Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Analytisk bestämning av mitokondriell funktion av strukna fasta tumör homogenater

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62875
Automatic Translation
1,2,3, 1, 2,4, 1,3
1Integrated Physiology and Molecular Medicine Laboratory, Pennington Biomedical Research Center, 2Clinical Oncology and Metabolism, Pennington Biomedical Research Center, 3Department of Nutrition, Case Western Reserve University, 4Department of Clinical Nutrition, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

Vi utvecklat ett praktiskt protokoll och analytiska tillvägagångssätt för att utvärdera mitokondriell oxidativ fosforylering och elektron överföring kapacitet i färska tumör homogenates. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att undersöka olika mitokondriella funktioner som bidrar till cancerinitiering, progression och behandlingssvar.

Abstract

Mitokondrier är viktiga för uppkomsten och progressionen av cancer genom energiproduktion, reaktiva syrearter reglering och makromolekylsyntes. Genetiska och funktionella anpassningar av mitokondrier till tumör miljön driva proliferative och ögonbevarande potential. Tillkomsten av DNA och RNA sekvensering bort kritiska hinder för utvärdering av genetiska medlare av tumorigenesis. Hittills är dock metodologiska metoder för att utvärdera tumör mitokondriell funktion fortfarande svårfångade och kräver tekniska färdigheter som begränsar genomförbarheten, vilket i slutändan minskar diagnostiska och prognostiska värdet i både experimentella och kliniska inställningar. Här beskriver vi en enkel och snabb metod för att kvantifiera frekvenser av oxidativ fosforylering (OXPHOS) och elektronöverföring (ET) kapacitet i nystrukna fasta tumör homogenater med hjälp av högupplöst respirometry. Protokollet kan reproduceras mellan arter och tumörtyper samt anpassas för att utvärdera en mångfald av mitokondriella ET-vägar. Med hjälp av detta protokoll visar vi att möss med en luminal B bröstcancer uppvisar defekta nikotinamid adenin dinucleotide-linked andning och beroende av succinate att generera adenosintrifosfat via OXPHOS.

Introduction

Alla celler är intimt kopplade av deras behov av att producera och konsumera adenosintrifosfat (ATP), den molekylära energivalutan. Eftersom cellulära mutationer ger upphov till bildandet av tumörer säkerställer mitokondrier överlevnad genom diversifiering av energiproduktion som ofta är fenotypiskt särskiljbar från icke-cancervävnad1,2,3. Som sådan finns det ett kritiskt behov av snabb och djup profilering av mitokondriell respiratorisk funktion för att underlätta klassificeringen av tumörtyp, cancerinitiering, progression och behandlingssvar.

Andningsfunktioner hos strukna vävnadsprover kan inte utvärderas intakta eftersom de primära substraten för OXPHOS inte är cellgenomsläppliga. För att övervinna denna begränsning kan mitokondrier beredas antingen genom isolering, kemisk permeabilisering eller mekanisk homogenisering. Mitokondriell isolering anses länge vara en guldstandard för utvärdering av andningsfunktionen. Det kräver dock stora mängder vävnad, är tidskrävande och är lågvkastande med möjlig urvalsbias för vissa fraktioner av mitokondrier4. Permeabilisering består av mekanisk separation och exponering av vävnadssektioner eller fiberbuntar till ett milt tvättmedel som selektivt försämrar plasmamembranet5. Permeabilization används ofta i strimmor vävnader såsom skelett och hjärtmuskel som enskilda fiber buntar kan retas isär. Jämfört med isolering ger permeabilisering mer mitokondrier i sin inhemska cellulära miljö och fysiska form5. Permeabilization har framgångsrikt tillämpats i andra vävnader såsom tumör6,7 och moderkakan8; Reproducerbarheten hos permeabiliserade fiberpreparat kan dock vara svår på grund av konsistensen av dissekering och syrekrav för att övervinna diffusionsbegränsningar9. Dessutom kan permeabiliserade fibrer vara olämpliga i vissa tumörtyper som är tätt cellulära och mycket fibrotiska. Vävnad homogenater genereras genom mekanisk störning av plasmamembranet och liknar permeabiliserade fibrer när det gäller mitokondriell avkastning och integritet10. Vävnads homogenater minimerar också begränsningarna av syrediffusion och kan lätt användas över vävnadstyper genom optimering av mekanisk kraft11,12.

Här beskriver vi en enkel och snabb metod för att kvantifiera frekvenser av oxidativ fosforylering (OXPHOS) och elektronöverföring (ET) kapacitet i nystrukna fasta tumör homogenater. Protokollet är optimalt utformat för att utvärdera färsk vävnad med hjälp av Oxygraph-2k (O2k) högupplöst respirometer, som kräver förkunskaper om instrumentell installation och kalibrering men kan anpassas på samma sätt med hjälp av någon Clark-typ elektrod, Seahorse-analysator eller plattläsare. Protokollet kan reproduceras mellan arter och tumörtyper samt anpassas för att utvärdera en mångfald av mitokondriella ET-vägar.

Protocol

Alla experiment och försök med djur godkändes av Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Reagensberedning.

  1. Förbered EO771 celltillväxtmedium med 10 mM HEPES, 10% fetalt bovinserum (FBS), 1% penicillin-streptomycin (100 U/mL) och 0,2% amhtericin B.
  2. Förbered 1 L biopsiskyddslösning (BIOPS) i en 1000 ml glasbägare.
    1. Tillsätt 3.180 g Na2ATP (5.77 mM slutlig koncentration).
    2. Tillsätt 1,334 g MgCL2·6H2O (6,56 mM slutlig koncentration).
    3. Tillsätt 2,502 g taurin (20 mM slutlig koncentration).
    4. Tillsätt 3,827 g Na2Fosfo kreatin (15 mM slutlig koncentration).
    5. Tillsätt 1,362 g Imidazol (20 mM slutlig koncentration).
    6. Tillsätt 0,077 g Dithiothreitol (,5 mM slutlig koncentration).
    7. Tillsätt 9,76 g MES-hydrathydrat (50 mM slutlig koncentration).
    8. Tillsätt 800 ml H2O och blanda beståndsdelarna med en magnetomrörare vid 30 °C.
    9. Tillsätt 72,3 ml 100 mM K2EGTA (7,23 mM slutlig koncentration).
      1. Lös upp 7,608 g EGTA och 2,3 g KOH i 100 ml H2O.
      2. Justera pH till 7,0 med 5 M KOH och få upp volymen till 200 ml med H2O.
    10. Tillsätt 27,7 ml 100 mM CaK2EGTA (2,77 mM slutlig koncentration).
      1. Lös upp 7.608 g EGTA i 200 ml H2O och värm till 80 °C (100 mM slutlig koncentration).
      2. Lös upp 2.002 g CaCO3 i 200 ml varm 100 mM EGTA-lösning.
      3. Under kontinuerlig omrörning, tillsätt 2,3 g KOH och justera pH till 7,0.
    11. Justera pH-värdet till 6,75 vid 23 °C (pH 7,1 vid 0 °C) med 5 M KOH. Ta upp volymen till 980 ml med H2O och blanda lösningen. Kontrollera pH-värdet en gång till, justera vid behov och för upp den slutliga volymen till 1000 ml med vatten.
    12. Aliquot BIOPS i koniska rör (15 ml eller 50 ml) och förvara vid -20 °C tills de används. Tina bara en gång, strax före användning.
  3. Förbered 1 L mitokondriellt andningsmedium (MiR05) i en 1000 ml glasbägare.
    1. Tillsätt 0,190 g EGTA (0,5 mM slutlig koncentration).
    2. Tillsätt 0,610 g MgCL2·6H2O (3 mM slutlig koncentration).
    3. Tillsätt 2,502 g taurin (20 mM slutlig koncentration).
    4. Tillsätt 1,361 g KH2PO4 (10 mM slutlig koncentration).
    5. Tillsätt 4,77 g HEPES (20 mM slutlig koncentration).
    6. Tillsätt 37,65 g D-Sackaros (110 mM slutlig koncentration).
    7. Tillsätt 800 ml H2O och blanda beståndsdelarna med en magnetomrörare vid 30 °C.
    8. Tillsätt 120 ml 0,5 M Laktobionsyra (60 mM slutlig koncentration).
      1. Lös upp 35,83 g laktobionsyra i 100 ml H2O.
      2. Justera pH till 7,0 med 5 M KOH och ge volym upp till 200 ml med H2O.
    9. Blanda lösningen och justera pH till 7,1 med 5 M KOH.
    10. Väg 1 g BSA, i huvudsak fettsyrafri (1 g/L slutlig koncentration), i ett koniskt rör på 50 ml. Tillsätt 40 ml pH 7.1-lösningen från steg 9 till rör, vänd försiktigt för att blanda och undvik skumbildning. Överför den upplösta BSA till den återstående pH 7.1-lösningen från steg 9 och rör försiktigt och kontinuerligt. Kontrollera pH en gång till, justera vid behov och för upp den slutliga volymen till 1000 ml med H2O.
    11. Aliquot MiR05 medium i 50 ml koniska rör och lagra vid -20 °C tills den används. Tina bara en gång, strax före användning.
  4. Förbered substrat, uncouplers och inhibitorer.
    1. Förbered 0,8 M malat: Lös upp 536,4 mg L-äppelsyra i 4 ml H2O. Neutralisera med 5 M KOH till pH 7 och för upp volymen till 5 ml med H2O. Dela upp i alikvoter och förvara sedan vid -20 °C.
    2. Förbered 1 M Pyruvat: Lös upp 550 mg pyruvsyranatriumsalt i 4 ml H2O. Neutralisera med 5 M KOH till pH 7 och för upp volymen till 5 ml med H2O. Dela upp i alikvoter och förvara sedan vid -20 °C.
    3. Förbered 0,5 M ADP (adenosin 5′-difosfat): Lös upp 1,068 g ADP-natriumsalt i 4 ml H2O. Neutralisera med 5 M KOH till pH 7 och för upp volymen till 5 ml med H2O. Dela upp dig i alikvoter och förvara sedan vid -20 °C.
    4. Förbered 2 M glutamat: Lös upp 3,7426 g L-glutaminsyramonohydrat i 8 ml H2O. Neutralisera med 5 M KOH till pH 7 och för upp volymen till 10 ml med H2O. Dela upp dig i alikvoter och förvara sedan vid -20 °C.
    5. Förbered 4 mM Cytokrom c: Lös upp 50 mg cytokrom c i 1 ml H2O. Dela upp dig i alikvoter och förvara sedan vid -20 °C.
    6. Förbered 1 M Succinate: Lös upp 2,701 g Succinate disodiumsalt hexahydrat i 8 ml H2O. Neutralisera med 1 N HCl till pH 7 och för upp volymen till 10 ml med H2O. Dela upp i alikvoter och förvara sedan vid -20 °C.
    7. Förbered 1 mM FCCP (carbonyl cyanid-4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon): Lös upp 2,54 mg FCCP i 10 ml ren etanol. Dela upp dig i alikvoter och förvara sedan vid -20 °C.
    8. Förbered 150 μM Rotenone: Lös upp 3,94 mg Rotenone i 10 ml ren etanol för att bereda 1 mM-buljong, virvel tills den är helt upplöst. Späd 225 μL 1 mM Rotenone beståndskoncentration med 1,275 ml ren etanol för att göra 1,5 ml 150 μM Rotenone. Skydda mot ljus, dela upp i alikvoter och förvara sedan vid -20 °C.
    9. Förbered 125 μM Antimycin A: Lös upp 11 mg Antimycin A i 4 ml ren etanol för att bereda 5 mM lagerkoncentration av Antimycin A. Späd 25 μL av 5 mM Antimycin A lagerkoncentration med 975 μL ren etanol för att göra 1 ml 0,125 mM Antimycin A. Dela i alikvoter och lagra sedan vid -20 °C.
    10. Förbered 0,8 M Ascorbate: Lös upp 1,584 g ascorbatnatriumsalt i 8 ml H2O. Justera pH med askorbinsyra till pH 6 och för upp volymen till 10 ml med H2O. Skydda mot ljus, dela upp i alikvoter och förvara sedan vid -20 °C.
    11. Förbered 0,2 M TMPD (tetrametyl-p-fenylendiamin): Lös upp 32,85 mg TMPD i 987,5 μL DMSO. Tillsätt 12,5 μL 0,8 M askorbat (10 mM slutlig koncentration av askorbat). Skydda mot ljus, dela upp i alikvoter och förvara sedan vid -20 °C.
    12. Förbered 4 M natriumazid: Lös upp 2,6 g natriumazilid i 10 ml H2O. Dela upp dig i alikvoter och förvara vid -20 °C.

2. Tumörtillväxt

  1. Odla EO771-celler i RPMI 1640 tillväxtmedium och behåll cellerna i en 37 °C fuktad inkubator med 5% CO2.
  2. Enhus fyra veckor gamla kvinnliga C57BL/6J möss, upprätthålla dem vid 21-22 °C på en 12 h ljus: mörk cykel. Ge mössen ad libitum tillgång till mat och vatten.
  3. När mössen når 10 veckors ålder, förbered cellerna och mössen för cancercellimplantation.
    1. Prova cellerna, inaktivera trypsin med tillväxtmedium och centrifugera celler vid 500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten och återanvända och kombinera cellpelletsen (efter behov) i media. Räkna livskraftiga celler med trypanblått och förbered en cellutspädning av 1 x 106 celler i en total volym på 60 μL med en 1:1:1 Media/ Basement Membrane Matrix/PBS-lösning. När källarmembranmatrisen har tillsatts, blanda väl och håll cellupphängningen på is. Fyll sprutorna med 60 μL cellfjädring och lägg dem på is. Arbeta effektivt och injicera celler i möss inom 1,5 timmar från beredningen.
    2. Bedöva möss genom isofluraninandning (3%-5% för induktion och 1%-3% för underhåll). Raka mellan höger4: e och 5:e inguinallymfknutor bröstkörtlar. Ortopiskt injicera de sövda mössen med EO771 cell suspension.
  4. Använd elektroniska bromsok för att övervaka och mäta tumörtillväxten två gånger i veckan i 4 veckor. Vid obduktion, punktskatt, väg och placera sedan tumören (eller minst 60 mg tumörsektion) omedelbart i 10 ml iskall BIOPS. Håll röret på våt is.

3. Instrumentinställning och kalibrering

  1. Värm MiR05-mediet i ett vattenbad på 37 °C.
  2. Aktivera Oroboros O2k-systemet, öppna DATLAB-programvaran, ange eller välj Användare. Klicka på Anslut till O2k. Kontrollera O2k-konfigurationen och se till att rätt instrument är märkt för Power-O2k och varje kammare motsvarar rätt syresensor; Klicka på OK. När kontrollfönstret för O2k öppnas, under fliken System, ställer du in blocktemperaturen på 37 °C, omrörarhastigheten till 750 rpm för båda kamrarna, ND Data Recording-intervallet till 2,0 s. Kontrollera både omrörarkraft och belysning i kammarlådor. På fliken Syre, O2, ställ in förstärkning för sensor till 1 V/μA (förstärkningen kan behöva justeras för äldre instrumentmodeller), polariseringsspänningen till 800 mV och klicka sedan på Anslut till O2k. När en ny experimentfil öppnas namnger du filen och klickar på Spara. När experimentet är aktivt öppnas ett protokollvalsfönster. Klicka på Avbryt för att köra en anpassad SUIT (Substrate uncoupler inhibitor titration).
  3. Efter protokollval öppnas ett exempelfönster för att fylla i den experimentella koden, exempeltypen, kohorten, exempelkoden, exempelnumret och delprovsnumret efter vad som är tillämpligt. Tilldela enheten till mg och ange tumör homogenat koncentration per ml (mängden per kammare fylls automatiskt). Se till att det angivna mediet är MiR05 och att kammarvolymen är 2,00 ml. Lägg till kommentarer efter behov i den nedre rutan och klicka på OK.
  4. Ta bort propparna och aspirera 70% etanol från kamrarna. Aspirera aldrig nära membranet som exponeras på insidan av kammaren. Skölj fyra gånger med rent vatten och fyll kammaren med 2,25 ml MiR05.
  5. Sensortest: Klicka på F9 för att stänga av omrörarna i 30 s. När omrörarstången slås på igen, se till att O2-lutningen snabbt ökar monoexponentiellt i varje kammare. Om kammaren inte klarar sensortestet, kontrollera de elektriska anslutningarna och rengör om salter har ackumulerats. upprepa testet. Om sensorn fortsätter att misslyckas med testet, ta bort den polarografiska syresensorns (POS) kontakt för att inspektera membranet. Om synliga skador på membranet, tung oxidation eller betydande bubbelackumulering observeras, stoppa de experimentella procedurerna och fortsätt till instrumentservice.
  6. Syrekalibrering: Utför syrekalibrering för att få exakta andningsmätningar.
    1. Sätt långsamt i propparna till deras volymkalibrerade läge med en vridningsrörelse. Sug bort överskottet av medium som matas ut genom injektionskalasiet som samlas i proppens brunn. Lyft propparna tillräckligt hårt för att tätt passa propp-distanserverktyget och lämna en gasvolym över vätskefasen för den slutliga luftkvilibrationen (30-45 min.).
    2. Använd det steady-state som uppnåtts under denna period för att kalibrera syresensorn för att få exakta mätningar av andning. O2 lutning neg. (negativ lutning av syre) är 0 ± 2 pmol/s·mL. Om värdet är högre än 2 pmol/s·mL, rengör kammaren och fyll på den med nyupptinad MiR05. Om lutningen är instabil, fortsätt till instrumentservice.
    3. När du har uppnått ett stabilt tillstånd väljer du koncentrationskurvan O2 och markerar kurvans stadiga region genom att hålla ned skifttangenten och musknappen med vänsterklick. När regionen har valts klickar du på F5, väljer märket för luftkalibrering med rullgardinspilen och klickar på Kalibrera och kopiera till Urklipp.
  7. Instrumentell bakgrundskalibrering (tillval)
    1. Efter luftkalibrering, se till att det inte finns någon gasvolym över vätskefasen för flödesbakgrundslikvidration (~ 15 min) och stäng kamrarna helt.
      OBS: Steady-state-hastigheten som uppnåtts under denna period representerar instrumentell bakgrund och kan subtraheras från de resulterande data för förbättrad analytisk precision. O2-lutningen neg. kommer initialt att öka något och platå mellan ± 2 till 4 pmol/s·mL.
    2. Om värdet är högt (>6 pmol/s·mL) finns det potentiell biologisk förorening. Rengör i så fall kammaren och fyll på den med nyupptinad MiR05. När ett steady-state har uppnåtts väljer du kurvan O2 lutning neg.
    3. När du har valt region klickar du på F5, väljer korrigeringsrutan baslinje och markeringen för Baslinje med listrutan och klickar på OK.

4. Tumör homogenate beredning

  1. Placera en glas homogenisator som innehåller 1 ml MiR05 och en tätt passande glasplåga på våt is.
  2. Vid tidpunkten för studien, placera vävnaden i 1 ml BIOPS i en iskall Petri-maträtt.
  3. Rengör och dissekera vävnaden för att maximera lösligt material, undvika nekrotiska regioner och ta bort marginell tumörvävnad. Använd ett dissekeringsmikroskop, skalpell och kirurgiska pincett, ta bort hår, nekrotisk vävnad, perifer bindväv och kärlvävnad och angränsande fett, efter tillämpligt. Var noga med att hålla tumören i iskall BIOPS under dissekeringen.
  4. Skär tumören i små bitar (~ 5-10 mg vardera) och placera de återstående tumörbitarna tillbaka i 10 ml BIOPS som hålls på is. Använd denna vävnad senare för ytterligare preparat om det behövs.
    Obs: Utför följande steg snabbt för att minimera den tid som provet inte är helt nedsänkt i BIOPS. När provet har placerats i MiR05 är tiden av avgörande betydelse. Flytta försiktigt den beredda homogenatet till den kalibrerade kammaren så snart som möjligt.
  5. Fläcka vävnadssektionerna försiktigt på ett filterpapper, placera dem på en liten plasttjärad vägbåt och registrera den ursprungliga våta vikten. Placera tillbaka de oanvända bitarna i BIOPS koniska 10 ml-rör för fortsatt konservering.
  6. Sänk ner vävnadssektionerna i en iskall homogenisator som innehåller MiR05 och registrera återstående vikt på vägningsbåten, om tillämpligt.
  7. Använd en glasplåga (clearance range 0,09-0,16 mm), stör försiktigt tumörvävnaden genom att slutföra 5-7 down-and-up-slag. För varje slag roterar du pesteln i en medurs-mot-medurs rörelse 3 gånger medan du trycker ner pesteln och 3 ytterligare gånger medan du drar upp pesteln igen. Var noga med att låta vävnaden sätta sig till botten av homogenisatorn mellan slagen men undvik att föra pesteln helt över vätskevolymen för att förhindra skumning.
    OBS: Det resulterande homogenatet bör verka grumligt med minimala rester av fast vävnad.
  8. Häll homogenatet i ett koniskt rör på 15 ml och placera det på is.
  9. Pipettering 1-3 ml färsk MiR05 över pesteln och in i homogenisatorn för att tvätta eventuell återstående vävnadshomogenat. Häll MiR05-tvätten i det koniska röret som innehåller homogenatet. Upprepa pestle och homogenizertvätt 2-3 gånger för att säkerställa fullständig överföring av homogenatet. Tänk på målkoncentrationen och den volym som krävs för att inte överspäd provet under tvättstegen.
  10. För att noggrant beräkna vävnads homogenatkoncentrationen, inspektera noggrant homogenisatorn och homogenatet för återstående icke-homogeniserat material (dvs. bindväv).
    1. För att ta bort det icke-homogeniserade materialet från homogenisatorn som inte kan nås med pincett, tillsätt MiR05 till homogenisatorn, aspirera volymen (inklusive vävnaden) med en pipett och flytta innehållet till en Petri-maträtt.
    2. För att avlägsna det icke-homogeniserade materialet från homogenatet (bosatt i stora bitar längst ner i det koniska röret), aspirera de stora bitarna med en pipetter och placera dem på vävnadslocket på det koniska röret.
    3. Ta bort vävnaden från petriskålen eller koniska rörlocket med pincett och fläcka den på filterpapper. Tillsätt det återstående homogenatet från det koniska rörlocket tillbaka i koniska röret, kapa det och vänd sedan för att blanda.
    4. Kontrollera homogenisatorerna och homogenatet på nytt efter ytterligare icke-homogeniserat material och upprepa steg 4.10.1-4.10.3 för att avlägsna materialet vid behov.
  11. Väg och registrera massan av det icke-homogeniserade materialet som återvinns från homogenisatorn. Inspektera homogenpreparatet för eventuell grovt intakt vävnad som överförs. Ta bort de icke-homogeniserade bitarna och väg vid behov.
  12. Subtrahera vävnadsvikten som återvinns från vägbåten, homogenisatorn och homogenatet (om nödvändigt) från den ursprungliga våtvikten för att beräkna den slutliga provvikten.
  13. Använd den slutliga provvikten och tillsätt ytterligare MiR05 för att homogenisera den önskade koncentrationen (se steg 5 för detaljer om optimeringsexperiment).
  14. När homogenatet har vägts och beretts, fortsätt att analysera så snart som möjligt. Förvara provet lagrat på våt is tills det överförs till instrumentet.

5. Substrat, uncoupler, inhibitor titrering protokoll (SUIT)

  1. När instrumentet är kalibrerat och provet är förberett, ta bort propparna med en vridande rörelse och aspirera MiR05 från kamrarna (undvik att membranet exponeras inuti kammaren). Blanda homogenisbrunn och tillsätt 2,25 ml homogenat till kammaren. Om du lägger till ett homogenat i flera kammare, pipetten 1 ml i taget i varje kammare samtidigt som homogenatet blandas för att säkerställa jämn vävnadsfördelning. Klicka på F4 för att namnge och tidsstämpla evenemanget och klicka sedan på OK.
  2. Fyll en 50 ml spruta med syre från en syretank med en regulator och gasrör med en trubbig 18 G-nål. Hyperoxygenera kamrarna till ~500 μM syre. För detta injicerar du syre direkt i kamrarna. Sätt löst i propparna och vänta med att stänga tills syret når ~480 μM. Med en vridande rörelse stänger du långsamt kammaren och låter andningen balansera (~ 15-20 min). Fyll proppens centrala kapillär med MiR05 om det behövs.
  3. Analytisk bestämning av OXPHOS- och ET-kapaciteten (elektronöverföringstillstånd) för N-länkad och NS-länkad och CIV -aktivitet (komplex IV): Använd dedikerade mikrosyringer för att injicera substrat, uncouplers och inhibitorer i helt slutna kammare. Klicka på F4 med varje injektion för att namnge och tidsstämpla händelserna för varje kammare i realtid. Under hela studien väljer du F6 för att justera O2-koncentrationen och O 2-lutningsvågarna efter behov. Efter varje injektion, tvätta sprutorna 3 gånger i vatten (för vattenlösliga föreningar) eller 70% etanol (för föreningar upplösta i etanol eller DMSO).
    OBS: N-länkat: O2 flöde som stöds av definierade NADH-genererande substratkombinationer, NS-länkade: O2 flöde som stöds av konvergensen av definierade NADH-genererade substratkombinationer och koncisa.
    1. Tillsätt 5 μL malat (2 mM slutlig koncentration) och fortsätt omedelbart till nästa injektion. Tvätta injektionssprutan 3 gånger i vatten.
    2. Tillsätt omedelbart 5 μL 1 M Pyruvat (2,5 mM slutlig koncentration) och vänta tills andningen stabiliseras. Tvätta injektionssprutan 3 gånger i vatten.
    3. Tillsätt 10 μL 0,5 M ADP (2,5 mM slutlig koncentration) och vänta på att ADP-svaret stabiliseras. Tvätta injektionssprutan 3 gånger i vatten.
      OBS: Ytterligare ADP (2,5-10 mM) kan krävas för att säkerställa att adenylatkoncentrationerna inte begränsas till andningsflöde.
    4. Tillsätt 5 μL 2 M glutamat (5 mM slutlig koncentration) och vänta tills andningen stabiliseras. Tvätta injektionssprutan 3 gånger i vatten.
    5. Tillsätt 5 μL 4 mM Cytokrom c (10 μM slutlig koncentration) och vänta tills andningen stabiliseras. Tvätta injektionssprutan 3 gånger i vatten.
    6. Tillsätt 20 μL 1 M Succinate (10 mM slutlig koncentration) och vänta tills andningen stabiliseras. Tvätta injektionssprutan 3 gånger i vatten.
    7. Titrate 0,5-1 μL steg om 1 mM FCCP (2-20 μM slutlig koncentration) och vänta på att andningen stabiliseras efter varje injektion, fortsätt tills det inte finns någon ytterligare ökning av andningen. Tvätta injektionssprutan 3 gånger i 70% etanol.
    8. Tillsätt 2 μL 150 μM Rotenone (150 nM-2 μM slutlig koncentration) och vänta tills andningen stabiliseras. Tillsätt ytterligare 1 μL Rotenone för att försäkra att det inte finns någon ytterligare hämning. Om andningen minskar, fortsätt med ytterligare injektioner tills andningen inte minskar. Tvätta injektionssprutan 3 gånger i 70% etanol.
    9. Tillsätt 2 μL 125 μM Antimycin A (125 nM-5 μM slutlig koncentration) och vänta tills andningen stabiliseras. Tillsätt ytterligare 1 μL Antimycin A för att försäkra att det inte finns någon ytterligare hämning. Om andningen minskar, fortsätt med ytterligare injektioner tills andningen inte minskar. Tvätta injektionssprutan 3 gånger i 70% etanol.
    10. Kontrollera kammarens syrekoncentration; Om koncentrationen är lägre än 125 μM, reoxygenera till rumsluften eller milt hyperoxygenat för att säkerställa att syret inte begränsar andningsflödet. Tillsätt 5 μL 0,8 M Ascorbate (2 mM slutlig koncentration). Tvätta injektionssprutan 3 gånger i 70% etanol.
    11. Tillsätt omedelbart 10 μL 0,2 M TMPD (1 mM slutlig koncentration) vänta på en ökning av andningen långsamt. Tvätta injektionssprutan 3 gånger i 70% etanol.
    12. Tillsätt 25 μL 4 M natriumazilid (50 mM slutlig koncentration) omedelbart när andningsflödet i Ascorbate/TMPD-platåerna. Tvätta injektionssprutan 3 gånger i 70% etanol.
    13. Avsluta studien - klicka på Arkiv, Spara och Koppla från. Fortsätt att tvätta kammaren och sprutan enligt steg 9.2-9.3.

6. ADP-känslighetsprotokoll

  1. När instrumentet är kalibrerat och provet är förberett, ta bort propparna med en vridande rörelse och aspirera MiR05 från kamrarna (undvik att membranet exponeras på insidan av kammaren). Blanda homogenisbrunn och tillsätt 2,25 ml homogenat till kammaren. Antag att man lägger till en homogenat till flera kammare, pipetten 1 ml i taget i varje kammare samtidigt som homogenatet blandas för att säkerställa lika vävnadsfördelning. Klicka på F4 för att namnge och tidsstämpla evenemanget och klicka på OK.
  2. Sätt i propparna, och med en vridande rörelse, stäng långsamt kammaren och låt andningen balansera (~ 15-20 min). Fyll proppens centrala kapillär med MiR05 om det behövs.
  3. Analytisk bestämning av succinate-linked mitokondriell ADP känslighet: Klicka på F4 med varje injektion för att namnge och tid stämpla händelserna för varje kammare i realtid. Under hela studien väljer du F6 för att justera O2-koncentrationen och O 2-lutningsvågarna efter behov.
    1. Tillsätt 2 μL 150 μM Rotenone (150 nM slutlig koncentration).
    2. Tillsätt omedelbart 20 μL 1 M Succinate (10 mM slutlig koncentration) och vänta tills andningen stabiliseras.
    3. Titrera ADP genom stegvis tillsats av submättande koncentrationer tills den når den maximala svarshastigheten (VMAX, 2,5-10 mM slutlig koncentration).
      OBS: Frekvensen kan platå efter injektion på grund av en liten förändring i ADP-koncentrationen, vilket ökar injektionskoncentrationen efter varje platå och fortsätt med titreringen tills det inte finns någon ytterligare ökning av andningen även med en vikningsökning i ADP injektionskoncentration.

7. Rekommenderade optimeringsexperiment

  1. Bestäm optimal homogeniserings- och syrekoncentration för protokoll.
    1. Utför SUIT-protokoll (steg 5.1-5.3) vid flera vävnadskoncentrationer (t.ex. 30 mg/mL, 20 mg/ml, 10 mg/ml, 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1 mg/ml och/eller 0,5 mg/ml).
    2. Välj en koncentration som maximerar andningsflödet samtidigt som frekvensen av reoxygenationer begränsas (högst 1-2). Om mer frekventa reoxygenationer krävs, minska homogenatets koncentration.
  2. Bestäm det optimala antalet slag med homogenisatorn.
    1. Utför SUIT-protokoll (steg 5.1-5.3) på flera nivåer av homogenisering (t.ex. 5 slag, 10 slag, 15 slag, 20 slag).
    2. Eftersom det inte finns tillräckliga data i litteraturen för att bestämma en tröskel för den procentuella ökningen av cytokrom c med tumör homogenate beredning, välj preparatet med begränsad cytokrom c svar men tillräcklig andning energi av substrat(er) av intresse.
  3. Bestäm de optimala substrat- ADP-, frikopplings- och inhibitorkoncentrationer som krävs för kvantitativa och reproducerbara andningsflöde.
    1. Utför SUIT-protokoll (steg 5.1-5.3.9) vid vald vävnadskoncentration (steg 7.1). Titrera varje substrat, uncoupler, inhibitor och ADP tills inget ytterligare svar observeras. Titrera hämningen med natriumazid i separata experiment.
      1. Tillsätt 5 μL malat (2 mM slutlig koncentration) och fortsätt omedelbart till nästa injektion.
      2. Titrate 1 μL steg om 1 M Pyruvat och vänta på att andningen stabiliseras efter varje injektion, fortsätt tills det inte finns någon ytterligare ökning av andningen.
      3. Titrate 2 μL steg på 0,5 M ADP och vänta på att andningen stabiliseras efter varje injektion, fortsätt tills det inte finns någon ytterligare ökning av andningen.
      4. Titrate 1 μL steg om 2 M glutamat och vänta på att andningen stabiliseras efter varje injektion, fortsätt tills det inte finns någon ytterligare ökning av andningen.
      5. Tillsätt 5 μL 4 mM Cytokrom c (10 μM slutlig koncentration) och vänta tills andningen stabiliseras.
      6. Titrera 5 μL steg om 1 M Succinate och vänta tills andningen stabiliseras efter varje injektion, fortsätt tills det inte finns någon ytterligare ökning av andningen.
      7. Titrate 5 μL steg på 0,5 M ADP och vänta på att andningen stabiliseras efter varje injektion, fortsätt tills det inte finns någon ytterligare ökning av andningen.
      8. Titrate 0,5 μL steg på 1 mM FCCP och vänta tills andningen stabiliseras efter varje injektion, fortsätt tills det inte finns någon ytterligare ökning av andningen.
      9. Titrate 1 μL steg om 150 μM Rotenone och vänta på att andningen stabiliseras efter varje injektion, fortsätt tills det inte finns någon minskning av andningen.
      10. Titrate 1 μL steg om 125 μM Antimycin A och vänta på att andningen stabiliseras efter varje injektion, fortsätt tills det inte finns någon ytterligare minskning av andningen.
      11. Tillsätt 5 μL 0,8 M Ascorbate (2 mM slutlig koncentration).
      12. Tillsätt omedelbart 5 μL 0,2 M TMPD (,5 mM slutlig koncentration) vänta på ökad andning långsamt. I ett separat experiment tillsätt 10 μL 0,2 M TMPD (1 mM slutlig koncentration).
      13. I separata experiment tillsätts 10 μL, 25 μL, 50 μL och 100 μL 4 M natriumazid (20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM slutlig koncentration) omedelbart när andningsflödet hos Ascorbate/TMPD-platåer.
    2. Välj de substrat- och inhibitorkoncentrationer som mättas inom den första injektionen för att förbättra tidpunkten för experimentet. Använd ADP vid mättande eller submättande koncentrationer för att kombinera ADP-känslighetsutvärderingar med traditionella SUIT-protokoll.
    3. Använd sub maximala uncoupler koncentrationer för att visa dos-lyhördhet utan hämning av andning flöde.

8. Dataanalys

  1. SUIT-analys
    1. Välj steady-state eller peak rates från varje titrering och export för analytisk minskning.
    2. Uttryck data som pmol O2 per sekund per mg vävnad (pmol/s/mg).
    3. Uppnå den analytiska minskningen av PM-L, PM-P, PMG-P, PMGS-P och PMGS-E genom att subtrahera antimycin A okänslig ränta från respektive frekvens (dvs. steady-state rate som erhålls efter tillsats av ADP).
      OBS: PM: Pyruvate + Malate; PMG: Pyruvate + Malate + Glutamat; PMGS: Pyruvate + Malate + Glutamat + Succinate; -L:Läckagetillstånd; -P: Oxidativt fosforyleringstillstånd, -E: Elektronöverföringstillstånd.
    4. Uppnå den analytiska minskningen av CIV-E genom att subtrahera natriumazid okänsligt från topp askorbat/TMPD-hastighet.
    5. Uppnå den analytiska minskningen av PMG-E genom att subtrahera rotenon okänsligt från PMGS-E-hastigheten.
    6. Uppnå analytisk minskning av S-E genom att subtrahera antimycin A okänslig hastighet från rotenon okänslig hastighet.
    7. Uppnå analytisk minskning av cytokrom c kontroll effektivitet, en markör för yttre membran intakthet, genom följande ekvation:
      jc = ((JCHNOc - JCHNO)/JCHNO) x 100
      I ekvationen är jc % ökning vid tillsats av cytokrom c, JCHNOc är syreflödet efter tillsats av cytokrom c, och JCHNO är syreflödet före tillsats av cytokrom c.
  2. ADP-känslighetsanalys
    1. Analytiskt bestämma kinetiken för ADP-känsligheten i förhållande till läckagehastigheten för succinate + rotenone (inte vävnad homogenatets hastighet).
    2. Rita O2-flödet (Y-axeln) mot den relativa ADP-koncentrationen (X-axeln). Bestäm den maximala andningshastigheten (Vmax)som den topphastighet som uppnås under ADP-titreringen.
    3. Bestäm Michaelis-Menten-kinetiken med hjälp av en kurvpassningsprogram (PRISM, version 10.1) för att avslöja ADP-koncentrationen vid vilken 1/2 VMAX uppnås (Apparent KM).

9. Instrumentell kvalitetskontroll

  1. Utför instrumental O2-bakgrund över önskat syrekoncentrationsområde (0-600 μM) och noll kalibrering.
    1. Slutför steg 3.1 och 3.2
    2. Ta bort propparna och aspirera 70% etanol från kamrarna (undvik membranet exponerat på insidan av kammaren). Skölj 4 gånger med dubbeldestillerad H2O och fyll kammaren med 2,25 ml MiR05
    3. Hyperoxygenera kamrarna till ~600 μM syre.
    4. Sätt långsamt in propparna i helt stängt läge. Sug bort överskottet av det överflödiga mediet som kastas ut genom injektionska kapillären och samlas i proppens brunn och låt syresignalen stabiliseras (30-45 min).
    5. Om du vill utföra syrekalibrering väljer du den region där både syrekoncentrationen och lutningen är stabila, öppnar kalibreringsfönstret för respektive kammare och väljer R1-märket.
    6. Förbered ditionitlösningen genom att lösa upp 20 mg natriumhydrosulfit i 0,5 ml vatten. Begränsa exponeringen för luft eftersom ditionit oxideras med tiden med exponering för syre.
    7. När syresignalen har stabiliserats injicerar du 1 μL och observerar minskningen av syrekoncentrationen. Justera styrkan hos ditionitlösningen efter behov.
    8. Injicera tillräcklig ditionitlösning för att sänka syrekoncentrationen till 450 μM, 300 μM, 225 μM, 150 μM, 75 μM respektive 0 μM. Vid varje injektion, låt syret stabiliseras och välj ett märke för steady-state lutningen. När syrekoncentrationen är ~0 μM, markera syrekoncentrationen.
    9. Om du vill utföra instrumentell O2-bakgrundskorrigering väljer du flödet/lutningsfönstret för respektive kammare, väljer O2 Bakgrundskalibreringoch klickar på Kalibrera för intressanta märken.
    10. Om du vill utföra nollkalibrering öppnar du kalibreringsfönstret för respektive kammare och väljer R0-märket som uppnåtts efter ditionittititerring.
  2. Rengöring av instrument
    1. Skölj snabbt varje kammare med rent vatten tre gånger. För den första tvätten, aspirera homogenatet, fyll kammaren helt med vatten och aspirera sedan vattnet. För den andra tvätten, fyll kammaren 3/4 full av vatten, sätt in propparna för att tvinga vatten genom injektionska kapillären, aspirera en del av vattnet genom injektionska kapillären och ta sedan bort propparna för att aspirera tvätta helt.
    2. Tvätta kamrarna med 70% etanol i 5 min.
    3. Rengör propparna med rent vatten, 70% etanol och 100% etanol över en diskbänk eller bägare, vilket tvingar vätska genom injektionskarillärerna med en tvättflaska.
    4. Skölj snabbt varje kammare med rent vatten två gånger.
    5. Inkubera kamrarna med 2 ml PBS som innehåller ~2 mg frysta mitokondrier, celllylyst eller levande fibroblaster i 15 minuter.
    6. Tvätta kamrarna med rent vatten i 5 min två gånger.
    7. Tvätta kamrarna med 70% etanol i 5 min två gånger.
    8. Tvätta kamrarna med 100% etanol i 10 min.
    9. Fyll kamrarna med 70% etanol.
      1. Om du kör ett på varandra följande experiment, lämna kamrarna i 70% etanol i 5 min och fortsätt sedan att steg 3,3.
      2. Om experimenten är klara, sätt lock på propparna och stäng av instrumentet.
  3. Rengör injektionssprutorna ordentligt efter varje användning och förvara sprutorna avsedda för specifik sammansatt användning för att förhindra överföring.
    1. För in sprutan i tvättvätskan och sänk ner injektionsnålen helt.
    2. Dra upp tvättvätskan i sprutan till maximal volym.
    3. Ta ut sprutan ur tvättbehållaren, kasta ut tvättvätskan i en bägare och fläcka sedan sprutan på en pappershandduk.
    4. Upprepa steg 9.3.1-9.3.3 tre gånger så snart som möjligt efter varje användning.

Representative Results

Inledande studier visade att EO771 tumörer var låg oxidativa och därmed krävs höga homogenate koncentrationer för adekvat O2 flöde bedömning. Optimeringsexperiment utfördes för att bestämma det optimala vävnad homogenat koncentrationsområdet för studien. Tumör homogenater förbereddes ursprungligen vid 40 mg/ml och sedan linjärt utspädd. O2-flödet normaliserat till vävnadsmassa var konsekvent över koncentrationerna (figur 1A-D). Det observerades att 40 mg/ml resulterade i snabb syrebrist och inte var lämplig för experiment (figur 1A). Syreförbrukningen minskade avsevärt med 30 mg/ml och 20 mg/ml men minskade ändå snabbt på kort tid i avsaknad av substrat eller ADP(figur 1B,C). Koncentrationen på 10 mg/ml resulterade i den optimala syreförbrukningen (figur 1D) som skulle stödja ett längre 90-minuters SUIT-protokoll.

Ett SUIT-protokoll användes för att utvärdera NADH- och konsennakopplade OXPHOS och ET, samt CIV-aktivitet (figur 2A). Pyruvate och malate tillsattes till vävnad homogenate i avsaknad av ADP att driva läcka (L) genom NADH. Mättande ADP lades sedan till för att driva maximal NADH-länkad OXPHOS (P), följt av tillsats av glutamat. Cytokrom c tillsattes sedan för att säkerställa yttre membran integritet; Ökningen av andningsfrekvensen var mindre än 20 % i alla prover(figur 2B). Med tanke på det mycket låga svaret på NADH-länkade substrat bedömdes cytokrom c-frisättning också i närvaro av succinate och rotenon och observerade minimal cytokrom c stimulering (figur 2B). Intressant nog var NADH-länkade OXPHOS försumbar i EO771 tumörer (figur 2C). Succinate tillsattes sedan i närvaro av pyruvat, malat och glutamat för att stimulera elektronflödet genom succinate dehydrogenase. FCCP titrerades sedan för att driva maximalt elektronflöde (E), vilket visade att i EO771 tumörer var fosforylering snarare än oxidation begränsad till andning (figur 2C). Rotenon och antimycin A titrerades därefter för att hämma komplex I respektive komplex III. Ascorbate och TMPD tillsattes sedan för att driva maximalt elektronflöde genom CIV, som sedan hämmas av natriumazid. Tabell 1 illustrerar analytiska reduktionsekvationer i rådata (tabell 2) för att kvantitetera de andningsparametrar som ritas upp i figur 2C. Sammantaget liknar tumör homogenate andningsprofiler (figur 2C) de hos icke-implanterade digitonin-permeabiliserade EO771-celler (figur 2D) med undantag för minskad maximal elektronöverföring som stöds av N- och S-länkade substrat i tumören.

Eftersom NADH-länkad andning var försumbar, utvärderades andningskinetiken hos succinate ytterligare genom stegvisa titreringar av submättande ADP tills den maximala hastigheten (VMAX)uppnåddes (figur 3A,3B). Den halv-maximala koncentrationen (KM)av ADP i närvaro av succinate + rotenone var 37,5 μM, medan VMAX var ~ 10,5 pmol/s/mg (figur 3C). Trots relativt låga oxidationshastigheter var EO771 tumörer mycket känsliga för ADP och ihållande ATP syntes vid relativt låga ADP koncentrationer.

Att välja lämpliga regioner i rådata för extraktion är avgörande för experimentens reproducerbarhet och korrekt kvantifiering. För cytokrom cmåste ett märke väljas i steady-state omedelbart före injektionen(figur 4A, märke 1). Det finns ofta en första injektion artefakt som kan följas av en tidsperiod (ca 5-10 min) där O2 flux inte är stadig. Utvärdering av cytokrom c-effektiviteten görs genom att göra ett ytterligare val när O2-flödet har stabiliserats(figur 4A, märke 2). Val efter tillsats av substrat, ADP eller de flesta hämmare görs också efter injektionsartefakten och när O2-flödet har stabiliserats (figur 4B). Det urval som används för att bestämma maximal frikoppling görs vid den maximala ökning som uppnås under titrering av FCCP, vilket ofta inte är den sista injektionen som görs (figur 4C). Valet för TMPD görs efter att både askorbat och TMPD har lagts till och vid den maximala ökningen av andningen (figur 4D, märke 1). Strax efter denna topp tillsätts hämmaren, natriumazid, vilket snabbt minskar andningen men också ofta har en injektionsartefakt som är lägre än den hämmade andningshastigheten (figur 4D). Inhibitormärket görs omedelbart efter injektionsartefakten (figur 4D, märke 2). O2-flödet stabiliseras vanligtvis inte och fortsätter att minska.

Tabell 1: Andnings notation och analytisk härledning. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tabell 2: Prov- och andningsegenskaper hos luminala B-brösttumör homogenater. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Figure 1
Figur 1: Optimering av tumör homogenat koncentration. O2 Flux (röd) och O2 Koncentration (blå) i brösttumör homogenater beredda vid (A) 40 mg/mL, (B) 30 mg/mL, (C) 20 mg/mL och (D) 10 mg/mL. Thom: Vävnad homogeniserad andning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Utvärdering av OXPHOS- och ET-kapacitet genom högupplöst respirometri i nystrukna tumör homogenater. (A) Representativt diagram över syreförbrukning (röd) och koncentrationer (blå) under loppet av ett substrat, hämmare, frikopplingsprotokoll. PM: Pyruvate + Malate, D: ADP, G: Glutamat, c: Cytokrom c, S: Succinate, F: FCCP, Rot: Rotenone, Ama: Antimycin A, Asc/TMPD: Ascorbate/Tetramethyl-p-fenylendiamin. (B) Procentuell ökning av O2 flöde vid tillsats av cytokrom c. (C-D) Andning som stöds av malat, pyruvat, glutamat och koncisat i närvaro av ADP, FCCP och ascorbate/TMPD i (C) EO771-härledda tumör homogenater och (D) icke-implanterade EO771 digitonin-permeabiliserade celler. Thom: Vävnad homogenisering. PM: Pyruvate + Malate; PMG: Pyruvate + Malate + Glutamat; PMGS: Pyruvate + Malate + Glutamat + Succinate; CIV: Komplex IV; -L: Läckagetillstånd; -P: Oxidativt fosforyleringstillstånd, -E: Elektronöverföringstillstånd; N-länkad: O2-flöde som stöds av definierade NADH-genererande substratkombinationer. NS-länkat: O2-flöde som stöds av konvergensen av definierade NADH-genererade substratkombinationer och koncisa. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: EO771 bröst tumörer visade hög ADP (adenosin 5′-difosfat) känslighet. ( A) Representativt diagram över syreförbrukning (röd) och koncentrationer (blå) i ett S-länkat ADP-titreringsprotokoll. Thom: Vävnad homogenisering. S/Rot: Succinate/Rotenone; D: ADP. (B)Andning som stöds av konnat i närvaro av rotenon och ökande koncentrationer av ADP (0 μM ADP = S/Rot-L). c) Maximal hastighet (VMAX)och halv-maximal koncentration (KM)av ADP i närvaro av succinate + rotenone. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativ spårning som illustrerar markeringsval av råa O2-flöden för datautvinning. (A) Cytokrom c-urval: urval nummer 1 före cytokrom c-injektionen och urvalsnummer 2 efter injektionen när O2-flödet har stabiliserats. c Cytokrom c. (B) Substrat, ADP och inhibitorval: urval nummer 1 efter injektionen (konsentan i detta representativa område) där O2-flödet har stabiliserats. S: Succinate. c)Val av frikopplare: urval nummer 1 vid den maximala ökningen av andningen under icke-frikopplartitreringen. I denna representativa FCCP titreringsplott minskar den tredje injektionen något andningen och används därför inte för urval. F: ACCP. (D)TMPD-urval: urval nummer 1 vid den maximala ökningen av andningen efter askorbat- och TMPD-injektionerna. Natriumazidval: urval nummer 2 efter den akuta injektionsartefakten när andningen initialt minskar. As/Tm: Ascorbate/TMPD; Azd: Azide. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Discussion

Metoder för att utvärdera mitokondriell andning vid cancer har till stor del begränsats till in vitro-modeller 13,14,15,16. Viss framgång har uppnåtts vid mätning av mitokondriell andning i tumörer med hjälp av kemisk permeabilisering6,7,17, men det finns ingen enhetlig, guldstandardmetod som kan tillämpas universellt och jämföras över tumörtyper. Dessutom har bristen på konsekvent dataanalys och rapportering begränsad datageneralisering och reproducerbarhet. Metoden beskrivs häri ger en enkel, relativt snabb strategi för att mäta mitokondriell andning18 i mitokondriellt preparat från nyligen strukits fasta tumör exemplar. Tumörer odlades från ortopiskt implanterade murin Luminal B, ERα-negativa EO771 bröstcancerceller19.

Flit och omsorg med vävnadshantering kommer avsevärt att förbättra noggrannheten och normaliseringen av syreförbrukningen. Vävnaden och mitokondrierna kan lätt skadas om provet inte hålls kallt, inte konsekvent är nedsänkt i konserveringsmedier eller hanteras alltför mycket, vilket resulterar i suboptimala rutiner och OXPHOS-hastigheter. Dessutom är noggrann våt vikt av homogeniserad vävnad av avgörande betydelse eftersom detta är den primära normaliseringsmetoden. Andra normaliseringsmetoder kan övervägas, såsom totalt protein eller mitokondriella specifika markörer, såsom citratsyntasaktivitet20. Dessutom måste vävnad heterogenitet åtgärdas, med beslut om tumör regioner att inkludera i experiment som gjorts a priori. Necrotic, fibrotic och bindväv får inte homogenisera och/eller respir väl och bör undvikas om inte avsiktligt analysera dessa tumör regioner. I synnerhet kan tumören vara mycket klibbig beroende på typ och excision region, vilket gör noggrann vägning och överföring mer utmanande. Antalet slag som används för homogeniseringar bör optimeras för att säkerställa fullständig förberedelse av mitokondrierna samtidigt som skadorna på de yttre mitokondriella membranen mildras.

För förbättrad noggrannhet och reproducerbarhet rekommenderar vi att optimeringsexperiment utförs för antalet slag för homogen beredning, vävnadskoncentration och substrat, frikopplings- och inhibitorkoncentrationer. Studier kan jämföra det olika antalet stroke och hur de motsvarar svar på tillsats av cytokrom c i studien samt den maximala mitokondriella andningskapaciteten 21. Även om det finns en allmän acceptans för att mindre cytokrom c svar är bättre, eftersom en ökning av syreförbrukningen efter tillsats av cytokrom c kan indikera skador på det yttre mitokondriella membranet, finns det ingen guldstandard för vad denna tröskel är för varje vävnad och bör undersökas experimentellt för att säkerställa att vävnaden inte är överarbetad eller underpreparerad. I denna tumör vävnad, det konstaterades att en cytokrom c svar under ~ 30% inte försämrade luftvägarna funktion. Cytokrom c användning blir avgörande för korrekt kvantifiering av andningskapacitet om testet är positivt. I detta fall fyller tillägget på endogen cytokrom c, vilket, om det utarmas, kommer att orsaka en underskattning av andningsfrekvenserna.

Vävnadskoncentration titreringsexperiment kan utföras över en rad möjliga koncentrationer och skulle helst göras med SUITs som kommer att undersökas under studien. Andningskapaciteten varierar beroende på tumörtyp och sammansättning. Således kommer tumörer täta med mitokondrier eller hög andningskapacitet att kräva lägre koncentrationer (0,5-5 mg/ml). Tumörer med få mitokondrier eller låg andningskapacitet kommer att kräva högre koncentrationer (7-12 mg/ml). Dessutom kan SUITs som är långa eller har mycket konsumerade substrat behöva mindre vävnad för att förhindra reoxygenation av kammaren eller ADP-begränsning. Vissa vävnader kommer att ha ett linjärt samband i syreförbrukningen, medan andra kommer att visa förbättrad känslighet och maximal oxidation vid vissa koncentrationsområden. Den valda vävnadskoncentrationen bör optimeras för att maximera syreflödet samtidigt som antalet reoxygenerationshändelser begränsas. Dessutom är det ofta bättre att överskatta behovet eller sikta på den högre änden av koncentrationsområdet. Inhibitorerna, som är väsentliga för mängden andningsflöde, är mer exakta när de används i större pooler av mitokondrier.

En annan viktig faktor är koncentrationen av de läkemedel som används under protokollen. Förändringar i homogenkoncentrationen kan förändra koncentrationerna av substrat, uncouplers och inhibitorer som krävs för maximal respons. Således, när det optimala koncentrationsområdet har valts, bör ett experiment som testar de doser som krävs för SUIT-protokollet utföras. Ytterligare ADP kan tillsättas för att säkerställa att adenylatkoncentrationerna inte begränsas till andningsflöde. Kemiska uncouplers som FCCP eller CCCP kommer att hämma andning vid högre koncentrationer22. Som sådan är det viktigt att titrera i små mängder för att avslöja den maximala uppnådda hastigheten. Inhibitorer, såsom rotenon och antimycin A, används bäst när de är mättade inom den första injektionen. Medan optimala koncentrationer fastställdes i preliminära experiment, har vi också observerat behandlingsrelaterade skillnader som svar på inhibitorer och därmed ofta lägga till en ytterligare injektion av inhibitorer för att visa maximal hämning eftersom de resulterande frekvenserna tjänar som grund för kvantifiering. Kemisk hämning av Ascorbate/TPMD är avgörande för noggrann analytisk reduktion eftersom TMPD genomgår autooxidation23. Vi kontrollerade för automatisk oxidation av ascorbate/TMPD/cytokrom c genom tillsats av natriumazid, en etablerad CIV-hämmare. För Km-studierna förhindrar tillsats av rotenon i närvaro av enbart succinate oxaloacetat ackumulering som kan hämma konjak dehydrogenasaktivitet vid låga koncentrationer24. Volymen och koncentrationen av ADP är mycket beroende av mitokondriernas känslighet för den rådande substratkombinationen. Mitokondriella preparat som är mycket känsliga för ADP kommer att kräva lägre startkoncentrationer. Dessutom är validerade kemikalier och korrekt läkemedelsberedning med uppmärksamhet på pH, ljuskänslighet om tillämpligt och lagringstemperatur avgörande för framgångsrika experiment.

Instrumentinställning och rutinvård är av avgörande betydelse för framgången för dessa experiment. Adekvat och korrekt rengöring av kamrarna är avgörande för reproducerbarhet och förebyggande av biologisk, protein-, hämmare eller frikopplingskontaminering. Elektroder av Clark-typ och O2k-system använder glasreaktionskammare vilket är en betydande kostnadsfördel för plåtbaserade system som är beroende av förbrukningsvaror. Glaskamrarna måste dock rengöras kraftigt och kan vara en källa till inhibitorkontaminering i efterföljande studier. Inkubation med mitokondririka exemplar under tvättprocessen (isolerad hjärt- eller lever mitokondrier, till exempel) kan minska risken för experimentell förorening och rekommenderas utöver utspädning och alkoholbaserade tvättprocedurer. Om på varandra följande studier körs minimerar rengöring med etanol och mitokondrier risken för inhibitorkontaminering. Kalibrering av syresensorn rekommenderas före varje experiment för att få exakta mätningar av andning i förhållande till det rådande partiella syretrycket. Om flera kalibreringar inte är möjliga kan en kalibrering om dagen vara tillräcklig om syrekoncentrationen förblir stabil och jämn efter tvättproceduren.

De procedurer som beskrivs ovan utnyttjar Oroboros O2k-instrumentet för att mäta syreförbrukning i tumörvävnad inom 4 timmar efter tumörexcision med hjälp av tidigare utformad och optimerad konserveringslösning och andningsmedier25,26,27. Flera parametrar i det här protokollet kan ändras för efterföljande program. Instrumentinställningen och kalibreringen, homogenisatorerna som används för vävnadsberedning och optimal homogenis- och kammarsyrekoncentration kan alla anpassas för användning på andra instrument med syreövervakningspotential. Till exempel var kamrarna något överfyllda när man lägger till homogen, och således när kammaren är helt stängd förblir kammaren kapillären full. Detta kommer att konsumera lite syre i kammaren, men med optimering av provkoncentrationen kan vi redogöra för denna förbrukning för att bestämma vilken syrenivå vi ska börja med. Alternativt kan provet tillåtas att balansera vid omgivande syre innan kammaren stängs, men detta ökar ofta tiden innan experimentet startar och fördröjer tillsatsen av substrat. Medan homogenisatorer som används i detta protokoll är allmänt tillgängliga, kan andra kommersiella homogeniseringstekniker användas, till exempel en vävnadsförstörare eller automatiserad homogenisator28.

Dessutom kan vävnadsberednings- och instrumentprocedurerna användas med ett antal olika SUITs för att studera andningskontroll genom en mångfald av kopplings- och vägkontrolltillstånd29. Dessa SUIT-protokoll har utvecklats för att mäta funktionskapacitet, och därmed har bidraget från potentiella endogena substrat ingen inverkan på kapacitetsmätningen. Vi tar analytiskt hänsyn till icke-mitokondriell syreförbrukning och/eller restförbrukning av homogenatet genom subtraktion av antimycin A-rotenone, eller natrium azid okänsliga priser, när så är lämpligt. Mitokondrier kan förbli livskraftiga i BIOPS eller liknande konstruerade konserveringslösningar under längre tidsperioder (>24 h) beroende på vävnadstyp och intakthet30,31. Studier kan utföras i förväg för att fastställa de tidsmässiga lagringsgränserna eftersom OXPHOS för vissa substrat kan ha olika begränsningar. Detta är viktigt om experimentet inte kan utföras inom flera timmar efter vävnad excision/biopsi. 37°C är en optimal och fysiologisk temperatur för utvärdering av andningsfunktionen i de flesta däggdjurssystem. Om analystemperaturen verkar störa utvärdering32kan jämförande studier dock genomföras över ett brett temperaturområde (25–40 °C) för att säkerställa tillräcklig respons. Instrumentella begränsningar kan begränsa förmågan att genomföra sådana studier.

Större begränsningar av ovannämnda metod är 1) risken för skador på mitokondrier genom mekanisk homogenisering, 2) förekomst av ATPases eller andra subcellulära biokemikalier i homogena preparat som kan störa samtidig bestämning av ATP eller andra variabler av intresse och kan kräva ytterligare korrigeringsmetoder eller inhibitoranvändning33 , och 3) Utvärdering av många prover och/eller flera SUIT per prov är tidskrävande eftersom ett instrument kan rymma två experiment i taget och kräver rengöring och inrättande mellan på varandra följande experiment. Optimeringsexperiment och konsekvent förberedelse av prover kan minimera betydande mitokondriella skador som skulle bidra till inkonsekventa data.

Metodens betydelse för befintliga/alternativa metoder är förbättrad genomförbarhet jämfört med mängden startmaterial, utmaning att isolera mitokondrier eller teknisk utmaning i permeabiliserande vävnad. Beredning av homogenater är snabbare, syre är inte alls lika begränsande och är mindre mottagligt för variabilitet mellan personal jämfört med permeabiliserad vävnad. Viktigt är att nästan alla provtyper är lämpliga för homogen beredning som möjliggör jämförande analys mellan vävnader. Högupplöst respirometri är guldstandardmätningen av mitokondriell OXPHOS och ET. Tillämpningen av denna metod i preklinisk och klinisk cancerforskning har kapacitet att utöka nuvarande in vitro-undersökningar till ex vivo-studier. Dessutom erbjuder det potentiella applikationer i kliniska och diagnostiska inställningar.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter relaterade till detta arbete.

Acknowledgments

Vi tackar Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology Core personal för djurvård. Denna forskning stöddes delvis av National Institute of Health grants U54GM104940 (JPK) och KL2TR003097 (LAG). Alla experiment och försök med djur godkändes av Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate Sigma-Aldrich M8250
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A2383
Amphotericin B Gibco 15290018
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Ascorbate Sigma-Aldrich A4544
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free Sigma-Aldrich 3117057001 Roche
BD 50 mL Luer-Lok Syringe Fisher Scientific 13-689-8
BD Vacutainer General Use Syringe Needles Fisher Scientific 23-021-020
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C4830
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C2506
Datlab 7.4 software Oroboros Instruments
Dimethylsulfoxide Amresco N182
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
D-Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Dumont # 5 Forceps Fine Science Tools 11251-30 Dumoxel, autoclavable
Dumont # 7 Forceps Fine Science Tools 11271-30 Dumoxel, autoclavable
Digital Calipers 150 mm/6 in World Precision Instruments 501601
EO771 cells CH3 BioSystems SKU: 94APV1-vial-prem Pathogen Tested
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378
Female C57BL/6J mice  Jackson Laboratory Stock #000664
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Imidazole Sigma-Aldrich 56750
Kimwipes Fisher Scientific 34120
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich G1626
Lactobionic acid Sigma-Aldrich L2398
Malate Sigma-Aldrich M6413
Matrigel Matrix Corning 354248
MgCl·6H2O Sigma-Aldrich M2670
Microsyringes Hamilton 87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma-Aldrich T7394
Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10023-03
Oxygraph-2k FluoRespirometer Oroboros Instruments 10003-01
PBS Gibco 10010023
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich P1767
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
RPMI 1640 Gibco 21875034
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Succinate (disodium) Sigma-Aldrich W327700
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Whatman Filter Paper, grade 5 Sigma-Aldrich 1005-090
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL Duran Wheaton Kimble 357424
Straight Tip Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5914SC
Non-Safety Scalpel No. 11 McKesson 1029065
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2 Becton, Dickinson and Company 305109
BD Precision Glide Needle 18 G x 1 Becton, Dickinson and Company 305195
BD 1mL Slip Tip Syringe Becton, Dickinson and Company 309659
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm Thermo Fisher Scientific 316060
Rodent Very High Fat Diet,  60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate Research Diet D12492
Pyrex Watch Glass, 100 mm Thermo Fisher Scientific S34819

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeBerardinis, R. J., Chandel, N. S. Fundamentals of cancer metabolism. Science Advances. 2 (5), 1600200 (2016).
  2. Bajzikova, M., et al. Reactivation of dihydroorotate dehydrogenase-driven pyrimidine biosynthesis restores tumor growth of respiration-deficient cancer cells. Cell Metabolism. 29 (2), 399-416 (2019).
  3. Martínez-Reyes, I., et al. Mitochondrial ubiquinol oxidation is necessary for tumour growth. Nature. 585 (7824), 288-292 (2020).
  4. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS One. 6 (3), 18317 (2011).
  5. Saks, V. A., et al. Bioenergetics of the Cell: Quantitative Aspects. Saks, V. A., et al. , Springer US. 81-100 (1998).
  6. Kaambre, T., et al. Metabolic control analysis of cellular respiration in situ in intraoperational samples of human breast cancer. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (5), 539-558 (2012).
  7. Koit, A., et al. Mitochondrial respiration in human colorectal and breast cancer clinical material is regulated differently. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 1372640 (2017).
  8. Holland, O. J., et al. Changes in mitochondrial respiration in the human placenta over gestation. Placenta. 57, 102-112 (2017).
  9. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  10. Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).
  11. Kondrashova, M. N., et al. Preservation of native properties of mitochondria in rat liver homogenate. Mitochondrion. 1 (3), 249-267 (2001).
  12. Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
  13. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (1), 125-136 (2007).
  14. Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e58426 (2018).
  15. Zhang, J., Zhang, Q. Cancer Metabolism: Methods and Protocols. Haznadar, M. , Springer. New York. 353-363 (2019).
  16. Wigner, P., Zielinski, K., Labieniec-Watala, M., Marczak, A., Szwed, M. Doxorubicin-transferrin conjugate alters mitochondrial homeostasis and energy metabolism in human breast cancer cells. Scientific Reports. 11 (1), 4544 (2021).
  17. Schöpf, B., et al. Oxidative phosphorylation and mitochondrial function differ between human prostate tissue and cultured cells. The FEBS Journal. 283 (11), 2181-2196 (2016).
  18. Ye, F., Hoppel, C. L. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts. Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).
  19. Le Naour, A., et al. EO771, the first luminal B mammary cancer cell line from C57BL/6 mice. Cancer Cell International. 20, 328 (2020).
  20. Gnaiger, E., et al. Mitochondrial physiology. Bioenergetics Communications. 1, 44 (2020).
  21. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
  22. Dranka, B. P., et al. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radical Biology and Medicine. 51 (9), 1621-1635 (2011).
  23. Munday, R. Generation of superoxide radical, hydrogen peroxide and hydroxyl radical during the autoxidation of N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine. Chemico-Biological Interactions. 65 (2), 133-143 (1988).
  24. Moser, M. D., Matsuzaki, S., Humphries, K. M. Inhibition of succinate-linked respiration and complex II activity by hydrogen peroxide. Archives of Biochemistry and Biophysics. 488 (1), 69-75 (2009).
  25. Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G., Kapelko, V. I., Saks, V. A. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochimica et Biophysica Acta. 892 (2), 191-196 (1987).
  26. Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).
  27. Doerrier, C., et al. High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).
  28. Rohlenova, K., et al. Selective disruption of respiratory supercomplexes as a new strategy to suppress Her2(high) breast cancer. Antioxidants & Redox Signaling. 26 (2), 84-103 (2017).
  29. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. Bioenergetics Communications. 5th ed. , (2020).
  30. Barksdale, K. A., et al. Mitochondrial viability in mouse and human postmortem brain. FASEB Journal. 24 (9), 3590-3599 (2010).
  31. Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reportys. 10 (1), 13179 (2020).
  32. Jorgensen, L. B., Overgaard, J., Hunter-Manseau, F., Pichaud, N. Dramatic changes in mitochondrial substrate use at critically high temperatures: a comparative study using Drosophila. Journal of Experimental Biology. 224, Pt 6 (2021).
  33. Salin, K., et al. Simultaneous measurement of mitochondrial respiration and ATP production in tissue homogenates and calculation of effective P/O ratios. Physiological Reports. 4 (20), 13007 (2016).

Tags

Cancerforskning nummer 174
Analytisk bestämning av mitokondriell funktion av strukna fasta tumör homogenater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zunica, E. R. M., Axelrod, C. L.,… More

Zunica, E. R. M., Axelrod, C. L., Gilmore, L. A., Kirwan, J. P. Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates. J. Vis. Exp. (174), e62875, doi:10.3791/62875 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter