Summary
Hier bieden we een gedetailleerde procedure voor grootschalige productie van onderzoekskwaliteit AAV-vectoren met behulp van adherente HEK 293-cellen gekweekt in celstapels en affiniteitschromatografiezuivering. Dit protocol levert consequent >1 x 1013 vectorgenomen /ml op, wat vectorhoeveelheden oplevert die geschikt zijn voor grote dierstudies.
Abstract
Adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren behoren tot de meest klinisch geavanceerde gentherapie vectoren, met drie AAV gentherapieën goedgekeurd voor mensen. Klinische vooruitgang van nieuwe toepassingen voor AAV omvat de overgang van kleine diermodellen, zoals muizen, naar grotere diermodellen, waaronder honden, schapen en niet-menselijke primaten. Een van de beperkingen van het toedienen van AAV aan grotere dieren is de vereiste voor grote hoeveelheden hoogtitervirus. Hoewel suspensiecelcultuur een schaalbare methode is voor de productie van AAV-vectoren, hebben maar weinig onderzoekslaboratoria de apparatuur (bijvoorbeeld bioreactoren) of weten ze hoe ze AAV op deze manier kunnen produceren. Bovendien zijn AAV-titers vaak aanzienlijk lager wanneer ze worden geproduceerd in suspensie HEK 293-cellen in vergelijking met adherente HEK293-cellen. Hier wordt een methode beschreven voor het produceren van grote hoeveelheden AAV met hoge titer met behulp van celstapels. Een gedetailleerd protocol voor het titeren van AAV en methoden voor het valideren van vectorzuiverheid worden ook beschreven. Ten slotte worden representatieve resultaten van AAV-gemedieerde transgene expressie in een schapenmodel gepresenteerd. Dit geoptimaliseerde protocol voor grootschalige productie van AAV-vectoren in adherente cellen zal moleculair biologische laboratoria in staat stellen om het testen van hun nieuwe AAV-therapieën in grotere diermodellen te bevorderen.
Introduction
Gentherapie met behulp van adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren heeft enorme vooruitgang geboekt in de afgelopen drie decennia1,2. Aangetoonde verbeteringen in een breed scala aan genetische ziekten, waaronder aangeboren blindheid, hemofilie en ziekten van het bewegingsapparaat en het centrale zenuwstelsel, hebben AAV-gentherapie naar de voorgrond van klinisch onderzoek gebracht3,4. In 2012 keurde het Europees Geneesmiddelenbureau (EMA) Glybera goed, een AAV1-vector die lipoproteïnelipase (LPL) tot expressie brengt voor de behandeling van LPL-deficiëntie, waardoor het de eerste handelsvergunning is voor een gentherapiebehandeling in Europa of de Verenigde Staten5. Sindsdien hebben twee extra AAV-gentherapieën, Luxturna6 en Zolgensma7,fda-goedkeuring gekregen en de markt zal naar verwachting de komende 5 jaar snel groeien met maar liefst 10-20 gentherapieën verwacht tegen 20258. Beschikbare klinische gegevens geven aan dat AAV-gentherapie een veilige, goed verdragen en effectieve modaliteit is, waardoor het een van de meest veelbelovende virale vectoren is, met meer dan 244 klinische onderzoeken met AAV geregistreerd bij ClinicalTrials.gov. De toenemende interesse in klinische toepassingen met AAV-vectoren vereist robuuste en schaalbare productiemethoden om de evaluatie van AAV-therapieën in grote diermodellen te vergemakkelijken, omdat dit een cruciale stap is in de translationele pijplijn9.
Voor de productie van AAV-vectoren zijn de twee belangrijkste vereisten het AAV-genoom en de capside. Het genoom van wild-type (wt)-AAV is enkelstrengs DNA dat ongeveer 4,7 kb lang is10. Het wt-AAV-genoom bestaat uit omgekeerde terminale herhalingen (ITR's) aan beide uiteinden van het genoom, die belangrijk zijn voor verpakking, en de rep- en capgenen 11. De rep- en capgenen, die nodig zijn voor genoomreplicatie, assemblage van de virale capsid en inkapseling van het genoom in de virale capsid, worden uit het virale genoom verwijderd en in trans geleverd voor AAV-vectorproductie12. De verwijdering van deze genen uit het virale genoom biedt ruimte voor therapeutische transgenen en alle noodzakelijke regulerende elementen, waaronder de promotor en het polyA-signaal. De ITR's blijven in het vectorgenoom om te zorgen voor een goede genoomreplicatie en virale inkapseling13,14. Om de kinetiek van transgenexpressie te verbeteren, kunnen AAV-vectorgenomen worden ontworpen om zelfcomplementair te zijn, wat de behoefte aan conversie van enkelstrengs naar dubbelstrengs DNA-conversie tijdens AAV-genoomreplicatie vermindert, maar de codeercapaciteit vermindert tot ~ 2,4 kb15.
Naast het ontwerp van het AAV-genoom bepaalt capsid serotypeselectie het weefsel- en celtropisme van de AAV-vector in vivo2. Naast weefseltropisme is aangetoond dat verschillende AAV-serotypen verschillende genexpressiekinetiek vertonen16. Zincarelli et al.17 classificeerden bijvoorbeeld verschillende AAV-serotypen in serotypen met lage expressie (AAV2, 3, 4, 5), matige expressieserotypen (AAV1, 6, 8) en serotypen met hoge expressie (AAV7 en 9). Ze categoriseerden ook AAV-serotypen in langzaam optredende expressie (AAV2, 3, 4, 5) of snel optredende expressie (AAV1, 6, 7, 8 en 9). Deze divergente tropismen en genexpressiekinetiek zijn te wijten aan aminozuurvariaties in de capside-eiwitten, capside-eiwitformaties en interacties met gastheercelreceptoren / co-receptoren18. Sommige AAV-capsiden hebben extra gunstige eigenschappen, zoals het vermogen om de bloed-hersenbarrière te passeren na intravasculaire toediening (AAV9) of verblijven in langlevende spiercellen voor duurzame transgenexpressie (AAV6, 6.2FF, 8 en 9)19,20.
Dit artikel is bedoeld om een kosteneffectieve methode te beschrijven voor het produceren van zeer zuivere, hoogtiterige, onderzoekskwaliteit AAV-vectoren voor gebruik in preklinische grote diermodellen. Productie van AAV met behulp van dit protocol wordt bereikt met behulp van dual-plasmid transfectie in adheren human embryonic kidney (HEK)293 cellen gekweekt in celstapels. Verder beschrijft de studie een protocol voor heparinesulfaataffiniteitschromatografiezuivering, dat kan worden gebruikt voor AAV-serotypen die heparinebindende domeinen bevatten, waaronder AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 en DJ21,22.
Er zijn een aantal verpakkingssystemen beschikbaar voor de productie van AAV-vectoren. Onder deze, het gebruik van een twee-plasmide co-transfectie systemen, waarin de Rep en Cap genen en Ad helper genen (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6, en VA RNA) zijn opgenomen in één plasmide (pHelper), heeft een aantal praktische voordelen ten opzichte van de gemeenschappelijke drie-plasmide (triple) transfectie methode, waaronder lagere kosten voor plasmide productie23,24 . Het AAV-genoomplasmide dat de transgenexpressiecassette (pTransgene) bevat, moet worden geflankeerd door ITR's en mag niet langer zijn dan ~ 4,7 kb. Vectortiter en zuiverheid kunnen worden beïnvloed door het transgen als gevolg van mogelijke cytotoxische effecten tijdens transfectie. Beoordeling van vectorzuiverheid wordt hierin beschreven. Vectoren geproduceerd met behulp van deze methode, die een 1 x 1013 vg / ml voor elk opleveren, werden geëvalueerd in muizen, hamsters en schapen diermodellen.
Tabel 1: Samenstelling van de vereiste oplossingen. Noodzakelijke informatie, inclusief percentages en volumes, van componenten die nodig zijn voor verschillende oplossingen in het protocol. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dubbele plasmidetransfectie van HEK293-cellen in celstapels
- Ontdooi een cryoflacon met HEK293-cellen in een kralenbad op 37 °C.
OPMERKING: Verwarm volledige DMEM voor tot 37 °C terwijl de cellen ontdooien om ervoor te zorgen dat de koude temperatuur cellen niet schokt bij het plateren. Zorg ervoor dat de cellen een laag doorgangsgetal hebben, idealiter minder dan 20, om optimale groei en transfectie-efficiëntie te garanderen. Zorg ervoor dat de cellen gecertificeerd zijn om mycoplasma-vrij te zijn. - Breng de inhoud van de cryoflacon druppelsgewijs over in een conische buis van 15 ml met 10 ml voorverwarmde complete DMEM en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g.
- Adem de media op en resuspend de HEK293-cellen in 20 ml voorverwarmde complete DMEM. Zaai de cellen in een plaat van 15 cm en incubeer bij 37 °C, met 5% CO2.
- Splits de cellen van één plaat van 15 cm in drie voor zaaien in de celkweekkamer.
- Zodra cellen voor 80% samenvloeien, zuigt u de media op en wast u de plaat voorzichtig met 3 ml PBS om de monolaag niet te verstoren. Aspirateer vervolgens PBS en voeg 3 ml trypsine toe.
- Incubeer gedurende 2 minuten bij 37 °C totdat de cellen uit de plaat komen en neutraliseer trypsine door 7 ml volledige DMEM aan de plaat toe te voegen.
- Verzamel alle media en cellen in een buis van 15 ml en pellet de cellen door gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 500 x g.
- Zuig het supernatant op uit de buis van 15 ml en resuspend de celkorrel in 3 ml volledige DMEM. Voeg 1 ml toe aan elke plaat van 15 cm met 20 ml volledige DMEM; schommel de platen voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen en incubeer bij 37 °C, met 5% CO2.
- Zodra de cellen voor 80% samenvloeiend zijn, herhaalt u stap 1.4.1 en 1.4.2. Verzamel het supernatant in conische buizen van 50 ml en keer de buis voorzichtig om om ervoor te zorgen dat de cellen homogeen zijn.
- Bepaal de celdichtheid door 10 μL van de monsters van cellen te mengen met 10 μL trypan blauw en voeg het mengsel toe aan een celtelglaasje voor analyse in de celteller.
- Meng 1 L voorverwarmde complete DMEM met de benodigde celsuspensie om de celkweekkamer (oppervlakte van 6360 cm2) te zaaien met 1 x 104 cellen/cm2. Giet het celmengsel in de celkweekkamer en draai voorzichtig om de cellen gelijkmatig over elke monolaag te verdelen (figuur 1) en incubeer bij 37 °C, met 5% CO2.
- Plaats naast de celkweek een plaat van 15 cm met 1 x 104 cellen/cm2 als referentie voor confluentie.
- Controleer na ~65-h incubatie de referentieplaat op confluency-idealiter ~80%-90% confluent.
OPMERKING: Verwarm volledige DMEM voor het voorverwarmen aan de celkweekkamer bij 37 °C.
Figuur 1: Manoeuvreren van de celstapel voor celzaaien en transfectie. Voor het zaaien van de celstapel, begin met het verwijderen van een van de ontluchtingsdoppen en het inschenken van 1 L voorverwarmde complete DMEM met de benodigde hoeveelheid HEK293-cellen (A). Verdeel cellen en media gelijkmatig door beide ontluchtingsdoppen aan te draaien en breng alle media naar de hoek van de celstapel met een van de ontluchtingsdoppen en plaats deze in die hoek (B), plaats de celstapel op zijn kant (C) en draai vervolgens de celstapel 90 ° (D) zodat de ontluchtingspoorten omhoog zijn (E). Laat de celstapel voorzichtig zakken naar de normale horizontale positie en zorg ervoor dat alle kamers van de celstapel volledig bedekt zijn met media (F). Schroef bij het transfecteren beide ontluchtingsdoppen los en giet langzaam oude media uit in een afvalsteriele afvalcontainer voor een gelijkmatige stroom om de monolaag van de cellen niet te verstoren (G). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Bereid polyethyleenimine (PEI)/DNA-mengsel in een concentratieverhouding van 3:1 (w/w).
- Bereid het DNA-mengsel in een conische buis van 50 ml door 475 μg pTrangene en 1425 μg pHelper toe te voegen aan 40 ml gereduceerd serummedium om een 3:1-verhouding pHelper:pTrangene te creëren.
OPMERKING: De PEI/DNA-mengselcalculator is te vinden met behulp van tabel 2. - Voeg 5,7 ml PEI (1 g/l) toe aan het gereduceerde serummedium en het DNA-mengsel druppelsgewijs. Vortex vervolgens kort en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Als PEI/DNA bij kamertemperatuur incubeert, wordt het licht troebel.
- Bereid het DNA-mengsel in een conische buis van 50 ml door 475 μg pTrangene en 1425 μg pHelper toe te voegen aan 40 ml gereduceerd serummedium om een 3:1-verhouding pHelper:pTrangene te creëren.
- Verwijder na 8 minuten PEI/DNA-incubatie de media uit de celkweekkamer.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u beide oranje doppen losmaakt om een soepele stroom van media te behouden om ontwrichting van cellen te voorkomen. - Voeg PEI/DNA toe aan 1 L voorverwarmde complete DMEM en giet het mengsel langzaam in de poort van de celkweekkamer. Verdeel de vloeistof gelijkmatig over alle rijen (figuur 1) en incubeer gedurende 72 uur bij 37 °C, met 5% CO2.
2 Oogsten van AAV en chemische lysis van de getransfecteerde HEK293 cellen
- Schud de celkweek krachtig om de cellen los te maken totdat de media troebel lijken van losgeraakte cellen en giet in vier centrifugebuizen van 500 ml.
- Centrifugeer de buizen bij 18.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren. Giet het geklaarde supernatant in een PETG-fles (petg)-fles van polyethyleentereftalaat (polyethyleentereftalaat).
OPMERKING: Als men geen toegang heeft tot een snelle centrifuge, centrifugeer dan gedurende 40 minuten bij 12.000 x g. De gepelletiseerde cellen zijn mogelijk niet vast met deze snelheid en zullen glijden als uitstortend supernatant. - Resuspend de celkorrels in centrifugebuizen van 500 ml met 50 ml lysisbuffer en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C.
- Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 18.000 x g en breng het supernatant vervolgens over in dezelfde PETG-fles van 1 L. Gooi het gepelletiseerde celafval weg.
OPMERKING: Zuiver het geklaarde supernatant onmiddellijk en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal 72 uur. Bewaren voor langere opslag bij -80 °C. Niet bewaren bij -20 °C.
3 AAV Vector zuivering met behulp van heparine affiniteit chromatografie
- Verwijder het ruwe lysaat van -80 °C en laat het een nacht bij 4 °C ontdooien. Gebruik na ontdooide een filter van 0,22 μM om het ruwe lysaat te filteren.
- Om de centrifugaalconcentrator te passiveren, voegt u 4 ml filtervoorbehandelingsbuffer toe aan een centrifugaalconcentrator voor elke heparine sepharosekolom die wordt gebruikt. Passiveer de centrifugaalconcentrator bij kamertemperatuur gedurende 2-8 uur. Stel passivering in direct voor de zuiveringsstappen.
- Stel de slang en de pomp in(figuur 2).
- Plaats de slang in een peristaltische pomp en laat 20 ml van 1 M NaOH lopen. Voer vervolgens 50 ml water van moleculaire kwaliteit uit en voer vervolgens 50 ml basale DMEM uit.
- Bevestig 5 ml heparine sepharose kolom aan de slang en laat 25 ml basale DMEM lopen om het conserveermiddel te verwijderen.
- Laat 0,2 μM van het gefilterde ruwe olie door de kolom lopen met een stroomsnelheid van 1-2 druppels/s.
Figuur 2: Opstelling voor peristaltische pomp voor AAV-zuivering. Laat de slang van het ruwe lysaat, door de peristaltische pomp en in de heparinematrixkolom lopen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u geen bubbels introduceert of de kolom laat drogen, omdat dit de kolom in gevaar brengt en de elutie van AAV voorkomt. Gooi de kolom weg als deze droog is en gebruik een nieuwe kolom voor de rest van het ruwe lysaat.
- Laad al het ruwe lysaat op de heparinekolom en gebruik de volgende oplossingen om de kolom te wassen.
- Wassen met 50 ml 1x Hank's Balanced Salt Solutions (HBSS) zonder Mg2+ en Ca2+.
- Wassen met 15 ml 0,5 % N-Lauroylsarcosine in HBSS zonder Mg2+ en Ca2+.
- Wassen met 50 ml HBSS zonder Mg2+ en Ca2+.
- Wassen met 50 ml HBSS met Mg2+ en Ca2+
- Wassen met 50 ml van 200 mM NaCl/HBSS met Mg2+ en Ca2+.
- Eluteer 5 x 5 ml (25 ml totaal) met 300 mM NaCl/HBSS met Mg2+ en Ca2+ en label de elutie als E1-E5 (elke elutie is 5 ml).
- Het virus concentreren met behulp van een centrifugaalconcentrator
- Draai de centrifugaalconcentrator met de voorbehandelingsbuffer gedurende 2 minuten op 900 x g. Gooi de doorstroming weg.
- Was het centrifugaalconcentratorfilter met 4 ml HBSS met Mg2+ en Ca2+ en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1000 x g; gooi de doorstroming weg.
- Voeg de elutie E2 toe aan de centrifugaalconcentrator. Draai gedurende 5 minuten op 1000 x g en gooi de doorstroom weg.
- Voeg E2 toe en voeg vervolgens E3 toe aan de centrifugaalconcentrator en draai gedurende 5 minuten op 1000 x g totdat het geconcentreerde virus ongeveer 1 ml is.
OPMERKING: Vermijd het centrifugeren van de vector zodanig dat het volume onder het niveau van het filter ligt. Concentreer E1, E4 of E5 niet in de centrifugaalconcentrator, omdat deze zeer weinig tot geen vector bevatten en verontreinigingen bevatten. - Verwijder het geconcentreerde virus uit de centrifugaalconcentrator met behulp van een p200 gefilterde punt en plaats het in een steriele centrifugebuis van 1,5 ml.
- Spoel de centrifugaalconcentrator met 200 μL HBSS met Mg2+ en Ca2+ om de resterende AAV uit het filter te verwijderen. Pipetteer meerdere keren krachtig op en neer (gedurende ~ 30 s) om elk virus dat aan het membraan is gehecht te verdrijven en plaats in de 1,5 ml centrifugebuis met de rest van het virus. Meng de tube goed door elkaar.
- Aliquot 5 μL voor DNA-extracties en bewaar de gezuiverde vector bij -80 °C.
- Was de kolom met 25 ml van 2 M NaCl. Gebruik verder 25 ml 0,1% Triton X-100, voorverwarmd tot 37 °C om de kolom te wassen. Was vervolgens de kolom met 50 ml steriel dH2O en was vervolgens met 25 ml 20% ethanol.
- Zorg ervoor dat het kolommembraan volledig verzadigd is met 20% ethanol, want dit is de opslagoplossing. Sluit de kolom af met de meegeleverde pluggen en bewaar bij 4 °C.
- Bewaar de slang in 1 M NaOH.
OPMERKING: Als het goed wordt schoongemaakt, kunnen heparine sepharose-kolommen tot vijf keer worden hergebruikt.
4 AAV genomische DNA-extractie
- Bereid de in tabel 3 genoemde reactiemix voor in een PCR-buis voor behandeling met DNase.
| Bestanddeel | Volume |
| Gezuiverde AAV-vector | 5 μl |
| 10x DNase-buffer | 2 μl |
| DNase | 1 μl |
| DDH2O | 12 μL |
| Definitief deel | 20 μL |
Tabel 3: DNase treatment master mix formule. Aanbevolen componenten en volumes die nodig zijn voor DNase-behandeling van AAV-virale vectoren tijdens DNA-extractie.
- Vortex de PCR-buis om de PCR-buis te mengen en te pulseren om de inhoud te laten draaien.
- Incubeer met behulp van een thermocycler bij 37 °C gedurende 20 minuten gevolgd door 75 °C gedurende 15 minuten om de DNase te verwarmen.
- Voeg 5 μL Proteinase K toe.
- Incubeer met behulp van een thermocycler bij 50 °C gedurende 60 minuten en vervolgens bij 95 °C gedurende 30 minuten om Proteinase K te verwarmen.
- Gebruik een DNA-opruimkit om mogelijke verontreinigingen te verwijderen.
OPMERKING: Deze stap is uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgbare bloed- enweefselreinigingskit (Tabel met materialen).- Voeg 200 μL AL-buffer (bloed- en weefselreinigingskit, materialentabel)toe aan de PCR-buis met de met DNase/Proteinase K behandelde vector.
- Vortex de PCR-buis en incubeer bij 56 °C gedurende 10 minuten in een thermocycler.
- Pipetteer de vloeistof uit de PCR-buis in een steriele spinkolom die in een opvangbuis zit.
- Voeg 200 μL 100% ethanol toe aan de kolom en meng grondig door vortexing.
- Centrifugeer bij 6.000 x g gedurende 1 minuut en gooi de doorstroming weg.
- Voeg 500 μL buffer AW1 (Blood and tissue clean up kit, Table of Materials)toe aan de spinkolom.
- Centrifugeer bij 6.000 x g gedurende 1 minuut en gooi de doorstroming weg.
- Voeg 500 μL buffer AW2 (Blood and tissue clean up kit, Table of Materials)toe aan de spinkolom.
- Centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 3 minuten en gooi de doorstroming weg.
- Plaats de spinkolom in een steriele centrifugebuis van 1,5 ml en voeg 200 μL buffer AE (bloed- en weefselreinigingskit, materialentabel)rechtstreeks toe aan het membraan van de spinkolom.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
- Centrifugeer bij 6.000 x ggedurende 1 minuut om het DNA te elueren.
- Bewaar het DNA bij -20 °C.
5 Titratie van AAV-vectorgenomen met behulp van kwantitatieve polymerasekettingreactie en een Simian Virus 40 (SV40) probe
OPMERKING: Voer al het qPCR-werk in een PCR-kap uit met behulp van gefilterde pipetpunten om externe DNA-besmetting te voorkomen. Als het AAV-genoom niet codeert voor een SV40-polyA-sequentie, gebruik dan een sonde tegen de ITR die elders is beschreven25. Zorg ervoor dat het plasmide-DNA dat standaard is geselecteerd SV40 polyA-sequentie bevat.
- Voorraad standaard voorbereiding
- Verdun de stamplasmide-DNA-standaard (pTransgene plasmide met SV40 polyA-sequentie) tot een eindconcentratie van 10 μg/μL en bewaar bij -20 °C in aliquots van 6 μL.
- Bepaal het kopienummer dat aanwezig is in de plasmide DNA-standaard met behulp van de volgende online calculator26.
OPMERKING: Gebruik een plasmide-DNA dat wordt gebruikt voor de standaard die door een commerciële leverancier wordt geproduceerd om de kwaliteit en de juiste concentratie te garanderen. Bereid een grote hoeveelheid standaard voor (bijv. 10 ml) om overbruggingsstudies uit te voeren bij de overgang naar een nieuw voorbereide standaard.
- Bereid het volgende reagensmengsel vermeld in tabel 4 voor zowel de monsters als de standaard in een centrifugebuis van 1,5 ml.
OPMERKING: Bereid voldoende overage van mastermix voor. Zie tabel 5 voor primer-/probesequenties.
| Bestanddeel | Volume |
| Universele qPCR master mix (2X) | 10 μl |
| Water van moleculaire kwaliteit | 4,5 μL |
| 40x SV40 polyA primer/sonde | 0,5 μL |
| Definitief deel | 15 μL |
Tabel 4: qPCR master mix voor AAV titratie. Aanbevolen componenten en volumes die nodig zijn voor qPCR van DNA geëxtraheerd uit AAV virale vectoren.
| Bestanddeel | Volgorde |
| Voorwaartse primer | 5'-AGCAATAGCATCACACAAATTTCACAA-3' |
| Omgekeerde primer | 5'-CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT-3' |
| Sonde | /56-FAM/AGCATTTTT/Zen/TTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC/3IABkFQ |
Tabel 5: Primersequenties tegen de SV40 polyA DNA-sequentie. Sequenties van de primers en probe gebruikt voor qPCR-titratie, die binden aan specifieke gebieden van AAV virale vectoren die de SV40 polyA-sequentie bevatten.
- Pipetteer de mastermix op en neer om te mengen.
- Stel de verdunningsplaat in.
- Gebruik een heldere plaat met 96 putten om standaard- en monsterverdunningen te bereiden, voeg 45 μL water van moleculaire kwaliteit toe aan elke put in elke andere kolom, te beginnen met kolom 1 (kolommen 1, 3, 5, 7, 9 en 11).
- Voeg 5 μL van de standaard toe aan goed A1 en pipetteer om te mengen.
- Gebruik een nieuwe gefilterde pipetpunt om een 1/10 verdunning van put A1 naar B1 te maken.
- Ga door met een reeks van 10-voudige verdunningen langs de kolom totdat G1 is bereikt.
- Voeg niet toe aan H1, omdat dit als een negatieve controle zal werken.
- Breng het eerste monster (S1) aan door het toe te voegen aan put A3, waardoor een verdunning van 1/10 ontstaat. Pipetteer dit mengsel en breng 5 μL over op goed B3. Gooi de pipetpunt na deze overdracht weg.
- Meng met een nieuwe pipetpunt de oplossing goed in B3 en vorm een 1/100 verdunning. Breng dit mengsel 5 μLof over op put C3 en gooi de punt na de overdracht weg.
- Pipetteer met een nieuwe pipetpunt de oplossing op en neer in put C3 om een verdunning van 1/1000 te maken. Gooi de punt weg.
- Ga door met het verdunnen van monsters zonder monsters toe te voegen aan de kolommen 2, 4, 6, 8, 10 of 12.
- Zodra alle monsters zijn verdund, mengt u de inhoud in putjes van kolom 1 en brengt u 20 μL over naar kolom 2.
- Herhaal dit voor de kolommen 3, 5, 7, 9 en 11 om replicaties van elke standaard en monsterverdunning te maken. Zie figuur 3 voor de lay-out van de plaat.
OPMERKING: Bij het volgen van de plaatopstelling in figuur 3hebben monsters verdund in rijen G en H slechts 1/10 en 1/100 verdunningen.
Figuur 3: Plaatindeling voor qPCR AAV-titratie. Blauw geeft de plaatsing van de seriële verdunning van de standaard aan; groen geeft de plaatsing van de negatieve controle aan; paars geeft de plaatsing van de verdunning van de monsters aan. Elke standaard, negatief of monster wordt toegevoegd in repliceren. Een voorbeeld voor de concentratie van de standaard is toegevoegd om de verdunningsreeks van de standaard weer te geven, en plaatsing van monsterverdunningen is toegevoegd aan hun respectieve putten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Titratie door SV40 polyA detectie-gebaseerde qPCR
- Voeg 15 μL qPCR-mastermix toe aan elke put van een wit-semi-omrande 96-well qPCR-plaat.
- Breng 5 μL van elk monster over van de heldere 96-well plaat naar de wit-semi-omrande 96 well qPCR plaat.
- Gebruik een meerkanaalspipet om ervoor te zorgen dat de qPCR-mastermix en het monster voldoende worden gemengd.
- Sluit de plaat af met een afdichtingsfolie en centrifugeer de qPCR-plaat bij 1500 x g gedurende 30 s.
- Voer de qPCR-reactie uit op een op platen gebaseerd real-time PCR-versterkings- en detectie-instrument, met behulp van de voorgestelde voorwaarden in tabel 6.
| Afdeling | Cycli | Tijd | Temperatuur | Beschrijving |
| Pre-incubatie | 1x | 5 min. | 95 °C | DNA-denaturatie. |
| Amplificatie | 38x | 15 s | 95 °C | Amplificatie van DNA. Instellingen kunnen worden gewijzigd bij gebruik van alternatieve primers met verschillende gloeitemperaturen. |
| 60 s | 60 °C | |||
| Verkoeling | 1x | 60 s | 40 °C | Plaatkoeling. Einde run. |
Tabel 6: Thermocycler-protocol voor qPCR-titratie op basis van hydrolysesondes. Aanbevolen thermocycler protocol voor het gebruik van probe-gebaseerde qPCR titratie van DNA geëxtraheerde gezuiverde AAV vectoren.
OPMERKING: Voor qPCR AAV titratie werkblad zie Tabel 7.
- Data-analyse om het aantal kopieën van AAV-genoom te bepalen.
- Vul de gegevenscellen van de spreadsheet (tabel 7A) in met de concentratiewaarden die zijn verkregen uit de qPCR-run voor zowel standaard- als monsterverdunningen.
- Gebruik concentratiewaarden uit tabel 7A om een standaardcurve te verkrijgen(tabel 7B).
OPMERKING: De standaardcurve wordt weergegeven als een natuurlijke logaritme (y = a ln(x) + b) samen met R2 efficiëntie. Een standaardcurve moet een rendement hebben van bijna 100 % en R2 van 1,0 (≥0,99). - Vul de hellingefficiëntie in door deze online calculator in te vullen27.
OPMERKING: Een rendement tussen 90% -110% is acceptabel. Als de efficiëntie van qPCR buiten dit bereik ligt, voert u de qPCR opnieuw uit. - Gebruik concentratiewaarden uit tabel 7A om het gemiddelde te nemen van de verdunningen van elk monster en bepaal de standaardafwijking van elk monster (tabel 7C).
OPMERKING: Sluit verdunningen uit monsters uit die meer dan één standaardafwijking verwijderd zijn van het gemiddelde van de monsterverdunningen. - Gebruik de gemiddelde concentratie van elke verdunning, vermenigvuldig met de verdunningsfactor en deel vervolgens door vijf om de vectorgenomen (vg)/μL van elk monster te krijgen(tabel 7C).
- Bereken de vg/ml van elk monster door het gemiddelde van de concentraties van elk monster te vermenigvuldigen met 80.000(tabel 7C).
- Gemiddelde van de vg/ml van elke verdunning om de uiteindelijke vg/ml van elk monster te verkrijgen (tabel 7C).
OPMERKING: De gebruiker moet de gemiddelde concentratie van elke verdunning delen door een factor vijf om rekening te houden met de 5 μL die in elke put wordt belast voor de qPCR-run om de concentratie in vg/μL te produceren. De factor 80.000 verklaart de overgang van de gemiddelde concentratiewaarde van elk monster naar vg/ml. Ten eerste moet het gemiddelde van de concentratiewaarde van elk monster worden vermenigvuldigd met 2 om rekening te houden met de enkelstrengs genomen, omdat de primer-probe-set alleen positief zintuiglijk, enkelstrengs DNA (ssDNA) kwantificeert en het AAV-genoom bestaat in een verhouding van ongeveer 1: 1 tussen positief en negatief zintuig ssDNA25,28. Het gemiddelde van de concentratiewaarde van elk monster moet worden vermenigvuldigd met x40 om rekening te houden met de monsterverdunning van 5 μL gezuiverde vector (punt 4.1) tot 200 μL geëxtraheerd DNA (punt 4.6.12). Ten slotte moet het gemiddelde van de concentratiewaarde van elk monster worden vermenigvuldigd met x1000 om om te zetten van vg/μL naar vg/ml.
6 Beoordeling van vectorkwaliteit en -zuiverheid
- Kwaliteitscontrole - Western Blot
- Bereid een 12% SDS PAGE gel.
- Voer polyacrylamide gel elektroforese uit.
OPMERKING: Laad 6 x 1010 vg monsters per put. - Breng de eiwitten over in het polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan.
- Pvdf-membraan blokkeren
- Verwijder het membraan van het transferapparaat en spoel in 0,1% PBST om los acrylamide te verwijderen.
- Plaats het membraan gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C in een blokkerende oplossing.
OPMERKING: Blokkerende buffer kan verder worden aangevuld met 2% geitenserum.
- Incubatie met primair antilichaam
- Decanteer de blokkerende buffer en voeg het primaire antilichaam toe, een anti-AAV muis monoklonaal antilichaam bij een verdunning van 1:200.
- Incubeer een nacht bij 4 °C.
- Decanteer het primaire antilichaam en was vijf keer met 0,1% PBST gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met agitatie.
- Incubatie met secundair antilichaam
- Decanteer de wasoplossing en voeg HRP-geconjugeerd secundair antilichaam toe, verdund met een blokkeringsbuffer van 1:7500, en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met roeren.
- Decanteer het secundaire antilichaam en was vijf keer met 0,1% PBST gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met agitatie.
- Voer een laatste wasbeurt uit met PBS bij kamertemperatuur met roeren.
- Detecteer de eiwitten met behulp van verbeterd chemiluminescent (ECL) substraat.
- Stel de gel voor om de virale eiwitten (VP1, VP2 en VP3 subeenheden) te visualiseren(Figuur 4).
Figuur 4: Western blot met AAV capsid eiwitten. Rijstrook A; MW ladder, Baan B; AAV6.2FF-hIgG01, Baan C; AAV6.2FF-hIgG02, Baan D; AAV6.2FF-hIgG03 en Lane E; AAV6.2FF-hIgG04. 6 x 1010 vg van elke AAV6.2FF-hIgG werd in hun respectievelijke rijstroken geladen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Purity Control - SDS PAGE en Coomassie Stain
- Bereid SDS-PAGE-gel en monsters zoals beschreven in stap 6.1.1 en 6.1.2.
- Bevestig de gel in fixatieoplossing gedurende 1 uur of een nacht met zacht roeren. Vervang de bevestigingsoplossing eenmaal gedurende het eerste uur.
- Kleur de gel in kleuringsoplossing gedurende 2-4 uur met zachte agitatie.
- Destain de gel met een destaining oplossing. Vul de destaining-oplossing meerdere keren aan totdat de achtergrond van de gel volledig is vastgehouden (4-24 uur).
- Bewaar de vastgehouden gel in een opbergoplossing.
- Stel je de gel voor om alle eiwitten te visualiseren die gekleurd zijn door Coomassie-kleuringsoplossing.
Figuur 5: Coomassie-gekleurde gel. Rijstrook A; MW ladder, Baan B; AAV6.2FF-hIgG01, Baan C; AAV6.2FF-hIgG02, Baan D; AAV6.2FF-hIgG03, Baan E; AAV6.2FF-hIgG04, Baan F; AAV6.2FF-hIgG05 en Lane G; AAV6.2FF-hIgG06. 6 x 1010 vg van elke AAV6.2FF-hIgG werd in hun respectievelijke rijstroken geladen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Alternatieve zuiverheidscontroletest - HEK293 host cell protein detection ELISA
- Voer de HEK293-gastheerceleiwitdetectie uit via ELISA volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Gebruik verdunningen van 5 x 10-2 en 1 x 10-3 voor gezuiverde rAAV-monsters. Zodra TMB aan de put is toegevoegd, incubeer je weg van het licht. Lineaire regressie kan niet worden gebruikt om de resultaten te analyseren. - Voer een point-to-point analyse, kubische spline of vier-parameter logistieke fitmethode uit om concentraties van onbekenden te interpoleren en te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor om de oorspronkelijke monsterconcentratie te bepalen.
- Voer de HEK293-gastheerceleiwitdetectie uit via ELISA volgens de instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De vertaling van kleine knaagdiermodellen naar grotere diermodellen en uiteindelijke klinische toepassing vormt een aanzienlijke uitdaging vanwege de grote hoeveelheid AAV die nodig is om grotere dieren te transduceren en therapeutische effecten te bereiken. Om de transductie-efficiëntie van de rationeel ontworpen AAV6.2FF-capsid te vergelijken, toonde eerder een 101-voudige toename van transductie-efficiëntie in muizenspiercellen in vergelijking met AAV63, muizen, hamsters en lammeren kregen allemaal AAV6.2FF toegediend die een humaan monoklonaal antilichaam (hIgG) tot expressie bracht. De AAV6.2FF-hIgG-expressievector bevatte een CASI-promotor4,een Woodchuck hepatitisvirus post-transcriptioneel regulerend element (WPRE) en een SV40 polyA-sequentie. Zes weken oude vrouwelijke BALB/c (n = 4) muizen kregen intramusculair (IM) 1 x 1011 vg AAV6.2FF-hIgG toegediend in 40 μL, en bloed werd verzameld op dag 0, 7, 14, 21 en 28 na toediening van AAV voor hIgG-monitoring. Vier weken oude Syrische hamsters (twee vrouwtjes en twee mannetjes) kregen 1 x 1012 vg AAV6.2FF-hIgG toegediend in 40 μL en er werd wekelijks bloed verzameld om te controleren op hIgG-expressie. Ten slotte kregen 10 dagen oude mannelijke Dorset-lammeren (n = 3) IM toegediend 1 x1013 vg / kg AAV6.2FF-hIgG in twee tot drie injecties van 1 ml in de romp. De wekelijkse bloedafname werd voltooid door halsbloedingen en hIgG werd wekelijks gedurende 28 dagen gecontroleerd. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care Committee van de Universiteit van Guelph.
Muizen IM toegediend 5 x 1012 vg/kg AAV6.2FF-hIgG uitgedrukt tussen 171-237 μg/ml hIgG in het serum op dag 28 na toediening(figuur 6). Hamsters IM toegediend 2 x 1013 vg / kg AAV6.2FF-hIgG uitgedrukt veel hogere niveaus dan de muizen, met serum hIgG-niveaus van 495-650 μg / ml op dag 28 na toediening. Ten slotte toegediende schapen IM 1 x 1013 vg/kg uitgedrukte serum hIgG-spiegels van 21-46 μg/ml op dag 28 na toediening. In alle diermodellen leek de vector geen gezondheidsindices, zoals gewicht, te belemmeren, wat de veiligheid en kwaliteit van de geproduceerde vectoren bewijst. Het is bekend dat de expressie van AAV-gemedieerde monoklonale antilichamen (mAb) aanzienlijk varieert, afhankelijk van de soort en de mAb. Voor zover de auteurs weten, zijn er geen meldingen van AAV-mAb-expressie bij schapensoorten, dus er is geen benchmark voor verwachte expressieniveaus. Het is opmerkelijk dat de schapen in deze studie verdubbelden in gewicht gedurende de 28-daagse post-injectieperiode en dat de dieren in figuur 6 allemaal werden getransduceerd met verschillende AAV-mAbs en dus niet kunnen worden vergeleken.
Figuur 6: Intramusculaire toediening van AAV6.2FF-hIgG leidt tot aanhoudende serum hIgG-expressie bij muizen, hamsters en schapen. Vrouwelijke BALB/c muizen (n = 4) kregen IM toegediend 5 x 1012 vg/kg AAV6.2FF-hIgG, Syrische hamsters (2 mannetjes, 2 vrouwtjes), kregen IM toegediend 1 x 1013 vg/kg AAV6.2FF-hIgG, en 10 dagen oude mannelijke Dorset lammeren (n = 3) kregen IM toegediend 1 x 1013 vg/kg. Serum werd gecontroleerd op hIgG-expressie gedurende een periode van 28 dagen. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Transfectie van celkweekkamer | |||||
| Protocol | |||||
| 1. Laat DNA, OptiMEM en PEI opwarmen tot kamertemperatuur voorafgaand aan transfectie | |||||
| 2. Voer het aantal te transfecteren celstapels in (geen overschrijding vereist) | |||||
| 3. Zorg ervoor dat de DNA-concentraties correct zijn, omdat dit de vereiste volumes zal veranderen | |||||
| Aantal celkweekkamers | 1 | ||||
| Concentratie van transgen plasmide | 1 | mg/ml | |||
| Concentratie van pDGM6.2FF plasmide | 1 | mg/ml | |||
| Hoeveelheid Per cel kweekkasten | Transfectie Mastermix | ||||
| OptiMEM | 48.1 | Ml | 48.1 | Ml | |
| 1:3 verhouding pTransgene:pHelper | pTransgene | 475 | μg | 475 | μl |
| pHelper | 1425 | μg | 1425 | μl | |
| 4. Voeg de vereiste volumes OptiMEM- en plasmide-DNA toe aan een conische buis van 50 ml | |||||
| 5. Keer 10 keer om om te mengen | |||||
| 3:1 PEI:DNA verhouding | PEI Max | 5.7 | Ml | 5.7 | Ml |
| 6. Voeg de vereiste hoeveelheid PEI toe aan de buis van 50 ml met het DNA Van OptiMEM en plasmide | |||||
| 7. Sluit onmiddellijk de 50 ml buis en vortex en keer 3-5 keer om om te mengen. | |||||
| 8. Stel een timer in voor 10 minuten voor de PEI-complexen om te incuberen | |||||
| 9. Verplaats celstapels om te worden getransfecteerd in de BSC | |||||
| 10. Giet na 10 minuten het trasnfectionmengsel in één sinaasappelpoort. | |||||
| 11. Meng voorzichtig vloeistof door de celstapel | |||||
| 12. Breng de getransfecteerde cellenstapel terug naar de incubator en zorg voor een gelijk volume op elke laag | |||||
| 13. Oogst celkweek kamer 72 h later | |||||
Tabel 2: Transfectiecalculator voor celkweekkamer. Interactief werkblad om de juiste concentratie van pTransgene, pHelper en PEI voor transfectie van celkweek te bepalen.
Tabel 7: AAV-titratiecalculator. Interactief werkblad om de uiteindelijke concentratie van AAV-monsters van qPCR te bepalen, uitgedrukt als vg/ml. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De productie van recombinante AAV (rAAV) vectoren beschreven in dit artikel maakt gebruik van gemeenschappelijke materialen, reagentia en apparatuur gevonden in de meerderheid van de moleculair biologische onderzoekslaboratoria en faciliteiten. Dit papier maakt het mogelijk om hoogwaardige in vitro en in vivo kwaliteit rAAV te produceren door de lezer. Bovenal is dit protocol voor rAAV-productie, vergeleken met meer vervelende protocollen met cesiumchloridezuivering, efficiënt en vermijdt het gebruik van ultracentrifugatie. Zodra HEK293-cellen zijn getransfecteerd, is gezuiverde AAV binnen 5 werkdagen klaar voor gebruik.
Tijdens het rAAV-productie- en zuiveringsproces kunnen vele stappen de zuiverheid en eindtiter van de vector beïnvloeden. De eerste en meest kritische stap is de gezondheid van de HEK293-cellen, die een direct effect heeft op de vectortiter. Het gebruik van HEK293-cellen in tegenstelling tot andere celtypen of -systemen, zoals HEK293T-cellen, is voordelig omdat HEK293-cellen een groter vermogen hebben om zich te hechten aan de plastic coating van platen en cellen, waardoor robuuste celnetwerken worden gecreëerd voor continue celgroei. Het wordt aanbevolen om cellen te controleren op mycoplasmabesmetting en om te voorkomen dat HEK293-cellen voorbij ~ 40 passages passeren of zodra hun verdubbelingstijd lijkt te vertragen, omdat dit zal leiden tot lagere AAV-opbrengsten. Bovendien zorgt het bevestigen van cellen voor ongeveer 80% confluent voorafgaand aan transfectie ervoor dat cellen niet te dun of overwoekerd zijn. Met betrekking tot de transfectiecomponenten wordt het gebruik van hoogwaardig plasmide-DNA (bijv. commercieel bereid plasmide-DNA) sterk aanbevolen om ervoor te zorgen dat DNA in oplossing blijft en goed interageert met chemische transfectieafgiftecomponenten, zoals PEI. Ten slotte heeft het transfectiereagens een aanzienlijke invloed op de rAAV-opbrengst. Hier wordt PEI gebruikt als transfectiemiddel. PEI is een stabiel kationisch polymeer dat exogene DNA aflevert aan de kern van cellen door de productie van plasmide-polymeercomplexen, die vervolgens door cellen worden opgenomen en via gastheercelprocessen naar de kern worden verhandeld29. PEI-gebaseerde transfecties zijn snel en gemakkelijk in vergelijking met andere methoden van DNA-afgifte, waaronder calciumfosfaat of lipofectamine. De verhouding PEI:DNA moet echter worden geoptimaliseerd.
Het gebruik van celstapels in tegenstelling tot traditionele hechtende platen biedt een handigere en consistentere methode voor de productie van rAAV. Celstapels omvatten minder technische manipulatie tijdens transfectie, waardoor de mogelijke loslating van cellen uit de aanhangende monolaag wordt verminderd, waardoor sterkere celnetwerken en een betere productie van rAAV mogelijk worden. Na transfectie is de verzameling van supernatant en lysis van cellen efficiënt en consistent. Om rAAV uit cellen te oogsten, zijn fysieke cellysismethoden zoals vries-ontdooien inefficiënt en inconsistent, omdat er geen manier is om ervoor te zorgen dat alle cellen worden gelyseerd. Hier wordt een chemische lysisprocedure beschreven. Het gebruik van chemische lysisbuffer zorgt ervoor dat alle cellen worden blootgesteld aan het lysismiddel in een specifieke concentratie, evenals additieven zoals proteaseremmer om capsid-afbraak te voorkomen. Deze methode lyseert cellen consistenter, waardoor een efficiëntere oogst van rAAV mogelijk is. Bovendien elimineert het pelleteren en verwijderen van cellulair afval mogelijke verontreinigingen uit het ruwe lysaat, wat de tijd en kosten van het filteren van lysaat voorafgaand aan de zuivering kan verhogen.
Hoewel rAAV in grote hoeveelheden aanwezig kan zijn in het ruwe lysaat, kan de handeling van het afvangen en reinigen van de rAAV verschillen tussen verschillende zuiveringsmethoden, zoals cesiumchloridegradiënten. Hier biedt het gebruik van heparine sepharose affiniteitschromatografiezuivering een snelle en eenvoudige methode voor vectorzuivering die resulteert in ultrapuur virus en geen gradiënt ultracentrifugatie vereist. Niet alle AAV-serotypen bevatten echter heparinebindende domeinen, dus voor die serotypen zou deze zuiveringsmethode niet geschikt zijn. Terwijl AAV2 en AAV6 bijvoorbeeld heparinesulfaat binden, doen AAV4 en AAV5 niet30. Hoewel deze methode niet universeel is, is het efficiënt en gemakkelijk voor die capsiden die heparinesulfaat binden. In tegenstelling tot ultra-centrifugatiegradiënten zoals iodixanol, worden alle rAAV-deeltjes gebonden aan het membraan van de kolom totdat ze worden geëlueerd met behulp van wasbeurten met een hoge zoutconcentratie, waardoor problemen zoals het mengen van gradiënten en vaardigheden die nodig zijn om fracties van de gradiënt te herstellen, worden vermeden. Elutie door wasbeurten met een hoge zoutconcentratie maakt een gecontroleerde en nauwkeurige elutie van het virus in fracties mogelijk die verder kunnen worden geconcentreerd. Alleen het concentreren van bepaalde fracties van het geëlueerde virus verwijdert verder potentiële verontreinigingen terwijl >97% van het geëlueerde virus wordt teruggewonnen. Een beperking van heparine sepharose affiniteit chromatografie zuivering is dat het geen onderscheid maakt tussen lege en volle deeltjes. Aanvullende analytische ultracentrifugatiestappen zouden moeten worden opgenomen om lege capsiden te verwijderen31.
qPCR is een kosteneffectieve en snelle methode voor het bepalen van het aantal vectorgenomen in een AAV-vectorvoorbereiding. Hoewel qPCR een gevoelige kwantificeringsmethode is, geeft het geen informatie over het aantal infectieuze deeltjes in de prep. Bovendien kan de gevoeligheid van deze test resulteren in variabiliteit, omdat technische fouten tijdens het pipetteren kunnen leiden tot inter-assay variabiliteit. Dus voor elk experiment waarbij verschillende AAV-vectoren worden vergeleken, is het van cruciaal belang dat de vectoren op dezelfde qPCR-plaat worden getitereerd. Ondanks deze beperkingen is qPCR de meest nauwkeurige methode die is ontwikkeld voor het titeren van AAV en is momenteel de meest gebruikte en geaccepteerde methode voor kwantificering van AAV-vectoren32. Het gebruik van een primer/probe die bindt aan de SV40 polyA van een rAAV genoom is gebaseerd op het feit dat deze sequentie bewaard blijft in veel AAV genoom plasmiden die in het laboratorium zijn ontwikkeld. Naast het kiezen van een geconserveerde sequentie tussen de rAAV-genoomplasmiden van de lezer, kunnen qPCR-probes worden ontworpen voor alle delen van het rAAV-genoom, inclusief, maar niet beperkt tot, promotors, transgenen of post-transcriptionele factoren.
Het beoordelen van de zuiverheid en kwaliteit van het AAV-product is een belangrijke stap in het productieproces. Western blotting kan worden gebruikt om de VP1-, VP2- en VP3-structurele eiwitten te detecteren die de capsid van AAV vormen, evenals eventuele gewijzigde vormen van VP. VP1, VP2 en VP3 zijn meestal aanwezig in een verhouding van 1: 1: 10, maar dit kan variëren van 1: 1: 5 tot 1: 1: 20, afhankelijk van het serotype. Daarom is het van cruciaal belang om de verhouding voor elk systeem empirisch te bepalen, vooral omdat is aangetoond dat het N-terminale gebied van VP1 belangrijk is voor infectiviteit en transductie33. SDS-PAGE in combinatie met Coomassie-kleuring is een vrij eenvoudige methode voor het detecteren van VP1, VP2 en VP3, evenals gastheerceleiwitverontreinigingen. Het gebruik van fluorescerende eiwitvlekken zoals SYPRO Ruby bieden een hogere gevoeligheidsdetectie van gastheerceleiwitverontreinigingen dan Coomassie; niet alle laboratoria hebben echter toegang tot de beeldvormingsapparatuur die nodig is om de gel te visualiseren. Ten slotte kunnen commerciële ELISA's worden gebruikt om gastheerceleiwitverontreinigingen te kwantificeren in AAV-vectoren die in HEK293-cellen worden geproduceerd.
Dit protocol biedt een diepgaand overzicht van de productie van hoge titer, hoge zuiverheid rAAV voor serotypen die binden aan heparine. In de sectie representatieve resultaten toont het gebruik van nieuwe AAV6.2FF die hIgG tot expressie brengt in verschillende diermodellen de veiligheid en efficiëntie van deze rAAV in vivo. Hoewel de AAV6.2FF-vector IM werd toegediend, kunnen deze hoogwaardige, zeer zuivere virussen in vivovia verschillende routes worden toegediend, omdat mogelijke ontstekingsverontreinigende stoffen, zoals gastheerceleiwit, zijn geëlimineerd door onze zuiveringsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sarah K. Wootton is uitvinder van een Amerikaans patent US10806802B2 voor de AAV6.2FF capsid.
Acknowledgments
Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas en Jacob G. E. Yates ontvingen Ontario Veterinary College Student Stipendommen en Ontario Graduate Scholarships. Amira D. Rghei ontving een Mitacs Accelerate Studentship. Dit werk werd gefinancierd door de Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant (# 66009) en een Collaborative Health Research Projects (NSERC partnered) grant (# 433339) aan SKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 1-Butanol | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| 10 chamber cellstack | Corning | 3271 | |
| 1L PETG bottle | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 1610158 | |
| 96-well skirted plate | FroggaBio | FS-96 | |
| Adhesive plate seals | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Blood and Tissue Clean up Kit | Qiagen | 69506 | Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Cell Culture Dishes | Greiner bio-one | 7000232 | 15 cm plates |
| Culture Conical Tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 mL conical tube |
| Culture Conical Tube | Fisher Scientific | 14955240 | 50 mL conical tube |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| Ethanol | Greenfield | P016EA95 | Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| HBSS with Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| HBSS without Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| HEK293 cells | American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots |
| HEK293 host cell protein ELISA kit | Cygnus Technologies | F650S | Follow manufacturer’s instructions |
| Heparin sulfate column | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
| Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
| Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion | Corning | CLS431124 | Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions |
| Large Volume Centrifuge Tubes | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL centrifuge tubes |
| MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use |
| Molecular Grade Water | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma Aldrich | L5125 | CAUTION. Wear gloves |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
| Optimem, reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | Sterilize prior to use |
| PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Dilute to 1x for use on cells |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
| pHelper plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | |
| Pipet basin | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Purchase sterile pipet basins |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | CAUTION. Wear gloves |
| Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 24765-1 | Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C |
| Polypropylene semi-skirted PCR Plate | FroggaBio | WS-96 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | CAUTION. Wear gloves |
| polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Cytiva Life Sciences | 10600023 | Use forceps to manipulate. Wear gloves. |
| Primary antibody | Progen | 65158 | |
| Protein Ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| pTrangene plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0 |
| Pump tubing | Cole-Parmer | RK-96440-14 | Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5 |
| RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer | Promega | M6101 | Use at 10x concentration in protocol from section 4.0 |
| RQ1 Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | |
| Sample dilutent | Cygnus Technologies | I700 | Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit |
| Secondary antibody, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
| Skim milk powder | Oxoid | LP0033B | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| SV40 polyA primer probe | IDT | Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
| Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff |
| Universal Nuclease for cell lysis | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
| Universal qPCR master mix | NEB | M3003L | |
| Whatman Paper | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 21985023 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals. |
References
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Nathwani, A. C., et al. Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).
- Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
- Ylä-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss (2020).
- FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease (2020).
- Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics (2020).
- Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).
- Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).
- Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA. Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).
- Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).
- Ling, C. Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo. Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).
- Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Pillay, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor. Journal of Virology. 91 (18), (2017).
- Merkel, S. F. Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells. Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).
- van Lieshout, L. P., et al. A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).
- Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).
- Liu, J., Moon, Y. -A. Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression. Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).
- Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).
- Kimura, T., et al. Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- dsDNA copy number calculator. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html (2021).
- qPCR Efficiency Calculator - CA. , Available from: http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html (2021).
- Lamb, R. A., Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology. , Available from: https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication (1996).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
- Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity. Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).
- Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
- Backovic, A., et al. Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).
