Summary
Настоящий протокол описывает способ обнаружения активных форм кислорода (АФК) в органоидах кишечного мыша с использованием качественной визуализации и количественных анализов цитометрии. Эта работа может быть потенциально распространена на другие флуоресцентные зонды для проверки влияния выбранных соединений на АФК.
Abstract
Активные формы кислорода (АФК) играют важную роль в кишечном гомеостазе. АФК являются естественными побочными продуктами клеточного метаболизма. Они производятся в ответ на инфекцию или травму на уровне слизистой оболочки, поскольку они участвуют в антимикробных реакциях и заживлении ран. Они также являются критическими вторичными мессенджерами, регулирующими несколько путей, включая рост и дифференцировку клеток. С другой стороны, чрезмерные уровни АФК приводят к окислительному стрессу, который может быть вредным для клеток и способствовать кишечным заболеваниям, таким как хроническое воспаление или рак. Эта работа обеспечивает простой метод обнаружения АФК в органоидах кишечных мышей с помощью живой визуализации и проточной цитометрии с использованием коммерчески доступного фторогенного зонда. Здесь протокол описывает анализ влияния соединений, которые модулируют окислительно-восстановительный баланс в кишечных органоидах и обнаруживают уровни АФК в определенных типах клеток кишечника, примером чего является анализ кишечных стволовых клеток, генетически меченных GFP. Этот протокол может использоваться с другими флуоресцентными зондами.
Introduction
Активные формы кислорода (АФК) являются естественными побочными продуктами клеточного метаболизма. Они также могут активно продуцироваться специализированными ферментативными комплексами, такими как мембранно-связанные NADPH-оксидазы (NOX) и двойные оксидазы (DUOX), которые генерируют супероксид анион и перекись водорода1. Экспрессируя антиоксидантные ферменты и поглотители АФК, клетки могут тонко настраивать свой окислительно-восстановительный баланс, тем самым защищая тканевый гомеостаз2. Хотя АФК может быть очень токсичным для клеток и повреждать ДНК, белки и липиды, они являются важнейшими сигнальными молекулами2. В кишечном эпителии для пролиферации стволовых и прогениторных клеток требуются умеренные уровни АФК3; высокие уровни АФК приводят к их апоптозу4. Хронический окислительный стресс связан со многими желудочно-кишечными заболеваниями, такими как воспалительные заболевания кишечника или рак. Например, в мышиной модели Wnt-управляемого рака кишечника было обнаружено, что повышенная продукция АФК посредством активации NADPH-оксидаз необходима для гиперпролиферации раковых клеток5,6. Определение того, как кишечные клетки, в частности стволовые клетки, стволовые клетки управляют окислительным стрессом и как клеточная среда может влиять на эту способность, имеет важное значение для лучшего понимания этиологии этого заболевания7.
В ткани различные типы клеток представляют базальное окислительное состояние, которое может варьироваться в зависимости от их функции и метаболизма, а также экспрессии различных уровней молекул окислителя и антиоксиданта4,7. Мониторинг ROS in vivo очень сложен. Клеточные проницаемые красители, которые излучают флуоресценцию в соответствии с их окислительно-восстановительным состоянием, были разработаны для визуализации и измерения клеточного АФК в живых клетках и животных. Однако их эффективность зависит от их диффузии внутри живых тканей и их быстрого считывания, что затрудняет их использование на животных моделях8.
В прошлом изучение влияния соединений на генерацию АФК проводилось с использованием клеточных линий, но это может не отражать ситуацию in vivo . Кишечная органоидная модель, разработанная группой Clevers9, обеспечивает рост первичных клеток кишечника ex vivo. Культивирование кишечных крипт в матрицах, в присутствии определенных факторов роста, приводит к трехмерным структурам, называемым органоидами (мини-кишечник), которые воспроизводят крипто-ворсинчатую организацию, с клетками из разных эпителиальных линий, выстилающих внутренний просвет, и кишечными стволовыми клетками, находящимися в небольших криптоподобных выступах.
Здесь, используя преимущества этой модели, описан простой метод изучения окислительного стресса в первичных клетках кишечника с одноклеточным разрешением путем добавления коммерчески доступного АФК-чувствительного красителя в органоидную культуральную среду.
Пластинчатые считыватели часто используются для обнаружения производства АФК в общей популяции. Этот протокол использует проточную цитометрию или визуальный анализ для обнаружения АФК в определенном типе клеток с генетически модифицированными клетками или специфическим окрашиванием антител. Эта работа включает в себя культуру органоидов кишечника мышей и визуализацию АФК путем конфокальной визуализации и количественной оценки с помощью проточной цитометрии. Используя органоиды тонкого кишечника, полученные от мышей Lgr5-GFP, можно специально проанализировать уровень окислительного стресса в кишечных стволовых клетках при различных методах лечения. Этот протокол может быть адаптирован для проверки влияния экзогенных молекул, таких как мурамил-дипептид (MDP)10, полученных из микробиоты, на баланс АФК, после стимуляции органоидов выбранными соединениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились после одобрения Комитетом по использованию Института Пастера и Министерством сельского хозяйства Франции No 2016-0022. Все этапы выполняются внутри вытяжки для культивирования тканей.
1. Подготовка реагентов и материалов для культивирования органоидов кишечника
- Для приготовления питательной среды смешайте усовершенствованный DMEM/F-12 с добавлением 1x глутамина, 1x раствора пенициллина/стрептомицина (P/S), 10 мМ HEPES, 50 нг/мл мышиного EGF, 20 мкг/мл мышиного Noggin 500 нг/мл мышиного R-Spondin1 (см. Таблицу материалов). Оставьте среду при комнатной температуре (RT) во время извлечения крипты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Заморозьте неиспользованную среду в аликвотах при -20 °C. Избегайте замерзания и оттепели. - Заполните 50 мл трубки 40 мл Advanced DMEM/F-12 и держите ее на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите неиспользуемую среду при температуре 4 °C. Он будет использоваться для пассирования органоидов. - Предварительно прогрейте пластины для культивирования клеток (μ-Slide 8 и/или 96-луночных круглых дна) в инкубаторе при 37 °C.
- Оттаивание базальной мембранной матрицы (БММ) (см. Таблицу материалов) аликвот на льду (перед началом протокола или не менее чем за 1 ч до обшивки крипт).
ПРИМЕЧАНИЕ: BMM быстро затвердеет, если его не держать холодным. - Готовят раствор для промывки/промывки, добавляя 1% раствор пенициллина-стрептомицина в DPBS (DPBS-P/S).
- Наполните 100-миллиметровую чашку Петри 10 мл холодного DPBS-P/S. Наполните шесть трубок по 15 мл 10 мл DPBS и пометьте их от F1 до F6.
- Готовят 30 мл раствора ЭДТА 10 мМ путем разведения из 0,5 М ЭДТА в DPBS. Заполните две трубки по 15 мл 10 мл 10 мМ ЭДТА и нанесите на них метки E1 и E2.
- Держите все растворы предварительно охлажденными при 4°C и держите их на льду во время процедуры.
2. Культура органоидов кишечника
- Принесите в жертву 8-10-недельную мышь Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) в соответствии с национальными правилами и нормами.
- Соберите 5-8 см тощей кишки, охватывающей область между двенадцатиперстной кишкой (5 см от желудка) и подвздошной кишкой (10 см от слепой кишки) и держите в холодном состоянии DPBS-P/S на льду.
- Очистите кишечное содержимое, промыв 5-10 мл холодного DPBS-P/S.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самодельные промывочные шприцы можно получить, подключив наконечник объемом 200 мкл к соплу шприца объемом 10 мл. - Вскрывайте кишечник продольно с помощью шариковых ножниц (см. Таблицу материалов) (для предотвращения повреждения тканей).
- С помощью щипцов перенесите ткань в чашку Петри, содержащую холодный DPBS-P/S комнатной температуры, и встряхните ее для смывания.
- С помощью пластиковой пипетки Пастера захватите кишечник путем аспирации и перенесите его в 15 мл трубки с маркировкой E1 , содержащую 10 мл холодного 10 мМ ЭДТА.
- Переверните трубку 3 раза и высиживайте на льду в течение 10 мин.
- Используя пластиковую пипетку Пастера, перенесите ткань в пробирку F1 , содержащую 10 мл DPBS. Вихрь в течение 2 мин (на обычном вихре, держа трубку вручную и следя за тем, чтобы кишечник хорошо закручивался).
- Поместите 10 мкл фракции в чашку Петри и оцените качество фракции под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все вихревые этапы выполняются на максимальной скорости, и качество каждой фракции должно оцениваться под микроскопом (рисунок 1). - С помощью пластиковой пипетки Пастера захватывают кишечник путем аспирации и переносят его в трубку F2 , содержащую 10 мл DPBS и вихрь в течение 2 мин.
- Повторите этап 2.10, перенеся ткань в пробирку F3 , содержащую 10 мл DPBS и вихрь в течение 2 мин.
- Повторяют инкубацию ЭДТА, как на стадии 2.6, перенося ткань в пробирку Е2 , содержащую 10 мМ ЭДТА.
- Переверните трубку 3 раза и высиживайте на льду в течение 5 мин.
- Повторите этап 2.10, перенеся ткань в пробирку F4 , содержащую 10 мл DPBS и вихрь в течение 3 мин.
- Повторяют этап 2.14, перенося ткань в пробирку F5 , содержащую 10 мл DPBS и вихрь в течение 3 мин.
- Повторяют шаг 2.15, перенося ткань в пробирку F6 , содержащую 10 мл DPBS и вихрь в течение 3 мин.
- Объедините лучшие фракции, фильтрующиеся под действием силы тяжести через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм, в трубку объемом 50 мл (на льду), чтобы устранить ворсинки и значительный мусор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно F5 и F6 являются фракциями, содержащими многочисленные крипты и меньше мусора. - Вращайте крипты при 150 х г при 4 °C в течение 3 мин.
- Опорожните трубку, механически разрушите гранулу и добавьте 5 мл холодного DMEM/F12.
- Поместите 10 мкл суспензии в чашку Петри и подсчитайте количество крипт, присутствующих в аликвоте, вручную под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не считайте одиночные ячейки или мелкий мусор. - Рассчитайте объем (V) суспензии крипт, необходимый в мкл, учитывая, что на скважину наносится 300 крипт, W — количество скважин, а N — количество склепов, исчисляемых из 10 мкл суспензии. Перенесите склепы в новую трубку объемом 15 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: V = 300 x Ш x 10/N. Если в планируемом эксперименте используется небольшой объем, можно использовать центрифужную трубку объемом 1,5 мл. - Вращайте крипты при 200 х г при 4 °C в течение 3 мин.
- Осторожно удалите супернатант с помощью пипетки.
- Механически разрушают гранулу и осторожно добавляют питательную среду для получения концентрации 90 крипт/мкл.
- Добавьте 2 тома неразбавленного BMM, чтобы иметь конечную концентрацию 30 крипт /мкл. Осторожно пипетку вверх и вниз, не вводя пузырьки воздуха в смесь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите трубку на льду, чтобы избежать затвердевания BMM. - Пластина 10 мкл крипт/БММ смешивается с каждой лункой. Для анализа проточной цитометрии используйте круглодонные 96-луночные пластины. Распределите 10 мкл в центре каждой скважины в виде купола. Для визуализации используйте μ-слайд 8 скважины (см. Таблицу материалов) и нанесите 10 мкл в виде тонкого слоя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесите органоиды в виде тонкого слоя для анализа визуализации, чтобы обеспечить их углубленную визуализацию. - Оставьте пластину на 5 минут при RT, чтобы BMM затвердел. Поместите пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2 в течение 15 мин.
- Добавьте 250 мкл питательной среды в каждую лунку, следя за тем, чтобы не отсоединить BMM.
- Поместите пластины в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
- Выполните анализ ROS между 4 и 6 днями культуры. В противном случае изменяют среду и расщепляют органоиды после появления нескольких и длинных почковых структур и при накоплении отмерших клеток в просвет органоидов.
3. Пассаж органоидов
- Начинают проходить тонкокишечные органоиды с 6-го дня культивирования, когда сформировались значительные почковые структуры, а просвет органоидов потемнел.
ПРИМЕЧАНИЕ: Просвет органоида становится темным из-за накопления мертвых клеток, мусора и слизи. Не позволяйте органоидам перерастать перед расщеплением. Коэффициент расщепления зависит от роста органоидов. Рекомендуется пассирование органоидов с соотношением 1:2 на 6-й день и 1:3 на 10-й день. - Заполните 15 мл трубки 4 мл холодного Advanced DMEM/F-12 и держите его на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь приведены объемы для 96-луночной культуральной плиты. Если используется другой формат, отрегулируйте громкость соответствующим образом. - Осторожно аспирируйте среду пипеткой или вакуумным насосом из скважин, не касаясь куполов BMM, и выбросьте ее.
- Добавьте 100 мкл холодного Advanced DMEM/F-12 на лунку. Пипетка вверх и вниз, чтобы разбить BMM и перенести содержимое скважины в трубку объемом 15 мл.
- Промыть колодец 200 мкл холодного Advanced DMEM/F-12 и собрать его в ту же трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: При прохождении нескольких скважин из одного и того же экспериментального состояния содержимое скважин может быть объединено в одну и ту же 15 мл коллекторную трубу. - Вращайте собирающую трубку 15 мл при 100 х г в течение 5 мин при 4°C.
- Выбросьте супернатант и добавьте в гранулу 1 мл холодного Advanced DMEM/F-12. Используя наконечник P1000, возьмите наконечник P10 (без фильтра) и пипетку вверх и вниз не менее 20 раз.
- Добавьте в пробирку 4 мл холодного Advanced DMEM/F-12. Отжим при 300 х г в течение 5 мин при 4°C.
- Аспирируйте супернатант пипеткой или вакуумным насосом, не нарушая гранулу. Затем нарушите гранулу механически.
- Добавьте BMM, разведенный в культуральной среде для роста (соотношение 2:1). Осторожно пипетку вверх и вниз, не вводя пузырьки воздуха в смесь.
- Пластина 10 мкл крипт/БММ смешивается с каждой лункой.
- Держите пластину в течение 5 минут при RT, чтобы BMM затвердел. Поместите пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2 в течение 15 мин.
- Добавьте в каждую лунку 250 мкл питательной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не отсоединить BMM. - Поместите пластины в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
4. Подготовка реагентов и материалов для оценки окислительного стресса в органоидах кишечника
- Готовят 250 мМ исходного раствора ингибитора N-ацетилцистеина (NAC) (см. Таблицу материалов), повторно суспендируют 10 мг с 245 мкл DPBS. Используйте при конечной концентрации 1 мМ.
- Готовят 50 мМ запасного раствора индуктора трет-бутилгидропероксида (tBHP), 70% в воде, разводят 3,22 мкл с 496,8 мкл DPBS. Используйте при конечной концентрации 200 мкМ.
- Для исследования проточной цитометрии готовят рабочий раствор флюорогенного зонда длиной 250 мкМ (см. Таблицу материалов) путем разбавления исходного раствора 1/10 в ДМСО. Используйте при конечной концентрации 1 мкМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как указано в инструкции производителя, фторогенный зонд чувствителен к свету и кислороду. Акции и аликвоты не должны открываться и закрываться слишком много раз. - Для визуализационного исследования готовят рабочий раствор флуорогенного зонда объемом 1,25 мМ путем разбавления исходного раствора 1/2 в ДМСО. Используйте при конечной концентрации 5 мкМ.
- Приготовьте окончательный раствор 0,1 мкг/мл DAPI в DPBS, который будет использоваться для дискриминации мертвых клеток в анализе проточной цитометрии.
- Разбавляют Hoechst 33342 до 1,25 мг/мл в DPBS. Используйте при конечной концентрации 5 мкг/мл для использования для ядерного окрашивания в анализе визуализации.
- Теплый ДМЭМ без фенольного красного цвета при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги описывают использование отрицательных и положительных элементов управления, которые должны быть включены в любые анализы, с использованием условий, указанных на рисунке 2A. Анализ может быть использован для тестирования антиоксидантных или прооксидантных соединений. Этапы одинаковы, и единственное различие заключается в том, когда соединения добавляются перед использованием фторгенного красителя.
5. Визуализация окислительного стресса в 3D органоидах методом конфокальной микроскопии
- Взять органоиды, покрытые в камерах скважин μ-Slide 8, и добавить 1 мкл раствора NAC в соответствующие скважины для получения конечной концентрации 1 мМ.
- Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C и 5% CO2.
- Добавляют 1 мкл раствора tBHP в соответствующие скважины для получения конечной концентрации 200 мкМ.
- Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C и 5% CO2.
- Добавьте 1 мкл на лунку разбавления фторогенного зонда 1,25 мМ для получения конечной концентрации 5 мкМ.
- Добавьте 1 мкл на лунку разбавления Хешта 1,25 мг/мл для получения конечной концентрации 5 мкг/мл.
- Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C и 5% CO2.
- Удалите среду, не нарушая BMM. Осторожно добавьте 250 мкл теплого ДМЭМ без фенолового красного цвета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если планируется долгосрочное приобретение, добавьте соединения факторов роста в DMEM без фенольного красного цвета. - Визуализируйте органоиды с помощью конфокального микроскопа, оснащенного термической камерой и газоснабжением, которое обнаруживает флюорогенный зонд (АФК).
ПРИМЕЧАНИЕ: Возбуждение/эмиссия (ex/em) для фторогенного зонда составляет 644/665, ex/em для Hoechst (ядер) составляет 361/486, а ex/em для GFP (кишечная стволовая клетка от мышей Lgr5-GFP) составляет 488/510. 63-кратный масляный погружной объектив используется для обнаружения сигналов в стволовых клетках. Не изменяйте настройки лазера между образцами. 20-кратная цель может быть использована для обеспечения обзора производства ROS. - Используйте положительный контроль для настройки интенсивности лазера и временного воздействия для сигнала ROS и убедитесь, что этот сигнал ниже в отрицательном контроле.
- С помощью окуляра экран слайда позволяет идентифицировать органоиды GFP, выражающие и регулировать интенсивность лазера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется вручную. - Определите положения для получения сшитого изображения всего органоида. Настройте z-стек 25 мкм (размер шага 5 мкм), чтобы получить участок органоидов, показывающий один слой клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к руководству пользователя микроскопа для оптимизации настройки. Используя живые клетки, приобретение должно быть произведено в течение 1 ч после окончания инкубации. - Откройте изображения в программном обеспечении для обработки изображений с открытым исходным кодом (см. Таблицу материалов).
- Пройдитесь по z-стеку и выберите участок, в котором хорошо представлена середина органоидов и создайте новое изображение с выбранной областью.
- Количественно оцените изображения в соответствии с шагами 5.15.1 - 5.15.5.
- Выберите инструмент «Линия от руки».
- Нарисуйте линию, следующую за ядрами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите только области, представляющие GFP-положительные клетки, если анализируются только стволовые клетки. - Увеличьте ширину линии, чтобы покрыть слой ячейки линией без включения просветного мусора.
- Выберите канал для сигнала ROS и измерьте интенсивность флуоресценции в выбранной области и аннотируйте значения.
- Проведите линию, где нет сигнала, и измерьте флуоресцентную интенсивность фона, которая будет вычтена до предыдущего значения, чтобы получить окончательную интенсивность.
6. Количественная оценка окислительного стресса на диссоциированных органоидах с помощью проточного цитометра
- Добавьте 1 мкл раствора NAC в скважины для отрицательного контроля для получения конечной концентрации 1 мМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте органоиды, покрытые 96-луночными пластинами с круглым дном. - Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C и 5% CO2.
- Добавляют 1 мкл раствора tBHP в соответствующие скважины для получения конечной концентрации 200 мкМ.
- Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C и 5% CO2.
- С помощью многоканальной пипетки удалите среду, не нарушая прикрепленный BMM, и перенесите ее на другую 96-луночную круглую нижнюю пластину. Держите эту тарелку в стороне.
- Добавьте 100 мкл трипсина, а с помощью многоканальной пипетки, пипетки вверх и вниз не менее пяти раз, чтобы уничтожить BMM.
- Инкубировать не более 5 мин при 37 °C и 5% CO2.
- С многоканальной пипеткой пипетка вверх и вниз не менее пяти раз, чтобы диссоциировать органоиды.
- Отжим при 300 х г в течение 5 мин при RT.
- Отбросьте супернатант, перевернув пластину. Добавьте обратно среду, собранную на этапе 6.3, в соответствующие скважины и повторно суспендируйте ячейки путем пипетирования вверх и вниз 5 раз.
- Добавьте фторогенный зонд в конечной концентрации 1 мкМ. Добавьте 1 мкл на лунку из разбавления 250 мкМ и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C и 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте флюорогенный зонд в скважины, необходимые для настроек прибора (рисунок 2B). - Отжим при 300 х г в течение 5 мин при RT.
- Повторное суспендирование клеток 250 мкл 0,1 мкг/мл раствора DAPI. Перенесите образцы в соответствующие проточные цитометрические трубки, держите трубки на льду и приступайте к анализу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте PBS вместо DAPI в скважины, необходимые для настроек инструмента (рисунок 2B). - Оптимизируйте настройки напряжения прямого и бокового рассеяния на неиспорченных контрольных и лазерных напряжениях для каждого флуорофора с помощью моноокрашенных образцов.
- Используя соответствующую стратегию гатинга (рисунок 4A), соберите не менее 20 000 событий.
ПРИМЕЧАНИЕ: 50 000 мероприятий являются предпочтительными. Подробные настройки сбора варьируются в зависимости от используемого инструмента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве доказательства концепции описываемого протокола использовались крипты, полученные из мышиной линии Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2, в которой кишечные стволовые клетки отображают мозаичную экспрессию GFP, которая была установлена Barker et al., чтобы изначально охарактеризовать кишечные стволовые клетки10 и позволить отобразить эти клетки на основе их экспрессии GFP. Таким образом, предоставляется модель для сравнения уровней АФК в популяции определенного типа клеток при различных методах лечения. Был использован ингибитор АФК (NAC) и индуктор (tBHP), который, как известно, действует на клеточную АФК для визуализации изменений их уровней.
На фиг.1А и 1В показаны репрезентативные изображения фракций F1 и F4, полученные в ходе процедуры экстракции крипт для кишечной органоидной культуры. Каждая фракция должна быть проверена под микроскопом или биноклем во время процедуры экстракции, чтобы проследить за отслоением крипт и определить те фракции, которые обогащены криптами, а не ворсинками, одиночными клетками или мусором. Выбранные фракции затем объединяют вместе и пропускают через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм, чтобы удалить все оставшиеся фрагменты ворсинок и получить препарат только с криптами (рисунок 1C). Крипты начинают закрываться в течение нескольких часов после встраивания в BMM, а при D1 наблюдались круглые органоиды (рисунок 1D). Через 3-5 дней органоиды появятся с почковыми структурами, представляющими собой «новообразованные крипты». Органоиды готовы к анализу АФК (рисунки 1Е и 1F).
В протоколе визуализации окислительного стресса с помощью конфокальной микроскопии слайд, содержащий органоиды, инкубированный с зондом, был изображен с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа, оснащенного лазерами и фильтрами для обнаружения сигналов Hoechst (ex/em: 361/486), GFP (ex/em: 488/510) и флуорогенного зонда (ex/em): 644/665). Конфокальный микроскоп, оснащенный 20-кратным воздушным и 63-кратным масляным погружным объективом, позволил визуализировать АФК. У мышей Lgr5-GFP GFP-положительные клетки представляют собой Lgr5-экспрессирующие кишечные стволовые клетки. На дополнительном рисунке 1 показаны репрезентативные изображения, полученные с помощью 20-кратного объектива, обеспечивающего обзор АФК в нескольких органоидах. На фиг.3 показаны репрезентативные изображения, полученные с 63-кратным масляным объективом, кишечных органоидов, экспрессирующих GFP, необработанных (NT), или предварительно инкубированных или не инкубированных ингибитором АФК NAC, и стимулируемых или не стимулируемых в течение 30 мин индуктором АФК tBHP.
При наличии ингибитора виден единственный сигнал от мертвых клеток, содержащихся в просвете органоида. В необработанном органоиде показаны базальные уровни АФК, доказывающие, что стволовые клетки производят более высокий АФК, чем дифференцированные клетки (в соответствии с настройками микроскопа сигнал АФК также может быть визуализирован в нестволовых клетках). GFP-положительные клетки представляют более значительный цитоплазматический сигнал с индуктором в присутствии фторогенного зонда, демонстрируя, что уровни АФК особенно увеличиваются в стволовых клетках после лечения.
На рисунке 4 показаны репрезентативные результаты, полученные при анализе продукции АФК в кишечных органоидах, стимулируемых или не стимулируемых ингибитором АФК или индуктором, с использованием проточного цитометра, оснащенного лазерами 405 нм, 488 нм и 630 нм. Стратегия гатинга, представленная на рисунке 4A , позволяет оценить продукцию АФК на уровне всей популяции органоидных клеток, определяя интактные и живые клетки на основе физических параметров и исключения DAPI (SSC-A против FSC-A и DAPI против FSC-A) и FSC-H против FSC-A) или только в кишечных стволовых клетках, дополнительно ограниченных клетками с высоким сигналом GFP. На рисунке 4B показаны уровни АФК в общей численности населения после сбора данных о 50 000 событий. Базальные уровни АФК в необработанных (NT) клетках снижаются после стимуляции ингибитором (NAC) и, наоборот, увеличиваются после вызова индуктором (tBHP). Клетки, предварительно обработанные ингибитором, а затем стимулируемые индуктором, представляют более низкий уровень, чем те, которые стимулируются только индуктором. Затем результаты были проанализированы с использованием соответствующего программного обеспечения, получая среднюю интенсивность флуоресценции (MFI). Полученные значения представлены в виде соотношения к необработанным клеткам, как показано на графике, представленном справа на рисунке 4B. На рисунке 4C показаны те же параметры, описанные на рисунке 4B в стволовых клетках, закрытых как GFP-положительные клетки, показывающие 3,5-кратное снижение уровня АФК при лечении NAC и 4-кратное увеличение при лечении tBHP по сравнению с нестимистическими клетками. Этот результат демонстрирует, что следуя этому протоколу, можно количественно оценить различия в уровнях АФК на уровне всей клеточной популяции или в GFP-положительных стволовых клетках при их обработке органоидов специфическими соединениями.
Рисунок 1: Репрезентативные изображения крипт и органоидов. (А) Пример фракции F1, полученной после первой инкубации с ЭДТА, обогащенной ворсинками (квадратом), с некоторыми обломками (звезда) и криптами (круг). (B) Пример фракции F4, обогащенной криптами. (C) Суспензия, представляющая собой только изолированные крипты, полученные после фильтрации с помощью клеточного сетчатого фильтра 70 мкм (шкала бар, 200 мкм). (D, E и F). Типичные органоиды были получены через 1, 3 и 5 дней соответственно, после встраивания крипт в BMM (шкала, 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Набросок плана эксперимента. (A) Условия, используемые в этом протоколе, включенные в каждый эксперимент: необработанные скважины (NT), скважины, обработанные индуктором (трет-бутилгидропероксид - tBHP), скважины, обработанные ингибиторами (N-ацетилцистеин - NAC), и скважины, обработанные ингибиторами и индукторами (NAC-tBHP). (B) Формат пластины для анализа проточной цитометрии. Каждое условие покрыто втрое (строка А). Линии B, C и D включают скважины для установки проточного цитометра только с флюорогенным зондом, только DAPI или неокрашенными (NS) образцами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные конфокальные изображения окрашивания АФК в органоидах. Сшитые изображения были получены с помощью конфокального микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой EMCCD, масляным объективом 63x/1.4 и щелью 35 мкм, с использованием лазеров 405, 488, 640 и фильтров 460/50, 535/50, 700/75 для получения Hoechst, GFP и фторогенного зонда соответственно. Конфокальные оптические срезы органоидов, не обработанных (NT), обработанных ингибитором ROS (NAC), ROS-индуктором (tBHP) или предварительно обработанных ингибитором ROS, а затем стимулируемых ROS-индуктором (NAC-tBHP). В сером цвете, ядра окрашены Hoechst; зеленого цвета, ячейки Lgr5-GFP; красного цвета, фторогенный зонд (шкала бар, 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативный анализ проточной цитометрии АФК в клетках, полученных из органоидов. (A) Схематическое представление стратегии гатинга, используемой в анализе проточной цитометрии: гатинг для формы клеток (исключение мертвых клеток и мусора, накопленных в просвете органоидов), гатинг для живых клеток (клетки, не включающие DAPI-лазер 405), гатинг для одиночных клеток (парблетная дискриминация) и стволовые клетки (GFP положительные клетки-лазер 488) (FSC: прямое рассеяние, SSC: боковое рассеяние). Сигнал ROS был получен с помощью лазера 630. (B) Слева гистограммы были получены с помощью соответствующего программного обеспечения, показывающего интенсивность сигналов АФК для всего живого населения (после обнаружения около 10 000 событий на состояние) в различных образцах NT: необработанных; NAC: обработанный ингибиторами; tBHP, обработанный индуктором; NAC-tBHP: обработанный ингибиторами и индукторами. Справа типичный пример рассчитанного соотношения значений МФО над образцами NT, полученными в ходе эксперимента, начиная с 3 образцов на условие (среднее ± SD) (*** P = 0,0003). (C) Такой же, как и в B для населения с положительным GFP (1 000 событий на условие) (* P = 0,02). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Репрезентативные конфокальные изображения окрашивания АФК в органоидах. Сшитые имаги были получены с помощью конфокального микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой EMCCD, объективом 20x и щелью 35 мкм, с использованием лазеров 405, 488, 640 и фильтров 460/50, 535/50, 700/75 для получения Hoechst, GFP и флуорогенного зонда соответственно. Конфокальные оптические срезы органоидов, не обработанных (NT), обработанных ингибитором ROS (NAC), ROS-индуктором (tBHP) или предварительно обработанных ингибитором ROS, а затем стимулируемых ROS-индуктором (NAC-tBHP). В сером цвете, ядра окрашены Hoechst; зеленого цвета, ячейки Lgr5-GFP; в красном цвете, фторогенный зонд (шкала бар, 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта работа предоставляет пошаговый протокол для выделения мышиных точевидных крипт, культивирования их в 3D-органоиды и анализа АФК в органоидах путем объединения ФТОРогенного зонда, чувствительного к АФК, с качественной микроскопической визуализацией целых органоидов и количественным измерением АФК с использованием проточной цитометрии на отдельных клетках после диссоциации органоидов.
Первым важным шагом в этом методе является процедура извлечения крипт. Действительно, качество приготовления крипт является залогом успешного формирования органоидов. Поэтому важно получать фракции с обогащенными криптами и небольшим количеством клеточного мусора или умирающих клеток. Крипты могут быть найдены в различных фракциях, чем те, которые указаны в протоколе, так как диссоциация может варьироваться в зависимости от возраста и состояния здоровья мыши. Количество инкубаций ЭДТА может быть соответствующим образом изменено. Если крипты, по-видимому, не отделяются после фракции 4, необходимо повторить 3-минутную инкубацию ЭДТА. И наоборот, предположим, что крипты уже отделяются после первой инкубации ЭДТА. В этом случае вторая инкубация ЭДТА может не понадобиться, и последовательные вихревые стадии в DPBS должны выполняться до тех пор, пока не будут получены фракции с достаточным количеством крипт, лишенных обломков. Если диссоциация не возникает, убедитесь, что dpBS без Ca2+ и Mg2+ используется для подготовки собирающих трубок, и замените ЭДТА новым раствором. Крипты являются хрупкими структурами, поэтому их следует как можно больше держать на льду и быстро покрывать после изоляции.
Различные пластины и объемы капель могут быть использованы для культивирования органоидов. Например, крипты также могут быть покрыты 24 или 48 пластинами скважины после регулировки концентрации крипт, объема капли BMM и среды, добавленной в каждую скважину. Несколько капель могут быть покрыты в одном и том же колодце в 12- или 6-луночной пластине. Как правило, крипты уменьшаются в размерах и округляются, образуя небольшие круглые органоиды на 1-й день культуры. Образование новых почек следует наблюдать через 2-3 дня после обшивки.
Для изучения изменений уровня АФК в кишечных стволовых клетках было использовано преимущество мышиной линии Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2. Предостережением этой модели является селективное глушение выбитого аллеля и последующий мозаицизм экспрессии GFP, который может отсутствовать в пятнах стволовых клеток или целых криптах. Во время протокола визуализации не все органоиды будут представлять стволовые клетки, экспрессирующие GFP; поэтому не все органоиды будут рассматриваться, если нельзя полагаться на пространственное положение клеток. Вместо этого это необходимо учитывать при анализе отрицательной популяции клеток GFP в протоколе flow cytometry. Действительно, поскольку невозможно полагаться на пространственное положение, GFP-отрицательная популяция будет состоять из нестволовых клеток и GFP-отрицательных стволовых клеток.
Здесь предусмотрен протокол качественной оценки АФК в органоидах кишечника. Критический аспект для этой части связан с рабочей дистанцией используемых целей. Органоиды выращивают в БММ; они не крепятся к дну скважины, вводя дистанцию от целевого плана фокусировки. По этой причине очень важно облицовать органоиды тонким слоем BMM, чтобы свести к минимуму эту проблему. Даже в этой оптимизированной обстановке не все органоиды будут находиться в правильном положении, чтобы быть адекватно изображенными.
Количественный анализ изображений может быть выполнен с использованием соответствующего программного обеспечения для анализа изображений, оценивающего среднюю интенсивность флуоресцентности изображений в канале сигнала ROS, как описано в протоколе. Для этого необходимо получить большое количество изображений, чтобы получить достаточное количество событий, чтобы быть статистически значимыми. Как упоминалось ранее, при использовании мышей Lgr5-GFP не все органоиды будут экспрессировать GFP, требуя значительного количества образцов для получения изображения.
Во время процедуры проточной цитометрии критическим этапом является диссоциация органоидов на отдельные клетки. Если диссоциация слишком жесткая, клетки могут погибнуть и выпустить ДНК. Ингибитор породы, Y-27632, для противодействия аноикису, и DNAse могут быть добавлены в буфер диссоциации, если они не мешают исследуемому пути. Можно использовать разбавление трипсина или сокращение времени инкубации.
Наконец, крайне важно определить наилучшую временную точку для анализа производства АФК после различных методов лечения (антиоксидант или прооксидант). В случае лекарств, которые быстро индуцируют АФК в течение нескольких минут или часов, анализ визуализации может быть использован для определения того, когда есть максимальная индукция, путем добавления фторогенного зонда перед тестируемыми соединениями. Интенсивность флуоресценции зонда после стимуляции органоидов может варьироваться в зависимости от экспериментов, выполняемых в разные дни. Поэтому крайне важно всегда рассчитывать соотношение с нестимулированными образцами и добавлять контрольные элементы (окислитель / антиоксидант) для проверки реакционной способности зонда. NAC и tBHP использовались в качестве отрицательных и положительных контрольных групп, поскольку они давали наиболее убедительные результаты. Тем не менее, могут быть использованы другие реагенты, такие как ресвератрол в качестве антиоксиданта или паракват/менадион в качестве окислителей. Слишком долгое инкубирование клеток с помощью фторогенного зонда может быть токсичным и даже изменять окислительно-восстановительный баланс клеток, поэтому время инкубации также должно жестко контролироваться. Клетки, окрашенные зондом, могут быть зафиксированы и проанализированы через несколько часов после этого. В этом случае для анализа проточной цитометрии DAPI не может различать живые и мертвые клетки. Вместо этого перед фиксацией следует использовать поправляемый краситель для живой/мертвой дискриминации.
Органоиды также могут выращиваться в течение нескольких дней (более 7), но это увеличит количество живых и пролиферативных клеток и мертвых клеток, которые накапливаются в просветах органоидов, создавая высокий фон, особенно в анализе визуализации. Если наблюдается аномальное увеличение сигнала фторгенного зонда, убедитесь, что раствор, используемый для повторного суспендирования стимулирующих соединений, не является прооксидантом как таковым (т.е. этанолом).
Одна из проблем, которую следует учитывать при использовании этого протокола, заключается в том, что живая визуализация и диссоциация клеток с последующей проточной цитометрией могут вызывать окислительный стресс в клетках и генерировать фоновый сигнал. Фиксация органоидов может быть рассмотрена в соответствии с экспериментом. Другое ограничение связано с трудностями в углубленной визуализации органоидов, выращенных в 3D-матрице. Как упоминалось в протоколе, BMM должен быть распределен на слайде в виде тонкого слоя, чтобы ограничить этот аспект.
Здесь протокол разработан с использованием коммерчески доступного фторогенного красителя. Его основным преимуществом является его совместимость с многоцветным окрашиванием органоидов таким образом, чтобы определенные типы клеток. Например, окрашивание антителами для маркеров клеточной поверхности сразу после инкубации флюорогенного зонда может быть выполнено для обнаружения определенных подтипов. Тем не менее, зонд не является специфическим для конкретного вида АФК, поскольку он может обнаруживать супероксид, перекись нитритов и перекись водорода11,12,13. По этой причине он обычно используется для обнаружения глобального окислительного стресса. Несмотря на коммерциализацию как цитозольный зонд, выбранный фторогенный зонд может достигать митохондрий14. Поскольку его специфичность может варьироваться в зависимости от клеточного контекста, мы предлагаем использовать другие дополнительные подходы для измерения АФК, когда это возможно. Могут быть использованы альтернативные красители, такие как зонды, специфичные для обнаружения супероксидных анионов, генерируемых митохондриями10. Также был разработан репертуар хемилюминесцентных зондов для обнаружения специфических видов АФК с высокой чувствительностью, таких как зонды на основе люциферина15,16. Они имеют преимущество в том, что они совместимы с визуализацией in vivo, но не могут использоваться для отображения производства АФК с конкретными типами клеток. Наконец, этот протокол может быть применен к другим типам органоидов, например, к органоидам толстой кишки, полученным из биопсии человека. В этом случае культуральная среда роста должна быть адаптирована соответствующим образом17. Для дальнейшего анализа окислительно-восстановительного механизма в клетках кишечника культуру органоидов и процедуры диссоциации, описанные в этом протоколе, могут быть объединены с транскриптомическим и протеомным подходами на целых органоидах или клетках органоидов, активированных флуоресценцией (FACS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Французского национального исследовательского агентства (ANR) 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
