여기서 는 세포 스택 및 친화성 크로마토그래피 정제에서 자란 부착 된 HEK 293 세포를 사용하여 연구 급 AAV 벡터의 대규모 생산을위한 상세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 지속적으로 >1 x10 13 벡터 게놈/mL을 산출하여 대규모 동물 연구에 적합한 벡터 양을 제공합니다.
Adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터는 인간을 위해 승인된 3개의 AAV 유전자 치료와 함께 가장 임상적으로 진보된 유전자 치료 벡터 중 하나입니다. AAV에 대한 새로운 응용 프로그램의 임상 발전은 개, 양 및 비인간 영장류를 포함한 더 큰 동물 모델로 마우스와 같은 작은 동물 모델에서 전환하는 것을 포함합니다. 더 큰 동물에 AAV를 투여의 한계 중 하나는 하이 티터 바이러스의 대량에 대한 요구 사항입니다. 서스펜션 세포 배양은 AAV 벡터 생산을 위한 확장 가능한 방법이지만, 장비(예를 들어, 생물반응기)가 있거나 이러한 방식으로 AAV를 생산하는 방법을 아는 연구실이 거의 없습니다. 더욱이, AAV 티터는 부착된 HEK293 세포에 비해 현탁액 HEK 293 세포에서 생산될 때 현저히 낮습니다. 여기에 설명된 셀 스택을 사용하여 다량의 하이티터 AAV를 생산하는 방법이다. AAV를 적발하기 위한 자세한 프로토콜과 벡터 순도 유효성을 검사하는 방법도 설명되어 있습니다. 마지막으로, 양 모델에서 AAV 매개 된 유전자 발현의 대표적인 결과가 제시된다. 부착 된 세포에서 AAV 벡터의 대규모 생산을위한이 최적화 된 프로토콜은 분자 생물학 실험실이 더 큰 동물 모델에서 새로운 AAV 치료의 테스트를 진행할 수 있게합니다.
아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 이용한 유전자 치료는 지난 3년간1,2에걸쳐 큰 진전을 이루었다. 선천성 실명, 혈우병, 근골격계 및 중추 신경계의 질병을 포함한 다양한 유전질환의 개선을 입증하여 임상 연구3,4의최전선에 AAV 유전자 요법을 도입했다. 2012년, 유럽의약품청(EMA)은 LPL 결핍 의 치료를 위해 지단백질 리파아제(LPL)를 발현하는 AAV1 벡터인 글리베라를 승인하여 유럽 또는 미국에서 유전자 치료 치료를 위한 최초의 마케팅 승인을5. 그 이후, 2개의 추가 AAV 유전자 치료, Luxturna6 및 Zolgensma7는FDA 승인을 수신하고, 시장은 2025년까지 예상되는 10-20의 유전자 치료로 향후 5년 동안 빨리 확장될 것으로 예상됩니다8. 사용 가능한 임상 데이터는 AAV 유전자 치료가 안전하고 잘 용납되며 효과적인 양식으로 가장 유망한 바이러스 벡터 중 하나이며 AAV가 ClinicalTrials.gov 등록한 244개 이상의 임상 시험이 있음을 나타냅니다. AAV 벡터를 포함하는 임상 응용에 대한 관심이 증가함에 따라 대형 동물 모델에서 AAV 치료법의 평가를 용이하게 하기 위해 견고하고 확장 가능한 생산 방법이 필요하며, 이는 번역 파이프라인9에서중요한 단계이기 때문이다.
AAV 벡터 생산을 위해, 두 가지 주요 요구 사항은 AAV 게놈과 캡시드입니다. 야생형(wt)-AAV의 게놈은 길이10에서약 4.7kb인 단일 좌초 DNA이다. wt-AAV 게놈은 게놈의 양끝에서 발견되는 반전된 말단 반복(ItR)을 포함하며, 이는 포장에 중요하며, 담당자 및 캡 유전자(11). 게놈 복제, 바이러스 캡슐화, 바이러스 캡슐화에 필요한 렙 및 캡 유전자는 바이러스 게놈으로부터 제거되고 AAV 벡터생산(12)을위한 트랜스에서 제공된다. 바이러스 게놈에서 이러한 유전자의 제거는 프로모터 및 polyA 신호를 포함하여 치료 간유전자 및 모든 필요한 규제 요소에 대한 공간을 제공합니다. ItR은 적절한 게놈 복제 및 바이러스 캡슐화를 보장하기 위해 벡터 게놈에 남아있다 13,14. 유전자 발현의 역학을 개선하기 위해 AAV 벡터 게놈은 자체 보완적으로 설계되어 AAV 게놈 복제 시 단일 가닥에서 이중 가닥 DNA 변환으로 변환할 필요성을 완화하지만 코딩 용량을 ~2.4 kb15로감소시킨다.
AAV 게놈 설계를 넘어, 캡시드 혈청형 선택은 생체 내 AAV 벡터의 조직 및 세포 트트로피를 결정한다. 조직 트락피즘 이외에, 상이한 AAV 혈청형은 다른 유전자 발현운동학(16)을표시하는 것으로 나타났다. 예를 들어, Zincarelli외. 17 낮은 발현 혈청형 (AAV2, 3, 4, 5), 적당 한 발현 혈청형 (AAV1, 6, 8), 및 높은 발현 혈청형 (AAV7 및 9)으로 상이한 AAV 혈청형을 분류하였다. 또한 AAV 혈청형을 느린 발병 식(AAV2, 3, 4, 5) 또는 급속 발병 식(AAV1, 6, 7, 8 및 9)으로 분류하였다. 이러한 발산 열대성 및 유전자 발현 운동학은 캡시드 단백질의 아미노산 변이, 캡시드 단백질 형성 및 숙주 세포 수용체/공동 수용체와의 상호작용(18)에기인한다. 일부 AAV 캡시드는 내트라바스 내투여(AAV9)에 이어 혈액-뇌 장벽을 넘거나 내구성이 뛰어난 유전자 발현(AAV6, 6.2FF, 8, 및 9)19,20을위한 장수 근육 세포에 상주하는 능력과 같은 추가적인 유익한특성을갖는다.
이 논문은 전임상 대형 동물 모델에 사용하기 위한 고순도, 하이티터, 연구급 AAV 벡터를 생산하는 비용 효율적인 방법을 자세히 설명하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜을 사용하여 AAV의 생산은 세포 스택에서 자란 부착 된 인간 배아 신장 (HEK)293 세포로 이중 플라스미드 형광을 사용하여 달성된다. 더욱이, 연구는 AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 및 DJ21,22를포함하여 헤파린 결합 도메인을 포함하는 AAV 혈청형에 사용될 수 있는 헤파린 황산염 친화성 크로마토그래피 정제를 위한프로토콜을기술한다.
AAV 벡터의 생산에 사용할 수 있는 여러 패키징 시스템이 있습니다. 이 중, Rep 및 Cap 유전자 및 Ad 도우미 유전자(E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 및 VA RNA)가 하나의 플라스미드(pHelper) 내에 포함되는 2-플라스미드 공동 형질 전환 시스템의 사용은 일반적인 3플라스미드(triple) 트랜스포메이션에 비해 몇 가지 실질적인 장점이있으며,23개의플라미드 생산 법, 비용 절감(triple) 트랜스포메이션 에 비해 몇 가지 실질적인 장점이 있다. . 유전자 발현 카세트(pTransgene)를 함유하는 AAV 게놈 플라스미드는 ItR에 의해 측면에 있어야 하며 길이가 ~4.7kb를 초과해서는 안 됩니다. 벡터 티터 및 순도는 형질 전환 시 잠재적인 세포독성 효과로 인해 트랜스진에 의해 영향을 받을 수 있다. 벡터 순도의 평가는 본원에 기재된다. 이 방법을 사용하여 생성된 벡터는 각각 1x10 13 vg/mL을 산출하며, 마우스, 햄스터 및 소 동물 모델에서 평가하였다.
표 1: 필요한 솔루션의 구성. 프로토콜 전체의 다양한 솔루션에 필요한 구성 요소의 백분율 및 볼륨을 포함한 필요한 정보입니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
이 논문에 기재된 재조합 AAV(rAAV) 벡터의 생산은 분자 생물학 연구 실험실 및 시설의 대부분에서 발견되는 일반적인 재료, 시약 및 장비를 사용합니다. 이 논문은 높은 품질의 시험관 내 및 생체 내 등급 rAAV를 독자에 의해 생성 할 수 있습니다. 무엇보다도, rAAV 생산을 위한 이 프로토콜은 세슘 염화 정제와 관련된 보다 지루한 프로토콜에 비해 효율적이며 초원심분리의 사용을 방지한…
The authors have nothing to disclose.
아미라 D. Rghei, 브레나 A. Y. 스티븐스, 실비아 P. 토마스, 제이콥 지 이 예이츠는 온타리오 수의대 학생 스티펜스와 온타리오 대학원 장학금을 받았다. 아미라 D. Rghei는 미탁스 가속 학생의 수혜자였다. 이 연구는 건강 연구를위한 캐나다 연구소 (CIHR) 프로젝트 보조금 (#66009)과 SKW에 공동 건강 연구 프로젝트 (NSERC 파트너) 보조금 (#433339)에 의해 투자되었다.
0.22 μm filter | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
0.25% Trypsin | Fisher Scientific | SM2001C | |
1-Butanol | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
10 chamber cellstack | Corning | 3271 | |
1L PETG bottle | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
30% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 1610158 | |
96-well skirted plate | FroggaBio | FS-96 | |
Adhesive plate seals | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
Blood and Tissue Clean up Kit | Qiagen | 69506 | Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol |
Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
Cell Culture Dishes | Greiner bio-one | 7000232 | 15 cm plates |
Culture Conical Tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 mL conical tube |
Culture Conical Tube | Fisher Scientific | 14955240 | 50 mL conical tube |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
Ethanol | Greenfield | P016EA95 | Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
HBSS with Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
HBSS without Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
HEK293 cells | American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots |
HEK293 host cell protein ELISA kit | Cygnus Technologies | F650S | Follow manufacturer’s instructions |
Heparin sulfate column | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
L-glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion | Corning | CLS431124 | Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions |
Large Volume Centrifuge Tubes | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL centrifuge tubes |
MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use |
Molecular Grade Water | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma Aldrich | L5125 | CAUTION. Wear gloves |
NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
Optimem, reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | Sterilize prior to use |
PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Dilute to 1x for use on cells |
Penicillin-Streptomycin Solution | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
pHelper plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | |
Pipet basin | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Purchase sterile pipet basins |
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | CAUTION. Wear gloves |
Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 24765-1 | Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C |
Polypropylene semi-skirted PCR Plate | FroggaBio | WS-96 | |
Polysorbate 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | CAUTION. Wear gloves |
polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Cytiva Life Sciences | 10600023 | Use forceps to manipulate. Wear gloves. |
Primary antibody | Progen | 65158 | |
Protein Ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
pTrangene plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0 |
Pump tubing | Cole-Parmer | RK-96440-14 | Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5 |
RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer | Promega | M6101 | Use at 10x concentration in protocol from section 4.0 |
RQ1 Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | |
Sample dilutent | Cygnus Technologies | I700 | Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit |
Secondary antibody, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
Skim milk powder | Oxoid | LP0033B | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
SV40 polyA primer probe | IDT | Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff |
Universal Nuclease for cell lysis | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
Universal qPCR master mix | NEB | M3003L | |
Whatman Paper | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
β-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 21985023 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals. |