Summary
新鮮な腫瘍ホモジナートにおけるミトコンドリア酸化リン酸化と電子移動能を評価する実用的なプロトコルと分析手法を開発しました。このプロトコルは、がんの開始、進行、および治療応答に寄与する様々なミトコンドリア機能を調査するために容易に適応することができる。
Abstract
ミトコンドリアは、エネルギー産生、活性酸素種調節、高分子合成を通じたがんの発症と進行に不可欠です。ミトコンドリアの腫瘍環境への遺伝的および機能的適応は、増殖および転移性の可能性を促進する。DNAとRNAシーケンシングの出現は、腫瘍形成の遺伝メディエーターの評価に重大な障壁を取り除いた。しかし、これまで、腫瘍ミトコンドリア機能を評価するための方法論的アプローチは依然として不可解であり、実現可能性を制限する技術的能力を必要とし、最終的には実験および臨床の両方の設定で診断および予後値を減少させる。ここでは、高解像呼吸法を用いて、新たに摘出した固形腫瘍均質物における酸化リン酸化(OXPHOS)および電子移動(ET)容量の定量化を簡単かつ迅速に行う方法を概説する。このプロトコルは、種および腫瘍タイプ間で再現的に適用できるだけでなく、ミトコンドリアET経路の多様性を評価するために適応することができる。このプロトコルを用いて、発光B乳腺癌を有するマウスが、OXPHOSを介してアデノシン三リン酸を生成するためにコハク酸に対する欠陥ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド結合呼吸および依存を示すことを実証する。
Introduction
すべての細胞は、生成し、アデノシン三リン酸(ATP)、分子エネルギー通貨を消費する必要性によって密接にリンクされています。細胞変異が腫瘍の形成を生じるにつれて、ミトコンドリアは、非癌性組織1、2、3としばしば区別可能なエネルギー産生の多様化を通じて生存を保証する。したがって、腫瘍の種類、癌開始、進行、および治療応答の分類を容易にするために、ミトコンドリア呼吸機能の迅速かつ深いプロファイリングが重要な必要があります。
OXPHOSの一次基質は細胞透過性がないため、切除された組織標本の呼吸機能はそのまま評価できません。この制限を克服するために、ミトコンドリアは、単離、化学的透過、または機械的均質化のいずれかによって調製することができる。ミトコンドリアの単離は、長い間、呼吸機能の評価のためのゴールドスタンダードであると考えられています。しかし、それは大量の組織を必要とし、時間がかかり、かつミトコンドリア4の特定の画分に対して可能な選択バイアスと低収量である。透過性は、組織切片または繊維束を、細胞膜5を選択的に分解する中性洗剤に機械的に分離および曝露することからなる。透過は、個々の繊維束が離れてからかうことができるように、骨格や心筋などの縞組織で頻繁に採用されています。単離と比較して、パーメアビライゼーションは、母国の細胞環境および物理的形態5においてより多くのミトコンドリアをもたらす。透過性は腫瘍6、7、胎盤8などの他の組織にうまく適用されている。しかし、透過性繊維製剤の再現性は、拡散限界を克服するための解剖と酸素要件の一貫性のために困難であり得る9。さらに、透過性繊維は、細胞密度が高く、線維性の高い特定の腫瘍タイプでは不適当である可能性がある。組織ホモジメートは、原形質膜の機械的破壊によって生成され、ミトコンドリア収率および完全性10の点で透過繊維に類似している。組織均質化はまた、酸素拡散の限界を最小限にし、機械的力11、12の最適化を通じて組織タイプ全体にわたって容易に採用することができる。
ここでは、新たに摘出した固形腫瘍均質化物における酸化リン酸化(OXPHOS)および電子移動(ET)容量の定量化を簡単かつ迅速に行う方法を概説する。このプロトコルは、Oxygraph-2k(O2k)の高解像度レスピロメーターを使用して新鮮な組織を評価するように最適に設計されており、これはインストゥルメンタルのセットアップとキャリブレーションに関する予備知識を必要としますが、クラーク型電極、シーホースアナライザ、またはプレートリーダーを使用して同様に適応することができます。このプロトコルは、種および腫瘍タイプ間で再現的に適用できるだけでなく、ミトコンドリアET経路の多様性を評価するために適応することができる。
Protocol
動物を含むすべての実験と手順は、ペニントン生物医学研究センター制度動物の世話と使用委員会によって承認されました。
1. 試薬の準備。
- EO771細胞増殖培地を10 mM HEPES、10%胎児ウシ血清(FBS)、ペニシリンストレプトマイシン1%、0.2%アンホテリシンBで調製します。
- 1Lのガラスビーカーに1Lの生検保存(BIOPS)溶液を用意します。
- Na2ATP (5.77 mM 最終濃度) の 3.180 g を加えます。
- MgCL 2·6H2O(6.56 mM最終濃度)の1.334 gを加えます。
- タウリンの2.502グラムを加える(20 mM最終濃度)。
- Na2ホスホクレアチン (15 mM 最終濃度) の 3.827 g を加えます。
- イミダゾール(20 mM最終濃度)を1.362 g加えます。
- 0.077 g のジチオトレイトール (.5 mM 最終濃度) を加えます。
- MES水和物(50 mM最終濃度)を9.76 g加えます。
- 800 mLのH2Oを加え、30°Cの磁気撹拌機を使用して構成成分を混合します。
- 100 mM K2EGTA (7.23 mM 最終濃度) の 72.3 mL を加えます。
- EGTAの7.608 gと2.3 gのKOHをH2Oの100 mLに溶解する。
- 5 M KOH で pH を 7.0 に調整し、H2 O で最大 200 mL までボリュームを持たします。
- 100 mM CaK2EGTA (2.77 mM 最終濃度) の 27.7 mL を加えます。
- EGTAの7.608gをH2Oの200mLに溶解し、80°C(100mM最終濃度)に加熱します。
- 熱い100 mM EGTAの200 mLのCaCO3 の2.002 gを溶かす。
- 撹拌を続けながら、2.3gのKOHを加え、pHを7.0に調整します。
- pHを23°C(0°CでpH 7.1)で6.75に5 M KOHで調整します。H2 Oで980mLまでボリュームを持って、溶液を混ぜます。もう一度pHをチェックし、必要に応じて調整し、水で最大1000 mLの最終体積を持って下さい。
- アリコートバイオスは円錐形の管(15 mLまたは50 mL)に入れ、使用まで-20 °Cで保管します。使用直前に一度だけ解凍してください。
- 1Lのガラスビーカーにミトコンドリア呼吸媒体(MiR05)1Lを準備します。
- 0.190 gの EGTA (0.5 mM 最終濃度) を加えます。
- MgCL 2·6H2O(3mM最終濃度)の0.610 gを加えます。
- タウリンの2.502グラムを加える(20 mM最終濃度)。
- KH2PO4 (10 mM 最終濃度) の 1.361 g を加えます。
- 4.77 gのHEPES (20 mM 最終濃度) を加えます。
- D-ショ糖(110 mM最終濃度)を37.65g加えます。
- 800 mLのH2Oを加え、30°Cの磁気撹拌機を使用して構成成分を混合します。
- 0.5 M ラクトビオン酸 (60 mM 最終濃度) の 120 mL を加えます。
- H2Oの100 mLにラクトビオイン酸の35.83 gを溶解する。
- 5 M KOH で pH を 7.0 に調整し、H2 O で最大 200 mL のボリュームを持ち上げてください。
- 溶液を混合し、pHを5 M KOHで7.1に調整します。
- BSAの1gを、本質的に脂肪酸を含まない(1g/L最終濃度)を50 mL円錐形チューブで秤量する。ステップ9からチューブにpH 7.1溶液の40 mLを加え、混ぜ合わせるために穏やかに反転し、発泡を避けます。ステップ9から溶かしたBSAを残りのpH 7.1溶液に移し、穏やかにかつ連続的に攪拌する。pHをもう一度確認し、必要に応じて調整し、H2Oで最終ボリュームを最大1000 mLにします。
- 50 mL円錐管にMiR05培地をアリコートし、使用するまで-20°Cで保管します。使用直前に一度だけ解凍してください。
- 基質、アンカプラー、および阻害剤を準備します。
- 0.8 Mのマルレートを準備する:5MKOHで5M KOHで中和し、5M KOHで中和し、H2Oで5mLまでボリュームを持ち込み、-20°Cで保存します。
- 1 Mピルビン酸塩を準備する:5Mのピルビン酸ナトリウム塩を4mLのH2O.に溶解し、5M KOHでpH7に中和し、H2Oで体積を5mLまで持ち込み、アリコートに分けて-20°Cで保存します。
- 0.5 M ADP(アデノシン5′-ジリン酸)を準備する:ADPナトリウム塩1.068 gをH2O.4 mLに溶解し、5 M KOHで中和して5 M KOH 7にし、H2Oで体積を5 mLまで持ち込み、アリコートに分けて-20°Cで保存します。
- 2 M グルタミン酸を準備する: H2O の 8 mL に L-グルタミン酸一水和物の 3.7426 gを溶解し、pH 7 に 5 M KOH で中和し、H2O で最大 10 mL まで量を持って得る。
- 4 mM シトクロム cを準備する: 50 mg のチトクロム c を H2O の 1 mL に分解し、-20 °C で保存します。
- 1 Mコハク酸塩を準備する:H2Oの8mLでコハク酸二ナトリウム塩の2.701 gを溶解し、1 N HClでpH 7に中和し、H2 Oで最大10 mLまでボリュームを持ち込み、-20°Cで保存します。
- 1 mM FCCP(カルボニルシアン化物-4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾンを調製する):純エタノールの10 mLに2.54mgのFCCPを溶解します。アリコートに分け、-20°Cで保管します。
- 150 μM ロテノーンを準備する:10 mLの純粋なエタノールにロテノーネの3.94 mgを溶解し、1 mMストック、ボルテックスを完全に溶解するまで調製します。1.275 mLの純粋なエタノールで225 μLの1mM Rotenoneストック濃度を希釈し、150 μMロテノーネを1.5 mLにします。光から保護し、アリコートに分け、-20°Cで保管してください。
- 125 μM Antimycin Aを調製:純粋エタノールの4mLに11mgのアンチマイシンAを溶解し、5mMのアンティマイシンAストック濃度を5mM希釈して5mMの25μLを純エタノール975 μLで希釈し、0.125 mMアンチマイシンAをアリコトリコに分け、次いで20°Cで0.125 mMのアンチマイシンAを作ります。
- 0.8 Mアスコルビン酸を準備する:アスコルビン酸ナトリウム塩1.584gをH2Oの8mLに溶解し、アスコルビン酸でpHをpH6に調整し、H2Oで体積を最大10 mLにし、光から保護し、アリコートに分け、-20°Cで保存します。
- 0.2 M TMPD(テトラメチル-p-フェニレンジアミン):32.85 mgのTMPDをDMSOの987.5 μLに溶解します。0.8 Mアスコルビンス(アスコルビントの10 mM最終濃度)の12.5 μLを加えます。光から保護し、アリコートに分け、-20°Cで保管してください。
- アジ化ナトリウム4 Mを準備する:10mLのH2Oでアジドナトリウム2.6gを溶解し、アリコートに分け、-20°Cで保存します。
2. 腫瘍の増殖
- RpmI 1640成長培地でEO771細胞を増殖させ、5%CO2で37°C加湿インキュベーター内の細胞を維持する。
- 一戸樹齢4週の雌C57BL/6Jマウスは、12時間光:暗いサイクルで21〜22°Cでそれらを維持する。マウスに食べ物や水への アクセスをアドリビタム を提供します。
- マウスが10週齢に達したら、癌細胞移植のために細胞およびマウスを準備する。
- 細胞をトリプシン化し、増殖培地でトリプシンを失活し、遠心分離細胞を室温で5分間500xgで分離した。上清を吸引し、再懸濁し、(必要に応じて)培地中の細胞ペレットを結合する。トリパンブルーを使用して生細胞を数え、1:1:1メディア/基部膜マトリックス/PBS溶液で60 μLの総体積で1 x 106細胞の細胞希釈を調製します。基質膜マトリックスを加えたら、よく混ぜて、細胞懸濁液を氷の上に置きます。60 μLのセル懸濁液で注射器を充填し、氷の上に置きます。効率的に働き、調製から1.5時間以内にマウスに細胞を注入する。
- イオブルラン吸入(誘導では3%〜5%、メンテナンスでは1%~3%)でマウスを麻酔します。右4番目 と5番目 のインギナル乳腺の間で剃ります。EO771細胞懸濁液を用いて麻酔マウスを直交的に注入する。
- 電子キャリパーを使用して、週に2回、4週間の腫瘍の成長を監視および測定します。壊死時、物品、重量、腫瘍(または最低60mgの腫瘍セクション)を10mLの氷冷BIOPSに直ちに入れます。チューブをぬれた氷の上に置いておきなさい。
3. 機器のセットアップとキャリブレーション
- 37°Cの水浴でMiR05培地を温めます。
- オロボロス O2k システムをオンにし、DATLAB ソフトウェアを開いて、 ユーザーを入力または選択します。 [O2k に接続]をクリックします。O2kの構成を確認し、正しい機器がPower-O2kのラベル付けされ、各チャンバが正しい酸素センサに対応していることを確認してください。 [OK] をクリックします。O2kコントロールウィンドウが開いたら、[システム]タブで[ブロック温度]を37°Cに設定し、両方のチャンバでStirrer速度を750rpmに設定し、NDデータ記録間隔を2.0秒に設定します。チャンバーボックスのスターラーパワーとイルミネーションの両方をチェックします。酸素、O2タブで、センサーのゲインを1 V/μA(古い機器モデルではゲインを調整する必要がある場合があります)、偏光電圧を800 mVに設定し 、O2kに接続をクリックします。新しい実験ファイルが開いたら、ファイルに名前を付け、[ 保存] をクリックします。実験がアクティブになると、プロトコル選択ウィンドウが開きます。カスタム SUIT (基質アンカプラー阻害剤滴定) を実行するには 、[キャンセル] をクリックします。
- プロトコルの選択に続いて、サンプル ウィンドウが開き、実験用コード、サンプルの種類、コホート、サンプル コード、サンプル番号、およびサブサンプル数を適宜入力します。mgに単位を割り当て、腫瘍ホモジュネート濃度/mL(チャンバーあたりの量が自動で入力されます)を入力します。示された媒体がMiR05であり、チャンバー容積が2.00 mLであることを確認して下ろします。必要に応じて下のボックスにコメントを追加し 、[OK] をクリックします。
- ストッパーを取り外し、チャンバーから70%エタノールを吸引します。チャンバーの内側に露出している膜の近くに吸引しないでください。純水で4回リンスし、2.25 mLのMiR05でチャンバーを満たします。
- センサーテスト :F9 をクリックして、30 sのスターラーをオフにします。スターラーバーが再びオンになったら、O2 の斜面が各チャンバで単一指数的に急速に増加することを確認します。チャンバーがセンサーテストに失敗した場合は、電気的な接続を確認し、塩が蓄積されている場合はきれいにします。テストを繰り返します。センサーがテストに失敗し続ける場合は、膜を検査するために、ポラグラフィック酸素センサー(POS)コネクタを取り外します。膜に目に見える損傷、重い酸化、または有意な気泡蓄積が観察された場合は、実験手順を停止し、機器の整備に進みます。
- 酸素キャリブレーション:酸素キャリブレーションを実行して正確な呼吸測定を行います。
- ねじれた動きで、ストッパーを音量調整された位置にゆっくりと挿入します。ストッパーの井戸に集まる注射毛細血管を通して排出された余分な媒体をサイフォンオフします。ねじれ運動で、ストッパーを持ち上げてストッパーをしっかりとフィットさせ、最終的な空気平衡(30〜45分)の液体相の上にガス体積を残します。
- この期間に達成された定常状態を使用して酸素センサーを校正し、呼吸の正確な測定を得ます。O2 の傾きは、0±2 pmol/s·mLである。値が2 pmol/s·mLより高い場合は、チャンバーを洗浄し、解凍したてのMiR05で補充してください。傾斜が不安定な場合は、計測器の整備に進みます。
- 定常状態を達成した後、O2 濃度曲線を選択し、シフトキーを押しながらマウスボタンを左クリックして曲線の定常領域をハイライトします。領域を選択したら 、F5をクリックし、ドロップダウン矢印で空気較正のマークを選択し、[ キャリブレーション ]をクリックしてクリップボードにコピーします。
- インストゥルメンタルバックグラウンドキャリブレーション(オプション)
- 空気較正の後、流束の背景平衡(〜15分)のために液相の上に気体体積がないことを確認し、チャンバーを完全に閉じます。
注: この期間に達成された定常率は、インストゥルメンタル背景を表し、分析精度を向上させるために得られたデータから差し引くことができます。O2 の傾きは、最初はわずかに増加し、± 2 ~ 4 pmol/s·mL の間の高原になります。 - 値が高い場合(>6 pmol/s·mL)、潜在的な生物学的汚染があります。この場合、チャンバーを清掃し、解凍したばかりのMiR05で補充してください。定常状態が得られたら、O2 の傾きの負のカーブを選択し、Shift キーを押しながらマウスの左ボタンを押して、曲線の定常領域をハイライトします。
- 領域を選択したら 、F5キーをクリックし、[ ベースライン補正] ボックス を選択し、[ベースライン] のマークをドロップダウン矢印で選択して 、[OK]をクリックします。
- 空気較正の後、流束の背景平衡(〜15分)のために液相の上に気体体積がないことを確認し、チャンバーを完全に閉じます。
4. 腫瘍ホモジネート製剤
- 1 mLのMiR05を含むガラスホモジナイザーと、湿った氷の上にしっかりとフィットしたガラスの害虫を置きます。
- 研究の時点で、ICE -冷たいペトリ皿に1 mLのBIOPSに組織を入れます。
- 可溶性物質を最大化し、壊死領域を避け、限界腫瘍組織を除去するために組織を洗浄し、解剖する。解剖顕微鏡、メス、および外科用ピンセットを使用して、任意の毛髪、壊死組織、末梢結合組織および血管組織、および隣接する脂肪を適宜除去する。解剖中は、腫瘍を氷冷BIOPSに保つように注意してください。
- 腫瘍を小さく切り(それぞれ5〜10mg)、残りの腫瘍片を氷の上に保ったBIOPSの10mLに戻します。必要に応じて、後でこの組織を使用して追加の準備を行います。
メモ:サンプルがBIOPSに完全に沈まない時間を最小限に抑えるために、次の手順を素早く実行してください。サンプルをMiR05に入れると、時間が本質になります。慎重に慎重にできるだけ早く校正チャンバーに準備されたホモゲネートを移動します。 - 濾紙の上に慎重に組織切片をブロットし、小さなプラスチックタール計量ボートに置き、最初の湿った重量を記録します。未使用の部分を、継続的な保存のために、BIOPSの10 mL円錐形のチューブに戻します。
- 組織切片をMiR05を含む氷冷ホモジナイザーに沈め、必要に応じて重量ボートに残りの重量を記録します。
- ガラスの害虫(クリアランス範囲0.09-0.16 mm)を使用して、5-7のダウン・アップ・ストロークを完了することによって腫瘍組織を穏やかに破壊する。各ストロークについて、害虫を時計回りに反時計回りに回転させながら、害虫を押し下げながら3回、害虫を引き上げながら3回回転させます。組織がホモジナイザーの底に落ち着くようにしてくださいが、泡立ちを防ぐために流体ボリュームの上に害虫を完全に持ち込まないようにしてください。
注:得られたホモジュネートは、最小限の固体組織残骸で白濁して表示されるはずです。 - ホモジュネートを15 mLの円錐形チューブに注ぎ、氷の上に置きます。
- 新鮮なMiR05のピペット1〜3 mLは、ペステルの上に、ホモジナイザーに、残りの組織ホモゲネートを洗浄する。ホモジネートを含む円錐管にMiR05洗浄を注ぎます。ホモゲネートの完全な移動を確実にするために、2〜3回洗浄する害虫およびホモジナイザーを繰り返します。洗浄工程中にサンプルを過剰に希釈しないように、目標濃度と必要な量を覚えておいてください。
- 組織ホモジネート濃度を正確に計算するために、ホモジナイザーとホモゲネートの残存非ホモジナイズ材料(すなわち、結合組織)を注意深く検査する。
- ピンセットで到達できないホモジナイザーから非ホモジナイザーを除去するには、ホモジナイザーにMiR05を加え、ピペットでボリューム(組織を含む)を吸引し、内容物をペトリ皿に移します。
- ホモジネートから非ホモジナイズ材料を除去し(円錐管の底部に大きな部分に収まる)、ピペットで大きな部分を吸引し、円錐管の組織キャップの上に置く。
- ペトリ皿または円錐形のチューブキャップからピンセットで組織を取り出し、ろ過用紙にブロットします。残りのホモジュネートを円錐形チューブに戻し、それをキャップし、反転して混合します。
- ホモジナイザーを再検査し、追加の非ホモジナイズ材料をホモゲネートし、必要に応じて材料を除去するためにステップ4.10.1-4.10.3を繰り返します。
- ホモジナイザーから回収した非ホモジナイズ材料の質量を計量して記録する。移された任意のひどく無傷の組織のためのホモゲネート調製物を検査する。非ホモジナイズされた部分を取り除き、必要に応じて重量を量る。
- 最初の湿潤重量から計量艇、ホモジナイザー、ホモジネート(必要に応じて)から回収した組織重量を引いて、最終的なサンプル重量を計算します。
- 最終的なサンプル重量を使用して、さらにMiR05を追加して、所望の濃度にホモゲネートを持ち込みます(最適化実験の詳細については、ステップ5を参照)。
- ホモジネートを計量して調製したら、できるだけ早くアッセイに進みます。サンプルは、器具に移されるまで湿った氷の上に保管してください。
5. 基質、アンカプラー、インヒビター滴定プロトコル(SUIT)
- 機器が較正され、サンプルが準備されたら、ねじれた動きでストッパーを取り外し、室からMiR05を吸引します(チャンバー内に露出した膜を避けます)。ホモゲネートをよく混ぜ、ホモゲネートの2.25 mLをチャンバに加えます。複数のチャンバに1つのホモジネートを加える場合、ホモジネートを混合しながら各チャンバに一度に1mLのピペットを使用して、均等な組織分布を確保する。 F4 キーを押してイベントに名前を付け、タイムスタンプを付け 、[OK]をクリックします。
- 鈍い18 G針を使用して、50 mLの酸素を酸素タンクからの酸素にレギュレータとガスチューブで満たします。チャンバーを約500μMの酸素に過酸素化する。このために、直接チャンバーに酸素を注入します。ストッパーを緩く挿入し、酸素が〜480 μMに達するまで閉じるのを待ちます。ねじれ運動で、チャンバーをゆっくりと閉じ、呼吸を平衡化させます(〜15〜20分)。必要に応じて、中央キャピラリーをMiR05で充填します。
- N結合およびNS結合およびCIV(複合IV)活性のOXPHOSおよびET(電子移動状態)能力の分析的決定:完全に閉じたチャンバーに基質、アンカプラーおよび阻害剤を注入するために専用のマイクロシリンジを使用する。各インジェクションで F4 をクリックすると、リアルタイムで各チャンバーのイベントに名前を付けてタイムスタンプが付きます。この調査では 、F6 を選択して O2 濃度を調整し、必要に応じて O2 の傾きが陰角を調整します。各注射の後、注射器を水(水溶性化合物の場合)または70%エタノール(エタノールまたはDMSOに溶解した化合物の場合)で3回洗浄します。
注:N-リンク:定義されたNADH生成基板の組み合わせによって支持されるO2 フラックス、NS結合:定義されたNADH生成基板の組み合わせとコハク酸塩の収束によって支持されるO2 フラックス。- 0.8 Mのマルレート(2 mM最終濃度)の5 μLを加え、次の注入にすぐに進みます。注射注射器を水で3回洗います。
- すぐに1 Mピルビン酸(2.5 mM最終濃度)の5 μLを加え、呼吸が安定するのを待ちます。注射注射器を水で3回洗います。
- 0.5 M ADP(2.5 mM最終濃度)の10 μLを加え、ADP応答が安定するまで待ちます。注射注射器を水で3回洗います。
注: アデニル酸濃度が呼吸束に限定されないようにするには、追加の ADP(2.5~10 mM)が必要になる場合があります。 - 2 M グルタミン酸 (5 mM 最終濃度) の 5 μL を加え、呼吸が安定するまで待ちます。注射注射器を水で3回洗います。
- 4 mM のシトクロム c (10 μM 最終濃度) の 5 μL を加え、呼吸が安定するまで待ちます。注射注射器を水で3回洗います。
- 1 Mコハク酸(10 mM最終濃度)の20 μLを加え、呼吸が安定するまで待ちます。注射注射器を水で3回洗います。
- 滴定0.5-1 μLは1 mM FCCP(2-20 μM最終濃度)の増分を滴定し、各注入後に呼吸が安定するのを待ち、呼吸の増加がなくなるまで継続します。注射注射器を70%エタノールで3回洗浄します。
- 150 μM ロテノーン(150 nM-2 μM の最終濃度)を2 μL加え、呼吸が安定するまで待ちます。さらに1 μLのロテノンを加えて、さらなる阻害がないことを保証します。呼吸の減少がある場合は、呼吸の減少がなくなるまで追加の注射を続けます。注射注射器を70%エタノールで3回洗浄します。
- 125 μM アンチマイシンA(125 nM-5 μM最終濃度)を2 μL加え、呼吸が安定するのを待ちます。さらに1μLのアンチマイシンAを加えて、さらなる阻害がないことを保証する。呼吸の減少がある場合は、呼吸の減少がなくなるまで追加の注射を続けます。注射注射器を70%エタノールで3回洗浄します。
- チャンバーの酸素濃度を確認してください。濃度が125μM未満の場合は、酸素が呼吸束を制限しないように、室内の空気または軽度の過酸素性に再酸素化します。0.8 Mアスコルビンテ(2 mM最終濃度)の5 μLを加えます。注射注射器を70%エタノールで3回洗浄します。
- 0.2 M TMPD(1 mM最終濃度)の10 μLをすぐに加えると、呼吸の増加が遅くなるのを待ちます。注射注射器を70%エタノールで3回洗浄します。
- アスコルベート/TMPDプラトの呼吸流束が直ちに4 Mナトリウムアジド(50 mM最終濃度)の25 μLを加えます。注射注射器を70%エタノールで3回洗浄します。
- スタディを終了する - ファイル、保存、切断をクリックします。手順9.2-9.3に従ってチャンバーとシリンジを洗浄し続けます。
6. ADP感度プロトコル
- 機器が較正され、サンプルが準備されたら、ねじれた動きでストッパーを取り外し、室からMiR05を吸引します(チャンバーの内側に露出した膜を避けます)。ホモゲネートをよく混ぜ、ホモゲネートの2.25 mLをチャンバに加えます。複数のチャンバに1つのホモジネートを加え、均一な組織分布を確保するためにホモジネートを混合しながら各チャンバに一度に1mLのピペットを加えることを想定する。 F4 をクリックしてイベントに名前を付け、タイムスタンプを付け 、[OK]をクリックします。
- ストッパーを挿入し、ねじった動きで、チャンバーをゆっくりと閉じ、呼吸を平衡化させます(〜15〜20分)。必要に応じて、中央キャピラリーをMiR05で充填します。
- コハク酸結合ミトコンドリアADP感度の分析決定:各注入で F4 をクリックして、各チャンバーのイベントにリアルタイムで名前を付け、タイムスタンプを付けます。この調査では 、F6 を選択して O2 濃度を調整し、必要に応じて O2 の傾きが陰角を調整します。
- 150 μM ロテノーン(150 nM 最終濃度)を2 μL加えます。
- すぐに1 Mコハク酸塩(10 mM最終濃度)の20 μLを加え、呼吸が安定するのを待ちます。
- 最大応答率(V MAX;2.5-10 mM最終濃度)に達するまでのサブ飽和濃度の段階的添加によるADPの滴定。
注:ADP濃度の小さな変化により、注射後の速度が高くなり、各高原後に注入濃度が上昇し、ADP注入濃度が2倍に増加しても呼吸の増加がなくなるまで滴定を継続します。
7. 推奨最適化実験
- プロトコルに最適なホモジネートと酸素濃度を決定します。
- 複数の組織濃度(例えば、30mg/mL、20mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1 mg/mL、1 mg/mL、および/または0.5mg/mL)でSUITプロトコル(ステップ5.1〜5.3)を実行します。
- 再酸素化の頻度を制限しながら呼吸束を最大にする濃度を選択します(1-2以下)。より頻繁に再酸素化が必要な場合は、ホモジェン酸の濃度を低下させる。
- ホモジナイザーで最適なストローク数を決定します。
- 複数の均質化レベル(例えば、5ストローク、10ストローク、15ストローク、20ストローク)でSUITプロトコル(ステップ5.1~5.3)を実行します。
- 文献には、腫瘍ホモジネート製剤によるシトクロム c の増加率の閾値を決定するデータが不十分であるため、目的の基質によって活性化されるチトクロム c応答が限られているが十分な呼吸で製剤を選択する。
- 定量的で再現可能な呼吸束に必要な最適な基質、ADP、アンカプラ、および阻害剤濃度を決定します。
- 選択した組織濃度でSUITプロトコル(ステップ5.1~5.3.9)を実行します(ステップ7.1)。各基質を活性化し、アンカプラー、阻害剤、およびADPは、それ以上の応答が見られないまで観察される。別々の実験でアジドナトリウムとの阻害を活性化します。
- 0.8 Mのマルレート(2 mM最終濃度)の5 μLを加え、次の注入にすぐに進みます。
- 1 Mピルビン酸の1μL増分を滴定し、各注入後に呼吸が安定するのを待ち、呼吸の増加がなくなるまで継続する。
- 0.5 M ADPの2μL増分を滴定し、各注入後に呼吸が安定するのを待ち、呼吸の増加がなくなるまで継続する。
- 2 Mグルタミン酸の1μL増分を滴定し、各注射後に呼吸が安定するのを待ち、呼吸の増加がなくなるまで継続する。
- 4 mM のシトクロム c (10 μM 最終濃度) の 5 μL を加え、呼吸が安定するまで待ちます。
- 1 Mコハク酸の5μL増分を滴定し、各注入後に呼吸が安定するのを待ち、呼吸の増加がなくなるまで継続する。
- 0.5 M ADPの5μL増分を滴定し、各注入後に呼吸が安定するのを待ち、呼吸の増加がなくなるまで継続する。
- 滴定0.5 μLの1 mM FCCPの増分を、各注入後に呼吸が安定するのを待ち、呼吸の増加がなくなるまで継続する。
- 1μLの1μL増分の150μMロテノーンを滴定し、各注入後に呼吸が安定するのを待ち、呼吸量の増加が減少しなくなるまで継続する。
- 125 μM アンチマイシンAの1μL増分を滴定し、各注入後に呼吸が安定するのを待ち、呼吸の減少がなくなるまで継続します。
- 0.8 Mアスコルビンテ(2 mM最終濃度)の5 μLを加えます。
- 直ちに0.2 M TMPD(.5 mM最終濃度)の5 μLを加えると、呼吸の増加が遅くなるのを待ちます。別の実験では、0.2 M TMPD(1 mM最終濃度)の10 μLを加えます。
- 別の実験では、アスコルベート/TMPDプラナスの呼吸束が直ちに追加されると、10μL、25 μL、50 μL、および100 μLの4 Mナトリウムアジド(20 mM、50 mM、100 mM、200 mM最終濃度)を追加します。
- 実験のタイミングを改善するために、最初の注射内で飽和している基質および阻害剤濃度を選択してください。ADP感度評価と従来のSUITプロトコルを組み合わせるには、飽和またはサブ飽和濃度でADPを使用します。
- 呼吸束の阻害なしに用量応答性を実証するために、最大のアンカプラ濃度を使用してください。
- 選択した組織濃度でSUITプロトコル(ステップ5.1~5.3.9)を実行します(ステップ7.1)。各基質を活性化し、アンカプラー、阻害剤、およびADPは、それ以上の応答が見られないまで観察される。別々の実験でアジドナトリウムとの阻害を活性化します。
8. データ分析
- スーツ分析
- 各滴定から定常またはピークレートを選択し、分析的な削減のためにエクスポートします。
- データを、1mgの組織(pmol/s/mg)あたり1秒当たりpmol O2 として表現する。
- PM-L、PM-P、PMG-P、PMGS-P、PMGS-Eの分析的還元を、それぞれの速度から抗マイシンA無感率(すなわち、ADPの添加後に得られる定常率)から差し引くことによって達成する。
注:PM:ピルビン酸+マラト;PMG: ピルビン酸 + マレート + グルタミン酸;PMGS: ピルビン酸 + マレート + グルタミン酸 + コハク酸塩;-L:リーク状態;-P:酸化リン酸化状態、-E:電子移動状態。 - ピークアスコルビン酸/TMPDレートからアジドナトリウム無感率を差し引くことで、CIV-Eの分析的還元を実現します。
- PMGS-Eレートからロテノン無感率を差し引くことで、PMG-Eの分析的な低減を実現します。
- アンチマイシンA無感率をロテノーン無感率から差し引くことで、S-Eの分析的還元を実現します。
- チトクロム c 制御効率の分析的還元を達成し、外膜無傷のマーカーであり、以下の式で達成する:
jc = ((JCHNOc - JCHNO)/JCHNO) x 100
式において、jc はシトクロム cの添加時の%増加、JCHNOc はチトクロム cを添加した後の酸素フラックスであり、JCHNO はチトクロム cを添加する前の酸素フラックスである。
- ADP感度解析
- コハク酸塩+ロテノンのリーク率に対するADP感度の運動性を分析的に決定する(組織ホモジネートの速度ではない)。
- O2 フラックス(Y軸)を相対的なADP濃度(X軸)に対してプロットします。ADP滴定で達成されるピーク速度として最大呼吸速度(V最大)を決定します。
- カーブフィッティングソフトウェア(PRISM、バージョン10.1)を使用してミカレ・メンテン動態を決定し、1/2 VMAXが達成されるADP濃度を明らかにする(見かけKM)。
9. 器械の品質管理
- 所望の酸素濃度範囲(0-600 μM)およびゼロキャリブレーションの上にインストゥルメンタルO2 のバックグラウンドを実行します。
- ステップ 3.1 および 3.2 を実行する
- ストッパーを取り外し、チャンバーから70%エタノールを吸引します(チャンバーの内側に露出した膜を避けます)。ダブル蒸留H2Oで4回リンスし、2.25 mLのMiR05でチャンバーを充填
- チャンバーを約600μMの酸素に過酸素化する。
- ストッパーを完全に閉じた位置にゆっくりと挿入します。注射毛細血管を通して噴出し、ストッパーのウェルに集められた余分な媒体をサイフォンオフし、酸素信号が安定することを可能にする(30-45分)。
- 酸素キャリブレーションを行うには、酸素濃度と傾斜角の両方が安定している領域を選択し、それぞれのチャンバのキャリブレーションウィンドウを開いて 、R1 マークを選択します。
- 20mgのヒドロ硫酸ナトリウムを0.5mLの水に溶解してジチオニスト溶液を調製します。ジチオナイトが酸素への暴露と共に時間の経過とともに酸化されるように空気への暴露を制限する。
- 酸素信号が安定したら、1μLを注入し、酸素濃度の低下を観察します。必要に応じて、ジチオネテ溶液の効力を調整します。
- 十分なジチオオン溶液を注入して、酸素濃度を450 μM、300 μM、225 μM、150 μM、75 μM、0 μMに下げます。各注入で酸素が安定し、定常勾配のマークを選択します。酸素濃度が0μM程度になったら、酸素濃度を印示します。
- インストゥルメンタル O2 バックグラウンド補正を実行するには、それぞれのチャンバのフラックス/スロープウィンドウを選択し 、O2 バックグラウンドキャリブレーションを選択し、目的のマークを表示する [キャリブレーション ]をクリックします。
- ゼロキャリブレーションを実行するには、それぞれのチャンバのキャリブレーションウィンドウを開き、ジチオオント滴定後に達成された R0 マークを選択します。
- インストルメントクリーニング
- 各チャンバーを純水で3回素早くすすぐすすります。最初の洗浄のために、ホモゲネートを吸引し、チャンバーを水で完全に満たし、水を吸引する。2回目の洗浄のために、水でいっぱいのチャンバー3/4を満たし、注入毛細管を通して水の一部を吸引し、その後、完全に吸引洗浄するためにストッパーを取り外すためにストッパーを挿入します。
- チャンバーを70%エタノールで5分間洗浄します。
- シンクまたはビーカーの上に、洗浄ボトルを使用して注入毛細血管を通して流体を強制し、純水、70%エタノール、および100%エタノールでストッパーを洗浄します。
- 各チャンバーを純水で2回素早くすすぐすすいでください。
- 2 mgの凍結ミトコンドリア、細胞リセート、または生きている線維芽細胞を15分間含むPBSの2 mLでチャンバーをインキュベートする。
- 5分間、清水でチャンバーを2回洗います。
- チャンバーを70%エタノールで5分間2回洗浄します。
- チャンバーを100%エタノールで10分間洗浄します。
- 70%エタノールでチャンバーを充填します。
- 連続した実験を行う場合は、チャンバーを70%エタノールで5分間放置し、ステップ3.3に進みます。
- 実験が完了したら、ストッパーに蓋をして、器具の電源を切ります。
- 使用後は、注射器を適切に洗浄し、持ち越しを防ぐために特定の化合物使用専用の注射器を保管してください。
- 注射器を洗浄液に挿入し、注射針を完全に水没させます。
- 洗浄液を最大体積までシリンジに引き上げる。
- 洗浄容器から注射器を取り出し、洗浄液をビーカーに取り出し、ペーパータオルで注射器をしみまします。
- 各使用後、ステップ 9.3.1 ~ 9.3.3 をできるだけ早く 3 回繰り返します。
Representative Results
最初の研究では、EO771腫瘍は低酸化的であり、したがって、適切なO2フラックス評価のために高いホモジネート濃度を必要とすることが明らかになった。最適化実験は、研究に最適な組織ホモジネート濃度範囲を決定するために実施した。腫瘍ホモジナイートは、最初は40mg/mLで調製し、次いで直線的に希釈した。組織質量に正規化されたO2フラックスは、濃度間で一貫していた(図1A-D)。40 mg/mL の結果、酸素が急激に枯渇し、実験には適していないことが観察されました (図 1A)。酸素消費量は30mg/mLおよび20mg/mLで大幅に減速したが、基質またはADPの不在の場合でも短時間で急速に減少した(図1B、C)。10 mg/mL濃度は、より長い90 minのSUITプロトコルをサポートする最適な酸素消費率(図1D)をもたらしました。
NADH およびコハネートリンク OXPHOS および ET、および CIV 活性を評価するために SUIT プロトコルが使用されました (図 2A)。ピルビン酸およびマル酸塩は、NADHを介してリーク(L)を駆動するADPの不在中に組織ホモジネートに添加された。次に、飽和ADPを最大NADH結合OXPHOS(P)を駆動し、続いてグルタミン酸を添加した。その後、チトクロムcを添加して外膜の完全性を確保した。呼吸速度の増加は、すべてのサンプルで20%未満であった(図2B)。NADH結合基質に対する反応が非常に低い場合、シトクロムc放出はコハク酸およびロテノンの存在下でも評価され、最小限のシトクロムc刺激を観察した(図2B)。興味深いことに、NADH結合OXPHOSはEO771腫瘍では無視できる(図2C)。次いで、コハク酸をピルビン酸、リンゴ酸、グルタミン酸の存在下に加えて、コハク酸デヒドロゲナーゼを通る電子流を刺激した。その後、FCCPを最大電子流量(E)を駆動するように滴定し、EO771腫瘍では酸化ではなくリン酸化が呼吸に限定されていたことが明らかになった(図2C)。ロテノーンとアンチマイシンAは、その後、それぞれ、複合体Iおよび複合体IIIを阻害するために滴定した。その後、アスコルビン酸とTMPDを加え、CIVを通る最大電子流を駆動し、アジドナトリウムによって阻害される。表1は、図2Cにプロットされた呼吸パラメータを定量化するための生データの分析還元式(表2)を示す。全体として、腫瘍ホモジネート呼吸プロファイル(図2C)は、腫瘍内のNおよびS結合基質で支持される減少した最大電子移動を除いて、非移植されたジジゴニン透過EO771細胞(図2D)のものと類似している。
NADH連動呼吸は無視できるものであったため、コハク酸塩の呼吸運動は、最大定格レート(VMAX)が達成されるまでADPの段階的滴定によってさらに評価された(図3A、3B)。コハク酸+ ロテノーンの存在下でのADPの半最大濃度(KM)は37.5μMであったのに対し、VMAXは〜10.5 pmol/s/mgであった(図3C)。したがって、比較的酸化率が低いにもかかわらず、EO771腫瘍はADPに対して非常に感受性が高く、比較的低いADP濃度でATP合成を持続した。
抽出のために生データの適切な領域を選択することは、実験の再現性と正確な定量化のために重要です。チトクロムcの場合、射出直前の定常状態でマークを選択する必要があります(図4A、マーク1)。O2フラックスが安定していない期間(約5〜10分)が続く初期注入アーティファクトがしばしば存在する。シトクロムc効率の評価は、O2フラックスが安定化したら追加の選択を行うことで行われる(図4A、マーク2)。基質、ADP、またはほとんどの阻害剤の添加後の選択も、注入アーティファクトの後、そしてO2フラックスが安定した後に行われる(図4B)。最大結合解除呼吸を決定するために使用される選択は、FCCPの滴定中に達成されるピーク増加時に行われますが、これはしばしば最後に行われた注射ではありません(図4C)。TMPDの選択は、アスコルビンとTMPDの両方が追加された後、呼吸のピーク増加時に行われます(図4D、マーク1)。このピークの直後に、阻害剤であるアジ化ナトリウムが添加され、呼吸が急速に減少するが、阻害された呼吸速度よりも低い注射アーティファクトを有することも多い(図4D)。インヒビターマークは、射出アーティファクトの直後に作られる(図4D、マーク2)。O2フラックスは通常安定せず、減少し続けます。
表1: 呼吸法と分析的導出. このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2: 発光B乳腺腫瘍均質のサンプルおよび呼吸特性このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図1: 腫瘍ホモジネート濃度の最適化O2フラックス(赤)およびO2濃度(青)で調製した乳腺腫瘍ホモジナート(A)40 mg/mL、(B)30 mg/mL、(C)20 mg/mL、および(D)10mg/mLで調製した。トム:組織ホモジネート呼吸。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:新たに摘出された腫瘍均質化物における高解像呼吸法によるOXPHOSおよびET容量の評価。(A)基質、阻害剤、アンカプラープロトコルの過程における酸素消費量(赤)および濃度(青)の代表的プロット。PM: ピルビン酸 + マレート, D: ADP, G: グルタミン酸, c: シトクロムc,S: コハク酸塩, F: FCCP, 腐敗: ロテノン, アマ: アンチマイシン A, Asc/TMPD: アスコルベート/テトラメチル p フェニレンジアミン.(B) シトクロムcを添加した場合のO2フラックスの増加率(C-D)ADP、FCCP、およびアスコルビン酸/TMPDの存在下でのマレート、ピルビン酸、グルタミン酸、およびコハク酸塩(C)EO771由来腫瘍ホモゲン酸塩および(D)非移植EO771デジコニン透過細胞で支えられる呼吸。トム:組織ホモジネート呼吸;PM: ピルビン酸 + マラト;PMG: ピルビン酸 + マレート + グルタミン酸;PMGS: ピルビン酸 + マレート + グルタミン酸 + コハク酸塩;CIV: コンプレックス IV;-L: リーク状態;-P:酸化リン酸化状態、-E:電子伝達状態N-リンク:定義されたNADH生成基板の組み合わせによってサポートされるO2フラックス。NS-リンク:定義されたNADH生成基質の組合せとコハク酸塩の収束によって支持されるO2フラックス。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:EO771乳腺腫瘍は高いADP(アデノシン5′−二リン酸)感受性を示した。(A)S連動ADP滴定プロトコル全体における酸素消費量(赤)と濃度(青)の代表的なプロット。トム:組織ホモジネート呼吸;S/腐敗:コハク酸塩/ロテノーネ;D: ADP.(B) ロテノーンの存在下でのコハク酸によって支えられ、ADPの濃度を増加させる (0 μM ADP = S/Rot-L).(C) コハク酸塩 + ロテノーンの存在下での ADP の最大濃度 (VMAX)と半分の濃度 (KM)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:データ抽出のための生O2フラックスのマーク選択を示す代表的なトレースは、(A)チトクロムc選択:O2フラックスが安定化した場合の射出後にシトクロムc注入前の選択番号1および選択番号2。c シトクロームc.(B)基質、ADP、および阻害剤選択:O2フラックスが安定化した射出後の選択数1(この代表的プロットではコハク酸塩)。S:コハク酸塩。(C)アンカプラー選択:アンカプラー滴定時の呼吸のピーク増加時の選択数1。この代表的なFCCP滴定プロットでは、3回目の注入は呼吸をわずかに減少させ、したがって選択には使用されない。F: ACCP.(D)TMPD選択:アスコルビンスおよびTMPD注射後の呼吸のピーク増加時の選択数1。アジ化ナトリウム選択:呼吸が最初に減少したときの急性注入アーティファクトの後の選択数2。As/Tm: アスコルベート/TMPD;アズド:アジデ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
癌におけるミトコンドリア呼吸の評価方法は、主にインビトロモデル13、14、15、16に限定されてきた。化学透過率6、7、17を用いた腫瘍におけるミトコンドリア呼吸の測定に成功したが、腫瘍タイプ間で普遍的に適用され、比較できる均一な金標準アプローチはない。さらに、一貫したデータ分析とレポートの欠如は、データの一般化性と再現性が限られています。本明細書で概説される方法は、切除されたばかりの固形腫瘍検体からミトコンドリア製剤中のミトコンドリア呼吸18を測定するための簡単で比較的迅速なアプローチを提供する。腫瘍は、交体移植マウスLuminal B、ERα陰性EO771乳腺癌細胞19から増殖させた。
組織の取り扱いに精通し、注意することは酸素消費率の正確さおよび正常化を大きく改善する。サンプルが冷たく保たれていない場合、保存培地に一貫して沈んでいない場合、または過度に処理されていないと、組織およびミトコンドリアは容易に損傷を受ける可能性があり、最適以下のルーチンおよびOXPHOS率をもたらす。さらに、ホモジナイズ組織の正確な湿潤重量は、これが一次的な正規化方法であるため、極めて重要である。他の正規化方法は、クエン酸合成酵素活性20などの全タンパク質またはミトコンドリア特異的マーカーなどと考えられる。さらに、組織の不均一性に対処する必要があります, 事前に行われた実験に含める腫瘍領域に関する決定 で. 壊死、線維性、および結合組織は、均質化および/または十分に呼吸をし、これらの腫瘍領域を意図的にアッテ除かない限り避けるべきである。特に、腫瘍はタイプや切除領域によっては非常に粘着性があり、正確な計量と移動がより困難になる。均質化に使用されるストロークの数は、ミトコンドリア外膜への損傷を軽減しながら、ミトコンドリアの完全な調製を確保するために最適化する必要があります。
精度と再現性を向上させるには、ホモジュネート製剤、組織濃度、基質、アンカプラー、インヒビター濃度のストローク数に対して最適化実験を行うことを推奨します。研究は、異なる数の脳卒中と、それらが研究内のシトクロム c の添加に対する応答と、最大ミトコンドリア呼吸能力 21とどのように対応するかを比較することができる。チトクロム c 応答が少ない方が良いという一般的な受け入れがありますが、シトクロム c を添加した後の酸素消費量の増加は、外ミトコンドリア膜への損傷を示す可能性があるので、この閾値がすべての組織に対して何であるかについてはゴールドスタンダードはなく、組織が過労または準備不足にならないように実験的に調査する必要があります。この腫瘍組織では、~30%以下のシトクロム c 応答は呼吸機能を損なわないことがわかった。シトクロム c の使用は、検査が陽性であれば呼吸能力を正確に定量するために重要となる。この場合、添加は内因性シトクロムcを補充し 、 枯渇した場合、呼吸数の過小評価を引き起こす。
組織濃度滴定実験は、可能な濃度の範囲にわたって行われることができ、理想的には、研究中に調査されるSUITで行われるであろう。呼吸能力は腫瘍の種類と組成によって異なります。したがって、ミトコンドリアまたは高い呼吸能力を有する腫瘍は、より低い濃度(0.5〜5 mg/mL)を必要とする。少ないミトコンドリアまたは低呼吸能力を有する腫瘍は、より高い濃度(7-12 mg/mL)を必要とする。さらに、長い、または高度に消費された基質を有するSUITは、チャンバーまたはADP制限の再酸素化を防ぐために必要な組織が少ない場合があります。いくつかの組織は酸素消費において線形関係を持ち、他の組織は特定の濃度範囲で改善された感度と最大酸化を示す。選択した組織濃度は、再酸素化イベントの数を制限しながら、酸素フラックスを最大化するように最適化する必要があります。さらに、必要を過大評価するか、または濃度範囲の上限を目指す方が良い場合が多い。呼吸束の定量に不可欠な阻害剤は、ミトコンドリアのより大きなプールで使用するとより正確です。
もう一つの重要な考慮事項は、プロトコル中に使用される薬物の濃度です。ホモジネート濃度の変化は、最大応答に必要な基質、アンカプラー、および阻害剤の濃度を変化させる可能性があります。したがって、最適な濃度範囲が選択されたら、SUITプロトコルに必要な用量をテストする実験を行う必要があります。ADPを追加して、アデニル酸濃度が呼吸束に限定されないようにすることができます。FCCPやCCCPなどの化学アンカプラは、より高い濃度で呼吸を阻害します22.したがって、最大達成率を明らかにするために少量での活性化が不可欠です。ロテノーネや抗ミシンAなどの阻害剤は、最初の注射で飽和したときに最もよく使用されます。予備的な実験で最適な濃度が決定された一方で、阻害剤に対する反応の治療関連の違いも観察され、結果として得られた速度が定量化の基礎となるため、阻害剤の追加注入を1回追加することが多い。アスコルベート/TPMDの化学的阻害は、TMPDが自己酸化23を受けるので、正確な分析的還元に不可欠である。確立されたCIV阻害剤であるアジドナトリウムを添加し、アスコルビン酸/TMPD/シトクロム c の自動酸化を制御しました。Km研究の場合、コハク酸の存在下でロテノーネを単独で添加すると、低濃度24でコハク酸脱水素酵素活性を阻害できるオキサロアセテート蓄積を防止する。ADPの体積および濃度は、優勢な基質の組み合わせに対するミトコンドリアの感受性に大きく依存する。ADPに対して非常に敏感なミトコンドリア製剤は、より低い開始濃度を必要とする。さらに、pHに注意を払った検証済みの化学物質と適切な薬剤調製、該当する場合は光に対する感受性、および保存温度が実験を成功させるために不可欠です。
計測器のセットアップとルーチンケアは、これらの実験を成功させるために非常に重要です。チャンバーの適切かつ適切な洗浄は、生物学的、タンパク質、阻害剤、または非結合汚染の再現性と予防に不可欠です。クラーク型電極およびO2kシステムは消耗品に頼る版ベースのシステムに重大な費用の利点であるガラスの反応室を利用する。しかし、ガラス室は精力的に洗浄する必要があり、その後の研究で阻害剤汚染の原因となり得る。洗浄プロセス中にミトコンドリアが豊富な検体(例えば、単離された心臓または肝臓のミトコンドリア)とのインキュベーションは、実験的汚染のリスクを低減することができ、希釈およびアルコールベースの洗浄手順に加えて推奨されます。連続した研究が行われれば、エタノールおよびミトコンドリアによる洗浄は、インヒビター汚染の可能性を最小限に抑える。酸素センサのキャリブレーションは、酸素の一般的な分圧に対する呼吸の正確な測定値を得るために、各実験の前に推奨されます。複数のキャリブレーションが不可能な場合、洗浄手順の後に酸素濃度が安定し、一貫性を保つ場合は、1日1回のキャリブレーションで十分です。
上記で概説した手順は、以前に設計および最適化された保存溶液および呼吸媒体25、26、27を使用して腫瘍切除の4時間以内に腫瘍組織における酸素消費量を測定するためのOroboros O2k装置を活用する。このプロトコルの複数のパラメータは、後続のアプリケーションで変更できます。装置のセットアップとキャリブレーション、組織の準備に使用されるホモジナイザー、および最適なホモジネートおよびチャンバー酸素濃度はすべて、酸素モニタリングポテンシャルのある他の機器での使用に適合させることができます。例えば、ホモジネートを添加する際にチャンバーがわずかに過剰に充填され、したがってチャンバーが完全に閉じられると、チャンバー毛細管は満杯のままである。これはチャンバー内の酸素を消費しますが、サンプル濃度の最適化により、最初にどの酸素レベルを決定する際にこの消費を考慮することができます。あるいは、チャンバーが閉じられる前に周囲酸素で平衡化することが可能ですが、実験が始まる前に時間が長くなり、基板の添加が遅れることがよくあります。このプロトコルで使用されるホモジナイザーは広くアクセス可能であるが、ティッシュシュレッダーまたは自動化ホモジナイザー28のような他の商業的均質化技術を採用することができる。
さらに、組織調製および器具の手順は、結合および経路制御状態29の多様性による呼吸制御を研究するために、多数の異なるSUITと利用することができる。これらのSUITプロトコルは、機能容量を測定するために開発されており、したがって、潜在的な内在性基質の寄与は容量測定に影響を与え得ない。我々は、分析的に抗ミシンA-ロテノンの減算を通じてホモゲン酸の非ミトコンドリアの酸素消費量、または残留消費、またはアジドナトリウムの無感な率を考慮する。ミトコンドリアは、組織の種類と無傷性30、31に応じて、BIOPSまたは同様に長期間(>24時間)の構築された保存溶液で実行可能なままであり続けることができる。特定の基質のOXPHOSが異なる制限を有し得る時的な貯蔵限界を決定するために、研究を事前に行うことができる。これは、組織切除/生検の数時間以内に実験を行うことができない場合に不可欠です。37°Cは、ほとんどの哺乳類システムにおける呼吸機能の評価に最適で生理学的な温度です。しかし、アッセイ温度が評価32に干渉しているように見える場合、十分な応答性を確保するために広い温度範囲(25〜40°C)にわたって比較研究を行ってもよい。器械的な制約は、そのような研究を行う能力を制限するかもしれない。
上記の方法の主な制限は、1)機械的均質化によるミトコンドリアへの損傷の可能性、2)ATPまたは他の関心のある変数の同時決定を妨げる可能性があり、追加の補正方法または阻害剤使用を必要とし得るホモゲネート製剤におけるATPasesまたは他の細胞下生化学の存在である33、および3)1つの装置は一度に2つの実験に対応でき、連続する実験の間でクリーニングとセットアップが必要なため、サンプル当たりの多くのサンプルおよび/または複数のSUITの評価は時間がかかります。最適化実験とサンプルの一貫した調製により、一貫性のないデータに寄与するミトコンドリアの損傷を最小限に抑えることができます。
既存/代替方法に関する方法の重要性は、出発物質の量、ミトコンドリアの単離の課題、または透過組織における技術的課題と比較して、実現可能性が向上する。ホモジメートの調製は速く、酸素はほぼ制限されず、パーメビル化された組織と比較して人間の変動の影響を受けにくい。重要なことに、ほぼすべてのサンプルタイプは、組織間で比較分析を可能にするホモジネート調製に適しています。高分解能呼吸法は、ミトコンドリアOXPHOSおよびETの金標準測定である。前臨床および臨床癌研究におけるこの方法の適用は、現在 のインビトロ 研究を ex vivo 研究に拡大する能力を有する。さらに、臨床および診断の設定で潜在的な適用を提供する。
Disclosures
著者らは、この研究に関連する利益相反はありません。
Acknowledgments
ペニントン生物医学研究センター比較生物学コアスタッフの動物ケアに感謝します。この研究は、国立衛生研究所の助成金U54GM104940(JPK)とKL2TR003097(LAG)によって部分的に支援されました。動物を含むすべての実験と手順は、ペニントン生物医学研究センター制度動物の世話と使用委員会によって承認されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free | Sigma-Aldrich | 3117057001 | Roche |
| BD 50 mL Luer-Lok Syringe | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| Datlab 7.4 software | Oroboros Instruments | ||
| Dimethylsulfoxide | Amresco | N182 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| D-Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumoxel, autoclavable |
| Dumont # 7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumoxel, autoclavable |
| Digital Calipers 150 mm/6 in | World Precision Instruments | 501601 | |
| EO771 cells | CH3 BioSystems | SKU: 94APV1-vial-prem | Pathogen Tested |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock #000664 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 34120 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | L2398 | |
| Malate | Sigma-Aldrich | M6413 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354248 | |
| MgCl·6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Microsyringes | Hamilton | 87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | |
| Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10023-03 | |
| Oxygraph-2k FluoRespirometer | Oroboros Instruments | 10003-01 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875034 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Succinate (disodium) | Sigma-Aldrich | W327700 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Whatman Filter Paper, grade 5 | Sigma-Aldrich | 1005-090 | |
| Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL | Duran Wheaton Kimble | 357424 | |
| Straight Tip Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5914SC | |
| Non-Safety Scalpel No. 11 | McKesson | 1029065 | |
| BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2 | Becton, Dickinson and Company | 305109 | |
| BD Precision Glide Needle 18 G x 1 | Becton, Dickinson and Company | 305195 | |
| BD 1mL Slip Tip Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 316060 | |
| Rodent Very High Fat Diet, 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate | Research Diet | D12492 | |
| Pyrex Watch Glass, 100 mm | Thermo Fisher Scientific | S34819 |
References
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