Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل الإجهاد التأكسدي في المواد العضوية المعوية الفئرانية باستخدام مسبار الفلوروجينيك الحساس لأنواع الأكسجين التفاعلية

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62880
Automatic Translation
1,3, 1,4, 1,2,5, 1,6
1Molecular Microbial Pathogenesis Unit, Institut Pasteur, 2Chaire de Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Institut de Biologie Paris Seine (IBPS) - Developmental Biology Unit, Sorbonne Université, CNRS UMR7622, INSERM U1156, 4Molecular Radiotherapy, INSERM U1030, Gustave Roussy, Université Paris-Saclay, 5The Center for Microbes, Development and Health, Institut Pasteur Shanghai and Chinese Academy of Sciences, 6Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في عضويات الفئران المعوية باستخدام التصوير النوعي ومقايسات قياس الخلايا الكمية. يمكن توسيع هذا العمل ليشمل مجسات الفلورسنت الأخرى لاختبار تأثير المركبات المختارة على ROS.

Abstract

تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أدوارا أساسية في التوازن المعوي. ROS هي منتجات ثانوية طبيعية لعملية التمثيل الغذائي للخلايا. يتم إنتاجها استجابة للعدوى أو الإصابة على مستوى الغشاء المخاطي لأنها تشارك في الاستجابات المضادة للميكروبات والتئام الجروح. كما أنها رسل ثانويون مهمون ، ينظمون العديد من المسارات ، بما في ذلك نمو الخلايا والتمايز. من ناحية أخرى ، تؤدي مستويات ROS المفرطة إلى الإجهاد التأكسدي ، والذي يمكن أن يكون ضارا بالخلايا ويفضل الأمراض المعوية مثل الالتهاب المزمن أو السرطان. يوفر هذا العمل طريقة مباشرة للكشف عن ROS في عضويات الفئران المعوية عن طريق التصوير الحي وقياس التدفق الخلوي ، باستخدام مسبار فلوروجيني متاح تجاريا. هنا يصف البروتوكول فحص تأثير المركبات التي تعدل توازن الأكسدة والاختزال في المواد العضوية المعوية وتكشف عن مستويات ROS في أنواع محددة من الخلايا المعوية ، ويتضح هنا من خلال تحليل الخلايا الجذعية المعوية المصنفة وراثيا مع GFP. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع مجسات الفلورسنت الأخرى.

Introduction

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي منتجات ثانوية طبيعية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي. كما يمكن إنتاجها بنشاط بواسطة مجمعات إنزيمية متخصصة مثل NADPH-Oxidases المرتبط بالغشاء (NOX) و Dual Oxidases (DUOX) ، والتي تولد أنيون فائق الأكسيد وبيروكسيد الهيدروجين 1. من خلال التعبير عن الإنزيمات المضادة للأكسدة وكاسحات ROS ، يمكن للخلايا ضبط توازن الأكسدة والاختزال بدقة ، وبالتالي حماية توازن الأنسجة 2. على الرغم من أن ROS يمكن أن يكون شديد السمية للخلايا ويتلف الحمض النووي والبروتينات والدهون ، إلا أنها جزيئات إشارة حاسمة2. في الظهارة المعوية ، هناك حاجة إلى مستويات ROS معتدلة لانتشار الخلايا الجذعية والسلف 3 ؛ مستويات ROS العالية تؤدي إلى موت الخلايا المبرمج 4. يرتبط الإجهاد التأكسدي المزمن بالعديد من أمراض الجهاز الهضمي ، مثل أمراض الأمعاء الالتهابية أو السرطان. على سبيل المثال ، في نموذج الفأر لسرطان الأمعاء الذي يحركه Wnt ، وجد أن إنتاج ROS المرتفع من خلال تنشيط NADPH-oxidases مطلوب لفرط انتشار الخلايا السرطانية5,6. إن تحديد كيفية إدارة الخلايا المعوية، وخاصة الخلايا الجذعية، والخلايا الجذعية للإجهاد التأكسدي وكيف يمكن للبيئة الخلوية أن تؤثر على هذه القدرة أمر ضروري لفهم مسببات هذا المرض بشكل أفضل7.

في الأنسجة ، تقدم أنواع الخلايا المختلفة حالة أكسدة قاعدية قد تختلف وفقا لوظيفتها والتمثيل الغذائي والتعبير عن مستويات متفاوتة من جزيئات المؤكسدة ومضادات الأكسدة4,7. مراقبة ROS في الجسم الحي أمر صعب للغاية. تم تطوير أصباغ نفاذية للخلايا تنبعث منها التألق وفقا لحالة الأكسدة والاختزال الخاصة بها لتصور وقياس ROS الخلوي في الخلايا الحية والحيوانات. ومع ذلك، تعتمد فعاليتها على انتشارها داخل الأنسجة الحية وقراءتها السريعة، مما يجعل من الصعب استخدامها في النماذج الحيوانية8.

في الماضي ، تم إجراء دراسة تأثير المركبات على توليد ROS باستخدام خطوط الخلايا ، ولكن هذا قد لا يعكس الوضع في الجسم الحي . النموذج العضوي المعوي ، الذي طورته مجموعة Clevers9 ، يمكن من نمو الخلايا الأولية المعوية خارج الجسم الحي. تؤدي زراعة الخبايا المعوية في المصفوفات ، في وجود عوامل نمو محددة ، إلى هياكل ثلاثية الأبعاد ، تسمى المواد العضوية (الأمعاء الصغيرة) ، والتي تعيد إنتاج تنظيم الزغابات ، مع خلايا من سلالات ظهارية مختلفة تبطن تجويفا داخليا ، والخلايا الجذعية المعوية الموجودة في نتوءات صغيرة تشبه الخبايا.

هنا ، بالاستفادة من هذا النموذج ، يتم وصف طريقة بسيطة لدراسة الإجهاد التأكسدي في الخلايا المعوية الأولية بدقة خلية واحدة عن طريق إضافة صبغة حساسة ل ROS متاحة تجاريا إلى وسط الثقافة العضوية.

غالبا ما تستخدم قارئات اللوحات للكشف عن إنتاج ROS في إجمالي عدد السكان. يستخدم هذا البروتوكول قياس التدفق الخلوي أو فحص التصوير للكشف عن ROS في نوع معين من الخلايا مع خلايا معدلة وراثيا أو تلطيخ معين للأجسام المضادة. يتضمن هذا العمل زراعة الأعضاء المعوية للفئران وتصور ROS عن طريق التصوير البؤري والقياس الكمي عن طريق قياس التدفق الخلوي. باستخدام Lgr5-GFP من الفئران العضوية المعوية الصغيرة المشتقة ، من الممكن تحليل مستوى الإجهاد التأكسدي في الخلايا الجذعية المعوية على وجه التحديد بناء على علاجات مختلفة. يمكن تكييف هذا البروتوكول لاختبار تأثير الجزيئات الخارجية ، مثل موراميل ثنائي الببتيد المشتق من الميكروبات (MDP)10 ، على توازن ROS ، بعد تحفيز المواد العضوية مع المركبات المختارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات بعد موافقة لجنة استخدام معهد باستور ووزارة الزراعة الفرنسية رقم 2016-0022. يتم تنفيذ جميع الخطوات داخل غطاء محرك السيارة لزراعة الأنسجة.

1. إعداد الكواشف والمواد اللازمة لزراعة المواد العضوية المعوية

  1. لإعداد وسط زراعة النمو ، امزج DMEM / F-12 المتقدم المكمل بمحلول 1x glutamine ، محلول 1x penicillin / streptomycin (P / S) ، 10 mM من HEPES ، 50 نانوغرام / مل من الفئران EGF ، 20 ميكروغرام / مل من الفئران Noggin 500 نانوغرام / مل من الفأر R-Spondin1 (انظر جدول المواد). اترك الوسط في درجة حرارة الغرفة (RT) أثناء استخراج السرداب.
    ملاحظة: قم بتجميد الوسط غير المستخدم في الأليكوتس عند -20 درجة مئوية. تجنب التجميد والذوبان.
  2. املأ أنبوبا سعة 50 مل ب 40 مل من DMEM / F-12 المتقدم واحتفظ به على الجليد.
    ملاحظة: حافظ على الوسط غير المستخدم عند 4 درجات مئوية. سيتم استخدامه لتمرير المواد العضوية.
  3. قم بتسخين ألواح زراعة الخلايا مسبقا (μ-Slide 8 غرف بئر و / أو قاع دائري 96 بئرا) في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  4. إذابة مصفوفة الغشاء السفلي (BMM) (انظر جدول المواد) aliquots على الجليد (قبل بدء البروتوكول أو على الأقل 1 ساعة قبل طلاء الخبايا).
    ملاحظة: سوف يتصلب BMM بسرعة إذا لم يتم الاحتفاظ به باردا.
  5. تحضير محلول الغسيل / التنظيف بإضافة محلول البنسلين والستربتومايسين بنسبة 1٪ إلى DPBS (DPBS-P / S).
  6. املأ طبق بتري 100 مم ب 10 مل من DPBS-P/S. املأ ستة أنابيب سعة 15 مل ب 10 مل من DPBS وقم بتصنيفها من F1 إلى F6.
  7. تحضير 30 مل من محلول EDTA 10 mM عن طريق التخفيف من 0.5 M EDTA في DPBS. املأ أنبوبين سعة 15 مل ب 10 مل من 10 مللي متر EDTA ، وقم بتسميتهما E1 و E2.
  8. حافظ على تبريد جميع المحاليل مسبقا عند 4 درجات مئوية واحتفظ بها على الجليد أثناء الإجراء.

2. ثقافة المواد العضوية المعوية

  1. التضحية بفأر Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) عمره 8-10 أسابيع وفقا للقواعد واللوائح الوطنية.
  2. جمع 5-8 سم من الصائم الذي يشمل المنطقة الواقعة بين الاثني عشر (5 سم من المعدة) والدقاق (10 سم من الأعور) والاحتفاظ بها في DPBS-P / S الباردة على الجليد.
  3. تنظيف محتوى الأمعاء عن طريق التنظيف مع 5-10 مل من DPBS-P / S الباردة.
    ملاحظة: يمكن الحصول على محاقن التنظيف محلية الصنع عن طريق توصيل طرف 200 ميكرولتر بفوهة حقنة 10 مل.
  4. افتح الأمعاء طوليا باستخدام مقص طرف الكرة (انظر جدول المواد) (لمنع إتلاف الأنسجة).
  5. باستخدام الملقط ، انقل الأنسجة إلى طبق بتري يحتوي على DPBS-P / S بارد في درجة حرارة الغرفة ورجه للشطف.
  6. باستخدام ماصة باستور البلاستيكية ، أمسك بالأمعاء عن طريق الشفط وانقلها إلى أنبوب 15 مل يحمل علامة E1 يحتوي على 10 مل بارد 10 مللي متر EDTA.
  7. اقلب الأنبوب 3 مرات واحتضنه على الثلج لمدة 10 دقائق.
  8. باستخدام ماصة باستور بلاستيكية ، انقل الأنسجة في أنبوب F1 يحتوي على 10 مل DPBS. دوامة لمدة 2 دقيقة (على دوامة طبيعية ، وعقد الأنبوب باليد وضمان أن الأمعاء تدور بشكل جيد).
  9. ضع 10 ميكرولتر من الكسر في طبق بتري وقم بتقييم جودة الكسر تحت المجهر.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الدوامة بأقصى سرعة، ويجب تقييم جودة كل جزء تحت المجهر (الشكل 1).
  10. باستخدام ماصة باستور البلاستيكية ، أمسك بالأمعاء عن طريق الشفط وانقلها في أنبوب F2 يحتوي على 10 مل DPBS ودوامة لمدة دقيقتين.
  11. كرر الخطوة 2.10 ، ونقل الأنسجة في أنبوب F3 يحتوي على 10 مل DPBS ودوامة لمدة دقيقتين.
  12. كرر حضانة EDTA كما في الخطوة 2.6 ، ونقل الأنسجة في أنبوب E2 يحتوي على 10 mM EDTA.
  13. اقلب الأنبوب 3 مرات واحتضنه على الثلج لمدة 5 دقائق.
  14. كرر الخطوة 2.10 ، ونقل الأنسجة في أنبوب F4 يحتوي على 10 مل DPBS ودوامة لمدة 3 دقائق.
  15. كرر الخطوة 2.14 ، ونقل الأنسجة في أنبوب F5 يحتوي على 10 مل DPBS ودوامة لمدة 3 دقائق.
  16. كرر الخطوة 2.15 ، ونقل الأنسجة في أنبوب F6 يحتوي على 10 مل DPBS ودوامة لمدة 3 دقائق.
  17. اجمع بين أفضل الكسور التي يتم ترشيحها حسب الجاذبية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل (على الجليد) للقضاء على الزغب والحطام الكبير.
    ملاحظة: عادة ما تكون F5 و F6 هي الكسور التي تحتوي على العديد من الخبايا وحطام أقل.
  18. تدور الخبايا عند 150 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.
  19. أفرغ الأنبوب ، وقم بتعطيل الكريات ميكانيكيا ، وأضف 5 مل من DMEM / F12 البارد.
  20. ضع 10 ميكرولتر من التعليق في طبق بتري واحسب عدد الخبايا الموجودة في الأليكوت يدويا تحت المجهر.
    ملاحظة: لا تحسب الخلايا المفردة أو الحطام الصغير.
  21. احسب الحجم (V) لتعليق الخبايا المطلوب ب μL ، مع الأخذ في الاعتبار أن 300 سرداب مطلية لكل بئر ، W هو عدد الآبار ، و N هو عدد الخبايا التي تم حسابها من أصل 10 ميكرولتر من التعليق. انقل الخبايا إلى أنبوب جديد بسعة 15 مل.
    ملاحظة: V = 300 × العرض × 10/N. إذا تم استخدام حجم صغير في التجربة المخطط لها ، فيمكن استخدام أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
  22. تدور الخبايا عند 200 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.
  23. قم بإزالة supernatant بعناية باستخدام ماصة.
  24. قم بتعطيل الكريات ميكانيكيا وأضف بلطف وسط ثقافة النمو للحصول على تركيز 90 سكراب / ميكرولتر.
  25. أضف 2 مجلدات من BMM غير المخفف للحصول على تركيز نهائي من 30 سكرابت / ميكرولتر.
    ملاحظة: احتفظ دائما بالأنبوب على الجليد لتجنب تصلب BMM.
  26. لوحة 10 ميكرولتر من الخبايا / BMM مزيج في كل بئر. لتحليل قياس التدفق الخلوي ، استخدم لوحات 96 بئرا مستديرة القاع. توزيع 10 ميكرولتر في وسط كل بئر وقبة. للتصوير ، استخدم μ 8 جيدا (انظر جدول المواد) وقم بإيداع 10 ميكرولتر كطبقة رقيقة.
    ملاحظة: قم بلوحة المواد العضوية كطبقة رقيقة لفحص التصوير لتمكين تصويرها المتعمق.
  27. اترك اللوحة لمدة 5 دقائق عند RT للسماح ل BMM بالتصلب. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 15 دقيقة.
  28. أضف 250 ميكرولتر من وسط النمو في كل بئر ، مع الحرص على عدم فصل BMM.
  29. ضع الألواح في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  30. قم بإجراء تحليل ROS بين اليومين 4 و 6 من الثقافة. خلاف ذلك ، قم بتغيير الوسط وتقسيم المواد العضوية بعد ظهور العديد من الهياكل الناشئة الطويلة وعندما تتراكم الخلايا الميتة في لومينات العضوية.

3. مرور المواد العضوية

  1. ابدأ في تمرير المواد العضوية المعوية الصغيرة من اليوم 6th من الثقافة ، عندما تشكلت هياكل ناشئة كبيرة ، وأصبحت لومن المواد العضوية مظلمة.
    ملاحظة: يصبح تجويف العضو العضوي مظلما بسبب تراكم الخلايا الميتة والحطام والمخاط. تجنب ترك المواد العضوية تنمو قبل الانقسام. تعتمد نسبة الانقسام على نمو المواد العضوية. يوصى بتمرير المواد العضوية بنسبة 1: 2 في اليوم 6 و 1: 3 في اليوم 10.
  2. املأ أنبوبا سعة 15 مل ب 4 مل من DMEM / F-12 المتقدم البارد واحتفظ به على الجليد.
    ملاحظة: هنا ، يتم توفير مجلدات للوحة ثقافة 96 بئرا. إذا تم استخدام تنسيق مختلف ، فاضبط مستوى الصوت وفقا لذلك.
  3. استنشق الوسط بعناية باستخدام ماصة أو مضخة تفريغ من الآبار دون لمس قباب BMM ، وتخلص منها.
  4. أضف 100 ميكرولتر من DMEM / F-12 المتقدم البارد لكل بئر. ماصة لأعلى ولأسفل لكسر BMM ونقل محتوى البئر إلى أنبوب 15 مل.
  5. اغسل البئر ب 200 ميكرولتر بارد متقدم DMEM / F-12 وقم بجمعه في نفس الأنبوب.
    ملاحظة: في حالة تمرير آبار متعددة من نفس الحالة التجريبية ، يمكن تجميع محتويات الآبار في نفس أنبوب التجميع سعة 15 مل.
  6. قم بتدوير أنبوب التجميع سعة 15 مل عند 100 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. تخلص من السوبرناتانت وأضف 1 مل من DMEM / F-12 المتقدم البارد إلى الكرية. باستخدام طرف P1000 ، تناول طرف P10 (بدون فلتر) وماصة لأعلى ولأسفل 20 مرة على الأقل.
  8. أضف 4 مل من DMEM / F-12 المتقدم البارد إلى الأنبوب. تدور على 300 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  9. شفط supernatant مع ماصة أو مضخة فراغ دون إزعاج الكرية. ثم ، تعطيل الكريات ميكانيكيا.
  10. أضف BMM المخفف في وسط ثقافة النمو (نسبة 2: 1). ماصة بعناية لأعلى ولأسفل دون إدخال فقاعات الهواء في المزيج.
  11. لوحة 10 ميكرولتر من الخبايا / BMM مزيج في كل بئر.
  12. احتفظ باللوحة لمدة 5 دقائق في RT للسماح ل BMM بالتصلب. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 15 دقيقة.
  13. أضف 250 ميكرولتر من وسط النمو في كل بئر.
    ملاحظة: احرص على عدم فصل BMM.
  14. ضع الألواح في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.

4. إعداد الكواشف والمواد لتقييم الإجهاد التأكسدي في المواد العضوية المعوية

  1. قم بإعداد محلول مخزون 250 mM من مثبط N-acetylcysteine (NAC) (انظر جدول المواد) ، أعد تعليق 10 ملغ مع 245 ميكرولتر من DPBS. يستخدم عند التركيز النهائي 1 ملليمتر.
  2. تحضير محلول مخزون 50 mM من الهيدروبيروكسيد Tert-butyl المحث (tBHP) ، 70 ٪ في الماء ، وتخفيف 3.22 ميكرولتر مع 496.8 ميكرولتر من DPBS. يستخدم عند التركيز النهائي 200 ميكرومتر.
  3. بالنسبة لدراسة قياس التدفق الخلوي ، قم بإعداد حل عمل 250 ميكرومتر لمسبار فلوروجيني (انظر جدول المواد) عن طريق تخفيف محلول المخزون 1/10 في DMSO. يستخدم عند التركيز النهائي 1 ميكرومتر.
    ملاحظة: كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة ، فإن المسبار الفلوروجيني حساس للضوء والأكسجين. يجب ألا تكون الأسهم و aliquots مفتوحة ومغلقة عدة مرات.
  4. بالنسبة لدراسة التصوير ، قم بإعداد حل عمل 1.25 mM للمسبار الفلوري عن طريق تخفيف محلول المخزون 1/2 في DMSO. يستخدم عند التركيز النهائي 5 ميكرومتر.
  5. قم بإعداد حل نهائي من 0.1 ميكروغرام / مل DAPI في DPBS ، لاستخدامه في تمييز الخلايا الميتة في فحص قياس التدفق الخلوي.
  6. تمييع Hoechst 33342 إلى 1.25 ملغ / مل في DPBS. استخدم بتركيز نهائي 5 ميكروغرام/مل لاستخدامه للتلطيخ النووي في فحص التصوير.
  7. دافئ DMEM دون الفينول الأحمر عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تصف هذه الخطوات استخدام عناصر التحكم السلبية والإيجابية التي يجب تضمينها في أي مقايسات ، باستخدام الشروط الموضحة في الشكل 2A. يمكن استخدام الفحص لاختبار المركبات المضادة للأكسدة أو المؤيدة للأكسدة. الخطوات هي نفسها ، والفرق الوحيد هو عندما تضاف المركبات قبل استخدام الصبغة الفلوروجينية.

5. تصور الإجهاد التأكسدي في المواد العضوية 3D عن طريق المجهر البؤري

  1. خذ المواد العضوية المطلية في غرف البئر μ-Slide 8 وأضف محلول مخزون NAC 1 ميكرولتر في الآبار المقابلة للحصول على تركيز نهائي قدره 1 mM.
  2. احتضن لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  3. أضف محلول مخزون tBHP 1 ميكرولتر في الآبار المقابلة للحصول على تركيز نهائي قدره 200 ميكرومتر.
  4. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  5. أضف 1 ميكرولتر لكل بئر من تخفيف 1.25 ملليمتر للمسبار الفلوروجيني للحصول على تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر.
  6. أضف 1 ميكرولتر لكل بئر من تخفيف 1.25 ملغم / مل من Hoescht للحصول على تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل.
  7. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  8. قم بإزالة الوسط دون إزعاج BMM. بلطف ، أضف 250 ميكرولتر من DMEM الدافئ دون أحمر الفينول.
    ملاحظة: إذا تم التخطيط لعملية استحواذ طويلة الأجل ، فأضف مركبات عوامل النمو إلى DMEM بدون أحمر الفينول.
  9. قم بتصوير المواد العضوية باستخدام مجهر بؤري مجهز بغرفة حرارية وإمدادات غاز تكتشف المسبار الفلوروجيني (ROS).
    ملاحظة: الإثارة / الانبعاث (ex / em) للمسبار الفلوروجيني هو 644/665 ، و ex / em ل Hoechst (النوى) هو 361/486 ، و ex / em ل GFP (الخلايا الجذعية المعوية من الفئران Lgr5-GFP) هو 488/510. يستخدم هدف غمر الزيت 63x للكشف عن الإشارات في الخلايا الجذعية. لا تقم بتغيير إعدادات الليزر بين العينات. يمكن استخدام هدف 20x للسماح بنظرة عامة على إنتاج ROS.
  10. استخدم عنصر التحكم الإيجابي لإعداد شدة الليزر والتعرض للوقت لإشارة ROS وتحقق من أن هذه الإشارة أقل في التحكم السلبي.
  11. باستخدام شاشة العدسة ، الشريحة لتحديد المواد العضوية GFP التي تعبر عن كثافة الليزر وضبطها.
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة يدويا.
  12. حدد المواضع للحصول على صورة مخيطة للعضوي بأكمله. قم بإعداد مكدس z من 25 ميكرومتر (حجم الخطوة 5 ميكرومتر) للحصول على قسم من المواد العضوية يعرض طبقة واحدة من الخلايا.
    ملاحظة: ارجع إلى دليل مستخدم المجهر لتحسين الإعداد. باستخدام الخلايا الحية ، يجب أن يتم الاستحواذ في غضون 1 ساعة بعد نهاية الحضانة.
  13. افتح الصور في برنامج معالجة صور مفتوح المصدر (انظر جدول المواد).
  14. انتقل إلى مكدس z واختر القسم الذي يتم فيه تمثيل منتصف المواد العضوية بشكل جيد وإنشاء صورة جديدة مع المنطقة المحددة.
  15. حدد كمية الصور وفقا للخطوات 5.15.1 - 5.15.5.
    1. حدد أداة الخط الحر.
    2. ارسم خطا يتبع النوى.
      ملاحظة: حدد فقط المناطق التي تعرض الخلايا الإيجابية GFP إذا تم تحليل الخلايا الجذعية فقط.
    3. قم بزيادة عرض الخط لتغطية طبقة الخلية بالخط دون تضمين الحطام المضيء.
    4. حدد قناة إشارة ROS وقم بقياس شدة التألق في المنطقة المحددة وقم بالتعليق التوضيحي على القيم.
    5. ارسم خطا لا توجد فيه إشارة وقم بقياس كثافة الفلورسنت للخلفية التي سيتم طرحها إلى القيمة السابقة للحصول على الكثافة النهائية.

6. القياس الكمي للإجهاد التأكسدي على المواد العضوية المنفصلة باستخدام مقياس التدفق الخلوي

  1. أضف محلول مخزون NAC 1 ميكرولتر في الآبار للحصول على ضوابط سلبية للحصول على تركيز نهائي قدره 1 mM.
    ملاحظة: استخدم المواد العضوية المطلية في الألواح ذات القاع المستدير البالغ عددها 96 بئرا.
  2. احتضن لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  3. أضف محلول مخزون tBHP 1 ميكرولتر في الآبار المقابلة للحصول على تركيز نهائي قدره 200 ميكرومتر.
  4. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  5. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بإزالة الوسط دون إزعاج BMM المرفق ونقله إلى لوحة سفلية مستديرة أخرى بسعة 96 بئرا. احتفظ بهذه اللوحة جانبا.
  6. أضف 100 ميكرولتر من التربسين ، ومع ماصة متعددة القنوات ، ماصة لأعلى ولأسفل خمس مرات على الأقل لتدمير BMM.
  7. احتضان لمدة لا تزيد عن 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  8. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بماصة لأعلى ولأسفل خمس مرات على الأقل لفصل المواد العضوية.
  9. تدور بسرعة 300 × جم لمدة 5 دقائق على RT.
  10. تخلص من السوبرناتانت عن طريق عكس اللوحة. أضف مرة أخرى الوسط الذي تم جمعه في الخطوة 6.3 إلى الآبار المقابلة وأعد تعليق الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5 مرات.
  11. أضف المسبار الفلوروجيني عند التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومتر. أضف 1 ميكرولتر لكل بئر من تخفيف 250 ميكرومتر واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    ملاحظة: لا تقم بإضافة المسبار الفلوروجيني إلى الآبار اللازمة لإعدادات الجهاز (الشكل 2B).
  12. تدور بسرعة 300 × جم لمدة 5 دقائق على RT.
  13. أعد تعليق الخلايا باستخدام محلول DAPI سعة 250 ميكرولتر من 0.1 ميكروغرام/مل. انقل العينات في أنابيب قياس التدفق الخلوي المناسبة ، واحتفظ بالأنابيب على الجليد ، واستمر في التحليل.
    ملاحظة: أضف PBS بدلا من DAPI إلى الآبار اللازمة لإعدادات الأداة (الشكل 2B).
  14. قم بتحسين إعدادات جهد التشتت الأمامي والجانبي على التحكم غير الملون وفولتية الليزر لكل فلوروفور باستخدام عينات أحادية اللون.
  15. باستخدام استراتيجية بوابات مناسبة (الشكل 4A) ، اجمع ما لا يقل عن 20000 حدث.
    ملاحظة: يفضل تنظيم 50,000 حدث. تختلف إعدادات الاقتناء التفصيلية وفقا للأداة المستخدمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكدليل على مفهوم البروتوكول الموصوف، استخدمت الخبايا التي تم الحصول عليها من خط الفأر Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 حيث تعرض الخلايا الجذعية المعوية تعبير GFP الفسيفسائي، الذي أنشأه باركر وآخرون، لتوصيف الخلايا الجذعية المعوية10 في البداية والسماح برسم خريطة لهذه الخلايا بناء على تعبيرها عن GFP. وبالتالي يتم توفير نموذج لمقارنة مستويات ROS في مجموعة معينة من أنواع الخلايا بناء على علاجات مختلفة. تم استخدام مثبط ROS (NAC) ، ومحفز (tBHP) ، المعروف بالعمل على ROS الخلوي لتصور التغيرات في مستوياتها.

يوضح الشكلان 1A و 1B صورا تمثيلية للكسور F1 و F4 التي تم الحصول عليها أثناء إجراء استخراج الخبايا للثقافة العضوية المعوية. يجب فحص كل جزء تحت المجهر أو المنظار أثناء إجراء الاستخراج لمتابعة انفصال الخبايا وتحديد تلك الكسور المخصب في الخبايا ، بدلا من الزغب أو الخلايا المفردة أو الحطام. ثم يتم تجميع الكسور المختارة معا وتمريرها عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر لإزالة جميع الأجزاء المتبقية من الزغب والحصول على إعداد مع سراديب فقط (الشكل 1C). تبدأ الخبايا في الإغلاق في غضون ساعات قليلة من التضمين في BMM ، وفي D1 ، لوحظت عضويات مستديرة (الشكل 1D). بعد 3-5 أيام ، ستظهر المواد العضوية مع هياكل ناشئة تمثل "الخبايا المشكلة حديثا". المواد العضوية جاهزة لتحليل ROS (الشكلان 1E و 1F).

في بروتوكول تصوير الإجهاد التأكسدي بواسطة المجهر البؤري ، تم تصوير الشريحة التي تحتوي على المواد العضوية ، المحتضنة مع المسبار ، باستخدام مجهر فلوري متحد البؤرة مجهز بالليزر والمرشحات للكشف عن إشارات Hoechst (على سبيل المثال / em: 361/486) ، GFP (ex / em: 488/510) والمسبار الفلوروجيني (ex / em): 644/665). سمح المجهر البؤري المجهز ب 20x الهواء و 63x هدف غمر الزيت بتصور ROS. في الفئران Lgr5-GFP ، الخلايا الإيجابية GFP هي الخلايا الجذعية المعوية المعبرة عن Lgr5. يوضح الشكل التكميلي 1 الصور التمثيلية التي تم الحصول عليها بهدف 20x مما يوفر نظرة عامة على ROS في العديد من المواد العضوية. يوضح الشكل 3 صورا تمثيلية ، تم الحصول عليها باستخدام هدف الزيت 63x ، للعضويات المعوية التي تعبر عن GFP ، أو غير المعالجة (NT) ، أو المحتضنة مسبقا أو غير المحتضنة مسبقا باستخدام NAC المثبط ROS ، وتحفيزها أو عدم تحفيزها لمدة 30 دقيقة باستخدام محفز ROS tBHP.

في وجود المثبط ، تكون الإشارة الوحيدة من الخلايا الميتة الموجودة في تجويف العضو مرئية. في المواد العضوية غير المعالجة ، يتم عرض مستويات ROS القاعدية ، مما يثبت أن الخلايا الجذعية تنتج ROS أعلى من الخلايا المتمايزة (وفقا لإعدادات المجهر ، يمكن أيضا تصور إشارة ROS في الخلايا غير الجذعية). تقدم الخلايا الإيجابية GFP إشارة سيتوبلازمية أكثر أهمية مع المحفز في وجود المسبار الفلوروجيني ، مما يدل على أن مستويات ROS تزداد بشكل خاص في الخلايا الجذعية بعد العلاج.

يوضح الشكل 4 النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها عند تحليل إنتاج ROS في المواد العضوية المعوية التي تم تحفيزها أو عدم تحفيزها باستخدام مثبط ROS أو محفز ، باستخدام مقياس التدفق الخلوي المجهز بليزر 405 نانومتر و 488 نانومتر و 630 نانومتر. تتيح استراتيجية البوابات المعروضة في الشكل 4A تقييم إنتاج ROS على مستوى مجموعة الخلايا العضوية بأكملها ، وتحديد الخلايا السليمة والحية بناء على المعلمات الفيزيائية واستبعاد DAPI (SSC-A مقابل FSC-A و DAPI مقابل FSC-A) و FSC-H مقابل FSC-A) أو فقط في الخلايا الجذعية المعوية ، التي يتم إغلاقها بشكل أكبر على الخلايا ذات الإشارة العالية GFP. يوضح الشكل 4B مستويات ROS في إجمالي عدد السكان عند جمع 50000 حدث. تنخفض مستويات ROS القاعدية في الخلايا غير المعالجة (NT) بعد التحفيز باستخدام المثبط (NAC) ، وعلى العكس من ذلك ، تزداد بعد التحدي مع المحفز (tBHP). الخلايا المعالجة مسبقا مع المثبط ثم تحفيزها مع المحفز تقديم مستوى أقل من تلك التي تم تحفيزها مع المحفز وحده. ثم تم تحليل النتائج باستخدام البرامج المناسبة ، والحصول على متوسط كثافة الفلورسنت (MFI). يتم عرض القيم التي تم الحصول عليها كنسبة على الخلايا غير المعالجة ، كما هو موضح في الرسم البياني المعروض على يمين الشكل 4B. يوضح الشكل 4C نفس المعلمات الموضحة في الشكل 4B في الخلايا الجذعية ، المسورة كخلايا إيجابية GFP ، مما يدل على انخفاض بمقدار 3.5 أضعاف في مستوى ROS عند علاج NAC وزيادة 4 أضعاف عند علاج tBHP على الخلايا غير المحفزة. توضح هذه النتيجة أنه بعد هذا البروتوكول ، من الممكن تحديد الاختلافات في مستويات ROS على مستوى جميع الخلايا أو في الخلايا الجذعية الإيجابية GFP عند معالجتها للعضويات بمركبات محددة.

Figure 1
الشكل 1: صور تمثيلية للسراديب والمواد العضوية. (أ) مثال على الكسر F1 الذي تم الحصول عليه بعد الحضانة الأولى مع EDTA ، المخصب في الزغب (مربع) ، مع بعض الحطام (نجمة) وسراديب (دائرة). (ب) مثال على الكسر F4 المخصب في الخبايا. (ج) تعليق يعرض فقط الخبايا المعزولة التي تم الحصول عليها بعد الترشيح باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر (شريط مقياس ، 200 ميكرومتر). (D، E، وF). تم الحصول على المواد العضوية النموذجية بعد 1 و 3 و 5 أيام على التوالي ، بعد تضمين الخبايا في BMM (شريط المقياس ، 100 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الخطوط العريضة للخطة التجريبية. (أ) الحالات المستخدمة في هذا البروتوكول المدرجة في كل تجربة: الآبار غير المعالجة (NT)، والآبار المعالجة بالمحفزات (هيدروبيروكسيد تيرت بوتيل - tBHP)، والآبار المعالجة بالمثبطات (N-acetyl cysteine - NAC)، والآبار المعالجة بالمثبطات والمحرضات (NAC-tBHP). (ب) شكل لوحة لفحص قياس التدفق الخلوي. كل شرط مطلي بثلاثة أضعاف (الخط A). تتضمن الخطوط B و C و D آبارا لإعداد مقياس التدفق الخلوي مع المسبار الفلوروجيني فقط ، أو عينات DAPI فقط ، أو العينات غير الملطخة (NS). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صور تمثيلية متحدة البؤرة لتلطيخ ROS في المواد العضوية. تم الحصول على صور مخيطة باستخدام مجهر بؤري مجهز بكاميرا EMCCD عالية السرعة ، وهدف زيت 63x / 1.4 ، وشق 35 ميكرومتر ، باستخدام أشعة الليزر 405 و 488 و 640 والمرشحات 460/50 و 535/50 و 700/75 للحصول على Hoechst و GFP والمسبار الفلوروجيني على التوالي. المقاطع البصرية البؤرية من المواد العضوية غير المعالجة (NT) ، المعالجة بمثبط ROS (NAC) ، مع محفز ROS (tBHP) ، أو المعالجة مسبقا بمثبط ROS ثم تحفيزها باستخدام محفز ROS (NAC-tBHP). باللون الرمادي ، نوى ملطخة مع Hoechst. في خلايا Lgr5-GFP الخضراء ؛ باللون الأحمر ، المسبار الفلوروجيني (شريط المقياس ، 50 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل التدفق الخلوي التمثيلي ل ROS في الخلايا المشتقة من المواد العضوية. (أ) التمثيل التخطيطي لاستراتيجية البوابات المستخدمة في تحليل قياس التدفق الخلوي: بوابات لشكل الخلية (استبعاد الخلايا الميتة والحطام المتراكم في تجويف المواد العضوية)، وبوابات للخلايا الحية (الخلايا التي لا تتضمن DAPI-laser 405)، وبوابات للخلايا المفردة (التمييز المزدوج)، والخلايا الجذعية (الخلايا الإيجابية GFP - الليزر 488) (FSC: المبعثر الأمامي، SSC: التشتت الجانبي). تم الحصول على إشارة ROS باستخدام ليزر 630. (ب) على اليسار، تم الحصول على الرسوم البيانية باستخدام برنامج حاسوبي مناسب يوضح شدة إشارات ROS لمجموع السكان الأحياء (بعد تحديد حوالي 10000 حدث لكل حالة) في العينات المختلفة NT: غير المعالجة؛ NAC: مثبطات المعالجة. tBHP المحرض المعالجة. NAC-tBHP: مثبط ومحفز معالج. على اليمين، مثال نموذجي للنسبة المحسوبة لقيم MFI على عينات NT التي تم الحصول عليها أثناء تجربة تبدأ من 3 عينات لكل شرط (متوسط ± SD) (*** P = 0.0003). (C) كما هو الحال في B بالنسبة للسكان الإيجابيين GFP (1000 حدث لكل حالة) (* P = 0.02). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: صور تمثيلية متحدة البؤرة لتلطيخ ROS في المواد العضوية. تم الحصول على images مخيط باستخدام مجهر بؤري مجهز بكاميرا EMCCD عالية السرعة ، وهدف 20x ، وشق 35 ميكرومتر ، باستخدام أشعة الليزر 405 و 488 و 640 والمرشحات 460/50 و 535/50 و 700/75 للحصول على مسبار Hoechst و GFP و fluorogenic على التوالي. المقاطع البصرية البؤرية من المواد العضوية غير المعالجة (NT) ، المعالجة بمثبط ROS (NAC) ، مع محفز ROS (tBHP) ، أو المعالجة مسبقا بمثبط ROS ثم تحفيزها باستخدام محفز ROS (NAC-tBHP). باللون الرمادي ، نوى ملطخة مع Hoechst. في خلايا Lgr5-GFP الخضراء ؛ في الأحمر ، مسبار فلوروجينيك (شريط مقياس ، 100 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا العمل بروتوكولا خطوة بخطوة لعزل سراديب الفئران الصولجان ، وزراعتها في عضويات 3D ، وتحليل ROS في المواد العضوية من خلال الجمع بين مسبار فلوروجيني حساس ل ROS مع تصوير مجهري نوعي للعضويات الكاملة وقياس ROS الكمي باستخدام قياس التدفق الخلوي على الخلايا المفردة بعد التفكك العضوي.

الخطوة الحاسمة الأولى في هذه الطريقة هي إجراء استخراج الخبايا. في الواقع ، فإن جودة إعداد الخبايا هي المفتاح لتشكيل عضويات ناجحة. لذلك من الضروري الحصول على كسور ذات سراديب غنية وعدد قليل من الحطام الخلوي أو الخلايا المحتضرة. يمكن العثور على الخبايا في كسور مختلفة عن تلك المشار إليها في البروتوكول ، حيث قد يختلف الانفصال باختلاف عمر الماوس وحالته الصحية. يمكن تعديل عدد حضانات EDTA وفقا لذلك. إذا لم يبدو أن الخبايا تنفصل بعد الكسر 4 ، فيجب تكرار حضانة EDTA لمدة 3 دقائق. على العكس من ذلك ، لنفترض أن الخبايا تنفصل بالفعل بعد أول حضانة EDTA. في هذه الحالة ، قد لا تكون حضانة EDTA الثانية ضرورية ، ويجب أن تتم خطوات الدوامة المتسلسلة في DPBS حتى يتم الحصول على الكسور مع ما يكفي من الخبايا الخالية من الحطام. في حالة عدم حدوث أي تفكك ، تأكد من استخدام DPBS بدون Ca2 + و Mg2 + لإعداد أنابيب التجميع ، واستبدال EDTA بمحلول جديد. الخبايا هي هياكل هشة ، لذلك يجب الاحتفاظ بها قدر الإمكان على الجليد وطلائها بسرعة بعد العزلة.

يمكن استخدام لوحات مختلفة وأحجام قطرة لزراعة المواد العضوية. على سبيل المثال ، يمكن أيضا طلاء الخبايا في 24 أو 48 لوحة بئر بعد ضبط تركيز الخبايا ، وحجم انخفاض BMM ، والوسيط المضاف في كل بئر. يمكن طلاء قطرات متعددة في نفس البئر في لوحة من 12 أو 6 آبار. بشكل عام ، تنخفض الخبايا في الحجم وتدور لتشكيل عضويات مستديرة صغيرة في اليوم 1 من الثقافة. يجب ملاحظة تكوين براعم جديدة بعد 2-3 أيام من الطلاء.

لدراسة التغيرات في مستويات ROS في الخلايا الجذعية المعوية ، تم أخذ ميزة خط الماوس Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2. أحد تحذيرات هذا النموذج هو إسكات انتقائي للأليل المكسور وما يترتب على ذلك من فسيفساء تعبير GFP ، والتي يمكن أن تكون غائبة في بقع من الخلايا الجذعية أو سراديب كاملة. أثناء بروتوكول التصوير ، لن تقدم جميع المواد العضوية خلايا جذعية تعبر عن GFP. لذلك ، لن يتم النظر في جميع المواد العضوية ما لم يكن من الممكن الاعتماد على الموقع المكاني للخلايا. بدلا من ذلك ، يجب مراعاة ذلك عند تحليل مجموعة الخلايا السلبية GFP في بروتوكول قياس التدفق الخلوي. في الواقع ، نظرا لأنه من المستحيل الاعتماد على الموقع المكاني ، فإن السكان السلبيين ل GFP سيتألفون من خلايا غير جذعية وخلايا جذعية سلبية GFP.

هنا يتم توفير بروتوكول للتقييم النوعي ل ROS في المواد العضوية المعوية. يرتبط جانب حاسم لهذا الجزء بمسافة العمل للأهداف المستخدمة. تزرع المواد العضوية في BMM. لا يتم إرفاقها بقاع البئر ، مما يؤدي إلى مسافة من خطة التركيز الموضوعية. لهذا السبب ، من الأهمية بمكان وضع المواد العضوية في طبقة رقيقة من BMM ، لتقليل هذه المشكلة. حتى في هذا الإعداد الأمثل ، لن تكون جميع المواد العضوية في الموضع الصحيح ليتم تصويرها بشكل كاف.

ويمكن إجراء تحليل كمي للصور باستخدام برنامج مناسب لتحليل الصور، وتقييم متوسط كثافة الفلورسنت للصور في قناة إشارة ROS كما هو موضح في البروتوكول. لهذا الغرض ، من الضروري الحصول على عدد كبير من الصور للحصول على عدد كاف من الأحداث لتكون ذات دلالة إحصائية. كما ذكرنا من قبل ، باستخدام الفئران Lgr5-GFP ، لن تعبر جميع المواد العضوية عن GFP ، مما يتطلب عددا كبيرا من العينات ليتم تصويرها.

أثناء إجراء قياس التدفق الخلوي ، تتمثل الخطوة الحاسمة في تفكك المواد العضوية إلى خلايا مفردة. إذا كان الانفصال قاسيا للغاية ، فقد تموت الخلايا وتطلق الحمض النووي. يمكن إضافة مثبط صخري ، Y-27632 ، لمواجهة الأنويكيس ، والحمض النووي إلى المخزن المؤقت للتفكك إذا لم تتداخل مع المسار المدروس. يمكن استخدام تخفيف التربسين أو تقليل أوقات الحضانة.

أخيرا ، من الأهمية بمكان تحديد أفضل نقطة زمنية لتحليل إنتاج ROS بعد اختبار العلاجات المختلفة (المضادة أو المؤيدة للأكسدة). في حالة الأدوية التي تحفز ROS بسرعة في غضون دقائق أو ساعات ، يمكن استخدام فحص التصوير لتحديد متى يكون هناك الحد الأقصى من الحث عن طريق إضافة المسبار الفلوروجيني قبل المركبات المختبرة. قد تختلف شدة التألق للمسبار بعد تحفيز المواد العضوية بين التجارب التي أجريت في أيام مختلفة. لذلك ، من الأهمية بمكان دائما حساب النسبة مع العينات غير المحفزة وإضافة عناصر تحكم (مؤكسدة / مضادة للأكسدة) للتحقق من تفاعل المسبار. تم استخدام NAC و tBHP كضوابط سلبية وإيجابية لأنها أعطت النتائج الأكثر حسما. ومع ذلك ، يمكن استخدام كواشف أخرى ، مثل ريسفيراترول كمضاد للأكسدة أو باراكوات / ميناديون كمواد مؤكسدة. قد تكون احتضان الخلايا لفترة طويلة جدا باستخدام المسبار الفلوروجيني سامة وحتى تعديل توازن الأكسدة والاختزال الخلوي ، لذلك يجب أيضا التحكم في أوقات الحضانة بإحكام. يمكن إصلاح الخلايا الملطخة بالمسبار وتحليلها بعد بضع ساعات. في هذه الحالة ، بالنسبة لتحليل التدفق الخلوي ، لا يمكن ل DAPI التمييز بين الخلايا الحية والميتة. بدلا من ذلك ، يجب استخدام صبغة قابلة للإصلاح للتمييز الحي / الميت قبل التثبيت.

يمكن أيضا زراعة المواد العضوية لعدة أيام (أكثر من 7) ، ولكن هذا سيزيد من عدد الخلايا الحية والتكاثرية والخلايا الميتة التي تتراكم في لومينات العضوية ، مما يولد خلفية عالية ، خاصة في فحص التصوير. إذا لوحظت زيادة غير طبيعية في إشارة المسبار الفلوروجيني ، فتأكد من أن المحلول المستخدم لإعادة تعليق المركبات المحفزة ليس مؤيدا للأكسدة في حد ذاته (أي الإيثانول).

أحد المخاوف التي يجب مراعاتها عند استخدام هذا البروتوكول هو أن التصوير الحي وتفكك الخلايا متبوعا بقياس التدفق الخلوي قد يحفز الإجهاد التأكسدي في الخلايا ويولد إشارة خلفية. يمكن النظر في تثبيت المواد العضوية وفقا للتجربة. هناك قيد آخر ينشأ من صعوبة التصوير المتعمق للعضويات المزروعة في مصفوفة 3D. كما هو مذكور في البروتوكول ، يجب توزيع BMM على الشريحة كطبقة رقيقة للحد من هذا الجانب.

هنا ، تم تصميم البروتوكول باستخدام صبغة فلوروجينية متاحة تجاريا. ميزته الأساسية هي توافقه مع تلطيخ متعدد الألوان من المواد العضوية بحيث أنواع معينة من الخلايا. على سبيل المثال ، يمكن إجراء تلطيخ الأجسام المضادة لعلامات سطح الخلية مباشرة بعد حضانة المسبار الفلوروجيني للكشف عن أنواع فرعية معينة. ومع ذلك ، فإن المسبار ليس خاصا بنوع معين من أنواع ROS حيث يمكنه اكتشاف الأكسيد الفائق وبيروكسيد النتريت وبيروكسيد الهيدروجين 11،12،13. لهذا السبب ، يتم استخدامه بشكل عام للكشف عن الإجهاد التأكسدي العالمي. على الرغم من تسويقه كمسبار خلوي فقط ، إلا أنه يمكن العثور على المسبار الفلوروجيني المختار للوصول إلى الميتوكوندريا14. نظرا لأن خصوصيته يمكن أن تختلف بين السياقات الخلوية المختلفة ، فإننا نقترح استخدام طرق تكميلية أخرى لقياس ROS عندما يكون ذلك ممكنا. ويمكن استخدام أصباغ بديلة مثل المجسات الخاصة للكشف عن أنيونات الأكسيد الفائق المولدة من الميتوكوندريا10. كما تم تطوير ذخيرة من المجسات الكيميائية للكشف عن أنواع محددة من ROS ذات الحساسية العالية ، مثل المجسات القائمة على لوسيفيرين 15،16. هذه لها ميزة كونها متوافقة مع التصوير في الجسم الحي ولكن لا يمكن استخدامها لتعيين إنتاج ROS مع أنواع محددة من الخلايا. أخيرا ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أنواع أخرى من المواد العضوية ، على سبيل المثال ، المواد العضوية القولونية المشتقة من الخزعات البشرية. في هذه الحالة ، يجب تكييف وسط نمو الثقافة وفقا لذلك17. لمزيد من التحليل لآلية الأكسدة والاختزال داخل الخلايا المعوية ، يمكن الجمع بين زراعة المواد العضوية وإجراءات التفكك الموصوفة في هذا البروتوكول مع النهج النسخية والبروتينية على الخلايا العضوية الكاملة أو الخلايا العضوية المنشطة بالفلور (FACS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منحة الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR) 17-CE14-0022 (i-Stress).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) The Jackson Laboratory
Growth culture medium
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) ThermoFisher 12634010
B-27 Supplement, minus vitamin A ThermoFisher 12587010 Stock Concentration: 50x
GlutaMAX (glutamine) ThermoFisher 35050038 Stock Concentration: 100x
Hepes ThermoFisher 15630056 Stock Concentration: 1 M
Murine EGF R&D 2028-EG-200 Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS
murine Noggin R&D 1967-NG/CF Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS
Murine R-spondin1 R&D 3474-RS-050 Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS
N-2 Supplement ThermoFisher 17502048 Stock Concentration: 100x
Penicillin-Streptomycin (P/S) ThermoFisher 15140122 Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin)
Material
70 µm cell strainer Corning 352350
96-well round bottom Corning 3799
ball tip scissor Fine Science Tools GMBH 14086-09
CellROX® Deep Red Reagent ThermoFisher C10422
DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) ThermoFisher D1306 stock at 10 mg/mL
DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) ThermoFisher 14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) ThermoFisher A1896701
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570 stock at 10 mg/mL
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) Corning 356231 once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C
µ-Slide 8 Well chambers Ibidi 80826
N-acetylcysteine (NAC) Sigma A9165
tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) Sigma 458139
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) ThermoFisher 12604013
UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 ThermoFisher 15575020
Y-27632 Sigma Y0503 Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation
Programs and Equipment
Attune NxT (Flow Cytometer) ThermoFischer Flow cytometer analyzer
Fiji/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/downloads images generation
FlowJo BD Bioscience FACS analysis
Observer.Z1 Zeiss confocal system
Opterra (swept-field confocal) Bruker confocal system
high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 Photometrics confocal system
Prism GraphPad Software statistical analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
  2. Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  3. vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
  4. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
  5. Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
  6. Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
  7. Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
  8. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
  11. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
  12. Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
  13. Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
  14. Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
  15. Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
  16. Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).

Tags

علم الأحياء ، العدد 175 ، الأعضاء المعوية الفئرانية ، الكشف عن ROS ، تحليل قياس التدفق الخلوي ، الكشف عن التصوير الحي ، الخلايا الجذعية المعوية ، صبغة حساسة ل ROS ، الإجهاد التأكسدي ، تحقيقات الفلوروجين
تحليل الإجهاد التأكسدي في المواد العضوية المعوية الفئرانية باستخدام مسبار الفلوروجينيك الحساس لأنواع الأكسجين التفاعلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stedman, A., Levy, A., Sansonetti,… More

Stedman, A., Levy, A., Sansonetti, P. J., Nigro, G. Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe. J. Vis. Exp. (175), e62880, doi:10.3791/62880 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter