Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לזיהוי מינים של חמצן תגובתי (ROS) באורגנוידים של מורין במעיים באמצעות הדמיה איכותית ובדיקות ציטומטריה כמותית. עבודה זו יכולה להיות מורחבת באופן פוטנציאלי לבדיקות פלואורסצנטיות אחרות כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות נבחרות על ROS.
Abstract
מינים חמצן תגובתי (ROS) לשחק תפקידים חיוניים הומאוסטזיס מעיים. ROS הם תוצרי לוואי טבעיים של חילוף החומרים של התא. הם מיוצרים בתגובה לזיהום או פציעה ברמה הרירית כפי שהם מעורבים בתגובות מיקרוביאלית וריפוי פצעים. הם גם שליחים משניים קריטיים, ויסות מספר מסלולים, כולל צמיחת תאים ובידול. מצד שני, רמות ROS מוגזמות להוביל עקה חמצונית, אשר יכול להיות מזיק לתאים לטובת מחלות מעיים כמו דלקת כרונית או סרטן. עבודה זו מספקת שיטה פשוטה כדי לזהות ROS באורגנוידים מורין מעיים על ידי הדמיה חיה וציטומטריית זרימה, באמצעות בדיקה פלואורוגנית זמינה מסחרית. כאן הפרוטוקול מתאר את ההשפעה של תרכובות המווסתות את איזון redox באורגנוידים במעיים ולזהות רמות ROS בסוגי תאי מעיים ספציפיים, המודגמים כאן על ידי ניתוח של תאי גזע מעיים המסומנים גנטית עם GFP. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם בדיקות פלואורסצנטיות אחרות.
Introduction
מינים חמצן תגובתי (ROS) הם תוצרי לוואי טבעיים של חילוף החומרים התאי. הם יכולים גם להיות מיוצרים באופן פעיל על ידי קומפלקסים אנזימטיים מיוחדים כגון NADPH-Oxidases הקשורים לממברנה (NOX) ו Oxidases כפול (DUOX), אשר מייצרים אניון סופראוקסיד ומי חמצן1. על ידי הבעת אנזימים נוגדי חמצון ואוכלי נבלות ROS, תאים יכולים לכוונן דק את איזון ה- redox שלהם, ובכך להגן על הומאוסטזיס רקמות2. למרות ROS יכול להיות רעיל מאוד לתאים ולפגוע DNA, חלבונים, שומנים, שומנים, הם מולקולות איתות חיוני2. באפיתל המעיים, רמות ROS מתונות נדרשות להתפשטות תאי גזע ואבות אבות3; רמות ROS גבוהות להוביל אפופטוזיס שלהם4. עקה חמצונית כרונית קשורה למחלות רבות במערכת העיכול, כגון מחלות מעי דלקתיות או סרטן. כדוגמה, במודל עכבר של סרטן מעיים מונחה Wnt, ייצור ROS מוגבר באמצעות הפעלה של NADPH-oxidases נמצאה כנדרשת עבור תאים סרטניים hyperproliferation5,6. הגדרת האופן שבו תאי מעיים, בפרט תאי גזע, תאי גזע מנהלים עקה חמצונית וכיצד הסביבה התאית יכולה להשפיע על יכולת זו חיונית כדי להבין את האטיולוגיה של מחלה זו טוב יותר7.
ברקמה, סוגי תאים שונים מציגים מצב חמצוני בסיסי שעשוי להשתנות בהתאם לתפקודם ולחילוף החומרים שלהם ולביטוי של רמות משתנות של מולקולות חמצון ונוגדי חמצון4,7. ניטור ROS ב vivo הוא מאתגר מאוד. צבעים חדירים לתאים הפולטים פלואורסצנטיות בהתאם למצבם האדום פותחו כדי לדמיין ולמדוד ROS תאי בתאים חיים ובבעלי חיים. עם זאת, היעילות שלהם תלויה בפיזור שלהם בתוך רקמות חיות ואת הקריאה המהירה שלהם, מה שהופך אותם קשים לשימוש במודלים של בעלי חיים8.
בעבר, המחקר של ההשפעה של תרכובות על דור ROS נעשה באמצעות קווי תאים, אבל זה לא יכול לשקף את המצב in vivo . מודל האורגנויד במעיים, שפותח על ידי קבוצת Clevers9, מאפשר את הצמיחה של תאים ראשוניים במעיים ex vivo. תרבות של קריפטות מעיים במטריצות, בנוכחות גורמי גדילה מוגדרים, מובילה למבנים תלת-ממדיים, הנקראים אורגנוידים (מיני-מעיים), אשר משחזרים את ארגון הקריפטה-וילון, עם תאים משושלות האפיתל השונות המצפות לומן פנימי, ותאי הגזע במעיים המתגוררים בבליטה קטנה דמוית קריפטה.
כאן, תוך ניצול מודל זה, מתוארת שיטה פשוטה לחקר עקה חמצונית בתאי מעיים ראשוניים ברזולוציה של תא יחיד על ידי הוספת צבע רגיש ל- ROS זמין מסחרית למדיום התרבות האורגנויד.
קוראי לוחות משמשים לעתים קרובות כדי לזהות ייצור ROS באוכלוסייה הכוללת. פרוטוקול זה משתמש בציטומטריית זרימה או בבדיקת הדמיה כדי לזהות ROS בסוג תא מסוים עם תאים מהונדסים גנטית או כתמי נוגדנים ספציפיים. עבודה זו כוללת תרבות אורגנויד מעיים של עכבר והדמיה ROS על ידי הדמיה קונפוקלית וכימות על ידי ציטומטריית זרימה. באמצעות Lgr5-GFP עכברים נגזרים אורגנוידים מעיים קטנים, ניתן לנתח באופן ספציפי את רמת הלחץ החמצוני בתאי גזע מעיים על טיפולים שונים. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לבדוק את ההשפעה של מולקולות אקסוגניות, כגון מראמיל-dipeptide נגזר מיקרוביוטה (MDP)10, על מאזן ROS, לאחר גירוי organoids עם התרכובות שנבחרו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו לאחר אישור ועדת השימוש בפסטר במכון ועל ידי משרד החקלאות הצרפתי מס ' 2016-0022. כל השלבים מבוצעים בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמות.
1. הכנת ריאגנטים וחומרים לפולחן אורגנוידים במעיים
- כדי להכין מדיום תרבות גדילה, לערבב מתקדם DMEM / F-12 בתוספת 1x גלוטמין, 1x פניצילין / סטרפטומיצין (P / S) פתרון, 10 מ"מ של HEPES, 50 ng / mL של EGF מורין, 20 מיקרוגרם / מ"ל של מורין Noggin 500 ng / mL של עכבר R-Spondin1 (ראה טבלת חומרים). השאירו את המדיום בטמפרטורת החדר (RT) במהלך החילוץ של הקריפטה.
הערה: הקפאת המדיום שאינו בשימוש ב- aliquots ב- -20 °C (60 °F). יש להימנע מהקפאה והפשרה. - מלא צינור 50 מ"ל עם 40 מ"ל של DMEM / F-12 מתקדם ולשמור אותו על קרח.
הערה: שמור על המדיום שאינו בשימוש בטמפרטורה של 4 °C (60 °F). זה ישמש עבור organoids עובר. - מחממים מראש את לוחות תרבית התאים (μ-Slide 8 היטב ו/או 96-well round bottom) באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- להפשיר מטריצת ממברנה מרתף (BMM) (ראה טבלת חומרים) aliquots על קרח (לפני תחילת הפרוטוקול או לפחות 1 שעה לפני ציפוי קריפטות).
הערה: ה-BMM יתמצק במהירות אם לא יישמר קר. - הכן פתרון כביסה/שטיפה הוספת תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 1% ל- DPBS (DPBS-P/S).
- מלאו צלחת פטרי 100 מ"מ עם 10 מ"ל של DPBS-P/S קר. מלאו שישה צינורות 15 מ"ל עם 10 מ"ל של DPBS ותייגו אותם מ-F1 עד F6.
- הכן 30 מ"ל של פתרון EDTA של 10 מ"מ על ידי דילול מ 0.5 M EDTA ב- DPBS. מלאו שני צינורות 15 מ"ל ב-10 מ"ל של 10 מ"מ EDTA, ותייגו אותם כ-E1 ו-E2.
- יש לשמור את כל הפתרונות מקוררים מראש ב-4°C ולשמור אותם על הקרח במהלך ההליך.
2. תרבות האורגנוידים במעיים
- להקריב עכבר Lgr5-10 שבועות בן 8-10 שבועות Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) על פי הכללים והתקנות הלאומיים.
- לאסוף 5-8 ס"מ של jejunum המקיף את האזור בין התריסריון (5 ס"מ מהקיבה) ואת ileum (10 ס"מ מן cecum) ולשמור על DPBS-P/S קר על קרח.
- נקו את תכולת המעיים על ידי שטיפה עם 5-10 מ"ל של DPBS-P/S קר.
הערה: ניתן להשיג מזרקי שטיפה תוצרת בית על ידי חיבור קצה μL 200 לזרבובית מזרק של 10 מ"ל. - פתח את המעי לאורך באמצעות מספריים קצה כדור (ראה טבלת חומרים) (כדי למנוע נזק לרקמה).
- בעזרת מלקחיים, מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי המכילה DPBS-P/S קר בטמפרטורת החדר ומנערים אותה לשטיפה.
- עם פיפטה פסטר פלסטיק, לתפוס את המעי על ידי שאיפה ולהעביר אותו לתוך צינור 15 מ"ל שכותרתו E1 המכיל 10 מ"ל קר 10 מ"ל 10 מ"מ EDTA.
- הפוך את הצינור 3 פעמים ודגור על קרח במשך 10 דקות.
- באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק, להעביר את הרקמה בצינור F1 המכיל 10 מ"ל DPBS. מערבולת במשך 2 דקות (על מערבולת רגילה, מחזיק את הצינור ביד ומבטיח כי המעי מסתחרר יפה).
- שים 10 μL של השבר בצלחת פטרי ולהעריך את איכות השבר תחת מיקרוסקופ.
הערה: כל שלבי המערבולת מבוצעים במהירות המרבית, ויש להעריך את האיכות של כל שבר תחת המיקרוסקופ (איור 1). - עם פיפטה פסטר פלסטיק, לתפוס את המעי על ידי שאיפה ולהעביר אותו צינור F2 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 2 דקות.
- חזור על שלב 2.10, העברת הרקמה בצינור F3 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 2 דקות.
- חזור על דגירה EDTA כמו בשלב 2.6, העברת הרקמה בצינור E2 המכיל 10 מ"מ EDTA.
- הפוך את הצינור 3 פעמים ודגר על קרח במשך 5 דקות.
- חזור על שלב 2.10, העברת הרקמה בצינור F4 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 3 דקות.
- חזור על שלב 2.14, העברת הרקמה בצינור F5 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 3 דקות.
- חזור על שלב 2.15, העברת הרקמה בצינור F6 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 3 דקות.
- שלב את החלקים הטובים ביותר סינון על ידי כוח הכבידה באמצעות מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל (על קרח) כדי לחסל villi ופסולת משמעותית.
הערה: בדרך כלל, F5 ו- F6 הם השברים המכילים קריפטות רבות ופחות פסולת. - לסובב את הקריפטות ב 150 x g ב 4 °C (50 °F) במשך 3 דקות.
- לרוקן את הצינור, לשבש את הכדור באופן מכני, ולהוסיף 5 מ"ל של DMEM / F12 קר.
- שים 10 μL של ההשעיה בצלחת פטרי ולספור את מספר הקריפטות הקיימות aliquot באופן ידני תחת מיקרוסקופ.
הערה: אין לספור תאים בודדים או פסולת קטנה. - חשב את הנפח (V) של השעיית קריפטות הנדרשת ב- μL, בהתחשב בכך ש - 300 קריפטות מצופות לבאר, W הוא מספר הבארות, ו- N הוא מספר הקריפטות הנספרות מתוך 10 μL של ההשעיה. מעבירים את הקריפטות לצינור חדש של 15 מ"ל.
הערה: V = 300 x W x 10/N. אם נעשה שימוש בנפח קטן בניסוי המתוכנן, ניתן להשתמש בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. - לסובב את הקריפטות ב 200 x g ב 4 °C (65 °F) במשך 3 דקות.
- הסר בזהירות את supernatant באמצעות פיפטה.
- באופן מכני לשבש את הכדור בעדינות להוסיף מדיום תרבות צמיחה כדי לקבל ריכוז של 90 קריפטות / μL.
- הוסף 2 כרכים של BMM לא מדולל כדי לקבל ריכוז סופי של 30 קריפטות / μL. בזהירות פיפטה למעלה ולמטה מבלי להכניס בועות אוויר לתערובת.
הערה: תמיד לשמור את הצינור על קרח כדי למנוע התגבשות BMM. - צלחת 10 μL של קריפטות / BMM לערבב לתוך כל באר. לניתוח ציטומטריית זרימה, השתמשו בלוחות עגולים עם 96 בארות. להפיץ 10 μL במרכז כל גם כמו כיפה. להדמיה, השתמש μ שקופית 8 היטב (ראה טבלת חומרים) ולהפקיד את 10 μL כשכבה דקה.
הערה: צלחת organoids כשכבה דקה עבור בדיקת הדמיה כדי לאפשר הדמיה מעמיקה שלהם. - השאירו את הצלחת במשך 5 דקות ב RT כדי לאפשר את BMM להתמצק. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2 במשך 15 דקות.
- הוסף 250 μL של מדיום צמיחה לתוך כל באר, הקפדה לא לנתק את BMM.
- מניחים את הצלחות באינקובטור ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2.
- בצע את ניתוח ROS בין ימים 4 ו 6 של תרבות. אחרת, לשנות את המדיום ולפצל את organoids לאחר הופעתם של כמה מבנים ניצנים ארוכים וכאשר תאים מתים מצטברים לתוך לומן organoids.
3. אורגנוידים חולפים
- התחל להעביר אורגנוידים מעיים קטנים מהיום השישי של התרבות, כאשר נוצרו מבנים ניצנים משמעותיים, ואת לומן organoids הפכו כהים.
הערה: לומן האורגנויד הופך כהה עקב הצטברות של תאים מתים, פסולת, ריר. הימנע לתת לאורגנוידים לגדול יתר על המידה לפני הפיצול. יחס הפיצול תלוי בצמיחה של האורגנוידים. מומלץ להעביר את האורגנוידים ביחס של 1:2 ביום 6 ו-1:3 ביום 10. - מלא שפופרת 15 מ"ל עם 4 מ"ל של DMEM / F-12 מתקדם קר ולשמור אותו על קרח.
הערה: כאן מסופקים כרכים עבור צלחת תרבות של 96 בארות. אם נעשה שימוש בתבנית אחרת, התאם את עוצמת הקול בהתאם. - בזהירות לשאוף את המדיום עם פיפטה או משאבת ואקום מן הבארות מבלי לגעת כיפות BMM, ולהשליך אותו.
- הוסף 100 μL של DMEM מתקדם קר / F-12 לבאר. פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את BMM ולהעביר את התוכן של הבאר לתוך צינור 15 מ"ל.
- לשטוף את הבאר עם 200 μL קר מתקדם DMEM / F-12 ולאסוף אותו באותו צינור.
הערה: אם עובר בארות מרובות מאותו מצב ניסיוני, התוכן של הבארות יכול להיות משולב באותו צינור איסוף 15 מ"ל. - לסובב את צינור איסוף 15 מ"ל ב 100 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- להשליך את supernatant ולהוסיף 1mL של DMEM / F-12 מתקדם קר לכדור. בעזרת טיפ P1000, קחו טיפ P10 (ללא מסנן) ופיפטה למעלה ולמטה לפחות 20 פעמים.
- הוסיפו לצינור 4 מ"ל של DMEM/F-12 קר ומתקדם. ספין ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 °C.
- שאפו את הסופר-נרטיב עם פיפטה או משאבת ואקום מבלי להפריע לכדור. לאחר מכן, לשבש את הכדור באופן מכני.
- הוסף BMM מדולל במדיום תרבות הצמיחה (יחס 2:1). בזהירות פיפטה למעלה ולמטה מבלי להכניס בועות אוויר לתערובת.
- צלחת 10 μL של קריפטות / BMM לערבב לתוך כל באר.
- שמור את הצלחת במשך 5 דקות ב RT כדי לאפשר BMM להתמצק. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2 במשך 15 דקות.
- הוסף 250 μL של מדיום צמיחה לתוך כל באר.
הערה: היזהרו לא לנתק את ה- BMM. - מניחים את הצלחות באינקובטור ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2.
4. הכנת ריאגנטים וחומרים להערכת עקה חמצונית באורגנוידים במעיים
- הכן פתרון מלאי 250 mM של מעכב N-אצטילציסטאין (NAC) (ראה טבלת חומרים), resuspend 10 מ"ג עם 245 μL של DPBS. יש להשתמש בריכוז סופי של 1 מ"מ.
- הכן פתרון מלאי 50 mM של ממריץ Tert-butyl hydroperoxide (tBHP), 70% במים, לדלל 3.22 μL עם 496.8 μL של DPBS. יש להשתמש בריכוז הסופי של 200 מיקרומטר.
- עבור המחקר cytometry זרימה, להכין פתרון עבודה 250 μM של בדיקה פלואורוגנית (ראה טבלת חומרים) על ידי דילול פתרון המלאי 1/10 ב- DMSO. יש להשתמש בריכוז הסופי של μM 1.
הערה: כפי שצוין בהוראות היצרן, הבדיקה הפלואורוגנית רגישה לאור ולחמצן. מניות ו aliquots לא צריך להיות פתוח וסגור יותר מדי פעמים. - למחקר ההדמיה, הכן פתרון עבודה של 1.25 mM של הבדיקה הפלואורוגנית על ידי דילול פתרון המניה 1/2 ב- DMSO. יש להשתמש בריכוז הסופי של 5 מיקרומטר.
- הכן פתרון סופי של 0.1 מיקרוגרם / mL DAPI ב- DPBS, שישמש לאפליה של תאים מתים בבדיקת הציטומיה של Flow.
- לדלל Hoechst 33342 כדי 1.25 מ"ג / מ"ל ב- DPBS. יש להשתמש בריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל כדי לשמש להכתמה גרעינית בבדיקת ההדמיה.
- חם DMEM ללא אדום פנול ב 37 °C (50 °F).
הערה: שלבים אלה מתארים שימוש בפקדים שליליים וחיוביים שיש לכלול בכל בדיקה, תוך שימוש בתנאים המצוינים באיור 2A. הבדיקה יכולה לשמש לבדיקת תרכובות נוגדות או פרו-חמצון. השלבים זהים, וההבדל היחיד הוא כאשר התרכובות מתווספות לפני השימוש בצבע פלואורוגני.
5. הדמיה של עקה חמצונית באורגנוידים תלת-ממדיים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית
- קח את organoids מצופה μ-שקופית 8 היטב תאים ולהוסיף 1 μL NAC מלאי פתרון בבארות המתאימות כדי לקבל ריכוז סופי של 1 מ"מ.
- דגירה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
- הוסף 1 μL tBHP פתרון מלאי בבארות המתאימות כדי לקבל ריכוז סופי של 200 מיקרומטר.
- דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2.
- הוסף 1 μL לכל באר של דילול 1.25 מ"מ של בדיקה פלואורוגנית כדי לקבל ריכוז סופי של 5 מיקרומטר.
- הוסף 1 μL לכל באר של 1.25 מ"ג / מ"ל דילול של Hoescht כדי לקבל ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל.
- דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2.
- הסר את המדיום מבלי להפריע ל- BMM. בעדינות, להוסיף 250μL של DMEM חם ללא אדום פנול.
הערה: אם מתוכננת רכישה ארוכת טווח, הוסף תרכובות גורמי גדילה ל- DMEM ללא אדום פנול. - דמיינו את האורגנוידים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בתא תרמי ובאספקת גז המזהה את הגשוש הפלואורוגני (ROS).
הערה: עירור / פליטה (ex /em) עבור בדיקה פלואורוגנית הוא 644/665, ex /em עבור Hoechst (גרעינים) הוא 361/486, ו ex /em עבור GFP (תא גזע מעיים מעכברי Lgr5-GFP) הוא 488/510. מטרת טבילת שמן 63x משמשת לזיהוי אותות בתאי גזע. אל תשנה הגדרות לייזר בין דגימות. ניתן להשתמש במטרה של 20x כדי לאפשר מבט כולל על ייצור ROS. - השתמש בפקד החיובי כדי להגדיר את עוצמת הלייזר ואת חשיפת הזמן עבור אות ROS ולבדוק כי אות זה נמוך יותר בפקד השלילי.
- באמצעות מסך העיניים השקופית כדי לזהות את האורגנוידים GFP המבטאים ולהתאים את עוצמת הלייזר.
הערה: שלב זה מבוצע באופן ידני. - הגדר עמדות כדי לקבל תמונה תפורה של האורגנויד כולו. הגדר z-stack של 25 מיקרומטר (גודל שלב 5 מיקרומטר) כדי לקבל קטע של organoids מראה שכבה אחת של תאים.
הערה: עיין במדריך למשתמש של המיקרוסקופ כדי למטב את ההתקנה. באמצעות תאים חיים, הרכישה צריכה להיעשות בתוך 1 שעות לאחר סיום הדגירה. - פתח את התמונות בתוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח (ראה טבלת חומרים).
- עבור דרך z-stack ובחר את המקטע שבו אמצע organoids מיוצג היטב וליצור תמונה חדשה עם האזור שנבחר.
- כימת את התמונות לפי שלבים 5.15.1 - 5.15.5.
- בחרו בכלי קו חופשי.
- צייר קו בעקבות הגרעינים.
הערה: בחר רק אזורים המציגים תאים חיוביים ל- GFP אם רק תאי גזע מנותחים. - הגדל את רוחב הקו כדי לכסות את שכבת התא בקו מבלי לכלול את הפסולת הזוהרת.
- בחר את הערוץ עבור אות ROS ומדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות באזור שנבחר וביאור הערכים.
- צייר קו שבו אין אות ומדוד את עוצמת הפלואורסצנט של הרקע שיופחת לערך הקודם כדי לקבל את העוצמה הסופית.
6. כימות הלחץ החמצוני על האורגנוידים המנותקים באמצעות ציטומטר זרימה
- הוסף 1 μL NAC פתרון מניות בבארות עבור פקדים שליליים כדי לקבל ריכוז סופי של 1 מ"מM.
הערה: השתמשו באורגנוידים מצופים בלוחות העגולים עם 96 הבאר. - דגירה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
- הוסף 1 μL tBHP פתרון מלאי בבארות המתאימות כדי לקבל ריכוז סופי של 200 מיקרומטר.
- דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2.
- בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הסירו את המדיום מבלי להפריע ל-BMM המצורף והעבירו אותו לצלחת תחתונה עגולה נוספת של 96 בארות. שמור את הצלחת הזאת בצד.
- הוסף 100 μL של טריפסין, ועם פיפטה רב ערוצית, פיפטה למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים כדי להרוס את BMM.
- דגירה במשך לא יותר מ 5 דקות ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2.
- עם פיפטה רב ערוצית, פיפטה למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים כדי לנתק את האורגנוידים.
- ספין ב 300 x g במשך 5 דקות ב RT.
- להשליך את supernatant על ידי היפוך הצלחת. הוסף בחזרה את המדיום שנאסף בשלב 6.3 לבארות המתאימות והחזר את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה 5 פעמים.
- מוסיפים את הבדיקה הפלואורוגנית בריכוז הסופי של 1 מיקרומטר. מוסיפים 1 μL לבאר מדילול 250 מיקרומטר ודגרה במשך 30 דקות ב 37 °C (37 °F) ו 5% CO2.
הערה: אל תוסיפו את הבדיקה הפלואורוגנית לבארות הדרושות להגדרות המכשיר (איור 2B). - ספין ב 300 x g במשך 5 דקות ב RT.
- Resuspend התאים עם 250 μL של 0.1 מיקרוגרם / mL פתרון DAPI. העבר את הדגימות בצינורות הציטומטריה הנכונים של Flow, שמור את הצינורות על הקרח, והמשיך בניתוח.
הערה: הוסף/י PBS במקום DAPI לבארות הדרושות להגדרות המכשיר (איור 2B). - מטב את הגדרות מתח הפיזור קדימה וצד על שליטה לא מוכתמת ומתחי לייזר עבור כל פלואורופור באמצעות דגימות מוכתמות מונו.
- באמצעות אסטרטגיית gating מתאימה (איור 4A), לאסוף מינימום של 20,000 אירועים.
הערה: 50,000 אירועים עדיפים. הגדרות רכישה מפורטות משתנות בהתאם למכשיר שבו נעשה שימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כהוכחה לרעיון של הפרוטוקול המתואר, הקריפטות שהתקבלו מקו העכבר Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 שימשו שבו תאי גזע מעיים מציגים ביטוי GFP פסיפס, אשר הוקם על ידי בארקר ואח ', כדי לאפיין תאי גזע מעיים10 בתחילה ולאפשר למפות תאים אלה בהתבסס על ביטוי GFP שלהם. מודל מסופק ובכך להשוות את רמות ROS באוכלוסיית סוג תא ספציפי על טיפולים שונים. מעכב ROS (NAC) שימש, וממריץ (tBHP), ידוע לפעול על ROS הסלולר כדי לדמיין שינויים ברמות שלהם.
איורים 1A ו - 1B מציגים תמונות מייצגות של שברים F1 ו- F4 שהושגו במהלך הליך החילוץ של הקריפטות לתרבות האורגנויד במעיים. כל שבר חייב להיבדק תחת מיקרוסקופ או משקפת במהלך הליך החילוץ כדי לעקוב אחר ניתוק קריפטות ולהגדיר את אותם שברים מועשרים בקריפטות, ולא villi, תאים בודדים, או פסולת. לאחר מכן, השברים הנבחרים מתאחדים ומועברים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר את כל שברי הווילי הנותרים ולקבל הכנה עם קריפטות בלבד (איור 1C). הקריפטות מתחילות להיסגר תוך שעות ספורות מההטבעה ב-BMM, וב-D1 נצפו אורגנוידים עגולים (איור 1D). לאחר 3-5 ימים, האורגנוידים יופיעו עם מבנים ניצנים המייצגים את "הקריפטות החדשות שנוצרו". האורגנוידים מוכנים לניתוח ROS (איורים 1E ו - 1F).
בפרוטוקול של דימות עקה חמצונית על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, השקופית המכילה את האורגנוידים, דגירה עם הגשושית, צולמה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי המצויד בלייזרים ומסננים כדי לזהות את ההוכשט (לשעבר/ אם: 361/486), GFP (לשעבר / em: 488/510) ואת הבדיקה הפלואורוגנית (לשעבר / em): 644/665) אותות. מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד באוויר 20x ומטרת טבילת שמן 63x אפשר הדמיה של ROS. בעכברים Lgr5-GFP, התאים החיוביים GFP הם תאי גזע מעיים המבטאים Lgr5. איור משלים 1 מציג תמונות מייצגות שהושגו במטרה 20x ומספק סקירה כללית של ROS במספר אורגנוידים. איור 3 מציג תמונות מייצגות, שהושגו עם מטרת שמן פי 63, של אורגנוידים במעיים המבטאים GFP, שאינם מטופלים (NT), או דגירה מראש או לא עם מעכב ROS NAC, ומעוררים או לא במשך 30 דקות עם tBHP ממריץ ROS.
בנוכחות המדכא, האות היחיד מהתאים המתים הכלולים בלומן של האורגנויד נראה לעין. באורגנויד שאינו מטופל, מוצגות רמות ה- ROS הבסיסיות, המוכיחות כי תאי גזע מייצרים ROS גבוה יותר מאשר תאים מובחנים (על פי הגדרות המיקרוסקופ, אות ROS עשוי גם להיות דמיינו בתאים שאינם גזע). תאים חיוביים GFP מציגים אות ציטופלסמי משמעותי יותר עם הממריץ בנוכחות הגשוש הפלואורוגני, המוכיח כי רמות ROS להגדיל במיוחד בתאי גזע לאחר הטיפול.
איור 4 מראה תוצאות מייצגות שהושגו בעת ניתוח ייצור ROS באורגנוידים במעיים מגורה או לא עם מעכב ROS או ממריץ, באמצעות cytometer Flow המצויד 405 ננומטר, 488 ננומטר, 630 ננומטר, ו 630 ננומטר לייזרים. אסטרטגיית הגיטינג המוצגת באיור 4A מאפשרת להעריך את ייצור ה-ROS ברמה של כל אוכלוסיית תאי האורגנוידים, ומגדירה תאים שלמים וחיים על סמך פרמטרים פיזיים ואי-הכללת DAPI (SSC-A לעומת FSC-A ו-DAPI לעומת FSC-A) ו-FSC-H לעומת FSC-A) או רק בתאי הגזע במעיים, מגודרים עוד יותר בתאים עם אות גבוה של GFP. איור 4B מציג את רמות ROS באוכלוסייה הכוללת באיסוף של 50,000 אירועים. רמות ROS בזאלי בתאים שאינם מטופלים (NT) להקטין לאחר גירוי עם המעכב (NAC), ולהיפך, להגדיל לאחר אתגר עם התמריץ (tBHP). תאים שטופלו מראש עם המדכא ולאחר מכן מגורה עם התמריץ להציג רמה נמוכה יותר מאשר אלה מגורה עם התמריץ לבד. לאחר מכן נותחו התוצאות באמצעות תוכנה מתאימה, תוך קבלת העוצמה הפלואורסצנטית החציונית (MFI). הערכים המתקבלים מוצגים כיחס על פני התאים שאינם מטופלים, כפי שמוצג בגרף המוצג מימין לאיור 4B. איור 4C מציג את אותם פרמטרים המתוארים באיור 4B בתאי הגזע, מגודרים כתאים חיוביים GFP, המציגים ירידה של פי 3.5 ברמת ה-ROS בעת טיפול ב-NAC ועלייה של פי 4 בטיפול ב-tBHP על פני תאים שאינם מגורים. תוצאה זו מדגימה כי בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לכמת את ההבדלים ברמות ROS ברמה של כל אוכלוסיית התאים או בתאי גזע חיוביים GFP על הטיפול שלהם organoids עם תרכובות ספציפיות.
איור 1: תמונות מייצגות של קריפטות ואורגנוידים. (A) דוגמה לשבר F1 שהושג לאחר הדגירה הראשונה עם EDTA, מועשר בוילי (ריבוע), עם כמה פסולת (כוכב) וקריפטות (מעגל). (ב) דוגמה לשבר F4 מועשר בקריפטות. (ג) השעיה המציגה רק קריפטות מבודדות שהושגו לאחר הסינון עם מסננת תאים של 70 מיקרומטר (סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר). (D, E ו- F). אורגנוידים טיפוסיים הושגו לאחר 1, 3, ו 5 ימים בהתאמה, לאחר הטמעת הקריפטות ב- BMM (סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מתווה התוכנית הניסיונית. (A) תנאים המשמשים בפרוטוקול זה הכלולים בכל ניסוי: בארות שאינן מטופלות (NT), בארות שטופלו במעודדים (tert-Butyl hydroperoxide - tBHP), בארות שטופלו במעכבים (N-אצטיל ציסטאין - NAC), ובארות שטופלו במעכבים וממריצים (NAC-tBHP). (B) תבנית צלחת עבור בדיקת ציטומטריית הזרימה. כל תנאי מצופה במשולש (קו A). קווים B, C ו- D כוללים בארות להגדרת ציטומטר זרימה עם בדיקה פלואורוגנית בלבד, רק דגימות DAPI או דגימות לא מוכתמות (NS). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות קונפוקליות מייצגות של כתמי ROS באורגנוידים. תמונות תפורות התקבלו עם מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במצלמת EMCCD במהירות גבוהה, מטרת שמן 63x/1.4, וחריצים של 35 מיקרומטר, באמצעות לייזרים 405, 488, 640 ומסננים 460/50, 535/50, 700/75 לרכישת הוכשסט, GFP והגשוש הפלואורוגני בהתאמה. חלקים אופטיים קונפוקליים של organoids לא מטופלים (NT), מטופלים עם מעכב ROS (NAC), עם ROS-inducer (tBHP), או מטופלים מראש עם מעכב ROS ולאחר מכן מגורה עם ROS-inducer (NAC-tBHP). באפור, גרעינים מוכתמים בהוכשט; בתאי Lgr5-GFP ירוקים; באדום, בדיקה פלואורוגנית (סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח ציטומטריית זרימה מייצגת של ROS בתאים שמקורם באורגנוידים. (A) ייצוג סכמטי של אסטרטגיית ההצטברות המשמשת בניתוח ציטומטריית זרימה: gating עבור צורת התא (אי הכללה של תאים מתים ופסולת שנצברו בלומן organoids), gating עבור תאים חיים (תאים שאינם משלבים DAPI-לייזר 405), gating עבור תאים בודדים (אפליה כפולה), ותאי גזע (GFP תאים חיוביים-לייזר 488) (FSC: פיזור קדימה, SSC: פיזור צד). אות ROS נרכש באמצעות לייזר 630. (ב) בצד שמאל, היסטוגרמה הושגו עם תוכנה מתאימה המציגה את אותות ROS האינטנסיביים עבור האוכלוסייה החיה הכוללת (לאחר gating סביב 10,000 אירועים לכל מצב) בדגימות השונות NT: לא מטופלים; NAC: מעכב מטופל; tBHP בטיפול ממריץ; NAC-tBHP: מעכב- ומטופל על ידי ממריץ. מימין, דוגמה אופיינית ליחס המחושב עבור ערכי MFI על פני דגימות NT שהושגו במהלך ניסוי החל מ- 3 דגימות לכל תנאי (ממוצע ± SD) (*** P = 0.0003). (ג) זהה ל- B עבור האוכלוסייה החיובית GFP (1,000 אירועים למצב) (* P = 0.02). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: תמונות קונפוקליות מייצגות של כתמי ROS באורגנוידים. images תפור הושגו עם מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד מצלמת EMCCD במהירות גבוהה, מטרה 20x, חריץ 35 מיקרומטר, באמצעות לייזרים 405, 488, 640, ומסננים 460/50, 535/50, 700/75 לרכוש Hoechst, GFP, ו בדיקה פלואורוגנית בהתאמה. חלקים אופטיים קונפוקליים של organoids לא מטופלים (NT), מטופלים עם מעכב ROS (NAC), עם ROS-inducer (tBHP), או מטופלים מראש עם מעכב ROS ולאחר מכן מגורה עם ROS-inducer (NAC-tBHP). באפור, גרעינים מוכתמים בהוכשט; בתאי Lgr5-GFP ירוקים; בגשוש אדום, פלואורוגני (סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבודה זו מספקת פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לבודד קריפטות jejunal murine, תרבית אותם לתוך organoids 3D, ולנתח ROS organoids על ידי שילוב בדיקה פלואורוגנית רגישה ROS עם הדמיה מיקרוסקופית איכותית של organoids שלמים ומדידת ROS כמותית באמצעות cytometry זרימה על תאים בודדים בעקבות דיסוציאציה organoid.
הצעד הקריטי הראשון בשיטה זו הוא הליך החילוץ קריפטות. אכן, איכות הכנת הקריפטות היא המפתח להיווצרות אורגניואידים מוצלחת. לכן חיוני להשיג שברים עם קריפטות מועשרות ומעט פסולת תאית או תאים גוססים. הקריפטות עשויות להימצא בשברים שונים לאלה המצוינים בפרוטוקול, שכן הדיסוציאציה עשויה להשתנות בהתאם לגיל ולמצב הבריאותי של העכבר. ניתן לשנות בהתאם את מספר הדגירה של EDTA. אם קריפטות לא נראה להתנתק לאחר שבר 4, דגירה EDTA 3 דקות צריך לחזור על עצמו. לעומת זאת, נניח שקריפטות כבר מתנתקות לאחר הדגירה הראשונה של EDTA. במקרה זה, הדגירה השנייה של EDTA עשויה שלא להיות נחוצה, ואת צעדי המערבולת הרציפה ב- DPBS צריך להיעשות עד שברים מתקבלים עם מספיק קריפטות ללא פסולת. אם לא מתרחש ניתוק, ודא ש- DPBS ללא Ca2+ ו- Mg2+ משמש להכנת צינורות האיסוף, והחלף את EDTA בפתרון חדש. קריפטות הן מבנים שבירים, ולכן הם צריכים להישמר ככל האפשר על קרח מצופה במהירות לאחר הבידוד.
צלחות שונות ונפחי טיפה עשויים לשמש לטפח organoids. לדוגמה, קריפטות ניתן גם מצופה ב 24 או 48 צלחות היטב לאחר התאמת ריכוז הקריפטות, את נפח טיפת BMM, ואת המדיום הוסיף בכל באר. טיפות מרובות עשויות להיות מצופות באותה באר בצלחת של 12 או 6 בארות. בדרך כלל, קריפטות להקטין בגודל לעגל כלפי מעלה כדי ליצור organoids עגול קטן ביום 1 של התרבות. היווצרות של ניצנים חדשים יש לראות 2-3 ימים לאחר הציפוי.
לחקר שינויים ברמות ROS בתאי גזע מעיים, היתרון של קו העכבר Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 נלקח. אזהרה של מודל זה היא ההשתקה הסלקטיבית של האלל הדפוק והפסיפסיות הנובעת מכך של הביטוי GFP, אשר יכול להיעדר טלאים של תאי גזע או קריפטות שלמות. במהלך פרוטוקול ההדמיה, לא כל האורגנוידים יציגו תאי גזע המבטאים GFP; לכן, לא כל organoids ייחשב אלא אם כן ניתן להסתמך על המיקום המרחבי של התאים. במקום זאת, יש לקחת זאת בחשבון בעת ניתוח אוכלוסיית התאים השליליים של GFP בפרוטוקול ציטומטריית זרימה. ואכן, מכיוון שאי אפשר להסתמך על העמדה המרחבית, האוכלוסייה השלילית GFP תורכב מתאי גזע שאינם תאי גזע ותאי גזע שליליים GFP.
כאן מסופק פרוטוקול להערכה איכותית של ROS באורגנוידים מעיים. היבט קריטי עבור חלק זה קשור למרחק העבודה של המטרות המשמשות. האורגנוידים גדלים ב- BMM; הם אינם מחוברים לתחתית הבאר, ומציגים מרחק מתוכנית המיקוד האובייקטיבית. מסיבה זו, זה קריטי כדי צלחת organoids בשכבה דקה של BMM, כדי למזער את הבעיה. אפילו בהגדרה ממוטבת זו, לא כל האורגנוידים יהיו במצב הנכון להיות בתמונה נאותה.
ניתוח כמותי של התמונות עשוי להיעשות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מתאימה, תוך הערכת העוצמה הפלואורסצנטית הממוצעת של התמונות בערוץ האות ROS כמתואר בפרוטוקול. לשם כך, יש צורך לרכוש מספר גבוה של תמונות כדי לקבל מספר מספיק של אירועים כדי להיות משמעותי מבחינה סטטיסטית. כפי שהוזכר קודם לכן, באמצעות עכברי Lgr5-GFP, לא כל organoids יבטא GFP, הדורש מספר ניכר של דגימות להיות בתמונה.
במהלך הליך ציטומטריית הזרימה, צעד קריטי הוא דיסוציאציה של האורגנוידים לתאים בודדים. אם הניתוק קשה מדי, תאים עלולים למות ולשחרר דנ"א. מעכב סלע, Y-27632, כדי לנטרל אנויקי, ו- DNAse עשוי להתווסף למאגר הדיסוציאציה אם הם לא יפריעו למסלול הנחקר. ניתן להשתמש בדילול טריפסין או זמני דגירה מופחתים.
לבסוף, זה חיוני כדי להגדיר את נקודת הזמן הטובה ביותר כדי לנתח את ייצור ROS לאחר הטיפולים השונים (אנטי או פרו חמצון) נבדק. במקרה של תרופות שגורמות במהירות ROS בתוך דקות או שעות, בדיקת הדמיה ניתן להשתמש כדי לקבוע מתי יש אינדוקציה מקסימלית על ידי הוספת הבדיקה fluorogenic לפני התרכובות שנבדקו. עוצמת הפלואורסצנטיות של הגשושית לאחר גירוי organoids עשויה להשתנות בין ניסויים שבוצעו בימים שונים. לכן, זה חיוני תמיד כדי לחשב את היחס עם דגימות שאינן מגורה ולהוסיף פקדים (חמצון / נוגד חמצון) כדי לאמת את התגובה של הבדיקה. NAC ו- tBHP שימשו כפקדים שליליים וחיוביים כפי שהם נתנו את התוצאות הסופיות ביותר. עדיין, ריאגנטים אחרים עשויים לשמש, כגון רזברטרול כנוגד חמצון או paraquat/menadione כמו חמצון. תאי הדגירה במשך זמן רב מדי עם הבדיקה הפלואורוגנית עשויים להיות רעילים ואפילו לשנות את מאזן redox התא, ולכן זמני הדגירה חייבים גם להיות נשלטים היטב. תאים מוכתמים בגשוש עשויים להיות קבועים ומנותחים כמה שעות לאחר מכן. במקרה זה, עבור ניתוח cytometry הזרימה, DAPI לא יכול להפלות בין תאים חיים ומתים. במקום זאת, יש להשתמש בצבע ניתן לתיקון לאפליה חיה/מתה לפני הקיבעון.
Organoids עשוי גם לגדול במשך מספר ימים (יותר מ 7), אבל זה יגדיל את מספר תאים חיים ושגשוגים ואת התאים המתים המצטברים לומן organoids, יצירת רקע גבוה, במיוחד בבדיקת הדמיה. אם נצפתה עלייה חריגה באות הבדיקה הפלואורוגני, ודא כי הפתרון המשמש לחידוש תרכובות מגרה אינו פרו חמצון כשלעצמו (כלומר, אתנול).
דאגה אחת שיש לקחת בחשבון בעת השימוש בפרוטוקול זה היא כי הדמיה חיה ופירוק תאים ואחריו cytometry זרימה עלול לגרום עקה חמצונית בתאים וליצור אות רקע. קיבוע של organoids עשוי להיחשב על פי הניסוי. מגבלה נוספת נובעת מהקושי בהדמיה מעמיקה של אורגנוידים הגדלים במטריצה תלת-ממדית. כפי שצוין בפרוטוקול, יש להפיץ את ה- BMM בשקופית כשכבה דקה כדי להגביל היבט זה.
כאן, הפרוטוקול מתוכנן באמצעות צבע פלואורוגני זמין מסחרית. היתרון העיקרי שלה הוא התאימות שלה עם כתמים מרובי צבעים של organoids, כך סוגי תאים ספציפיים. לדוגמה, כתמי נוגדנים עבור סמני פני התא מיד לאחר הדגירה הגשושית הפלאורוגנית עשויים להיעשות כדי לזהות תת-סוגים מסוימים. עם זאת, הבדיקה אינה ספציפית למין ROS ספציפי כפי שהוא יכול לזהות Superoxide, ניטריט מי חמצן, ומי חמצן11,12,13. מסיבה זו, הוא משמש בדרך כלל כדי לזהות עקה חמצונית גלובלית. למרות ממוסחר כגשוש ציטוסולי בלבד, ניתן היה למצוא את הבדיקה הפלואורוגנית שנבחרה כדי להגיע למיטוכונדריה14. מכיוון שהספציפיות שלו יכולה להשתנות בין הקשרים תאיים שונים, אנו מציעים להשתמש בגישות משלימות אחרות כדי למדוד ROS במידת האפשר. צבעים חלופיים כגון בדיקות ספציפיות כדי לזהות אניוני סופראוקסיד שנוצר מיטוכונדריה יכול לשמש10. רפרטואר של בדיקות chemiluminescent פותח גם כדי לזהות מינים ROS ספציפיים עם רגישות גבוהה, כגון בדיקות מבוססות לוציפרין15,16. אלה יש את היתרון של להיות תואם עם הדמיה vivo אבל לא ניתן להשתמש כדי למפות ייצור ROS עם סוגי תאים ספציפיים. לבסוף, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על סוגים אחרים של organoids, למשל, organoids המעי הגס נגזר ביופסיות אנושיות. במקרה זה, יש להתאים את מדיום הצמיחה התרבותית בהתאם17. כדי לנתח עוד יותר את מכונות redox בתוך תאי מעיים, אורגנוידים תרבות ונהלי דיסוציאציה המתוארים בפרוטוקול זה ניתן לשלב עם גישות transcriptomic ו proteomic על organoids שלמים או פלואורסצנטיות מופעל תא ממוין (FACS) אורגנוידים תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
