल में। बड़े जानवरों के लिए एएवी प्रशासन की सीमाओं में से एक उच्च टाइटर वायरस की बड़ी मात्रा के लिए आवश्यकता है । जबकि निलंबन सेल संस्कृति एएवी वेक्टर उत्पादन के लिए एक स्केलेबल विधि है, कुछ शोध प्रयोगशालाओं में उपकरण (जैसे, बायोरिएक्टर) हैं या जानते हैं कि इस तरीके से एएवी का उत्पादन कैसे किया जाए। इसके अलावा, एएवी टाइटर्स अक्सर काफी कम होते हैं जब अनुयायी HEK293 कोशिकाओं की तुलना में निलंबन HEK 293 कोशिकाओं में उत्पादित होता है। यहां वर्णित सेल स्टैक का उपयोग करके बड़ी मात्रा में उच्च-टाइटर एएवी का उत्पादन करने के लिए एक विधि है। एएवी के साथ-साथ वेक्टर शुद्धता को मान्य करने के तरीकों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल भी वर्णित किया गया है। अंत में, एक भेड़ मॉडल में एएवी-मध्यस्थता ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं। अनुयायी कोशिकाओं में एएवी वैक्टर के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए यह अनुकूलित प्रोटोकॉल आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं को बड़े पशु मॉडलों में अपने उपन्यास एएवी चिकित्सा के परीक्षण को आगे बढ़ाने में सक्षम बनाएगा।
एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) वैक्टर का उपयोग करने वाली जीन थेरेपी ने पिछले तीन दशकों में भारी प्रगति की है1,2। जन्मजात अंधापन, हीमोफीलिया, और मस्कुलोस्केलेटल और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रोगों सहित आनुवंशिक रोगों की एक विविध श्रृंखला में सुधार का प्रदर्शन किया, नैदानिक अनुसंधान3,4में सबसे आगे AAV जीन थेरेपी लाया है । 2012 में, यूरोपीय दवाएं एजेंसी (ईएमए) ने एलपीएल की कमी के उपचार के लिए लिपोप्रोटीन लिपेज (एलपीएल) व्यक्त करते हुए एक AAV1 वेक्टर ग्लाइबेरा को मंजूरी दी, जिससे यह यूरोप या संयुक्त राज्य अमेरिका5में जीन थेरेपी उपचार के लिए पहला विपणन प्राधिकरण बन गया। तब से, दो अतिरिक्त एएवी जीन चिकित्सा, लक्सटर्ना6 और Zolgensma7,एफडीए अनुमोदन प्राप्त हुआ है, और बाजार के रूप में कई के रूप में 10-20 जीन चिकित्सा २०२५8से उंमीद के साथ अगले 5 वर्षों में जल्दी से विस्तार की उंमीद है । उपलब्ध नैदानिक डेटा से संकेत मिलता है कि एएवी जीन थेरेपी एक सुरक्षित, अच्छी तरह से सहन की गई और प्रभावोत्पादक तौर-तरीके हैं जो इसे सबसे होनहार वायरल वैक्टर में से एक बनाते हैं, जिसमें ClinicalTrials.gov के साथ पंजीकृत एवीवी से जुड़े 244 नैदानिक परीक्षण शामिल हैं। एएवी वैक्टर से जुड़े नैदानिक अनुप्रयोगों में बढ़ती रुचि के लिए बड़े पशु मॉडलों में एएवी चिकित्सा के मूल्यांकन को सुविधाजनक बनाने के लिए मजबूत और स्केलेबल उत्पादन विधियों की आवश्यकता होती है, क्योंकि यह ट्रांसलेशनल पाइपलाइन9में एक महत्वपूर्ण कदम है।
एएवी वेक्टर उत्पादन के लिए, दो मुख्य आवश्यकताएं एएवी जीनोम और कैप्सिड हैं। जंगली प्रकार (wt) का जीनोम-एएवी एकल-फंसे डीएनए है जो लंबाई10में लगभग 4.7 किब है। डब्ल्यूटी-एएवी जीनोम में जीनोम के दोनों सिरों पर पाए जाने वाले उल्टे टर्मिनल रिपीट्स (आईटीआर) शामिल हैं, जो पैकेजिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं, और निरसित और कैप जीन11। प्रतिनिधि और टोपी जीन, जीनोम प्रतिकृति के लिए आवश्यक, वायरल कैप्सिड की असेंबली, और वायरल कैप्सिड में जीनोम के encapsulation, वायरल जीनोम से हटा दिया जाता है और एएवी वेक्टर उत्पादन12के लिए ट्रांस में प्रदान की जाती है । वायरल जीनोम से इन जीनों को हटाने से चिकित्सीय ट्रांसजीन और प्रमोटर और पॉलीए सिग्नल सहित सभी आवश्यक नियामक तत्वों के लिए जगह प्रदान की जाती है । आईटीआर वेक्टर जीनोम में बने हुए हैं ताकि जीनोम की उचित प्रतिकृति और वायरल एनकैप्सुलेशन13,14को सुनिश्चित किया जा सके । ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की गतिज में सुधार करने के लिए, एएवी वेक्टर जीनोम को आत्म-पूरक होने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है, जो एएवी जीनोम प्रतिकृति के दौरान एकल-फंसे डीएनए रूपांतरण से रूपांतरण की आवश्यकता को कम करता है, लेकिन कोडिंग क्षमता को ~ 2.4 केबी15तक कम कर देता है।
एएवी जीनोम डिजाइन से परे, कैप्सिड सेरोटाइप चयन वीवो2में एएवी वेक्टर के ऊतक और सेल ट्रॉपिज्म को निर्धारित करता है। ऊतक ट्रॉपिज्म के अलावा, विभिन्न एएवी सीरोटाइप को विभिन्न जीन अभिव्यक्ति काइनेटिक्स16प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, जिंकरेली एट अल17 ने विभिन्न एएवी सेरोटाइप्राइप को कम अभिव्यक्ति सेरोटाइप (एएवी 2, 3, 4, 5), मॉडरेट एक्सप्रेशन सेरोटाइप (एएवी 1, 6, 8) और उच्च अभिव्यक्ति सेरोटाइप्स (एएवी7 और 9) में वर्गीकृत किया। उन्होंने एएवी सेरोटाइप को धीमी शुरुआत वाली अभिव्यक्ति (एएवी 2, 3, 4, 5) या रैपिड-शुरुआत अभिव्यक्ति (AAV1, 6, 7, 8, और 9) में भी वर्गीकृत किया। ये भिन्न ट्रॉपिज्म और जीन अभिव्यक्ति गतिज कैप्सिड प्रोटीन, कैप्सिड प्रोटीन संरचनाओं में अमीनो एसिड विविधताओं और मेजबान सेल रिसेप्टर्स/सह-रिसेप्टर्स18के साथ बातचीत के कारण हैं । कुछ एएवी कैप्सिड में अतिरिक्त लाभकारी विशेषताएं होती हैं जैसे कि इंट्रावैस्कुलर एडमिनिस्ट्रेशन (एएवी9) के बाद रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करने की क्षमता या टिकाऊ ट्रांसजीन अभिव्यक्ति (एएवी 6, 6.2 एफएफ, 8, और 9)19,20के लिए लंबे समय तक रहने वाली मांसपेशियों की कोशिकाओं में रहते हैं।
इस पेपर का उद्देश्य प्रीक्लिनिकल बड़े पशु मॉडलों में उपयोग के लिए उच्च शुद्धता, उच्च-टाइटर, अनुसंधान ग्रेड एएवी वैक्टर के उत्पादन के लिए लागत प्रभावी विधि का विस्तार करना है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर एएवी का उत्पादन कोशिका के ढेर में उगाए जाने वाले अनुयायी मानव भ्रूणीय गुर्दे (एचईके) 293 कोशिकाओं में दोहरी-प्लाज्मिड ट्रांसफैक्शन का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। इसके अलावा, अध्ययन हेपरिन सल्फेट आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी शुद्धिकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जिसका उपयोग एएवी सेरोटाइप के लिए किया जा सकता है जिसमें हेपरिन-बाध्यकारी डोमेन होते हैं, जिनमें एएवी2, 3, 6, 6.2 एफएफ, 13 और डीजे21,22शामिल हैं।
एएवी वैक्टर के उत्पादन के लिए कई पैकेजिंग सिस्टम उपलब्ध हैं। इनमें से, दो-प्लाज्मिड सह-ट्रांसफैक्शन सिस्टम का उपयोग, जिसमें प्रतिनिधि और कैप जीन और विज्ञापन सहायक जीन (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6, और VA RNA) एक प्लाज्मिड (pHelper) के भीतर निहित हैं, आम तीन प्लाज्मिड (ट्रिपल) ट्रांसफेक्शन विधि पर कुछ व्यावहारिक लाभ है, प्लाज्मिड उत्पादन के लिए कम लागत सहित23,24 . ट्रांसजीन एक्सप्रेशन कैसेट (pTransgene) युक्त एएवी जीनोम प्लाज्मिड, आईटीआर द्वारा घिरा होना चाहिए, और लंबाई में ~ 4.7 किलो से अधिक नहीं होना चाहिए। ट्रांसफैक्शन के दौरान संभावित साइटोटॉक्सिक प्रभावों के कारण ट्रांसजीन द्वारा वेक्टर टाइटर और शुद्धता प्रभावित हो सकती है। वेक्टर शुद्धता का आकलन यहां वर्णित है। इस विधि का उपयोग करके उत्पादित वैक्टर, जो प्रत्येक के लिए 1 x 1013 वीजी/एमएल उपज, चूहों, हम्सटर और ओवाइन पशु मॉडल में मूल्यांकन किया गया था।
तालिका 1: आवश्यक समाधानों की संरचना। प्रोटोकॉल के दौरान विभिन्न समाधानों के लिए आवश्यक घटकों के प्रतिशत और मात्रा सहित आवश्यक जानकारी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
इस पेपर में वर्णित रिकॉम्बिनेंट एएवी (आरएवी) वैक्टर का उत्पादन आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान प्रयोगशालाओं और सुविधाओं के बहुमत में पाए जाने वाले सामान्य सामग्रियों, अभिकर्णों और उपकरणों का उपयोग करता ह…
The authors have nothing to disclose.
अमीरा डी आरघी, ब्रेन्ना ए वाई स्टीवंस, सिल्विया पी थॉमस, और जैकब जी ई येट्स ओंटारियो वेटनरी कॉलेज के छात्र वजीफे के साथ-साथ ओंटारियो ग्रेजुएट स्कॉलरशिप के प्राप्तकर्ता थे । अमीरा डी आरघेई एक Mitacs तेजी लाने के छात्रशिप के प्राप्तकर्ता थे । इस काम को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (सीआईएचआर) परियोजना अनुदान (#66009) और एसकेडब्ल्यू को एक सहयोगी स्वास्थ्य अनुसंधान परियोजनाएं (NSERC भागीदारी) अनुदान (#433339) द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
0.22 μm filter | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
0.25% Trypsin | Fisher Scientific | SM2001C | |
1-Butanol | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
10 chamber cellstack | Corning | 3271 | |
1L PETG bottle | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
30% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 1610158 | |
96-well skirted plate | FroggaBio | FS-96 | |
Adhesive plate seals | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
Blood and Tissue Clean up Kit | Qiagen | 69506 | Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol |
Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
Cell Culture Dishes | Greiner bio-one | 7000232 | 15 cm plates |
Culture Conical Tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 mL conical tube |
Culture Conical Tube | Fisher Scientific | 14955240 | 50 mL conical tube |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
Ethanol | Greenfield | P016EA95 | Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
HBSS with Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
HBSS without Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
HEK293 cells | American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots |
HEK293 host cell protein ELISA kit | Cygnus Technologies | F650S | Follow manufacturer’s instructions |
Heparin sulfate column | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
L-glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion | Corning | CLS431124 | Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions |
Large Volume Centrifuge Tubes | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL centrifuge tubes |
MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use |
Molecular Grade Water | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma Aldrich | L5125 | CAUTION. Wear gloves |
NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
Optimem, reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | Sterilize prior to use |
PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Dilute to 1x for use on cells |
Penicillin-Streptomycin Solution | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
pHelper plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | |
Pipet basin | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Purchase sterile pipet basins |
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | CAUTION. Wear gloves |
Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 24765-1 | Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C |
Polypropylene semi-skirted PCR Plate | FroggaBio | WS-96 | |
Polysorbate 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | CAUTION. Wear gloves |
polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Cytiva Life Sciences | 10600023 | Use forceps to manipulate. Wear gloves. |
Primary antibody | Progen | 65158 | |
Protein Ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
pTrangene plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0 |
Pump tubing | Cole-Parmer | RK-96440-14 | Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5 |
RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer | Promega | M6101 | Use at 10x concentration in protocol from section 4.0 |
RQ1 Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | |
Sample dilutent | Cygnus Technologies | I700 | Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit |
Secondary antibody, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
Skim milk powder | Oxoid | LP0033B | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
SV40 polyA primer probe | IDT | Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff |
Universal Nuclease for cell lysis | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
Universal qPCR master mix | NEB | M3003L | |
Whatman Paper | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
β-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 21985023 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals. |