Produção de vetores de vírus associados a Adeno em pilhas de células para estudos pré-clínicos em grandes modelos animais
Summary
Aqui fornecemos um procedimento detalhado para a produção em larga escala de vetores AAV de grau de pesquisa usando células hek 293 aderentes cultivadas em pilhas de células e purificação de cromatografia de afinidade. Este protocolo produz consistentemente >1 x 1013 genomas vetoriais/mL, fornecendo quantidades vetoriais apropriadas para grandes estudos em animais.
Abstract
Os vetores de vírus associados ao Adeno (AAV) estão entre os vetores de terapia genética mais clinicamente avançados, com três terapias genéticas AAV aprovadas para humanos. O avanço clínico de novas aplicações para AAV envolve a transição de pequenos modelos animais, como ratos, para modelos animais maiores, incluindo cães, ovelhas e primatas não humanos. Uma das limitações da administração de AAV para animais maiores é a exigência de grandes quantidades de vírus de alta titulação. Embora a cultura celular de suspensão seja um método escalável para a produção de vetores AAV, poucos laboratórios de pesquisa têm o equipamento (por exemplo, bioreatores) ou sabem como produzir AAV desta maneira. Além disso, os títulos AAV são muitas vezes significativamente mais baixos quando produzidos em células HEK 293 de suspensão em comparação com as células HEK293 aderentes. Descrito aqui é um método para produzir grandes quantidades de AAV de alta titer usando pilhas de células. Um protocolo detalhado para titering AAV, bem como métodos para validar a pureza vetorial também são descritos. Finalmente, são apresentados resultados representativos da expressão transgênica mediada pela AAV em um modelo de ovinos. Este protocolo otimizado para a produção em larga escala de vetores AAV em células aderentes permitirá que laboratórios de biologia molecular avancem os testes de suas novas terapias AAV em modelos animais maiores.
Introduction
A terapia genética utilizando vetores de vírus associados ao adeno (AAV) fez grandes avanços nas últimas três décadas1,2. Melhorias demonstradas em uma variedade diversificada de doenças genéticas, incluindo cegueira congênita, hemofilia e doenças do sistema nervoso musculoesquelético e central, trouxeram a terapia genética AAV à vanguarda da pesquisa clínica3,4. Em 2012, a Agência Europeia de Medicamentos (EMA) aprovou a Glybera, um vetor AAV1 que expressa lipoproteína lipase (LPL) para o tratamento da deficiência de LPL, tornando-se a primeira autorização de comercialização para um tratamento de terapia genética na Europa ou nos Estados Unidos5. Desde então, duas terapias genéticas AAV adicionais, Luxturna6 e Zolgensma7,receberam aprovação da FDA, e espera-se que o mercado se expanda rapidamente nos próximos 5 anos, com até 10-20 terapias genéticas esperadas até 20258. Os dados clínicos disponíveis indicam que a terapia genética AAV é uma modalidade segura, bem tolerada e eficaz, tornando-a um dos vetores virais mais promissores, com mais de 244 ensaios clínicos envolvendo AAV registrados com ClinicalTrials.gov. O crescente interesse por aplicações clínicas envolvendo vetores AAV requer métodos de produção robustos e escaláveis para facilitar a avaliação das terapias AAV em grandes modelos animais, pois este é um passo crítico no pipeline translacional9.
Para a produção de vetores AAV, os dois principais requisitos são o genoma AAV e o capsídeo. O genoma do tipo selvagem (wt)-AAV é um DNA de um único fio que tem aproximadamente 4,7 kb de comprimento10. O genoma wt-AAV compreende repetições terminais invertidas (ITRs) encontradas em ambas as extremidades do genoma, que são importantes para a embalagem, e os genes rep e cap 11. Os genes de representação e tampa, necessários para a replicação do genoma, montagem do capsídeo viral e encapsulamento do genoma no capsídeo viral, são removidos do genoma viral e fornecidos em trans para a produção de vetores AAV12. A remoção desses genes do genoma viral abre espaço para transgênicos terapêuticos e todos os elementos regulatórios necessários, incluindo o promotor e o sinal poliA. Os ITRs permanecem no genoma vetorial para garantir a replicação adequada do genoma e o encapsulamento viral13,14. Para melhorar a cinética da expressão transgênica, os genomas vetores AAV podem ser projetados para serem autocons complementares, o que mitiga a necessidade de conversão de conversão de DNA de uma só vez para dupla mente durante a replicação do genoma AAV, mas reduz a capacidade de codificação para ~2,4 kb15.
Além do desenho do genoma AAV, a seleção do sorotipo capsid determina o tropismo tecidual e celular do vetor AAV in vivo2. Além do tropismo tecidual, diferentes sorotipos AAV têm sido mostrados para exibir cinética de expressão genética diferente16. Por exemplo, Zincarelli et al.17 classificaram diferentes sorotipos AAV em sorotipos de baixa expressão (AAV2, 3, 4, 5), sorotipos de expressão moderada (AAV1, 6, 8) e sorotipos de alta expressão (AAV7 e 9). Eles também categorizaram os sorotipos AAV em expressão de início lento (AAV2, 3, 4, 5) ou expressão de início rápido (AAV1, 6, 7, 8 e 9). Esses tropismos divergentes e cinéticas de expressão genética são devido a variações de aminoácidos nas proteínas capsóides, formações de proteína capsíide e interações com receptores/co-receptores de células hospedeiras18. Alguns capsídeos AAV têm características benéficas adicionais, como a capacidade de atravessar a barreira hemoencefálica após a administração intravascular (AAV9) ou residir em células musculares de longa duração para expressão transgênica durável (AAV6, 6.2FF, 8 e 9)19,20.
Este artigo tem como objetivo detalhar um método econômico para produzir vetores AAV de alta pureza, alto título e grau de pesquisa para uso em modelos animais grandes pré-clínicos. A produção de AAV usando este protocolo é alcançada usando transfecção dual-plasmid em rim embrionário humano aderente (HEK)293 células cultivadas em pilhas de células. Além disso, o estudo descreve um protocolo para purificação cromatografia de afinidade de sulfato de heparina, que pode ser usado para sorotipos AAV que contêm domínios de ligação de heparina, incluindo AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 e DJ21,22.
Uma série de sistemas de embalagem estão disponíveis para a produção de vetores AAV. Entre eles, o uso de um sistema de co-transfection de dois plasmídeos, nos quais os genes Rep e Cap e os genes auxiliares de anúncios (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 e VA RNA) estão contidos dentro de um plasmídeo (pHelper), tem algumas vantagens práticas sobre o método comum de transfecção de três plasmídeos (triplos), incluindo custo reduzido para produção plasmida23,24 . O plasmídeo genoma AAV contendo o de expressão transgene (pTransgene), deve ser ladeado por ITRs, e não deve exceder ~4,7 kb de comprimento. O título vetorial e a pureza podem ser afetados pelo transgene devido a potenciais efeitos citotóxicos durante a transfecção. A avaliação da pureza vetorial é descrita aqui. Os vetores produzidos utilizando este método, que produzem um 1 x 1013 vg/mL para cada um, foram avaliados em camundongos, hamsters e modelos de animais ovinos.
Tabela 1: Composição das soluções necessárias. Informações necessárias, incluindo percentuais e volumes, de componentes necessários para diversas soluções ao longo do protocolo. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Protocol
Representative Results
Discussion
A produção de vetores AAV (rAAV) recombinantes descritos neste artigo utiliza materiais, reagentes e equipamentos comuns encontrados na maioria dos laboratórios e instalações de pesquisa de biologia molecular. Este artigo permite que o rAAV in vitro e in vivo de alta qualidade seja produzido pelo leitor. Acima de tudo, este protocolo para produção de rAAV, comparado a protocolos mais tediosos envolvendo purificação de cloreto de césio, é eficiente e evita o uso de ultracentrifugação. Uma ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas e Jacob G. E. Yates foram beneficiários do Ontário Veterinary College Student Stipends, bem como de Bolsas de Pós-Graduação em Ontário. Amira D. Rghei foi a beneficiária de um Mitacs Accelerate Studentship. Este trabalho foi financiado pelo Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant (#66009) e uma bolsa colaborativa de Projetos de Pesquisa em Saúde (NSERC) (#433339) para a SKW.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 1-Butanol | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| 10 chamber cellstack | Corning | 3271 | |
| 1L PETG bottle | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 1610158 | |
| 96-well skirted plate | FroggaBio | FS-96 | |
| Adhesive plate seals | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Blood and Tissue Clean up Kit | Qiagen | 69506 | Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Cell Culture Dishes | Greiner bio-one | 7000232 | 15 cm plates |
| Culture Conical Tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 mL conical tube |
| Culture Conical Tube | Fisher Scientific | 14955240 | 50 mL conical tube |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| Ethanol | Greenfield | P016EA95 | Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| HBSS with Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| HBSS without Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| HEK293 cells | American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots |
| HEK293 host cell protein ELISA kit | Cygnus Technologies | F650S | Follow manufacturer’s instructions |
| Heparin sulfate column | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
| Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
| Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion | Corning | CLS431124 | Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions |
| Large Volume Centrifuge Tubes | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL centrifuge tubes |
| MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use |
| Molecular Grade Water | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma Aldrich | L5125 | CAUTION. Wear gloves |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
| Optimem, reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | Sterilize prior to use |
| PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Dilute to 1x for use on cells |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
| pHelper plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | |
| Pipet basin | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Purchase sterile pipet basins |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | CAUTION. Wear gloves |
| Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 24765-1 | Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C |
| Polypropylene semi-skirted PCR Plate | FroggaBio | WS-96 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | CAUTION. Wear gloves |
| polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Cytiva Life Sciences | 10600023 | Use forceps to manipulate. Wear gloves. |
| Primary antibody | Progen | 65158 | |
| Protein Ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| pTrangene plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0 |
| Pump tubing | Cole-Parmer | RK-96440-14 | Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5 |
| RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer | Promega | M6101 | Use at 10x concentration in protocol from section 4.0 |
| RQ1 Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | |
| Sample dilutent | Cygnus Technologies | I700 | Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit |
| Secondary antibody, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
| Skim milk powder | Oxoid | LP0033B | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| SV40 polyA primer probe | IDT | Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
| Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff |
| Universal Nuclease for cell lysis | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
| Universal qPCR master mix | NEB | M3003L | |
| Whatman Paper | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 21985023 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals. |
References
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