Summary
Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production à grande échelle de vecteurs AAV de qualité recherche en utilisant des cellules HEK 293 adhérentes cultivées dans des piles de cellules et la purification par chromatographie d’affinité. Ce protocole donne systématiquement >1 x 1013 génomes vectoriels/mL, fournissant des quantités vectorielles appropriées pour les études sur les grands animaux.
Abstract
Les vecteurs du virus adéno-associé (AAV) sont parmi les vecteurs de thérapie génique les plus avancés sur le plan clinique, avec trois thérapies géniques AAV approuvées pour les humains. L’avancement clinique de nouvelles applications pour l’AAV implique la transition de modèles de petits animaux, tels que des souris, à des modèles animaux plus grands, y compris des chiens, des moutons et des primates non humains. L’une des limites de l’administration d’AAV à des animaux plus gros est la nécessité de grandes quantités de virus à titre élevé. Bien que la culture cellulaire en suspension soit une méthode évolutive pour la production de vecteurs AAV, peu de laboratoires de recherche ont l’équipement (par exemple, les bioréacteurs) ou savent comment produire de l’AAV de cette manière. De plus, les titres AAV sont souvent significativement plus faibles lorsqu’ils sont produits dans des cellules HEK 293 en suspension par rapport aux cellules HEK293 adhérentes. Décrit ici est une méthode pour produire de grandes quantités d’AAV à titre élevé à l’aide de piles de cellules. Un protocole détaillé pour le titrage de l’AAV ainsi que des méthodes de validation de la pureté des vecteurs sont également décrits. Enfin, les résultats représentatifs de l’expression du transgène médiée par l’AAV dans un modèle ovin sont présentés. Ce protocole optimisé pour la production à grande échelle de vecteurs AAV dans les cellules adhérentes permettra aux laboratoires de biologie moléculaire de faire progresser les tests de leurs nouvelles thérapies AAV dans des modèles animaux plus grands.
Introduction
La thérapie génique utilisant des vecteurs de virus adéno-associés (AAV) a fait d’énormes progrès au cours des trois dernières décennies1,2. Les améliorations démontrées dans un large éventail de maladies génétiques, y compris la cécité congénitale, l’hémophilie et les maladies du système musculo-squelettique et du système nerveux central, ont amené la thérapie génique AAV à l’avant-garde de la recherche clinique3,4. En 2012, l’Agence européenne des médicaments (EMA) a approuvé Glybera, un vecteur AAV1 exprimant la lipoprotéine lipase (LPL) pour le traitement du déficit en LL, ce qui en fait la première autorisation de mise sur le marché pour un traitement de thérapie génique en Europe ou aux États-Unis5. Depuis lors, deux autres thérapies géniques AAV, Luxturna6 et Zolgensma7,ont reçu l’approbation de la FDA, et le marché devrait se développer rapidement au cours des 5 prochaines années avec jusqu’à 10-20 thérapies géniques attendues d’ici 20258. Les données cliniques disponibles indiquent que la thérapie génique AAV est une modalité sûre, bien tolérée et efficace, ce qui en fait l’un des vecteurs viraux les plus prometteurs, avec plus de 244 essais cliniques impliquant AAV enregistrés auprès de ClinicalTrials.gov. L’intérêt croissant pour les applications cliniques impliquant des vecteurs AAV nécessite des méthodes de production robustes et évolutives pour faciliter l’évaluation des thérapies AAV dans de grands modèles animaux, car il s’agit d’une étape critique dans le pipeline translationnel9.
Pour la production de vecteurs AAV, les deux principales exigences sont le génome AAV et la capside. Le génome de l’AAV de type sauvage (wt)-AAV est de l’ADN simple brin d’environ 4,7 kb de longueur10. Le génome wt-AAV comprend des répétitions terminales inversées (ITR) trouvées aux deux extrémités du génome, qui sont importantes pour l’emballage, et les gènes rep et cap 11. Les gènes rep et cap, nécessaires à la réplication du génome, à l’assemblage de la capside virale et à l’encapsulation du génome dans la capside virale, sont retirés du génome viral et fournis en trans pour la production de vecteurs AAV12. Le retrait de ces gènes du génome viral laisse place à des transgènes thérapeutiques et à tous les éléments régulateurs nécessaires, y compris le promoteur et le signal polyA. Les RTI restent dans le génome du vecteur pour assurer une réplication correcte du génome et une encapsulation virale13,14. Pour améliorer la cinétique de l’expression transgénique, les génomes des vecteurs AAV peuvent être conçus pour être auto-complémentaires, ce qui atténue le besoin de conversion de la conversion de l’ADN simple brin en double brin pendant la réplication du génome AAV, mais réduit la capacité de codage à ~ 2,4 kb15.
Au-delà de la conception du génome AAV, la sélection du sérotype de capside détermine le tropisme tissulaire et cellulaire du vecteur AAV in vivo2. En plus du tropisme tissulaire, il a été démontré que différents sérotypes AAV présentent une cinétique d’expression génique différente16. Par exemple, Zincarelli et coll.17 ont classé différents sérotypes AAV en sérotypes à faible expression (AAV2, 3, 4, 5), sérotypes à expression modérée (AAV1, 6, 8) et sérotypes à expression élevée (AAV7 et 9). Ils ont également classé les sérotypes AAV en expression lente (AAV2, 3, 4, 5) ou expression à apparition rapide (AAV1, 6, 7, 8 et 9). Ces tropismes divergents et la cinétique d’expression des gènes sont dus aux variations des acides aminés dans les protéines de la capside, aux formations de protéines de la capside et aux interactions avec les récepteurs/corécepteurs de la cellule hôte18. Certaines capsides AAV ont des caractéristiques bénéfiques supplémentaires telles que la capacité de traverser la barrière hémato-encéphalique après administration intravasculaire (AAV9) ou résident dans des cellules musculaires à longue durée de vie pour une expression transgénique durable (AAV6, 6.2FF, 8 et9) 19,20.
Cet article vise à détailler une méthode rentable pour produire des vecteurs AAV de haute pureté, à haut titre et de qualité recherche pour une utilisation dans des modèles précliniques de grands animaux. La production d’AAV à l’aide de ce protocole est réalisée par transfection à double plasmide dans des cellules adhérentes du rein embryonnaire humain (HEK)293 cultivées dans des piles cellulaires. En outre, l’étude décrit un protocole pour la purification par chromatographie d’affinité du sulfate d’héparine, qui peut être utilisé pour les sérotypes AAV qui contiennent des domaines de liaison à l’héparine, y compris AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 et DJ21,22.
Un certain nombre de systèmes d’emballage sont disponibles pour la production de vecteurs AAV. Parmi ceux-ci, l’utilisation d’un système de co-transfection à deux plasmides, dans lequel les gènes Rep et Cap et les gènes auxiliaires Ad (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 et ARN VA) sont contenus dans un plasmide (pHelper), présente certains avantages pratiques par rapport à la méthode de transfection commune à trois plasmides (triple), y compris un coût réduit pour la production de plasmides23,24 . Le plasmide du génome AAV contenant la cassette d’expression du transgène (pTransgene) doit être flanqué de RTI et ne doit pas dépasser ~4,7 kb de longueur. Le titre et la pureté des vecteurs peuvent être affectés par le transgène en raison des effets cytotoxiques potentiels pendant la transfection. L’évaluation de la pureté du vecteur est décrite ici. Les vecteurs produits à l’aide de cette méthode, qui donnent un 1 x10 13 vg/mL pour chacun, ont été évalués chez des souris, des hamsters et des modèles animaux ovins.
Tableau 1 : Composition des solutions requises. Informations nécessaires, y compris les pourcentages et les volumes, des composants nécessaires pour diverses solutions tout au long du protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Protocol
1. Double transfection plasmidique des cellules HEK293 dans des piles cellulaires
- Décongeler un cryo-flacon de cellules HEK293 dans un bain de billes fixé à 37 °C.
REMARQUE: Préchauffez le DMEM complet à 37 ° C pendant que les cellules décongèlent pour s’assurer que la température froide ne choque pas les cellules lors du placage. Assurez-vous que les cellules ont un faible nombre de passage, idéalement inférieur à 20, pour assurer une croissance et une efficacité de transfection optimales. Assurez-vous que les cellules sont certifiées exemptes de mycoplasmes. - Transférer le contenu du cryo-flacon goutte à goutte dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de DMEM complet préchauffé et centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min.
- Aspirer le milieu, puis remettre en suspension les cellules HEK293 dans 20 mL de DMEM complet préchauffé. Ensemencez les cellules dans une plaque de 15 cm et incubez à 37 °C, avec 5% de CO2.
- Divisez les cellules d’une plaque de 15 cm en trois pour les ensemencer dans la chambre de culture cellulaire.
- Une fois que les cellules sont confluentes à 80%, aspirez le milieu et lavez doucement la plaque avec 3 mL de PBS pour ne pas perturber la monocouche. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez 3 mL de trypsine.
- Incuber pendant 2 min à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se soulèvent de la plaque, puis neutraliser la trypsine en ajoutant 7 mL de DMEM complet à la plaque.
- Recueillir tous les milieux et cellules dans un tube de 15 mL et granuler les cellules en les centrifugant à 500 x g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant du tube de 15 mL et remettre en suspension la pastille de cellule dans 3 mL de DMEM complet. Ajouter 1 mL à chaque plaque de 15 cm contenant 20 mL de DMEM complet; bercer doucement les plaques pour répartir uniformément les cellules, et incuber à 37 °C, avec 5% de CO2.
- Une fois que les cellules sont confluentes à 80 %, répétez les étapes 1.4.1 et 1.4.2. Recueillir le surnageant dans des tubes coniques de 50 mL et inverser doucement le tube pour s’assurer que les cellules sont homogènes.
- Déterminer la densité cellulaire en mélangeant 10 μL d’échantillons de cellules avec 10 μL de bleu de trypan et en ajoutant le mélange à une lame de comptage de cellules pour analyse dans le compteur de cellules.
- Mélanger 1 L de DMEM complet préchauffé avec la suspension cellulaire nécessaire pour ensemencer la chambre de culture cellulaire (surface de 6360 cm2)avec 1 x 104 cellules/cm2. Versez le mélange cellulaire dans la chambre de culture cellulaire et faites pivoter doucement pour répartir uniformément les cellules sur chaque monocouche(Figure 1)et incuber à 37 °C, avec 5 % de CO2.
- En plus de la chambre de culture cellulaire, plaquez une plaque de 15 cm avec 1 x 104 cellules/cm2 comme référence pour la confluence.
- Après ~65-h d’incubation, vérifiez la confluence sur la plaque de référence - idéalement ~ 80% -90% confluent.
REMARQUE: Préchauffez le DMEM complet pour l’ajouter à la chambre de culture cellulaire à 37 ° C.
Figure 1: Manœuvre de la pile cellulaire pour l’ensemencement et la transfection des cellules. Pour l’empilement de cellules d’ensemencement, commencez par retirer l’un des bouchons d’aération et versez 1 L de DMEM complet préchauffé avec la quantité nécessaire de cellules HEK293 (A). Répartissez uniformément les cellules et les supports en resserrant les deux bouchons d’évent et amenez tous les supports au coin de la pile de cellules avec l’un des capuchons d’évent et placez-le dans ce coin (B), placez la pile de cellules sur le côté (C), puis tournez la pile de cellules à 90 ° (D) afin que les ports d’évent soient vers le haut (E). Abaissez doucement la pile de cellules à sa position horizontale normale et assurez-vous que toutes les chambres de la pile de cellules sont complètement recouvertes de support (F). Lors de la transfectation, dévissez les deux bouchons d’évent et versez lentement les vieux milieux dans un conteneur à déchets stérile pour un écoulement uniforme afin de ne pas perturber la monocouche des cellules (G). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Préparer un mélange de polyéthylèneimine (PEI)/ADN à un rapport de concentration de 3:1 (p/p).
- Préparez le mélange d’ADN dans un tube conique de 50 mL en ajoutant 475 μg de pTrangene et 1425 μg de pHelper à 40 mL de milieu à sérum réduit pour créer un rapport 3:1 de pHelper:pTrangene.
REMARQUE : Le calculateur de mélange PEI/ADN se trouve au tableau 2. - Ajouter 5,7 mL d’Î.-P.-É. (1 g/L) au milieu sérique réduit et au mélange d’ADN goutte à goutte. Ensuite, vortexz brièvement et incubez pendant 10 min à température ambiante.
REMARQUE: Lorsque PEI / ADN incube à température ambiante, il deviendra légèrement trouble.
- Préparez le mélange d’ADN dans un tube conique de 50 mL en ajoutant 475 μg de pTrangene et 1425 μg de pHelper à 40 mL de milieu à sérum réduit pour créer un rapport 3:1 de pHelper:pTrangene.
- Après 8 min d’incubation de l’Î.-P.-É./ADN, retirez le milieu de la chambre de culture cellulaire.
REMARQUE: Assurez-vous de desserrer les deux capuchons orange pour maintenir un flux fluide de milieu afin d’éviter le délogement des cellules. - Ajouter PEI/ADN à 1 L de DMEM complet préchauffé et verser lentement le mélange dans le port de la chambre de culture cellulaire. Répartir uniformément le liquide sur toutes les rangées(Figure 1)et incuber pendant 72 h à 37 °C, avec 5 % de CO2.
2 Récolte de l’AAV et lyse chimique des cellules HEK293 transfectées
- Agiter vigoureusement la chambre de culture cellulaire pour déloger les cellules jusqu’à ce que le milieu semble trouble des cellules délogées et verser dans quatre tubes centrifuges de 500 mL.
- Centrifugez les tubes à 18 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour granuler les cellules. Versez le surnageant clarifié dans un flacon de copolyester de polyéthylène téréphtalate (PETG) de 1 L.
REMARQUE: Si l’on n’a pas accès à une centrifugeuse à grande vitesse, centrifuger à 12 000 x g pendant 40 min. Les cellules granulées peuvent ne pas être solides à cette vitesse et glisseront comme déversant un surnageant. - Remettre en suspension les pastilles de cellule dans des tubes centrifuges de 500 mL avec 50 mL de tampon de lyse et incuber pendant 60 min à 37 °C.
- Centrifugez les tubes à 18 000 x g pendant 30 min, puis transférez le surnageant dans la même bouteille PETG de 1 L. Jetez les débris cellulaires granulés.
REMARQUE: Purifier immédiatement le surnageant clarifié et conserver à 4 °C jusqu’à 72 h. Pour un stockage à plus long terme, conserver à -80 °C. Ne pas conserver à -20 °C.
3 Purification vectorielle AAV par chromatographie d’affinité de l’héparine
- Retirer le lysat brut de -80 °C et laisser à 4 °C pendant la nuit pour décongeler. Une fois décongelé, utilisez un filtre de 0,22 μM pour filtrer le lysat brut.
- Pour passiver le concentrateur centrifuge, ajouter 4 mL de tampon de prétraitement du filtre à un concentrateur centrifuge pour chaque colonne d’héparine sépharose utilisée. Passivate le concentrateur centrifuge à température ambiante pendant 2-8 h. Mettez en place la passivation immédiatement avant les étapes de purification.
- Installez le tube et la pompe (Figure 2).
- Placez le tube dans une pompe péristaltique et faites fonctionner 20 mL de 1 M NaOH. Ensuite, faites couler 50 mL d’eau de qualité moléculaire, puis exécutez 50 mL de DMEM basal.
- Fixez une colonne d’héparine sépharose de 5 mL au tube et faites couler 25 mL de DMEM basal pour éliminer l’agent de conservation.
- Faire passer 0,2 μM de lysat brut filtré à travers la colonne à un débit de 1 à 2 gouttes/s.
Figure 2: Mise en place d’une pompe péristaltique pour la purification de l’AAV. Faites passer le tube du lysat brut à travers la pompe péristaltique et dans la colonne de la matrice d’héparine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
REMARQUE: Assurez-vous de ne pas introduire de bulles ou de laisser la colonne sécher, car cela compromettrait la colonne et empêcherait l’élution de l’AAV. Jetez la colonne si elle est sèche et utilisez une nouvelle colonne pour le reste du lysat brut.
- Chargez tout le lysat brut sur la colonne d’héparine et utilisez les solutions suivantes pour laver la colonne.
- Laver à l’aide de 50 mL de 1x Hank’s Balanced Salt Solutions (HBSS) sans Mg2+ et Ca2+.
- Laver à l’aide de 15 mL de 0,5 % de N-Lauroylsarcosine dans HBSS sans Mg2+ et Ca2+.
- Laver à l’aide de 50 mL de HBSS sans Mg2+ et Ca2+.
- Laver à l’aide de 50 mL de HBSS avec Mg2+ et Ca2+
- Laver à l’aide de 50 mL de 200 mM de NaCl/HBSS avec Mg2+ et Ca2+.
- Éluez 5 x 5 mL (25 mL au total) avec 300 mM de NaCl/HBSS avec Mg2+ et Ca2+ et étiquetez les élutions comme E1-E5 (chaque élution est de 5 mL).
- Concentration du virus à l’aide d’un concentrateur centrifuge
- Faire tourner le concentrateur centrifuge contenant le tampon de prétraitement à 900 x g pendant 2 min. Jetez le flux.
- Laver le filtre du concentrateur centrifuge avec 4 mL de HBSS avec Mg2+ et Ca2+ et centrifuger à 1000 x g pendant 2 min; jeter le flux traversant.
- Ajouter l’élution E2 au concentrateur centrifuge. Tourner à 1000 x g pendant 5 min et jeter le flux.
- Terminez l’ajout de E2, puis ajoutez E3 au concentrateur centrifuge et faites tourner à 1000 x g pendant 5 min jusqu’à ce que le virus concentré soit d’environ 1 mL.
REMARQUE: Évitez de centrifuger le vecteur de manière à ce que le volume soit inférieur au niveau du filtre. Ne concentrez pas E1, E4 ou E5 dans le concentrateur centrifuge, car ils contiennent très peu ou pas de vecteur et contiennent des contaminants. - Retirez le virus concentré du concentrateur centrifuge à l’aide d’une pointe filtrée p200 et placez-le dans un tube de centrifugeuse stérile de 1,5 mL.
- Rincez le concentrateur centrifuge avec 200 μL de HBSS avec Mg2+ et Ca2+ pour déloger tout AAV restant du filtre. Pipettez vigoureusement de haut en bas plusieurs fois (pendant environ 30 s) pour déloger tout virus adhérant à la membrane et placez-le dans le tube centrifuge de 1,5 mL avec le reste du virus. Mélangez bien le tube.
- Aliquote 5 μL pour les extractions d’ADN et stocker le vecteur purifié à -80 °C.
- Laver la colonne à l’aide de 25 mL de 2 M de NaCl. De plus, utilisez 25 mL de Triton X-100 à 0,1 %, préchauffé à 37 °C pour laver la colonne. Ensuite, lavez la colonne à l’aide de 50 mL de dH2O stérile, puis lavez à l’aide de 25 mL d’éthanol à 20 %.
- Assurez-vous que la membrane de la colonne est complètement saturée en éthanol à 20%, car il s’agit de la solution de stockage. Scellez la colonne avec des bouchons fournis et conservez-la à 4 °C.
- Conservez le tube dans 1 M NaOH.
REMARQUE: Si elles sont nettoyées correctement, les colonnes d’héparine sépharose peuvent être réutilisées jusqu’à cinq fois.
4 Extraction d’ADN génomique AAV
- Préparer le mélange réactionnel mentionné dans le tableau 3 dans un tube PCR pour le traitement par DNase.
| Composant | Volume |
| Vecteur AAV purifié | 5 μL |
| 10x Tampon DNase | 2 μL |
| DNase | 1 μL |
| ddH2O | 12 μL |
| Final Volume | 20 μL |
Tableau 3 : Formule du mélange maître du traitement À la DNase. Composants et volumes recommandés requis pour le traitement par DNase des vecteurs viraux AAV lors de l’extraction de l’ADN.
- Vortex le tube PCR pour mélanger et pulser le tube PCR pour faire tourner le contenu.
- À l’aide d’un thermocycleur, incuber à 37 °C pendant 20 min suivi de 75 °C pendant 15 min pour inactiver la DNase à la chaleur.
- Ajouter 5 μL de protéinase K.
- À l’aide d’un thermocycleur, incuber à 50 °C pendant 60 min, puis à 95 °C pendant 30 min pour inactiver à chaud la protéinase K.
- Utilisez un kit de nettoyage de l’ADN pour éliminer les contaminants potentiels.
REMARQUE: Cette étape a été effectuée à l’aide d’un kit de nettoyage du sang et des tissus disponible dans le commerce (Table des matériaux).- Ajouter 200 μL de tampon AL (kit de nettoyage du sang et des tissus, table des matériaux)au tube PCR contenant le vecteur traité DNase/Protéinase K.
- Vortex le tube PCR et incubation à 56 °C pendant 10 min dans un thermocycleur.
- Pipettez le liquide du tube PCR dans une colonne de spin stérile située dans un tube de collecte.
- Ajouter 200 μL d’éthanol à 100 % à la colonne et bien mélanger par vortex.
- Centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min et jeter le flux à travers.
- Ajouter 500 μL de tampon AW1 (Kit de nettoyage du sang et des tissus, Table des matériaux)à la colonne de rotation.
- Centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min et jeter le flux à travers.
- Ajouter 500 μL de tampon AW2 (kit de nettoyage du sang et des tissus, table des matériaux)à la colonne de rotation.
- Centrifuger à 15 000 x g pendant 3 min et jeter le flux à travers.
- Placez la colonne de spin dans un tube de centrifugeuse stérile de 1,5 mL et ajoutez 200 μL de tampon AE (kit de nettoyage du sang et des tissus, table des matériaux)directement à la membrane de la colonne de spin.
- Incuber à température ambiante pendant 1 min.
- Centrifuger à 6 000 x gpendant 1 min pour éluer l’ADN.
- Conservez l’ADN à -20 °C.
5 Titrage des génomes des vecteurs AAV à l’aide d’une réaction en chaîne quantitative par polymérase et d’une sonde Simian Virus 40 (SV40)
REMARQUE: Effectuez tous les travaux de qPCR dans une hotte PCR à l’aide d’embouts de pipette filtrés pour éviter la contamination externe de l’ADN. Si le génome AAV ne code pas une séquence SV40 polyA, utiliser une sonde contre l’ITR décrit ailleurs25. Assurez-vous que l’ADN plasmidique sélectionné comme standard contient une séquence de polyA SV40.
- Préparation standard du stock
- Diluer l’étalon d’ADN plasmidique stock (plasmide pTransgene contenant la séquence SV40 polyA) à une concentration finale de 10 μg/μL et conserver à -20 °C dans des aliquotes de 6 μL.
- Déterminez le nombre de copies présentes dans la norme d’ADN plasmidique à l’aide de la calculatrice en ligne suivante26.
REMARQUE: Utilisez un ADN plasmidique utilisé pour la norme produite par un fournisseur commercial pour assurer la qualité et la concentration correcte. Préparer une grande quantité de norme (p. ex., 10 ml) pour mener des études de transition lors de la transition vers une norme nouvellement préparée.
- Préparer le mélange de réactifs suivant mentionné dans le tableau 4 pour les échantillons et l’étalon dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.
REMARQUE: Préparez un excès suffisant du mélange principal. Voir le tableau 5 pour les séquences amorce/sonde.
| Composant | Volume |
| Mixage maître universel qPCR (2X) | 10 μL |
| Eau de qualité moléculaire | 4,5 μL |
| 40x SV40 polyA apprêt/sonde | 0,5 μL |
| Final Volume | 15 μL |
Tableau 4 : Mélange maître qPCR pour le titrage AAV. Composants et volumes recommandés requis pour la qPCR de l’ADN extrait des vecteurs viraux AAV.
| Composant | Séquence |
| Amorce avant | 5'-AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA-3' |
| Amorce inversée | 5'-CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT-3' |
| Sonde | /56-FAM/AGCATTTTT/Zen/TTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC/3IABkFQ |
Tableau 5 : Séquences d’amorce par rapport à la séquence d’ADN polyA SV40. Séquences des amorces et de la sonde utilisées pour le titrage qPCR, qui se lient à des zones spécifiques de vecteurs viraux AAV contenant la séquence SV40 polyA.
- Pipette le mélange principal de haut en bas pour mélanger.
- Installez la plaque de dilution.
- Utilisez une plaque transparente de 96 puits pour préparer les dilutions étalons et d’échantillons, ajoutez 45 μL d’eau de qualité moléculaire à chaque puits dans une colonne sur deux en commençant par la colonne 1 (colonnes 1, 3, 5, 7, 9 et 11).
- Ajouter 5 μL de l’étalon au puits A1 et pipette pour mélanger.
- Utilisez une nouvelle pointe de pipette filtrée pour créer une dilution de 1/10 du puits A1 à B1.
- Continuez une série de dilutions 10 fois le long de la colonne jusqu’à ce qu’elles atteignent G1.
- N’ajoutez pas à H1, car cela agira comme un contrôle négatif.
- Appliquer le premier échantillon (S1) en l’ajoutant au puits A3, formant une dilution de 1/10. Pipette ce mélange et transfert de 5 μL au puits B3. Jetez l’embout de la pipette après ce transfert.
- Avec une nouvelle pointe de pipette, mélanger la solution dans le puits B3 et former une dilution de 1/100. Transférer 5 μL de ce mélange dans le puits C3 et jeter la pointe après le transfert.
- Avec une nouvelle pointe de pipette, pipettez de haut en bas la solution dans le puits C3 pour obtenir une dilution de 1/1000. Jetez la pointe.
- Continuez à diluer les échantillons sans ajouter d’échantillons aux colonnes 2, 4, 6, 8, 10 ou 12.
- Une fois tous les échantillons dilués, mélanger le contenu dans les puits de la colonne 1, puis transférer 20 μL dans la colonne 2.
- Répétez cette opération pour les colonnes 3, 5, 7, 9 et 11 afin de créer des répétitions de chaque dilution d’étalon et d’échantillon. Reportez-vous à la figure 3 pour la disposition des plaques.
REMARQUE: Après la mise en place de la plaque à la figure 3,les échantillons dilués dans les rangées G et H n’auront que 1/10 et 1/100 dilutions.
Figure 3: Disposition des plaques pour le titrage qPCR AAV. Le bleu indique l’emplacement de la dilution en série de l’étalon; le vert indique l’emplacement du témoin négatif; le violet indique l’emplacement de la dilution des échantillons. Chaque standard, négatif ou échantillon est ajouté en réplique. Un exemple de concentration de l’étalon a été ajouté pour montrer la série de dilution de l’étalon, et le placement des dilutions d’échantillon a été ajouté à leurs puits respectifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Titrage par qPCR basée sur la détection SV40 polyA
- Ajouter 15 μL de mélange maître qPCR à chaque puits d’une plaque qPCR à 96 puits à semi-jupe blanche.
- Transférer 5 μL de chaque échantillon de la plaque transparente de 96 puits vers la plaque qPCR à 96 puits à semi-jupe blanche.
- Utilisez une pipette multicanal pour assurer un mélange adéquat du mélange maître qPCR et de l’échantillon.
- Scellez la plaque avec un film d’étanchéité et centrifugez la plaque qPCR à 1500 x g pendant 30 s.
- Exécutez la réaction qPCR sur un instrument d’amplification et de détection PCR en temps réel sur plaque, en utilisant les conditions suggérées dans le tableau 6.
| Section | Cycles | Heure | Température | Description |
| Pré-incubation | 1x | 5 min | 95 °C | Dénaturation de l’ADN. |
| Amplification | 38x | 15 s | 95 °C | Amplification de l’ADN. Les paramètres peuvent être modifiés si vous utilisez d’autres apprêts avec des températures de recuit différentes. |
| 60 s | 60 °C | |||
| Refroidissement | 1x | 60 s | 40 °C | Refroidissement des plaques. Fin de la course. |
Tableau 6 : Protocole de thermocycleur pour le titrage qPCR à base de sonde d’hydrolyse. Protocole de thermocycleur recommandé pour l’utilisation du titrage qPCR à base de sonde des vecteurs AAV purifiés extraits par ADN.
REMARQUE : Pour la feuille de calcul du titrage qPCR AAV, voir le tableau 7.
- Analyse des données pour déterminer le nombre de copies du génome AAV.
- Remplissez les cellules de données de la feuille de calcul (tableau 7A) avec les valeurs de concentration obtenues à partir de l’exécution de la qPCR pour les dilutions standard et d’échantillon.
- Utiliser les valeurs de concentration du tableau 7A pour produire une courbe standard (tableau 7B).
REMARQUE: La courbe standard sera représentée sous la forme d’un logarithme naturel (y = a ln(x) + b) avec l’efficacité R2. Une courbe standard doit avoir un rendement proche de 100 % etR2 proche de 1,0 (≥0,99). - Remplissez l’efficacité de la pente en remplissant ce calculateur en ligne27.
REMARQUE: Une efficacité comprise entre 90% et 110% est acceptable. Si l’efficacité de la qPCR est en dehors de cette plage, réexécutez la qPCR. - Utiliser les valeurs de concentration du tableau 7A pour faire la moyenne des dilutions de chaque échantillon et déterminer l’écart-type de chaque échantillon (tableau 7C).
REMARQUE : Exclure les dilutions des échantillons qui sont inférieures de plus d’un écart-type à la moyenne des dilutions de l’échantillon. - En utilisant la concentration moyenne de chaque dilution, multipliez par le facteur de dilution, puis divisez par cinq pour obtenir les génomes vectoriels (vg)/μL de chaque échantillon (Tableau 7C).
- Calculer le vg/mL de chaque échantillon en multipliant la moyenne des concentrations de chaque échantillon par 80 000(tableau 7C).
- Faire la moyenne du vg/mL de chaque dilution pour produire le vg/mL final de chaque échantillon (Tableau 7C).
REMARQUE: L’utilisateur doit diviser la concentration moyenne de chaque dilution par un facteur cinq pour tenir compte des 5 μL chargés dans chaque puits pour l’essai de qPCR afin de produire la concentration en vg/μL. Le facteur de 80 000 explique la transition de la valeur moyenne de concentration de chaque échantillon à vg/mL. Tout d’abord, la moyenne de la valeur de concentration de chaque échantillon doit être multipliée par 2 pour tenir compte des génomes monocaténaires, car l’ensemble de sondes d’amorce ne quantifie que l’ADN simple brin (ADNSs) à sens positif, et le génome de l’AAV existe dans un rapport approximatif de 1: 1 entre l’ADNSs positif et négatif25,28. La moyenne de la valeur de concentration de chaque échantillon doit être multipliée x40 pour tenir compte de la dilution de l’échantillon de 5 μL de vecteur purifié (section 4.1) à 200 μL d’ADN extrait (section 4.6.12). Enfin, la moyenne de la valeur de concentration de chaque échantillon doit être multipliée x1000 pour passer de vg/μL à vg/mL.
6 Évaluation de la qualité et de la pureté des vecteurs
- Contrôle de la qualité - Western Blot
- Préparez un gel SDS PAGE à 12%.
- Effectuer l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
REMARQUE: Chargez 6 x 1010 vg d’échantillons par puits. - Transférer les protéines dans la membrane du difluorure de polyvinylidène (PVDF).
- Blocage de la membrane PVDF
- Retirez la membrane de l’appareil de transfert et rincez à 0,1 % de PBST pour éliminer l’acrylamide en vrac.
- Placer la membrane dans une solution bloquante pendant au moins 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 °C.
REMARQUE: Le tampon bloquant peut être complété par du sérum de chèvre à 2%.
- Incubation avec anticorps primaire
- Décantez le tampon bloquant et ajoutez l’anticorps primaire, un anticorps monoclonal anti-AAV de souris à une dilution de 1:200.
- Incuber toute la nuit à 4 °C.
- Décantez l’anticorps primaire et lavez cinq fois avec 0,1% de PBST pendant 5 min à température ambiante avec agitation.
- Incubation avec anticorps secondaires
- Décanter la solution de lavage et ajouter l’anticorps secondaire conjugué HRP, dilué à 1:7500 dans un tampon bloquant, et incuber pendant 1 h à température ambiante avec agitation.
- Décanter l’anticorps secondaire et laver cinq fois avec 0,1% pbST pendant 5 min à température ambiante avec agitation.
- Effectuez un lavage final avec PBS à température ambiante avec agitation.
- Détectez les protéines à l’aide d’un substrat chimiluminescent amélioré (ECL).
- Imagez le gel pour visualiser les protéines virales (sous-unités VP1, VP2 et VP3) (Figure 4).
Figure 4: Transfert western montrant les protéines de la capside AAV. Voie A; Échelle MW, voie B; AAV6.2FF-hIgG01, voie C; AAV6.2FF-hIgG02, voie D; AAV6.2FF-hIgG03 et voie E; AAV6.2FF-hIgG04. 6 x 1010 vg de chaque AAV6.2FF-hIgG ont été chargés dans leurs voies respectives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Contrôle de la pureté - SDS PAGE et Coomassie Stain
- Préparer le gel et les échantillons de FDS-PAGE comme décrit aux étapes 6.1.1 et 6.1.2.
- Fixez le gel dans une solution de fixation pendant 1 h ou pendant la nuit avec une agitation douce. Changez la solution de fixation une fois au cours de la première heure.
- Tacher le gel dans une solution de coloration pendant 2-4 h avec une agitation douce.
- Détachez le gel avec une solution décolorante. Reconstituez la solution de déscoloration plusieurs fois jusqu’à ce que le fond du gel soit complètement coloré (4-24 h).
- Conservez le gel coloré dans une solution de stockage.
- Imagez le gel pour visualiser toutes les protéines colorées par la solution de coloration coomassie.
Figure 5: Gel teinté de Coomassie. Voie A; Échelle MW, voie B; AAV6.2FF-hIgG01, voie C; AAV6.2FF-hIgG02, voie D; AAV6.2FF-hIgG03, voie E; AAV6.2FF-hIgG04, voie F; AAV6.2FF-hIgG05 et Lane G; AAV6.2FF-hIgG06. 6 x 1010 vg de chaque AAV6.2FF-hIgG ont été chargés dans leurs voies respectives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Test alternatif de contrôle de la pureté - HEK293 détection de protéine de la cellule hôte ELISA
- Effectuez la détection de la protéine de la cellule hôte HEK293 via ELISA conformément aux instructions du fabricant.
REMARQUE: Utilisez des dilutions de 5 x 10-2 et 1 x 10-3 pour les échantillons de rAV purifiés. Une fois que la TMB est ajoutée au puits, incuber à l’abri de la lumière. La régression linéaire ne peut pas être utilisée pour analyser les résultats. - Effectuer une analyse point à point, une spline cubique ou une méthode d’ajustement logistique à quatre paramètres pour interpoler les concentrations d’inconnues et multiplier par le facteur de dilution afin de déterminer la concentration de l’échantillon d’origine.
- Effectuez la détection de la protéine de la cellule hôte HEK293 via ELISA conformément aux instructions du fabricant.
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Representative Results
La traduction de modèles de petits rongeurs en modèles animaux plus grands et l’application clinique éventuelle présentent un défi important en raison de la grande quantité d’AAV nécessaire pour transduire de plus gros animaux et obtenir des effets thérapeutiques. Pour comparer l’efficacité de transduction de la capside AAV6.2FF rationnellement conçue, précédemment démontrée une augmentation de 101 fois de l’efficacité de transduction dans les cellules musculaires murines par rapport à AAV63,des souris, des hamsters et des agneaux ont tous reçu AAV6.2FF exprimant un anticorps monoclonal humain (hIgG). Le vecteur exprimant AAV6.2FF-hIgG contenait un promoteur CASI4,un élément régulateur post-transcriptionnel (WPRE) du virus de l’hépatite Woodchuck et une séquence polyA SV40. Des souris FEMELLEs BALB/c (n = 4) âgées de six semaines ont reçu par voie intramusculaire (IM) 1 x10 11 vg d’AAV6.2FF-hIgG dans 40 μL, et du sang a été prélevé aux jours 0, 7, 14, 21 et 28 après l’administration d’AAV pour la surveillance de l’hIgG. Des hamsters syriens âgés de quatre semaines (deux femelles et deux mâles) ont reçu 1 x 1012 vg d’AAV6.2FF-hIgG dans 40 μL, et du sang a été prélevé chaque semaine pour surveiller l’expression de l’hIgG. Enfin, des agneaux Dorset mâles âgés de 10 jours (n = 3) ont reçu une IM administrée 1x10 13 vg /kg d’AAV6.2FF-hIgG en deux à trois injections de 1 mL dans la croupe. La collecte de sang hebdomadaire a été complétée par des saignements jugulaires et l’hIgG a été surveillé chaque semaine pendant 28 jours. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins aux animaux de l’Université de Guelph.
Souris IM administrées 5 x 1012 vg/kg d’AAV6.2FF-hIgG exprimées entre 171-237 μg/mL de hIgG dans le sérum au jour 28 après administration (Figure 6). Hamsters IM administré 2 x 1013 vg/ kg d’AAV6.2FF-hIgG ont exprimé des niveaux beaucoup plus élevés que les souris, avec des taux sériques d’hIgG de 495-650 μg / mL au jour 28 après l’administration. Enfin, l’IM ovin a administré 1 x 1013 vg/kg sériques exprimés en hIgG de 21 à 46 μg/mL au jour 28 après l’administration. Dans tous les modèles animaux, le vecteur ne semblait entraver aucun indice de santé, tel que le poids, prouvant l’innocuité et la qualité des vecteurs produits. Il est bien connu que l’expression des anticorps monoclonaux médiés par l’AAV (mAb) varie considérablement selon les espèces et le mAb. À la connaissance des auteurs, il n’y a pas de rapports sur l’expression de l’AAV-mAb chez les espèces ovines, il n’y a donc pas de point de référence pour les niveaux d’expression attendus. Il est à noter que les moutons de cette étude ont doublé de poids au cours de la période de 28 jours suivant l’injection et que les animaux de la figure 6 ont tous été transduis avec différents AAV-mAbs et ne peuvent donc pas être comparés.
Figure 6: L’administration intramusculaire d’AAV6.2FF-hIgG entraîne une expression sérique soutenue de l’hIgG chez la souris, le hamster et le mouton. Les souris FEMELLEs BALB/c (n = 4) ont reçu une IM administrée 5 x10 12 vg/kg d’AAV6.2FF-hIgG, des hamsters syriens (2 mâles, 2 femelles), ont reçu une IM 1 x10 13 vg/kg d’AAV6.2FF-hIgG, et des agneaux Dorset mâles de 10 jours (n = 3) ont reçu une IM administrée 1 x 1013 vg/kg. Le sérum a été surveillé pour l’expression de hIgG sur une période de 28 jours. Les données sont représentées comme la moyenne ± écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Transfection de la chambre de culture cellulaire | |||||
| Protocole | |||||
| 1. Permettre à l’ADN, à l’OptiMEM et à l’Î.-P.-É. de se réchauffer à la température ambiante avant la transfection | |||||
| 2. Entrez le nombre de piles de cellules à transfecter (aucun dépassement requis) | |||||
| 3. Assurez-vous que les concentrations d’ADN sont correctes, car cela modifiera les volumes requis | |||||
| Nombre de chambres de culture cellulaire | 1 | ||||
| Concentration de plasmide transgénique | 1 | mg/mL | |||
| Concentration de plasmide pDGM6.2FF | 1 | mg/mL | |||
| Quantité par chambre de culture cellulaire | Transfection Mastermix | ||||
| OptiMEM | 48.1 | Ml | 48.1 | Ml | |
| Rapport 1:3 pTransgene:pHelper | pTransgène | 475 | μg | 475 | μL |
| pHelper | 1425 | μg | 1425 | μL | |
| 4. Ajouter les volumes requis d’OptiMEM et d’ADN plasmidique à un tube conique de 50 mL | |||||
| 5. Inverser 10 fois pour mélanger | |||||
| Rapport 3:1 PEI:DNA | Î.-P.- | 5.7 | Ml | 5.7 | Ml |
| 6. Ajouter la quantité requise d’Î.-P.-É. au tube de 50 mL contenant l’OptiMEM et l’ADN plasmidique | |||||
| 7. Fermez immédiatement le tube et le vortex de 50 mL et inversez 3 à 5 fois pour mélanger. | |||||
| 8. Réglez une minuterie pendant 10 minutes pour que les complexes de l’Île-du-Prince-Édouard puissent incuber | |||||
| 9. Déplacer les piles de cellules à transfecter dans le BSC | |||||
| 10. Après 10 min, verser le mélange de trasnfection dans un orifice orange. | |||||
| 11. Mélanger doucement le liquide dans toute la pile de cellules | |||||
| 12. Renvoyer la pile de cellules transfectées à l’incubateur en assurant un volume égal sur chaque couche | |||||
| 13. Chambre de culture cellulaire de récolte 72 h plus tard | |||||
Tableau 2 : Calculateur de transfection pour chambre de culture cellulaire. Feuille de travail interactive pour déterminer la concentration correcte de pTransgene, pHelper et PEI pour la transfection de la chambre de culture cellulaire.
Tableau 7 : Calculateur de titrage AAV. Feuille de travail interactive pour déterminer la concentration finale d’échantillons d’AAV à partir de la qPCR, exprimée en vg/mL. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
La production de vecteurs AAV recombinants (rAAV) décrits dans cet article utilise des matériaux, des réactifs et de l’équipement courants trouvés dans la majorité des laboratoires et des installations de recherche en biologie moléculaire. Cet article permet au lecteur de produire des rAAV in vitro et in vivo de haute qualité. Surtout, ce protocole de production de rAAV, par rapport à des protocoles plus fastidieux impliquant la purification du chlorure de césium, est efficace et évite l’utilisation de l’ultracentrifugation. Une fois que les cellules HEK293 ont été transfectées, l’AAV purifié est prêt à l’emploi dans les 5 jours ouvrables.
Au cours du processus de production et de purification du rAAV, de nombreuses étapes peuvent influencer la pureté et le titre final du vecteur. La première étape et la plus critique est la santé des cellules HEK293, qui a un effet direct sur le titre vectoriel. L’utilisation de cellules HEK293 par opposition à d’autres types ou systèmes cellulaires, tels que les cellules HEK293T, est avantageuse dans la mesure où les cellules HEK293 ont une plus grande capacité à adhérer au revêtement plastique des plaques et des cellules créant des réseaux cellulaires robustes pour une croissance cellulaire continue. Il est recommandé de surveiller les cellules pour la contamination des mycoplasmes et d’éviter de passer les cellules HEK293 au-delà d’environ 40 passages ou une fois que leur temps de doublement semble ralentir, car cela entraînera une baisse des rendements en AAV. De plus, la confirmation que les cellules sont confluentes à environ 80 % avant la transfection garantit que les cellules ne sont pas trop clairsemées ou envahies par la végétation. En ce qui concerne les composants de transfection, l’utilisation d’ADN plasmidique de haute qualité (p. ex., l’ADN plasmidique préparé commercialement) est fortement recommandée pour s’assurer que l’ADN reste en solution et interagit correctement avec les composants d’administration de transfection chimique, tels que l’Î.-P.-É. Enfin, le réactif de transfection a un impact significatif sur les rendements en rAV. Ici, l’Île-du-Prince-Édouard est utilisée comme agent de transfection. PEI est un polymère cationique stable qui délivre de l’ADN exogène au noyau des cellules par la production de complexes plasmides-polymères, qui sont ensuite absorbés par les cellules et acheminés vers le noyau par des processus de cellules hôtes29. Les transfections basées sur l’Î.-P.-É. sont rapides et faciles par rapport à d’autres méthodes d’administration de l’ADN, y compris le phosphate de calcium ou la lipofectamine. Cependant, le rapport PEI:ADN doit être optimisé.
L’utilisation de piles de cellules par opposition aux plaques adhérentes traditionnelles fournit une méthode plus pratique et cohérente pour la production de rAAV. Les empilements de cellules impliquent moins de manipulation technique pendant la transfection, atténuant le délogement possible des cellules de la monocouche adhérente, permettant des réseaux cellulaires plus forts et une meilleure production de rAAV. Après la transfection, la collecte du surnageant et la lyse des cellules sont efficaces et cohérentes. Pour prélever le rAAV dans les cellules, les méthodes de lyse physique des cellules telles que la décongélation-décongélation sont inefficaces et incohérentes car il n’y a aucun moyen de s’assurer que toutes les cellules sont lysées. Ici, une procédure de lyse chimique est décrite. L’utilisation d’un tampon de lyse chimique garantit que toutes les cellules sont exposées à l’agent de lyse à une concentration spécifique, ainsi qu’à des additifs tels que l’inhibiteur de la protéase pour prévenir la dégradation de la capside. Cette méthode lyse plus systématiquement les cellules, ce qui permet une récolte plus efficace du rAAV. De plus, le granulation et l’élimination des débris cellulaires éliminent les contaminants possibles du lysat brut, ce qui peut augmenter le temps et le coût de la filtration du lysat avant la purification.
Bien que le rAV puisse être présent en grande quantité dans le lysat brut, l’acte de capturer et de nettoyer le rAAV peut différer selon diverses méthodes de purification, telles que les gradients de chlorure de césium. Ici, l’utilisation de la purification par chromatographie d’affinité héparine sépharose fournit une méthode rapide et facile de purification vectorielle qui aboutit à un virus ultrapur et ne nécessite pas d’ultracentrifugation par gradient. Cependant, tous les sérotypes AAV ne contiennent pas de domaines de liaison à l’héparine, donc pour ces sérotypes, cette méthode de purification ne serait pas appropriée. Par exemple, alors que AAV2 et AAV6 lient le sulfate d’héparine, AAV4 et AAV5 ne sont pas30. Bien que cette méthode ne soit pas universelle, elle est efficace et facile pour les capsides qui lient le sulfate d’héparine. Contrairement aux gradients d’ultracentrifugation tels que l’iodixanol, toutes les particules de rAAV sont liées à la membrane de la colonne jusqu’à ce qu’elles soient éluées à l’aide de lavages à forte concentration de sel, évitant ainsi des problèmes tels que le mélange de gradients et les compétences nécessaires pour récupérer les fractions du gradient. L’élution par des lavages à haute concentration de sel permet une élution contrôlée et précise du virus en fractions qui peuvent être davantage concentrées. Seule la concentration de certaines fractions du virus élué élimine davantage les contaminants potentiels tout en récupérant >97 % du virus élué. Une limitation de la purification par chromatographie d’affinité de l’héparine sépharose est qu’elle ne fait pas la distinction entre les particules vides et pleines. Des étapes d’ultracentrifugation analytique supplémentaires devraient être incorporées afin d’éliminer les capsides vides31.
La qPCR est une méthode rentable et rapide pour déterminer le nombre de génomes vectoriels dans une préparation vectorielle AAV. Bien que la qPCR soit une méthode de quantification sensible, elle ne fournit aucune information sur le nombre de particules infectieuses dans la préparation. De plus, la sensibilité de ce test peut entraîner une variabilité, car des erreurs techniques lors du pipetage peuvent entraîner une variabilité entre les essais. Ainsi, pour toute expérience qui implique la comparaison de différents vecteurs AAV, il est essentiel que les vecteurs soient titrés sur la même plaque qPCR. Malgré ces limitations, la qPCR est la méthode la plus précise développée pour titrer l’AAV et est actuellement la méthode la plus largement utilisée et acceptée pour la quantification des vecteurs AAV32. L’utilisation d’un amorce / sonde qui se lie au polyA SV40 d’un génome rAAV est basée sur le fait que cette séquence est conservée dans de nombreux plasmides du génome AAV conçus en laboratoire. Au-delà du choix d’une séquence conservée parmi les plasmides du génome rAAV du lecteur, les sondes qPCR peuvent être conçues pour toutes les parties du génome rAAV, y compris, mais sans s’y limiter, les promoteurs, les transgènes ou les facteurs post-transcriptionnels.
L’évaluation de la pureté et de la qualité du produit AAV est une étape importante du processus de production. Le Western blotting peut être utilisé pour détecter les protéines structurelles VP1, VP2 et VP3 qui composent la capside de l’AAV, ainsi que toute forme altérée de VP. VP1, VP2 et VP3 sont généralement présents à un rapport de 1: 1: 10, mais cela peut varier de 1: 1: 5 à 1: 1: 20 selon le sérotype. Par conséquent, il est essentiel de déterminer empiriquement le rapport pour chaque système, en particulier parce que la région N-terminale de VP1 s’est avérée importante pour l’infectiosité et la transduction33. SDS-PAGE couplé à la coloration de Coomassie est une méthode assez simple pour détecter VP1, VP2 et VP3, ainsi que les contaminants de la protéine de la cellule hôte. L’utilisation de colorants protéiques fluorescents tels que SYPRO Ruby offre une détection plus sensible des contaminants de la protéine de la cellule hôte que Coomassie; cependant, tous les laboratoires n’ont pas accès à l’équipement d’imagerie nécessaire pour visualiser le gel. Enfin, les ELISA commerciaux peuvent être utilisés pour quantifier les contaminants de la protéine de la cellule hôte dans les vecteurs AAV produits dans les cellules HEK293.
Ce protocole fournit une vue d’ensemble approfondie de la production de rAAV à titre élevé et de haute pureté pour les sérotypes qui se lient à l’héparine. Dans la section des résultats représentatifs, l’utilisation d’un nouvel AAV6.2FF exprimant hIgG dans une variété de modèles animaux montre l’innocuité et l’efficacité de ce rAV in vivo. Bien que le vecteur AAV6.2FF ait été administré im, ces virus de haute qualité et de haute pureté peuvent être administrés par une variété de voies différentes in vivo, car les contaminants inflammatoires possibles, tels que la protéine de la cellule hôte, ont été éliminés par nos processus de purification.
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Disclosures
Sarah K. Wootton est l’inventrice d’un brevet américain US10806802B2 pour la capside AAV6.2FF.
Acknowledgments
Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas et Jacob G. E. Yates ont reçu des bourses d’études supérieures de l’Ontario Veterinary College ainsi que des bourses d’études supérieures de l’Ontario. Amira D. Rghei a reçu une bourse d’études Mitacs Accelerate. Ces travaux ont été financés par la subvention de projet des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (no 66009) et une subvention de projets de recherche en santé concertée (partenariat avec le CRSNG) (no 433339) à SKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 1-Butanol | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| 10 chamber cellstack | Corning | 3271 | |
| 1L PETG bottle | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 1610158 | |
| 96-well skirted plate | FroggaBio | FS-96 | |
| Adhesive plate seals | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Blood and Tissue Clean up Kit | Qiagen | 69506 | Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Cell Culture Dishes | Greiner bio-one | 7000232 | 15 cm plates |
| Culture Conical Tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 mL conical tube |
| Culture Conical Tube | Fisher Scientific | 14955240 | 50 mL conical tube |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| Ethanol | Greenfield | P016EA95 | Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| HBSS with Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| HBSS without Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| HEK293 cells | American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots |
| HEK293 host cell protein ELISA kit | Cygnus Technologies | F650S | Follow manufacturer’s instructions |
| Heparin sulfate column | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
| Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
| Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion | Corning | CLS431124 | Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions |
| Large Volume Centrifuge Tubes | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL centrifuge tubes |
| MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use |
| Molecular Grade Water | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma Aldrich | L5125 | CAUTION. Wear gloves |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
| Optimem, reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | Sterilize prior to use |
| PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Dilute to 1x for use on cells |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
| pHelper plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | |
| Pipet basin | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Purchase sterile pipet basins |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | CAUTION. Wear gloves |
| Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 24765-1 | Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C |
| Polypropylene semi-skirted PCR Plate | FroggaBio | WS-96 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | CAUTION. Wear gloves |
| polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Cytiva Life Sciences | 10600023 | Use forceps to manipulate. Wear gloves. |
| Primary antibody | Progen | 65158 | |
| Protein Ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| pTrangene plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0 |
| Pump tubing | Cole-Parmer | RK-96440-14 | Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5 |
| RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer | Promega | M6101 | Use at 10x concentration in protocol from section 4.0 |
| RQ1 Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | |
| Sample dilutent | Cygnus Technologies | I700 | Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit |
| Secondary antibody, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
| Skim milk powder | Oxoid | LP0033B | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| SV40 polyA primer probe | IDT | Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
| Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff |
| Universal Nuclease for cell lysis | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
| Universal qPCR master mix | NEB | M3003L | |
| Whatman Paper | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 21985023 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals. |
References
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Nathwani, A. C., et al. Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).
- Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
- Ylä-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss (2020).
- FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease (2020).
- Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics (2020).
- Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).
- Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).
- Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA. Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).
- Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).
- Ling, C. Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo. Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).
- Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Pillay, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor. Journal of Virology. 91 (18), (2017).
- Merkel, S. F. Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells. Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).
- van Lieshout, L. P., et al. A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).
- Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).
- Liu, J., Moon, Y. -A. Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression. Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).
- Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).
- Kimura, T., et al. Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- dsDNA copy number calculator. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html (2021).
- qPCR Efficiency Calculator - CA. , Available from: http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html (2021).
- Lamb, R. A., Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology. , Available from: https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication (1996).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
- Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity. Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).
- Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
- Backovic, A., et al. Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).
