Summary
Een voorbijgaande broeiwond (65 °C ± 0,5 °C, 3 s) van één achterpoot verlaagt de drempel (g) tot von Frey filamentstimulatie van de ipsilaterale zijde en verandert het looppatroon. Bovendien veroorzaakt brandwonden depressie-achtig gedrag in de gedwongen zwemtest.
Abstract
Broeiwater is de meest voorkomende oorzaak van brandwonden bij zowel oudere als jonge populaties. Het is een van de grootste klinische uitdagingen vanwege de hoge mortaliteit en gevolgen in lage- en middeninkomenslanden. Brandwonden veroorzaken vaak intense spontane pijn en aanhoudende allodynie, evenals levensbedreigende problemen. Wat nog belangrijker is, overmatige pijn gaat vaak gepaard met depressie, wat de kwaliteit van leven aanzienlijk kan verminderen. Dit artikel laat zien hoe een diermodel te ontwikkelen voor de studie van brandwonden-geïnduceerde pijn en depressie-achtig gedrag. Na anesthesie werd brandwonden veroorzaakt door één achterpoot van de muis gedurende 3 s in heet water (65 °C ± 0,5 °C) te dompelen. De von Frey-test en geautomatiseerde loopanalyse werden om de 2 dagen na brandwonden uitgevoerd. Daarnaast werd depressie-achtig gedrag onderzocht met behulp van de geforceerde zwemtest en werd de rota-staaftest uitgevoerd om de abnormale motorische functie na brandwonden te differentiëren. Het belangrijkste doel van deze studie is het beschrijven van de ontwikkeling van een diermodel voor de studie van door brandwonden veroorzaakte pijn en depressie-achtig gedrag bij muizen.
Introduction
Weefselschade, zoals brandwonden en trauma, wordt over het algemeen geassocieerd met het gelijktijdig optreden van acute pijn. Brandwonden en traumagerelateerde symptomen zijn naar schatting 1.80.000 sterfgevallen per jaar worden veroorzaakt door brandwonden - de overgrote meerderheid komt voor in lage- en middeninkomenslanden van verschillende soorten brandwonden1. Volgens een wereldwijd rapport komen brandwonden vaak voor bij kinderen en zijn ze goed voor ongeveer 40% -60% van de gehospitaliseerde patiënten 2,3. Deze specifieke verwondingen zijn nog ernstiger omdat ze in het dagelijks leven kunnen voorkomen, zoals kokend of zwemwater 4,5. Hoewel acute pijn in de meeste gevallen spontaan kan worden opgelost na herstel van weefselbeschadiging, kan het mogelijk zijn om chronisch te worden als gevolg van abnormale veranderingen in het zenuwstelsel 6,7.
Onlangs is gesuggereerd dat acute pijn een depressieve stemming kan veroorzaken en chronische pijn kan angst en depressie veroorzaken 8,9,10,11. Het naast elkaar bestaan van pijn en depressie maakt het moeilijker om de patiënt te behandelen. Depressie heeft ook de neiging om de pijngevoeligheid te verhogen, wat waarschijnlijk intensere depressie en pijn zal veroorzaken12. Complicaties van pijn en depressie worden getoond in diermodellen van perifere ontsteking 13,14,15,16. De gedetailleerde mechanismen die ten grondslag liggen aan door pijn geïnduceerde depressie zijn tot nu toe niet goed bekend17. Het is dus noodzakelijk om effectievere behandelingen voor brandwonden te ontwikkelen om de bijwerkingen en symptomen te verlichten.
De huidige studie was dus ontworpen om een diermodel te ontwikkelen om door brandwonden veroorzaakte acute pijn en depressie-achtig gedrag bij muizen te bestuderen. Hiervoor werden brandwondengerelateerde abnormale tactiele gevoeligheid, veranderd looppatroon en depressie-achtig gedrag gemeten. Bovendien probeert deze studie het model te valideren met behulp van NSAID's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Chungnam National University in Zuid-Korea en vervolgens uitgevoerd op basis van de ethische richtlijnen van de International Association for the Study of Pain18.
1. Inductie van broeiend brandwondenletsel op de achterpoot
- Huisvest de mannelijke ICR-muizen met een gewicht van 20-25 g in een lichte en temperatuurgecontroleerde kamer (12/12 uur licht-donkercyclus, 22,5 ° C ± 2,5 ° C) met een vochtigheid van 40% -60%.
OPMERKING: Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen kunnen voor dit protocol worden gebruikt. - Geef het dier vrije toegang tot voedsel en water en acclimatiseer gedurende ten minste 1 week voordat het experiment wordt gestart.
OPMERKING: Alle dieren werden in groepshuisvesting geplaatst om variabelen zoals isolatiestress uit te sluiten. - Wijs de muizen willekeurig toe aan de experimentele of controlegroep en voer blinde experimenten uit met diernummers als codes.
- Verdoof de muis op de dag van brandwondeninductie door intraperitoneale (i.p.) injectie van 300 μL alfaxalone in een dosis van 100 mg / kg. Draag een chirurgische japon, handschoenen en masker tijdens het uitvoeren van de brandwondeninductie.
- Na het diep verdoven van de muis, desinfecteer je rond de rechterachterpoot met 70% ethanol.
OPMERKING: Controleer het gebrek aan respons op knijpstimulatie toegepast op de achterste tenen of staart om de toestand van diepe anesthesie te bevestigen. - Breng een oogheelkundige zalf aan op de ogen om te voorkomen dat het hoornvlies droogt na inductie van anesthesie.
- Dompel de rechterachterpoot van de diep verdoofde muis onder in heet water bij 65 °C ± 0,5 °C gedurende 3 s. Maak een markering op de enkel van elke muis voordat je de achterpoot onderdompelt in heet water om de consistentie in het verbrande gebied te behouden.
- Breng na inductie van brandwonden de muizen in een schone thuiskooi en plaats ze op een verwarmingskussen totdat de dieren herstellen van de anesthesie.
OPMERKING: Het pijnstillende middel, paracetamol (200 mg / kg), werd intraperitoneaal eenmaal daags toegediend gedurende 7 dagen vanaf de dag van brandwonden (alleen Burn + Acetaminophen-groep). De Burn-groep werd behandeld met zoutoplossing als voertuigcontrole. Het experiment werd uitgevoerd volgens de methode beschreven in een eerdere studie4.
2. Meting van mechanische allodynie
- Breng de muizen naar de gedragstestruimte en laat ze minstens 30 minuten voorafgaand aan de test acclimatiseren. Draag een operatiejas, handschoenen en masker tijdens het uitvoeren van de test.
- Plaats de muizen in een vierkante doos (diameter: 13 cm, hoogte: 12 cm) op een metalen gaasvloer (maaswijdte: 0,7 cm x 0,7 cm) en laat ze minstens 30 minuten acclimatiseren.
- Beoordeel de mechanische drempel van de achterpoot met behulp van de oplopende stimulusmethode19,20.
- Prik voorzichtig in een reeks von Frey-filamenten met intervallen van 5-8 s om de achterste plantaire te stimuleren. Verkrijg de basiswaarden op de dag vóór de brandinductie.
OPMERKING: De 0,16-1,2 g von Frey-filamenten werden bij de test gebruikt om de pootonttrekkingsdrempel bij alle dieren te meten. De pootonttrekkingsresponstest werd gestart met de laagste buigkracht van von Frey-filament (0,16 g in dit protocol). Als er geen reactie was, werd een filament met de volgende buigkracht toegepast. - Voer vijf proeven uit om mechanische drempels voor elke ipsilaterale (gewonde) achterpoot te evalueren.
OPMERKING: De buigkracht van von Frey filament die meer dan drie keer de respons van de vijf proeven bij elk dier produceert, werd uitgedrukt als pootonttrekkingsdrempel (PWT, g). Mechanische drempels werden een dag voor en op 1, 3, 5 en 7 dagen na brandwonden gemeten. Het analgetische effect werd 1 uur na toediening van de paracetamol bij het dier beoordeeld.
3. Geautomatiseerde loopanalyse
- Acclimatiseer de muizen eenmaal daags in het loopanalysesysteem gedurende 10-15 minuten vanaf 5 dagen vóór de brandwond. Draag een chirurgische japon, handschoenen en masker tijdens het uitvoeren van loopanalyses.
- Breng de muizen op de dag van de test naar de gedragstestruimte en acclimatiseer ze gedurende ten minste 30 minuten vóór de test.
OPMERKING: Voer acclimatisatie- en loopanalysetests uit in een donkere omgeving. Stel de voorwaarden van het programmamenu als volgt in.- Nadat u het programma hebt uitgevoerd, klikt u op het menu Nieuw experiment maken om de map aan te wijzen waarin de gegevens moeten worden opgeslagen.
- Stel na de aanwijzing de maximale looptijd in op 5 s en de maximaal toegestane snelheidsvariaties op 50%.
- Selecteer een geregistreerde camera en stel de loopbruglengte in op 30 cm op het tabblad Instellingen van het programma.
- Selecteer op het tabblad Verwerven van het programmamenu de optie Acquisitie openen.
- Klik op basis van de statusberichten op de knop Achtergrond uitlijnen om een achtergrondafbeelding van een lege loopbrug te verkrijgen.
- Klik op de knop Acquisitie starten en plaats de muis bij de ingang van de links-rechts doorkruisbare loopbrug. De opname wordt automatisch gestart na de vrije beweging van de muis.
OPMERKING: Als de gang van het dier met succes is geregistreerd en alle voetstappen zijn gedetecteerd, wordt deze gemarkeerd als Compliant Run met een groen pictogram. Als de software geen voetstappen detecteert, wordt een rood pictogram weergegeven, in welk geval het wordt aanbevolen om de opname opnieuw uit te voeren. De auteurs raden aan om ten minste vijf succesvolle compatibele runs te verzamelen en te analyseren die met vergelijkbare hardloopsnelheden worden uitgevoerd. - Selecteer op het tabblad Acquire van het programmamenu de optie Runs classificeren.
OPMERKING: Nadat u de gegevens hebt geselecteerd die zijn verkregen uit de succesvolle nalevingsrun hierboven, gaat u naar het video-analysescherm waar de looppatronen van de muizen werden vastgelegd. - Selecteer de te analyseren run en klik op de knop Auto Classify ( Auto Classify ).
- Na het uitvoeren van automatische classificatie, verwijdert u neus, genitale herkenning en de verkeerde erkenning van poten aan ongewenste gegevens in elke run en analyseert u vervolgens de gegevens.
OPMERKING: Alle statistische parameters worden automatisch geanalyseerd en opgeslagen in het programma en ruwe gegevenswaarden zijn te vinden in het analysemenu van de experimentator. Automatische loopanalyse werd uitgevoerd voor en op 1, 3, 5 en 7 dagen na brandwonden. De evaluatie werd uitgevoerd 30 min na toediening van paracetamol in de Burn + Acetaminophen-groep en 30 min na zoutoplossingbehandeling in de Burn-groep. Dit experiment werd uitgevoerd volgens de methode beschreven in de vorige studies 4,21,22.
4. Meting van depressie-achtig gedrag
OPMERKING: Op wanhoop gebaseerd gedrag, immobiliteitstijd in het water werd gemeten door de gedwongen zwemtest.
- Breng de muizen naar de gedragstestruimte en acclimatiseer ze gedurende ten minste 30 minuten voor de test. Draag een chirurgische japon, handschoenen en masker tijdens het uitvoeren van de gedwongen zwemtest.
- Plaats de muis gedurende 15 minuten in een doorzichtige cilinder van plexiglas (10 cm x 25 cm) met 15 cm water (25 °C ± 0,5 °C).
- Plaats de muis na 24 uur in de cilinder van dezelfde omstandigheden en meet de immobiliteitstijd.
OPMERKING: Immobiliteitstijd werd gemeten gedurende 5 minuten testtijd en de tijd dat muizen stopten met klimmen of zwemmen en gewoon zweefden om hun hoofd boven het wateroppervlak te houden, werd geregistreerd. De gedwongen zwemtest werd uitgevoerd op dag 7 na de brandwond. De evaluatie werd uitgevoerd 1 uur na toediening van paracetamol in de Burn + Acetaminophen-groep en 1 uur na zoutoplossingbehandeling in de Burn-groep. Het experiment werd uitgevoerd volgens de methode beschreven in eerdere studies23,24.
5. Meting van de normale motorische functie
OPMERKING: De rota-rod-test werd uitgevoerd om de abnormale motorische functie na brandwonden te onderscheiden.
- Breng de muizen naar de gedragstestruimte en acclimatiseer ze gedurende ten minste 30 minuten voor de test. Draag een chirurgische japon, handschoenen en masker tijdens het uitvoeren van de gedwongen zwemtest.
- Plaats de dieren op een rollend cilindrisch platform (5,7 cm breed; 3 cm diameter) dat 16 cm boven de onderkant van het apparaat hangt.
- Laat elk dier eenmaal per dag trainen op een rota-staaf gedurende ten minste 5 dagen voorafgaand aan de inductie van brandwonden.
- Voer de rota-staaftest elke 20 minuten uit gedurende 2 uur na toediening van het geneesmiddel. Stel de cut-off tijd in op 2 min.
- Meet de tijdsduur dat de muis op een roterende staaf draait met de constante snelheid van 15 omwentelingen per minuut zonder te vallen.
OPMERKING: De rota-rod test werd uitgevoerd 7 dagen na de inductie van brandwonden. De evaluatie werd uitgevoerd onmiddellijk na toediening van paracetamol in de Burn + Acetaminophen-groep en na zoutoplossingbehandeling in de Burn-groep. Alfaxalone werd gebruikt als een positieve controle voor experimenteel behandelde geneesmiddelen in deze test. Tijdens de rotarod-test wordt de duur gemeten van de tijd dat de muis op de roterende staaf loopt zonder te vallen. Het experiment werd uitgevoerd volgens de methode beschreven in eerdere studies22,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om dierenleed te minimaliseren en het aantal dieren dat wordt gebruikt volgens de drie R's (vervanging, vermindering en verfijning) richtlijnen te verminderen, is deze studie ontworpen met het minimale aantal dieren voor het verzamelen van belangrijke gegevens die zijn vastgesteld door middel van een voorlopig experiment. In deze studie werden gedragsexperimenten twee keer als volgt onafhankelijk uitgevoerd. De loopanalyse, mechanische allodynie en depressie-achtige gedragstests werden uitgevoerd met Control (n = 5), Burn (n = 7; voertuigcontrole; zoutoplossing) en Burn + Acetaminophen (n = 7) groepen. In de rota-staaftest, Controle (n = 3), Burn (n = 4; voertuigcontrole; zoutoplossing), Burn + Paracetamol (n = 4), Positieve controle (n = 4; Alfaxalone) groepen werden ontworpen. Alfaxalone is een soort neuroactieve steroïde en anestheticum dat momenteel wordt gebruikt in de diergeneeskunde als een injecteerbare algemene anesthetische inductor. In deze studie werd alfaxalone gebruikt in dierlijke anesthesie voor brandwondeninductie en gebruikt als een positief controlegeneesmiddel voor motorische stoornissen in de rota-staaftest.
De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± S.E.M. Bovendien werden experimentele gegevens die op verschillende tijdstippen werden verkregen, onafhankelijk geanalyseerd. Pijngedragsreacties werden berekend als het gebied onder de curve (AUC). Tweeweg herhaalde metingen ANOVA werd uitgevoerd om verschillen in de gegevens van mechanische allodynietest, loopanalyse en rota-staaftest in de loop van de tijd te bepalen. Dunnett's test werd gebruikt voor post-hoc analyse om de P-waarde onder de experimentele groepen te bepalen. P-waarden lager dan 0,05 werden als significant beschouwd. GraphPad Prism 6.0 software werd gebruikt om deze statistische validiteit te analyseren. Alle statistische analyseprocedures werden blindelings uitgevoerd in relatie tot de experimentele omstandigheden. Een figuur die de door brandwonden veroorzaakte weefselschade illustreert, is weergegeven in aanvullende figuur 1.
Tijdsverloopveranderingen in de pootontwenningsdrempel (PWT, g) na brandwonden zijn weergegeven in figuur 1. De PWT (g) van door brandwonden geïnduceerde muizen was 1 dag na burn-inductie afgenomen en hield gedurende 7 dagen aan in vergelijking met die van de controlegroep. Toediening van paracetamol (200 mg/kg, i.p., eenmaal daags gedurende 7 dagen vanaf de dag van burn-inductie) verminderde de door brandwonden geïnduceerde afname van PWT aanzienlijk (figuur 1A, ** p < 0,01 versus Burn-groep). Bovendien toonde de AUC-analyse (gedurende 7 dagen) aan dat de toediening van paracetamol de door brandwonden geïnduceerde mechanische allodynie significant verminderde (figuur 1B, *** p < 0,001 versus controlegroep, ** p < 0,01 versus burn-groep).
Veranderingen in het achterpootafdrukgebied na brandwonden in de loop van de tijd worden weergegeven in figuur 2. Brandwonden verminderden het ipsilaterale achterpootafdrukgebied aanzienlijk vanaf de dag na inductie en hielden 7 dagen aan. Het achterpootafdrukgebied werd significant verbeterd door het toedienen van paracetamol (200 mg/kg, i.p., eenmaal daags gedurende 7 dagen vanaf de dag van de verbrandingsinductie) in vergelijking met de met het voertuig behandelde groep (figuur 2A,B, * p < 0,05 en ** p < 0,01 versus burn-groep).
Veranderingen in het tijdsverloop in een enkele houding na brandwonden zijn weergegeven in figuur 3. Brandwonden verminderden de enkele houding (%) van de ipsilaterale achterpoot 1 dag na brandwondeninductie en deze vermindering werd gedurende 7 dagen gehandhaafd. De enkele houding van de achterpoot werd verbeterd door toediening van paracetamol (200 mg/kg, i.p., eenmaal daags gedurende 7 dagen vanaf de dag van de verbrandingsinductie) in vergelijking met de met het voertuig behandelde groep (figuur 3A,B, * p < 0,05 versus Burn-groep).
Veranderingen in de immobiliteitstijd verkregen uit de geforceerde zwemtest zijn weergegeven in figuur 4. De immobiliteitstijd van de door brandwonden geïnduceerde muizen was 7 dagen na de inductie van de brandwonden verhoogd in vergelijking met die van de controlegroep. Bij door brandwonden geïnduceerde muizen verminderde paracetamoltoediening (200 mg/kg, i.p., eenmaal daags gedurende 7 dagen vanaf de dag van de brandwondeninductie) de door brandwonden veroorzaakte toename van de immobiliteitstijd aanzienlijk (** p < 0,01 en *** p < 0,001 versus Burn-groep).
De normale motorfunctie werd beoordeeld op basis van de veranderingen in de looptijd op de roosterstang, zoals weergegeven in figuur 5. De looptijd van de door brandwonden veroorzaakte muizen veranderde niet na 7 dagen na de inductie van de brandwond in vergelijking met die van de controlegroep. Daarentegen was de looptijd van met alfaxalon behandelde muizen (positieve controle) significant verminderd gedurende ongeveer 60 minuten. Dit resultaat geeft aan dat een brandwondenletsel dat in deze studie wordt gebruikt, geen motorische stoornissen veroorzaakt (*** p < 0,001 versus Burn-groep).
Figuur 1: Mechanische allodynie beoordeeld door von Frey-test bij door brandwonden geïnduceerde muizen. (A) De pootontwenningsdrempel (PWT, g) in de ipsilaterale achterpoot van muizen was 1 dag na brandwonden verminderd en gedurende 7 dagen opgelopen in vergelijking met de controlegroep. Acetaminophen toediening (200 mg/kg, i.p., eenmaal daags gedurende 7 dagen vanaf de dag van brandwondeninductie) verminderde de door brandwonden geïnduceerde mechanische allodynie aanzienlijk. (B) De PWT werd geanalyseerd als het gebied onder de curve (AUC). Pijlen geven de dag van toediening van geneesmiddelen aan. p < 0,001 versus controlegroep, ** p < 0,01 versus burngroep. Tweerichtings herhaalde metingen ANOVA werd uitgevoerd om de totale effecten in het tijdsverloop van de von Frey-test te bepalen. Post-hoc analyse werd uitgevoerd met behulp van dunnett's test om de P-waarde te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Pootafdrukgebied verkregen uit geautomatiseerde loopanalyse bij door brandwonden veroorzaakte muizen. (A) Representatieve beelden van zowel de ipsilaterale als contralaterale achterpoten van muizen werden vastgelegd door de loopanalysesoftware. De contactgrootte van de poot is verminderd na brandwonden in vergelijking met die van de controlegroep. Deze vermindering werd gedeeltelijk hersteld door toediening van paracetamol (200 mg/kg, i.p., eenmaal daags gedurende 7 dagen vanaf de dag van de verbrandingsinductie). Witte rechthoeken geven de door de software geanalyseerde achterpoten aan, (B) een grafiek toont de tijdsverloopveranderingen in het pootafdrukgebied (%). Gegevens worden berekend als het percentage veranderingen in het afdrukgebied tussen de ipsilaterale (rechts) en contralaterale (linker) achterpoten (bijv. De waarde van 50% geeft dezelfde pootafdrukgebieden aan in de rechter- en linkerachterpoot). Pijlen geven de dag van toediening van geneesmiddelen aan. * p < 0,05 en ** p < 0,01 versus Burn groep. Tweeweg herhaalde metingen ANOVA werd uitgevoerd om de totale effecten in het tijdsverloop van het afdrukgebied op loopanalyse te bepalen. Post-hoc analyse werd uitgevoerd met behulp van dunnett's test om de P-waarde te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Enkele houding verkregen uit geautomatiseerde loopanalyse bij door brandwonden veroorzaakte muizen. (A) Representatieve beelden van een enkele houding werden vastgelegd door de ganganalysesoftware. Verschillende kleuren gaven de houding van elke poot aan: blauw, rechtervoorpoot; roze, rechterachterpoot; geel, linker voorpoot; groen, linker achterpoot. De enkele houding van de ipsilaterale achterpoot werd verkort na brandwond. Deze verandering werd gedeeltelijk hersteld door het toedienen van paracetamol (200 mg/kg, d.w.z. eenmaal daags gedurende 7 dagen vanaf de dag van de brandwondeninductie). (B) Een grafiek toont veranderingen in het tijdsverloop in de enkele stand (%). Gegevens worden samengevat als een lijngrafiek na het berekenen van het percentage veranderingen in enkele houding tussen de ipsilaterale (rechter) en contralaterale (linker) achterpoten (bijv. De waarde van 50% geeft dezelfde enkele houding aan in de rechter- en linkerachterpoot). Pijlen geven de dag van toediening van geneesmiddelen aan. * p < 0,05 versus Burn groep. Tweeweg herhaalde metingen ANOVA werd uitgevoerd om de totale effecten te bepalen in het tijdsverloop van een enkele houding op loopanalyse. Post-hoc analyse werd uitgevoerd met behulp van dunnett's test om de P-waarde te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De immobiliteitstijd van de gedwongen zwemtest bij door brandwonden veroorzaakte muizen. De immobiliteitstijd van de door brandwonden geïnduceerde muizen was 7 dagen na de inductie van de brandwonden verhoogd in vergelijking met die van de controlegroep. Bij door brandwonden veroorzaakte muizen verlichtte paracetamoltoediening (200 mg / kg, d.w.z. eenmaal daags gedurende 7 dagen vanaf de dag van brandwondeninductie) de door brandwonden veroorzaakte verhoogde immobiliteitstijd aanzienlijk. p < 0,001 versus controlegroep, ** p < 0,01 versus burngroep. Eenrichtings herhaalde metingen ANOVA werd uitgevoerd om de algehele effecten in het tijdsverloop van de geforceerde zwemtest te bepalen. Post-hoc analyse werd uitgevoerd met behulp van dunnett's test om de P-waarde te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De normale motorische functiebeoordeling op basis van de veranderingen in de looptijd van de rota-staaftest bij door brandwonden veroorzaakte muizen. Er was geen verandering in de looptijd van de door brandwonden geïnduceerde muizen 7 dagen na brandwondeninductie in vergelijking met die van controle- en paracetamolbehandelde brandwondengroepen. De looptijd van met alfaxalon behandelde muizen (positieve controle) was echter significant verminderd tot ~ 60 s. Dit resultaat geeft aan dat een brandwondenletsel dat in deze studie wordt gebruikt, geen motorische stoornissen veroorzaakt. p < 0,001 versus Burn groep. Tweerichtings herhaalde metingen ANOVA werd uitgevoerd om de totale effecten in het tijdsverloop van de rota-staaftest te bepalen. Post-hoc analyse werd uitgevoerd met behulp van dunnett's test om de P-waarde te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Veranderingen in weefselschade in de loop van de tijd na inductie van brandwonden. Na de broeiende brandwondeninductie werd aanzienlijke weefselschade waargenomen, die geleidelijk in de loop van de tijd toenam. In deze studie heeft Acetaminophen, gebruikt als een positief controlemiddel, een beschermend effect op weefselbeschadiging aangetoond. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De broeibrand is een soort thermische verbranding die wordt veroorzaakt door verwarmde vloeistoffen. Er is gesuggereerd dat eerste- of tweedegraads brandwonden in de meeste gevallen voorkomen, maar langdurig contact met warmtebronnen kan derdegraads brandwonden veroorzaken26. In de huidige studie werd brandwondenletsel geïnduceerd door de rechterachterpoot van muizen bloot te stellen aan heet water bij 65 °C gedurende 3 s 4,26. Weefselbeschadiging werd gedetecteerd in de brandwondgewonde poot, die veel voorkomende symptomen van brandwonden vertoont, zoals roodheid, schilfering van de huid en zwelling (aanvullende figuur 1)4.
Mechanische allodyniemeting is een veelgebruikte pijnresponsidentificatiemethode in dierlijke pijnmodellen en werd gemeten met von-Frey-filamenten in deze studie. De opgaande stimulusmethode met de von Frey-filamenten wordt gebruikt om de mechanische drempel te bepalen die nodig is om de pootonttrekkingsrespons van een dier19,20 te induceren. Het experiment begon met het filament met de minste prikkel. De buigkracht van de gloeidraad die reageert op een vast getal (drie keer in dit protocol) werd verkregen als drempelwaarde voor het onttrekken van de poot.
Loopanalyse van knaagdieren tijdens vrij lopen wordt gebruikt om de ziekte van Parkinson of ledemaatbewegingen en positieveranderingen in modellen met sensorisch-motorische stoornissen te bestuderen, waaronder dwarslaesie en beroerte27,28. Het loopanalysesysteem analyseert automatisch verschillende loopparameters, waaronder pootintensiteit, pootafdruk, standfase, enz. Wijzigingen van parameters die het loopanalysesysteem kan analyseren, kunnen worden gebruikt als pijngerelateerde indicatoren in de ganganalyse van pijndiermodellen. Daarom kan loopanalyse worden gebruikt als een experimentele methode om spontane pijn niet-invasief te kwantificeren in diermodellen 4,21,22. Op basis van eerdere bevindingen dat loopparameters waren verlaagd aan de door pijn geïnduceerde kant in diermodellen van pijn 21,22, kwantificeerde dit gepresenteerde protocol elke gangparameter als de verhouding van de door brandwonden geïnduceerde ipsilaterale en contralaterale kant. In dit protocol werden pootafdrukgebied en enkelvoudige standgegevens omgezet in de snelheid van veranderingen tussen ipsilaterale (gewonde) en contralaterale (niet-gewonde) achterpoten. De waarde van 50% betekent dat de pootafdrukgrootte en de tijd om de vloer te bereiken hetzelfde zijn in zowel de ipsilaterale als contralaterale, terwijl de waarde minder dan 50% aangeeft dat deze parameters zijn afgenomen in de door brandwonden geïnduceerde ipsilaterale achterpoot. De procentuele veranderingen tussen de ipsilaterale en contralaterale achterpoten werden gebruikt voor het verkrijgen van alle gegevens (d.w.z. normale muizen vertoonden ~ 50%, wat betekent dat de ipsilaterale: contralaterale verhouding 50: 50 was). Bij normale dieren lijken de parameters met betrekking tot elke achterpoot aan beide zijden hetzelfde wanneer ze vrij lopen. De analyse van dit protocol is echter gericht op het feit dat de parameters aan de ipsilaterale kant afnemen na pijninductie. Bovendien is er individuele variatie in elk dier; nauwkeurige gegevens kunnen niet worden verkregen wanneer de ruwe gegevens worden geanalyseerd zoals ze zijn. Daarom werd elke gangparameterwaarde omgezet in een verhouding om nauwkeurigere resultaten te verkrijgen tijdens de analyse. De huidige studie heeft aangetoond dat de grootte van het afdrukgebied en de enkele standtijd van de ipsilaterale achterpoot werden verminderd na brandwonden, en deze vermindering werd hersteld door herhaalde intraperitoneale paracetamol toediening. Deze veranderingen vielen samen met een vergelijkbaar patroon van tijdsverloopveranderingen in pijngedrag na brandwonden en toediening van geneesmiddelen.
Hoewel controversieel, is de gedwongen zwemtest de meest gebruikte methode om het gedrag van depressieve knaagdieren te bestuderen. De dieren proberen te ontsnappen uit de container vol water, maar bewegen uiteindelijk niet, wat wanhoop oproept29. Er wordt echter beweerd dat immobiliteit moeilijk te evalueren is als een maat voor depressie, omdat deze test wordt geassocieerd met uithoudingsvermogen en gevoelens van wanhoop. Om de resultaten van het gedwongen zwemexperiment te ondersteunen, kunnen andere methoden voor het evalueren van depressie, zoals de staartsuspensietest, de nieuwheidsonderdrukte voedingstest en de sucroseconsumptietest, worden overwogen30,31. In de huidige studie werd de immobilisatietijd verhoogd na brandwonden en deze toename werd hersteld door toediening van paracetamol.
De protocollen van deze studie waren ontworpen om een model van acute pijn vast te stellen dat gepaard gaat met depressie-achtig gedrag na brandwonden. Het depressie-achtige gedrag in deze studie kan de secundaire effecten zijn van fysieke beperking en veranderingen in thermische gevoeligheid na brandwonden 15,32,33. De resultaten zouden kunnen suggereren dat muizen met geïnduceerde acute pijn na brandwonden depressie-achtig gedrag vertoonden. Het is aangetoond dat het de pijnrespons en het daaruit voortvloeiende depressie-achtige gedrag verbetert door experimenteel behandelde medicijnen.
De rota-staaftest is een prestatietest op basis van een rotatiebelasting die over het algemeen met geweld wordt toegepast op knaagdieren met atletische activiteit. De test meet parameters zoals looptijd en uithoudingsvermogen. Enkele van de testkenmerken omvatten, onder andere, de effecten van een experimenteel medicijn of de balans van proefpersonen in het neuropathische pijnmodel, grijpkracht en motorische coördinatiebeoordeling 22,25,34. Zoals blijkt uit de resultaten van deze studie, was er geen verandering in de draaitijd van de rota-rod na brandwonden of paracetamolbehandeling in vergelijking met die van de controlegroep.
Deze studie toont de ontwikkeling van een diermodel voor het bestuderen van door brandwonden veroorzaakte pijn en depressie-achtig gedrag bij muizen. In dit opzicht heeft deze studie aangetoond dat broeiende brandwonden mechanische allodynie, veranderingen van loopparameters en depressie-achtig gedrag zoals immobiliteitstijd veroorzaakten. Dit model is geschikt voor onderzoek naar de verschillende aspecten en uitkomsten van brandwondenpijn en de behandeling ervan en zal naar verwachting belangrijke informatie naar dit onderzoeksveld brengen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de Chungnam National University en de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de regering van Korea (NRF-2019R1A6A3A01093963 en NRF-2021R1F1A1062509).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 307809 | |
| 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL tube | SPL | 50050 | |
| Acetaminophen BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | A7085-100G | This analgesic agent is used as a positive control. |
| Alfaxan multidose (Alfaxalone) | JUROX Pty.Limited | In this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test. | |
| CatWalk automated gait analysis system | Noldus | CatWalk XT | Gait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction |
| OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment) | Ashish Life Science | This material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia. | |
| Plexiglass cylinder | SCITECH KOREA | custom made products | Used in forced swimming test |
| Rota-rod system | SCITECH KOREA | Accelerating rota rod | Used in the measurement of Normal Motor Function |
| von Frey filaments | North Coast Medical | NC12775 | Used in the measurement of Mechanical Allodynia |
| Waterbath | CHANGSHIN SCIENCE | C-WBE | Used in the burn injury induction |
References
- Peck, M. D. Epidemiology of burns throughout the World. Part II: intentional burns in adults. Burns. 38 (5), 630-637 (2012).
- Tracy, L. M., Cleland, H. Pain assessment following burn injury in Australia and New Zealand: Variation in practice and its association on in-hospital outcomes. Australasian Emergency Care. 24 (1), 73-79 (2021).
- Montgomery, R. K.
- Kang, D. W., Choi, J. G. Bee venom reduces burn-induced pain via the suppression of peripheral and central substance P expression in mice. Journal of Veterinary Science. 22 (1), 9 (2021).
- Abdi, S., Zhou, Y.
- Ullrich, P. M., Askay, S. W. Pain, depression, and physical functioning following burn injury. Rehabilitation Psychology. 54 (2), 211-216 (2009).
- Patwa, S., Benson, C. A. Spinal cord motor neuron plasticity accompanies second-degree burn injury and chronic pain. Physiological Reports. 7 (23), 14288 (2019).
- Michaelides, A., Zis, P. Depression, anxiety and acute pain: links and management challenges. Postgraduate Medicine. 131 (7), 438-444 (2019).
- Doan, L., Manders, T., Wang, J. Neuroplasticity underlying the comorbidity of pain and depression. Neural Plasticity. 2015, 504691 (2015).
- Vachon-Presseau, E., Centeno, M. V. The emotional brain as a predictor and amplifier of chronic pain. Journal of Dental Research. 95 (6), 605-612 (2016).
- Apkarian, A. V., Baliki, M. N. Predicting transition to chronic pain. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 360-367 (2013).
- Yin, W., Mei, L. A Central amygdala-ventrolateral periaqueductal gray matter pathway for pain in a mouse model of depression-like behavior. Anesthesiology. 132 (5), 1175-1196 (2020).
- Deng, Y. T., Zhao, M. G., Xu, T. J. Gentiopicroside abrogates lipopolysaccharide-induced depressive-like behavior in mice through tryptophan-degrading pathway. Metabolic Brain Disease. 33 (5), 1413-1420 (2018).
- Zhang, G. F., Wang, J. Acute single dose of ketamine relieves mechanical allodynia and consequent depression-like behaviors in a rat model. Neuroscience Letters. 631, 7-12 (2016).
- Edwards, R. R., Smith, M. T. Symptoms of depression and anxiety as unique predictors of pain-related outcomes following burn injury. Annals of Behavioral Medicine. 34 (3), 313-322 (2007).
- Pincus, T., Vlaeyen, J. W. Cognitive-behavioral therapy and psychosocial factors in low back pain: directions for the future. Spine. 27 (5), 133-138 (2002).
- Laumet, G., Edralin, J. D. CD3(+) T cells are critical for the resolution of comorbid inflammatory pain and depression-like behavior. Neurobiology of Pain. 7, 100043 (2020).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Scholz, J., Broom, D. C. Blocking caspase activity prevents transsynaptic neuronal apoptosis and the loss of inhibition in lamina II of the dorsal horn after peripheral nerve injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (32), 7317-7323 (2005).
- Kang, D. W., Choi, J. G. Automated gait analysis in mice with chronic constriction injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56402 (2017).
- Kang, D. W., Moon, J. Y. Antinociceptive profile of levo-tetrahydropalmatine in acute and chronic pain mice models: Role of spinal sigma-1 receptor. Scientific Reports. 6, 37850 (2016).
- Huang, W., Chen, Z. Piperine potentiates the antidepressant-like effect of trans-resveratrol: involvement of monoaminergic system. Metabolic Brain Disease. 28 (4), 585-595 (2013).
- Can, A., Dao, D. T. The mouse forced swim test. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3638 (2012).
- Choi, J. G., Kang, S. Y. Antinociceptive effect of Cyperi rhizoma and Corydalis tuber extracts on neuropathic pain in rats. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 16 (6), 387-392 (2012).
- Mosby's. Mosby's Dictionary of Medicine, Nursing & Health Professions - Seventh edition, Nursing Standard. 20 (22), RCN Publishing Company Ltd. 36 (2006).
- Vandeputte, C., Taymans, J. M. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Isvoranu, G., Manole, E. Gait analysis using animal models of peripheral nerve and spinal cord injuries. Biomedicines. 9 (8), 1050 (2021).
- Yankelevitch-Yahav, R., Franko, M. The forced swim test as a model of depressive-like behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52587 (2015).
- Yan, H. C., Cao, X.
- Papp, M., Willner, P. An animal model of anhedonia: attenuation of sucrose consumption and place preference conditioning by chronic unpredictable mild stress. Psychopharmacology. 104 (2), 255-259 (1991).
- Seminowicz, D. A., Laferriere, A. L. MRI structural brain changes associated with sensory and emotional function in a rat model of long-term neuropathic pain. Neuroimage. 47 (3), 1007-1014 (2009).
- Yalcin, I., Barthas, F. Emotional consequences of neuropathic pain: insight from preclinical studies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 47, 154-164 (2014).
- Choi, J. W., Kang, S. Y. Analgesic effect of electroacupuncture on paclitaxel-induced neuropathic pain via spinal opioidergic and adrenergic mechanisms in mice. American Journal of Chinese Medicine. 43 (1), 57-70 (2015).
