Développement d’une bande immunochromatographique à flux latéral pour la détection rapide et quantitative de composés de petites molécules

Published: November 13, 2021
doi:

Abstract

Les bandelettes immunochromatographiques à flux latéral (CSI) à base de membrane sont des outils utiles pour l’autodiagnostic à faible coût et ont été appliquées efficacement à la détection des toxines, de l’indice physiologique et des biomarqueurs cliniques. Dans ce protocole, nous fournissons une description détaillée des étapes de développement d’un immunodosage rapide, sensible et quantitatif à flux latéral (en utilisant les AuNPs comme marqueur et les mAbs comme sonde). La procédure décrit la préparation et la caractérisation de l’or colloïdal, la synthèse du conjugué AuNP-mAb, l’assemblage de la bande immunochromatographique et l’étude méthodologique du test. Les résultats ont montré que les bandelettes finales peuvent être utilisées pour l’autodiagnostic rapide et pratique d’une petite molécule, ce qui peut fournir un outil alternatif dans l’analyse rapide et précise des indices physiologiques et biologiques.

Introduction

Les bandelettes immunochromatographiques à flux latéral (CSI) à base de membrane sont des outils utiles pour une détection rapide et à faible coût. La membrane de nitrocellulose en tant que support et l’or colloïdal en tant que marqueurs des réactifs de diagnostic rapide par chromatographie immunitaire sont la méthode POCT (point of care testing) la plus couramment utilisée, et la portée des tests du projet est plus large. Depuis leur application initiale dans la surveillance pendant la grossesse, leur utilisation a été étendue pour surveiller l’état de coagulation sanguine1,2, les lésions myocardiques3, la médecine vétérinaire4, les résidus de pesticides5, les maladies infectieuses6 et les concentrations de médicaments. D’autres types d’échantillons peuvent être évalués, y compris l’urine, la salive, le sang total, le sérum et d’autres fluides corporels7,8,9.

Au cours des dernières années, de nombreux nouveaux tests ont été développés pour détecter les biomarqueurs dans le diagnostic des troubles, y compris HPLC, UPLC, LC-MS et ELISA, qui sont sensibles et précis, crédibles et spécifiques. Cependant, ces méthodes nécessitent une instrumentation sophistiquée, un prétraitement complexe et des traitements chronophages9. Par conséquent, le développement d’une stratégie de diagnostic au point de service plus rapide et plus pratique pour la détection en temps réel et en temps réel des composés actifs médicinaux est urgent10,11.

La popularité des ICS, en particulier pour les tests courants, est motivée par leur facilité d’utilisation, car ils ne nécessitent pas de professionnels ou de configurations instrumentales élaborées12. En d’autres termes, les personnes qui n’ont pas de formation spéciale peuvent utiliser des bandelettes ou des auto-tests13. Les résultats du test peuvent être obtenus en 5 minutes, ce qui signifie qu’il peut être utilisé pour des inspections de site14. De plus, selon nos calculs, le coût des bandes pourrait être inférieur à 1 RMB15, ce qui signifie que les tests sont peu coûteux pour promouvoir16. Par conséquent, l’ICS est un appareil jetable relativement précis, simple et peu coûteux. Les ICS basés sur l’or colloïdal17,18 sont également appliqués dans la détection rapide de la COVID-19.

Le principe de l’ICS peut être divisé en ICS sandwich et ICS compétitif. La figure 1A est un diagramme schématique du SCI sandwich, qui est principalement utilisé pour détecter les substances macromoléculaires telles que les protéines, y compris les marqueurs tumoraux, les facteurs inflammatoires et la gonadotrophine chorionique humaine (HCG, antigène de grossesse précoce). Dans cette méthode, des anticorps appariés ciblant différents épitopes de l’antigène sont utilisés, et l’anticorps de capture est séché sur la membrane NC comme ligne de test. L’anticorps marqué est séché sur le tampon conjugué et l’anticorps secondaire est utilisé comme ligne de contrôle.

La figure 1B est un diagramme schématique des SCI concurrents, qui est principalement utilisé pour détecter les substances à petites molécules (MWCO < 2000 Da). L’antigène de revêtement est fixé sur la membrane NC comme ligne de test, et l’anticorps marqué est séché sur le tampon conjugué. Au cours de la détection, l’échantillon et l’anticorps marqué circulent à travers la ligne de détection sous action capillaire, et l’antigène enrobé se lie de manière compétitive à l’antigène libre dans l’échantillon et développe une couleur rouge sur la ligne de détection.

Récemment, nous avons décrit la procédure de génération d’anticorps monoclonaux contre des produits naturels19. Dans ce travail, nous avons développé un nouveau test immunologique à flux latéral basé sur l’anti-SSD mA20 préparé pour une détection rapide sur site. Les résultats indiquent que le test d’immunochromatographie est un outil indispensable et pratique pour détecter les composés naturels dérivés de produits.

Figure 1
Figure 1 Schéma du test d’immunochromatographie (A) Bandelettes de test immunochromatographiques sandwich. (B) Bandelettes de test immuno chromatographiques compétitives indirectes. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhang et al.,201821. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Toutes les procédures effectuées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Université de médecine chinoise de Beijing (numéro d’approbation 2017BZYYL00120). 1. Préparation et caractérisation de l’or colloïdal REMARQUE: Pour la synthèse de l’or colloïdal, comme l’or colloïdal est facilement adsorbé sur la paroi interne du récipient et est sujet à la précipitation par les impuretés, le récipient …

Representative Results

Caractérisation de l’or colloïdalLes solutions d’or colloïdal préparées étaient rouge clair. Des analyses TEM ont été utilisées pour déterminer la morphologie et la forme des AuNPs (Figure 2A-D). Les figures 2A et 2B révèlent que les particules sont de forme polyédrique et uniformément réparties. Le diamètre moyen des AuNPs s’est avéré être d’environ 14 nm<strong class…

Discussion

Dans ce travail, nous présentons un protocole pour la préparation de mAbs contre de petites molécules dérivées de produits naturels. Les étapes essentielles et les questions nécessitant une attention particulière dans la procédure ont été décrites, et nous avons démontré l’utilité de ce protocole en utilisant le SSD à petite molécule comme exemple. Des exemples de spectres, d’images TEM, de résultats quantitatifs et d’investigations méthodologiques sont présentés dans des données représentati…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les Fonds spéciaux pour la recherche fondamentale des établissements d’enseignement supérieur affiliés aux départements centraux. Nous apprécions le soutien de l’équipe de recherche fondamentale sur la prescription classique de l’Université de médecine chinoise de Beijing.

Materials

Chloroauric acid solution (HAuCl4) Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory JY-SJ102
bovine serum albumin AMRESCO 332
centrifuge tube 15 mL Corning 430645
centrifuge tube 50 mL Corning 430828
ELISA plates, 96 well NUNC 655101
Filter paper Sinopharm H5072
Glass fibre membranes Jieyi XQ-Y6
goat-anti-mouse IgG antibody applygen C1308
Nitrocellulose membranes Millipore millipore 180
ovalbumin Beijing BIODEE 5008-25g
PEG20000 Sigma Aldrich RNBC6325
Pipette 10mL COSTAR 4488
Pipette 25mL FALCON 357525
semi-rigid PVC sheets Jieyi JY-C104
Sodium citrate Beijing Chemical Works C1034
sodium periodate Sinopharm Chemical BW-G0008
Sulfo-GMBS Perbio Science Germany 22324
TipOne Tips 1,000 µL Starlab S1111-2021
Tris-HCl Solarbio 77-86-1
TWEEN 20 Solarbio 9005-64-5

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Cite This Article
Zhang, Y., Cao, P., Lu, F., Cheng, J., Qu, H. Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds. J. Vis. Exp. (177), e62754, doi:10.3791/62754 (2021).

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