Summary

Büyük Hayvan Modellerinde Preklinik Çalışmalar İçin Hücre Yığınlarında Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Üretimi

Published: June 30, 2021
doi:

Summary

Burada, hücre yığınlarında yetişen yapışan HEK 293 hücrelerini ve benzeşim kromatografisi saflaştırmayı kullanarak araştırma sınıfı AAV vektörlerinin büyük ölçekli üretimi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak >1 x 1013 vektör genomları /mL verir ve büyük hayvan çalışmaları için uygun vektör miktarları sağlar.

Abstract

Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörleri, insanlar için onaylanmış üç AAV gen tedavisi ile klinik olarak en gelişmiş gen tedavisi vektörleri arasındadır. AAV için yeni uygulamaların klinik ilerlemesi, fareler gibi küçük hayvan modellerinden köpekler, koyunlar ve insan olmayan primatlar da dahil olmak üzere daha büyük hayvan modellerine geçişi içerir. AAV’yi daha büyük hayvanlara uygulamanın sınırlamalarından biri, büyük miktarlarda yüksek titre virüsü gereksinimidir. Süspansiyon hücre kültürü AAV vektör üretimi için ölçeklenebilir bir yöntem olsa da, çok az araştırma laboratuvarı ekipmana (örneğin biyoreaktörler) sahiptir veya bu şekilde AAV’nin nasıl üretileceği hakkında bilir. Ayrıca, AAV titreleri süspansiyon HEK 293 hücrelerinde üretildiğinde, yapışan HEK293 hücrelerine kıyasla genellikle önemli ölçüde daha düşüktür. Burada açıklanan hücre yığınları kullanarak yüksek titre AAV büyük miktarlarda üretmek için bir yöntemdir. AAV’yi titretmeye yönelik ayrıntılı bir protokol ve vektör saflığını doğrulama yöntemleri de açıklanmıştır. Son olarak, bir koyun modelinde AAV aracılı transgene ekspresyonunun temsili sonuçları sunulmuştur. AAV vektörlerinin yapışan hücrelerde büyük ölçekli üretimi için optimize edilmiş bu protokol, moleküler biyoloji laboratuvarlarının yeni AAV tedavilerinin daha büyük hayvan modellerinde test edilmesini ilerletmesini sağlayacaktır.

Introduction

Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörlerini kullanan gen tedavisi son otuz yılda büyük adımlar attı1,2. Konjenital körlük, hemofili ve kas-iskelet sistemi ve merkezi sinir sistemi hastalıkları da dahil olmak üzere çeşitli genetik hastalıklarda ortaya konan gelişmeler, AAV gen tedavisini klinik araştırmalarda ön plana çıkarmıştır3,4. 2012 yılında, Avrupa İlaç Ajansı (EMA), LPL eksikliğinin tedavisi için lipoprotein lipazını (LPL) ifade eden bir AAV1 vektörü olan Glybera’yı onayladı ve avrupa veya Amerika BirleşikDevletleri’ndebir gen tedavisi tedavisi için ilk pazarlama izni 5 . O zamandan beri, iki ek AAV gen tedavisi, Luxturna6 ve Zolgensma7, FDA onayı aldı ve pazarın önümüzdeki 5 yıl içinde 20258’ekadar beklenen 10-20 gen tedavisi ile hızla genişlemesi bekleniyor. Mevcut klinik veriler, AAV gen tedavisinin güvenli, iyi tolere edilmiş ve etkili bir modalite olduğunu ve AAV’nin ClinicalTrials.gov kayıtlı 244’ün üzerinde klinik çalışma ile onu en umut verici viral vektörlerden biri haline getirdiğini göstermektedir. AAV vektörlerini içeren klinik uygulamalara artan ilgi, AAV tedavilerinin büyük hayvan modellerinde değerlendirilmesini kolaylaştırmak için sağlam ve ölçeklenebilir üretim yöntemleri gerektirir, çünkü bu çeviri boru hattında kritik bir adımdır9.

AAV vektör üretimi için iki temel gereklilik AAV genom ve kapsiddir. Vahşi tip (wt)-AAV’nin genomları, yaklaşık 4,7 kb uzunluğunda10olan tek iplikli DNA’dır. wt-AAV genom, ambalajlama için önemli olan genomun her iki ucunda bulunan ters terminal tekrarlarını (ITR’ler) ve rep ve cap genleriniiçerir 11. Genom replikasyonu, viral kapsid montajı ve genomun viral kapsid içine kapsüllenmesi için gerekli olan rep ve cap genleri viral genomdan çıkarılır ve AAV vektör üretimi için trans olarak sağlanır12. Bu genlerin viral genomdan çıkarılması, terapötik transgenlere ve promotör ve polyA sinyali de dahil olmak üzere gerekli tüm düzenleyici unsurlara yer sağlar. ITR’ler, uygun genom replikasyonu ve viral kapsülleme sağlamak için vektör genomunda kalır13,14. Transgene ekspresyonunun kinetiğini iyileştirmek için, AAV vektör genomları, AAV genom replikasyon sırasında tek iplikten çift iplikli DNA dönüşümüne dönüştürme ihtiyacını azaltan, ancak kodlama kapasitesini ~ 2.4 kb15‘e düşüren kendi kendini tamamlayıcı olacak şekilde geliştirilebilir.

AAV genom tasarımının ötesinde, kapsid serotip seçimi AAV vektörün doku ve hücre tropizmini belirler in vivo2. Doku trompisine ek olarak, farklı AAV serotiplerinin farklı gen ekspresyasyonu kinetiği gösterdiği gösterilmiştir16. Örneğin, Zincarelli ve ark.17 farklı AAV serotiplerini düşük ekspresyon serotipleri (AAV2, 3, 4, 5), ılımlı ifade serotipleri (AAV1, 6, 8) ve yüksek ekspresyon serotipleri (AAV7 ve 9) olarak sınıflandırdı. Ayrıca AAV serotiplerini yavaş başlangıçlı ifade (AAV2, 3, 4, 5) veya hızlı başlangıçlı ifade (AAV1, 6, 7, 8 ve 9) olarak kategorize ettiler. Bu farklı tromizmler ve gen ekspresyasyonu kinetikleri kapsid proteinlerindeki amino asit varyasyonlarından, kapsid protein oluşumlarından ve konak hücre reseptörleri/ ko-reseptörleri ile etkileşimlerden kaynaklanmaktadır18. Bazı AAV kapsidleri, intravasküler uygulama (AAV9) sonrasında kan-beyin bariyerini geçme veya dayanıklı transgene ekspresyasyonu için uzun ömürlü kas hücrelerinde yaşama (AAV6, 6.2FF, 8 ve 9)19,20gibi ek faydalı özelliklere sahiptir.

Bu makale, klinik öncesi büyük hayvan modellerinde kullanılmak üzere yüksek saflıkta, yüksek titreli, araştırma sınıfı AAV vektörleri üretmek için uygun maliyetli bir yöntemi detaylandırmayı amaçlamaktadır. Bu protokol kullanılarak AAV üretimi, hücre yığınlarında yetişen yapışan insan embriyonik böbreği (HEK)293 hücreye çift plazmid transfeksiyon kullanılarak elde edilir. Ayrıca, çalışma, AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 ve DJ21,22 dahil olmak üzere heparin bağlayıcı alanlar içeren AAV serotipleri için kullanılabilen heparin sülfat benzeşim kromatografisi saflaştırma için bir protokol açıklanmaktadır.

AAV vektörlerinin üretimi için bir dizi paketleme sistemi mevcuttur. Bunlar arasında, iki plazmid eş transfeksiyon sistemlerinin kullanımı, Rep ve Cap genlerinin ve Reklam yardımcısı genlerinin (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 ve VA RNA) bir plazmid (pHelper) içinde bulunduğu, plazmid üretimi için azaltılmış maliyet de dahil olmak üzere ortak üç plazmid (üçlü) transfeksiyon yöntemine göre bazı pratik avantajlara sahiptir23,24 . Transgene ifade kasetini (pTransgene) içeren AAV genom plazmidi, ITR’ler tarafından kuşatılmalı ve uzunluğu ~4,7 kb’ı geçmemelidir. Vektör titresi ve saflık transeksiyon sırasında potansiyel sitotoksik etkiler nedeniyle transgeneden etkilenebilir. Vektör saflığının değerlendirilmesi burada açıklanmıştır. Her biri için 1 x 1013 vg/mL veren bu yöntem kullanılarak üretilen vektörler fare, hamster ve yumurta hayvan modellerinde değerlendirildi.

Tablo 1: Gerekli çözümlerin bileşimi. Protokol boyunca çeşitli çözümler için gereken bileşenlerin yüzdeleri ve hacimleri de dahil olmak üzere gerekli bilgiler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Protocol

1. Hücre yığınlarındaki HEK293 hücrelerinin çift plazmid transfeksiyon 37 °C’de ayarlanmış bir boncuk banyosunda hek293 hücrelerinin kriyo şişelerini çözün.NOT: Soğuk sıcaklığın kaplama sırasında hücreleri şoklamamasını sağlamak için hücreler çözülürken, önceden ısınan komple DMEM ila 37 °C. Optimum büyüme ve transeksiyon verimliliği sağlamak için hücrelerin ideal olarak 20’den az düşük geçiş sayısına sahip olduğundan emin olun. Hücrelerin mikoplazma içe…

Representative Results

Küçük kemirgen modellerinden daha büyük hayvan modellerine ve nihai klinik uygulamaya çeviri, daha büyük hayvanları transdüze etmek ve terapötik etkiler elde etmek için gereken büyük miktarda AAV nedeniyle önemli bir zorluk ortaya sömektedir. Rasyonel olarak tasarlanmış AAV6.2FF kapsidinin transdüksiyon verimliliğini karşılaştırmak için, daha önce AAV63’ekıyasla murine kas hücrelerinde transdüksiyon verimliliğinde 101 kat artış gösterdi, fareler, hamsterlar ve kuzu…

Discussion

Bu makalede açıklanan rekombinant AAV (rAAV) vektörlerinin üretimi, moleküler biyoloji araştırma laboratuvarlarının ve tesislerinin çoğunda bulunan ortak malzemeler, reaktifler ve ekipmanlar kullanmaktadır. Bu makale, okuyucu tarafından yüksek kaliteli in vitro ve in vivo sınıf rAAV üretilmesini sağlar. Her şeyden önce, rAAV üretimi için bu protokol, sezyum klorür saflaştırmayı içeren daha sıkıcı protokollere kıyasla verimlidir ve ultrasantrifüj kullanımını önler. HEK…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas ve Jacob G. E. Yates, Ontario Veteriner Koleji Öğrenci Burslarının yanı sıra Ontario Lisansüstü Bursları’nın da sahibiydi. Amira D. Rghei, Mitacs Accelerate Studentship’in alıcısıydı. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) Proje Hibesi (#66009) ve SKW’ye İşbirlikçi Sağlık Araştırma Projeleri (NSERC ortaklı) hibesi (#433339) tarafından finanse edildi.

Materials

0.22 μm filter Millipore Sigma S2GPU05RE
0.25% Trypsin Fisher Scientific SM2001C
1-Butanol Thermo Fisher Scientific A399-4 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
10 chamber cellstack Corning 3271
1L PETG bottle Thermo Fisher Scientific 2019-1000
30% Acrylamide/Bis Solution Bio-Rad 1610158
96-well skirted plate FroggaBio FS-96
Adhesive plate seals Thermo Fisher Scientific 08-408-240
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Blood and Tissue Clean up Kit Qiagen 69506 Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol
Bromophenol blue Fisher Scientific B392-5 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Cell Culture Dishes Greiner bio-one 7000232 15 cm plates
Culture Conical Tube Thermo Fisher Scientific 339650 15 mL conical tube
Culture Conical Tube Fisher Scientific 14955240 50 mL conical tube
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine Cytiva Life Sciences SH30022.01
ECL Western Blotting Substrate Thermo Fisher Scientific 32209
Ethanol Greenfield P016EA95 Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30396.03
Glacial acetic acid Fisher Scientific A38-500 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Glycine Fisher Scientific BP381-500
HBSS with Mg2+ and Ca2+ Thermo Fisher Scientific SH302268.02
HBSS without Mg2+ and Ca2+ Thermo Fisher Scientific SH30588.02
HEK293 cells American Tissue Culture Collection CRL-1573 Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots
HEK293 host cell protein ELISA kit Cygnus Technologies F650S Follow manufacturer’s instructions
Heparin sulfate column Cytiva Life Sciences 17040703
Kimwipe Thermo Fisher Scientific KC34120
 L-glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific SH30034.02
Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion Corning CLS431124 Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions
Large Volume Centrifuge Tubes Corning CLS431123-6EA 500 mL centrifuge tubes
MgCl Thermo Fisher Scientific 7791-18-6
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-129 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use
Molecular Grade Water Cytiva Life Sciences SH30538.03
N-Lauroylsarcosine sodium salt Sigma Aldrich L5125 CAUTION. Wear gloves
NaCl Thermo Fisher Scientific BP35810
Optimem, reduced serum medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D Sterilize prior to use
PBS (10x) Thermo Fisher Scientific 70011044 Dilute to 1x for use on cells
Penicillin-Streptomycin Solution Cytiva Life Sciences SV30010
pHelper plasmid De novo design or obtained from plasmid repository NA
Pipet basin Thermo Fisher Scientific 13-681-502 Purchase sterile pipet basins
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) Thermo Fisher Scientific 9002-93-1 CAUTION. Wear gloves
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 24765-1 Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C
Polypropylene semi-skirted PCR Plate FroggaBio WS-96
Polysorbate 20 (Tween 20) Thermo Fisher Scientific BP337-100 CAUTION. Wear gloves
polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Cytiva Life Sciences 10600023 Use forceps to manipulate. Wear gloves.
Primary antibody Progen 65158
Protein Ladder FroggaBio PM008-0500
Proteinase K Thermo Fisher Scientific AM2546
pTrangene plasmid De novo design or obtained from plasmid repository NA Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0
Pump tubing Cole-Parmer RK-96440-14 Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5
RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer Promega M6101 Use at 10x concentration in protocol from section 4.0
RQ1 Rnase-free Dnase Promega M6101
Sample dilutent Cygnus Technologies I700 Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit
Secondary antibody, HRP Thermo Fisher Scientific G-21040
Skim milk powder Oxoid LP0033B
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific 28312 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Sodium hydroxide (NaOH) Thermo Fisher Scientific SS266-4
SV40 polyA primer probe IDT Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Thermo Fisher Scientific 15524010 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Trypan blue Bio-Rad 1450021
Ultra-Filter Millipore Sigma UFC810024 Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff
Universal Nuclease for cell lysis Thermo Fisher Scientific 88702
Universal qPCR master mix NEB M3003L
Whatman Paper Millipore Sigma WHA1001325
β-mercaptoethanol Fisher Scientific 21985023 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals.

References

  1. Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
  2. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  3. Nathwani, A. C., et al. Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).
  4. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  5. Ylä-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).
  6. FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss (2020)
  7. FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease (2020)
  8. Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics (2020)
  9. Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).
  10. Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).
  11. Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA. Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).
  12. Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).
  13. Ling, C. Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo. Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).
  14. Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).
  15. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  16. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).
  17. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  18. Pillay, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor. Journal of Virology. 91 (18), (2017).
  19. Merkel, S. F. Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells. Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).
  20. van Lieshout, L. P., et al. A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).
  21. Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).
  22. Liu, J., Moon, Y. -. A. Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression. Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).
  23. Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).
  24. Kimura, T., et al. Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).
  25. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  26. . Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology Available from: https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication (1996)
  27. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  28. Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity. Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).
  29. Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
  30. Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
  31. Backovic, A., et al. Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).

Play Video

Cite This Article
Rghei, A. D., Stevens, B. A. Y., Thomas, S. P., Yates, J. G. E., McLeod, B. M., Karimi, K., Susta, L., Bridle, B. W., Wootton, S. K. Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models. J. Vis. Exp. (172), e62727, doi:10.3791/62727 (2021).

View Video