Summary
Il presente protocollo descrive un metodo per rilevare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) negli organoidi murini intestinali utilizzando l'imaging qualitativo e i saggi quantitativi di citometria. Questo lavoro può essere potenzialmente esteso ad altre sonde fluorescenti per testare l'effetto di composti selezionati sui ROS.
Abstract
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) svolgono un ruolo essenziale nell'omeostasi intestinale. I ROS sono sottoprodotti naturali del metabolismo cellulare. Sono prodotti in risposta a infezioni o lesioni a livello mucoso in quanto sono coinvolti nelle risposte antimicrobiche e nella guarigione delle ferite. Sono anche messaggeri secondari critici, che regolano diversi percorsi, tra cui la crescita e la differenziazione cellulare. D'altra parte, livelli eccessivi di ROS portano a stress ossidativo, che può essere deleterio per le cellule e favorire malattie intestinali come l'infiammazione cronica o il cancro. Questo lavoro fornisce un metodo semplice per rilevare i ROS negli organoidi murini intestinali mediante imaging dal vivo e citometria a flusso, utilizzando una sonda fluorogenica disponibile in commercio. Qui il protocollo descrive l'analisi dell'effetto di composti che modulano l'equilibrio redox negli organoidi intestinali e rilevano i livelli di ROS in specifici tipi di cellule intestinali, esemplificato qui dall'analisi delle cellule staminali intestinali geneticamente etichettate con GFP. Questo protocollo può essere utilizzato con altre sonde fluorescenti.
Introduction
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono sottoprodotti naturali del metabolismo cellulare. Possono anche essere prodotti attivamente da complessi enzimatici specializzati come le NADPH-ossidasi legate alla membrana (NOX) e le dual ossidasi (DUOX), che generano anione superossido e perossido di idrogeno1. Esprimendo enzimi antiossidanti e spazzini ROS, le cellule possono sintonizzare finemente il loro equilibrio redox, proteggendo così l'omeostasi dei tessuti2. Sebbene i ROS possano essere altamente tossici per le cellule e danneggiare il DNA, le proteine e i lipidi, sono molecole di segnalazione cruciali2. Nell'epitelio intestinale sono necessari livelli moderati di ROS per la proliferazione delle cellule staminali e progenitrici3; alti livelli di ROS portano alla loro apoptosi4. Lo stress ossidativo cronico è legato a molte malattie gastrointestinali, come le malattie infiammatorie intestinali o il cancro. Ad esempio, in un modello murino di cancro intestinale guidato da Wnt, è risultata necessaria un'elevata produzione di ROS attraverso l'attivazione di NADPH-ossidasi per l'iperproliferazione delle cellule tumorali5,6. Definire come le cellule intestinali, in particolare le cellule staminali, gestiscono lo stress ossidativo e come l'ambiente cellulare può influire su questa capacità è essenziale per comprendere meglio l'eziologia di questa malattia7.
In un tessuto, diversi tipi di cellule presentano uno stato ossidativo basale che può variare in base alla loro funzione e al loro metabolismo e all'espressione di diversi livelli di molecole ossidanti e antiossidanti4,7. Il monitoraggio dei ROS in vivo è molto impegnativo. I coloranti permeabili alle cellule che emettono fluorescenza in base al loro stato redox sono stati sviluppati per visualizzare e misurare i ROS cellulari nelle cellule viventi e negli animali. Tuttavia, la loro efficacia dipende dalla loro diffusione all'interno dei tessuti viventi e dalla loro rapida lettura, rendendoli difficili da usare nei modelli animali8.
In passato, lo studio dell'effetto dei composti sulla generazione di ROS è stato fatto utilizzando linee cellulari, ma questo potrebbe non riflettere la situazione in vivo . Il modello organoide intestinale, sviluppato dal gruppo di Clevers9, consente la crescita di cellule primarie intestinali ex vivo. La coltura di cripte intestinali in matrici, in presenza di fattori di crescita definiti, porta a strutture tridimensionali, chiamate organoidi (mini-intestino), che riproducono l'organizzazione cripto-villi, con cellule delle diverse linee epiteliali che rivestono un lume interno e le cellule staminali intestinali che risiedono in piccole sporgenze simili a cripte.
Qui, sfruttando questo modello, viene descritto un metodo semplice per studiare lo stress ossidativo nelle cellule intestinali primarie alla risoluzione di una singola cellula aggiungendo un colorante ros-sensibile disponibile in commercio nel terreno di coltura organoide.
I lettori di lastre sono spesso utilizzati per rilevare la produzione di ROS in una popolazione totale. Questo protocollo utilizza la citometria a flusso o il test di imaging per rilevare ROS in un particolare tipo di cellula con cellule geneticamente modificate o colorazione anticorpale specifica. Questo lavoro coinvolge la coltura di organoidi intestinali di topo e la visualizzazione ROS mediante imaging confocale e quantificazione mediante citometria a flusso. Utilizzando gli organoidi dell'intestino tenue derivati da topi Lgr5-GFP, è possibile analizzare in modo specifico il livello di stress ossidativo nelle cellule staminali intestinali con diversi trattamenti. Questo protocollo può essere adattato per testare l'influenza di molecole esogene, come il muramil-dipeptide derivato dal microbiota (MDP)10, sul bilancio ROS, dopo aver stimolato gli organoidi con i composti selezionati.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati dopo l'approvazione da parte del Comitato per l'uso dell'Institut Pasteur e del Ministero dell'Agricoltura francese n. 2016-0022. Tutti i passaggi vengono eseguiti all'interno di una cappa di coltura tissutale.
1. Preparazione di reagenti e materiali per la coltivazione di organoidi intestinali
- Per preparare il terreno di coltura, mescolare DMEM/F-12 avanzato integrato con 1x glutammina, 1x soluzione di penicillina/streptomicina (P/S), 10 mM di HEPES, 50 ng/mL di EGF murino, 20 μg/mL di Noggin murino 500 ng/mL di R-Spondin1 di topo (vedi Tabella dei materiali). Lasciare il mezzo a temperatura ambiente (RT) durante l'estrazione della cripta.
NOTA: Congelare il mezzo inutilizzato in aliquote a -20 °C. Evitare il congelamento e il disgelo. - Riempire un tubo da 50 mL con 40 mL di Advanced DMEM/F-12 e tenerlo sul ghiaccio.
NOTA: Mantenere il mezzo inutilizzato a 4 °C. Sarà utilizzato per il passaggio degli organoidi. - Preriscaldare le piastre di coltura cellulare (camere di pozzo μ-Slide 8 e/o fondo rotondo a 96 pozzetti) nell'incubatore a 37 °C.
- Matrice di membrana basale di disgelo (BMM) (vedi Tabella dei materiali) aliquote sul ghiaccio (prima di iniziare il protocollo o almeno 1 ora prima della placcatura delle cripte).
NOTA: il BMM si solidificherà rapidamente se non mantenuto freddo. - Preparare la soluzione di lavaggio/lavaggio aggiungendo la soluzione di penicillina-streptomicina all'1% di DPBS (DPBS-P/S).
- Riempire una capsula di Petri da 100 mm con 10 mL di DPBS-P/S freddo. Riempire sei tubi da 15 mL con 10 mL di DPBS ed etichettarli da F1 a F6.
- Preparare 30 mL di soluzione edTA da 10 mM mediante diluizione da 0,5 M EDTA in DPBS. Riempire due tubi da 15 ml con 10 mL di EDTA da 10 mM ed etichettarli E1 ed E2.
- Tenere tutte le soluzioni pre-raffreddate a 4°C e tenerle sul ghiaccio durante la procedura.
2. Coltura di organoidi intestinali
- Sacrificare un mouse Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) di 8-10 settimane secondo le norme e i regolamenti nazionali.
- Raccogliere 5-8 cm del digiuno che comprende la regione tra il duodeno (5 cm dallo stomaco) e l'ileo (10 cm dal cieco) e tenere a freddo DPBS-P/S sul ghiaccio.
- Pulire il contenuto intestinale lavando con 5-10 ml di DPBS-P/S freddo.
NOTA: le siringhe da incasso fatte in casa possono essere ottenute collegando una punta da 200 μL a un ugello per siringa da 10 mL. - Aprire l'intestino longitudinalmente usando le forbici a punta di sfera (vedi Tabella dei materiali) (per evitare di danneggiare il tessuto).
- Utilizzando una pinza, trasferire il tessuto in una capsula di Petri contenente DPBS-P/S freddo a temperatura ambiente e agitarlo per risciacquare.
- Con una pipetta Pasteur di plastica, afferrare l'intestino per aspirazione e trasferirlo in un tubo da 15 ml etichettato E1 contenente 10 mL di freddo 10 mM EDTA.
- Capovolgere il tubo 3 volte e incubare sul ghiaccio per 10 minuti.
- Utilizzando una pipetta Pasteur in plastica, trasferire il tessuto nel tubo F1 contenente 10 mL DPBS. Vortice per 2 minuti (sul vortice normale, tenendo il tubo a mano e assicurandosi che l'intestino turbini bene).
- Metti 10 μL della frazione in una capsula di Petri e valuta la qualità della frazione al microscopio.
NOTA: Tutti i passi del vortice vengono eseguiti alla massima velocità e la qualità di ciascuna frazione deve essere valutata al microscopio (Figura 1). - Con una pipetta Pasteur di plastica, afferrare l'intestino per aspirazione e trasferirlo nel tubo F2 contenente 10 ml di DPBS e vortice per 2 minuti.
- Ripetere il passaggio 2.10, trasferendo il tessuto nel tubo F3 contenente 10 ml di DPBS e vortice per 2 minuti.
- Ripetere l'incubazione edta come nel passaggio 2.6, trasferendo il tessuto nel tubo E2 contenente 10 mM EDTA.
- Capovolgere il tubo 3 volte e incubare sul ghiaccio per 5 minuti.
- Ripetere il passaggio 2.10, trasferendo il tessuto nel tubo F4 contenente 10 mL dpBS e vortice per 3 min.
- Ripetere il passaggio 2.14, trasferendo il tessuto nel tubo F5 contenente 10 ml di DPBS e vortice per 3 minuti.
- Ripetere il passaggio 2.15, trasferendo il tessuto nel tubo F6 contenente 10 mL dpBS e vortice per 3 min.
- Combina le migliori frazioni filtranti per gravità attraverso un filtro cellulare da 70 μm in un tubo da 50 ml (su ghiaccio) per eliminare villi e detriti significativi.
NOTA: Di solito, F5 e F6 sono le frazioni contenenti numerose cripte e meno detriti. - Ruotare le cripte a 150 x g a 4 °C per 3 min.
- Svuotare il tubo, interrompere meccanicamente il pellet e aggiungere 5 ml di DMEM/F12 freddo.
- Mettere 10 μL della sospensione in una capsula di Petri e contare manualmente al microscopio il numero di cripte presenti nell'aliquota.
NOTA: non contare celle singole o piccoli detriti. - Calcola il volume (V) di sospensione delle cripte richiesto in μL, considerando che 300 cripte sono placcate per pozzetto, W è il numero di pozzi e N è il numero di cripte contate su 10 μL della sospensione. Trasferire le cripte in un nuovo tubo da 15 ml.
NOTA: V = 300 x L x 10/N. Se nell'esperimento pianificato viene utilizzato un piccolo volume, è possibile utilizzare un tubo centrifugo da 1,5 ml. - Ruotare le cripte a 200 x g a 4 °C per 3 min.
- Rimuovere con attenzione il surnatante usando una pipetta.
- Interrompere meccanicamente il pellet e aggiungere delicatamente il terreno di coltura di crescita per ottenere una concentrazione di 90 cripte / μL.
- Aggiungere 2 volumi di BMM non diluito per avere una concentrazione finale di 30 cripte/μL. Pipettare con attenzione su e giù senza introdurre bolle d'aria nella miscela.
NOTA: Tenere sempre il tubo sul ghiaccio per evitare la solidificazione BMM. - Piastra 10 μL delle cripte / BMM mescolare in ogni pozzetto. Per l'analisi della citometria a flusso, utilizzare piastre a fondo tondo a 96 pozzetti. Distribuire 10 μL al centro di ciascun pozzetto come una cupola. Per l'imaging, utilizzare μ-slide 8 (vedere Tabella dei materiali) e depositare i 10 μL come strato sottile.
NOTA: placcare gli organoidi come uno strato sottile per il test di imaging per consentire la loro imaging approfondito. - Lasciare la piastra per 5 minuti a RT per consentire al BMM di solidificarsi. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 15 minuti.
- Aggiungere 250 μL di terreno di coltura in ogni pozzetto, facendo attenzione a non staccare il BMM.
- Posizionare le piastre nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.
- Eseguire l'analisi ROS tra i giorni 4 e 6 della coltura. Altrimenti, cambiare il mezzo e dividere gli organoidi dopo la comparsa di diverse e lunghe strutture in erba e quando le cellule morte si accumulano nei lumen degli organoidi.
3. Organoidi che passano
- Inizia a passare piccoli organoidi intestinali dal 6 ° giorno di coltura, quando si sono formate strutture in erba significative e i lumi degli organoidi sono diventati scuri.
NOTA: Il lume dell'organoide diventa scuro a causa dell'accumulo di cellule morte, detriti e muco. Evitare di lasciare che gli organoidi crescano troppo prima di dividersi. Il rapporto di scissione dipende dalla crescita degli organoidi. Si consiglia di passare gli organoidi con un rapporto di 1:2 al giorno 6 e 1:3 al giorno 10. - Riempire un tubo da 15 mL con 4 mL di DMEM/F-12 avanzato freddo e tenerlo sul ghiaccio.
NOTA: Qui vengono forniti i volumi per una piastra di coltura da 96 pozzetti. Se si utilizza un formato diverso, regolare il volume di conseguenza. - Aspirare accuratamente il mezzo con una pipetta o una pompa per vuoto dai pozzetti senza toccare le cupole BMM e scartarlo.
- Aggiungere 100 μL di DMEM avanzato/F-12 freddo per pozzetto. Pipettare su e giù per rompere il BMM e trasferire il contenuto del pozzo nel tubo da 15 ml.
- Lavare il pozzetto con 200 μL di DMEM/F-12 avanzato a freddo e raccoglierlo nello stesso tubo.
NOTA: se si passano più pozzi dalla stessa condizione sperimentale, il contenuto dei pozzetti può essere raggruppato nello stesso tubo di raccolta da 15 ml. - Ruotare il tubo di raccolta da 15 mL a 100 x g per 5 minuti a 4°C.
- Scartare il surnatante e aggiungere 1 ml di DMEM/F-12 avanzato freddo al pellet. Utilizzando una punta P1000, prendere una punta P10 (senza filtro) e pipettare su e giù almeno 20 volte.
- Aggiungere 4 mL di DMEM/F-12 avanzato freddo al tubo. Girare a 300 x g per 5 minuti a 4°C.
- Aspirare il surnatante con una pipetta o una pompa per vuoto senza disturbare il pellet. Quindi, interrompere meccanicamente il pellet.
- Aggiungere BMM diluito nel terreno di coltura di crescita (rapporto 2:1). Pipettare con cura su e giù senza introdurre bolle d'aria nel mix.
- Piastra 10 μL delle cripte / BMM mescolare in ogni pozzetto.
- Tenere la piastra per 5 minuti a RT per consentire al BMM di solidificarsi. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 15 minuti.
- Aggiungere 250 μL di terreno di coltura in ciascun pozzetto.
NOTA: Fare attenzione a non staccare il BMM. - Posizionare le piastre nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.
4. Preparazione di reagenti e materiali per valutare lo stress ossidativo negli organoidi intestinali
- Preparare una soluzione madre da 250 mM di inibitore N-acetilcisteina (NAC) (vedere Tabella dei materiali), sospendere 10 mg con 245 μL di DPBS. Utilizzare a 1 mM di concentrazione finale.
- Preparare una soluzione madre da 50 mM di induttore Tert-butil idroperossido (tBHP), 70% in acqua, diluire 3,22 μL con 496,8 μL di DPBS. Utilizzare a 200 μM di concentrazione finale.
- Per lo studio di citometria a flusso, preparare una soluzione di lavoro da 250 μM di una sonda fluorogenica (vedere Tabella dei materiali) diluendo la soluzione madre 1/10 in DMSO. Utilizzare a 1 μM di concentrazione finale.
NOTA: Come indicato nelle istruzioni del produttore, la sonda fluorogenica è sensibile alla luce e all'ossigeno. Le scorte e le aliquote non dovrebbero essere aperte e chiuse troppe volte. - Per lo studio di imaging, preparare una soluzione di lavoro da 1,25 mM della sonda fluorogenica diluendo la soluzione madre 1/2 in DMSO. Utilizzare a 5 μM di concentrazione finale.
- Preparare una soluzione finale di 0,1 μg/mL DAPI in DPBS, da utilizzare per la discriminazione delle cellule morte nel saggio di citometria a flusso.
- Diluire Hoechst 33342 a 1,25 mg/mL in DPBS. Utilizzare a 5 μg/mL di concentrazione finale da utilizzare per la colorazione nucleare nel test di imaging.
- DMEM caldo senza rosso fenolo a 37 °C.
NOTA: questi passaggi descrivono l'utilizzo di controlli negativi e positivi che devono essere inclusi in qualsiasi test, utilizzando le condizioni indicate nella Figura 2A. Il test può essere utilizzato per testare composti antiossidanti o pro-ossidanti. I passaggi sono gli stessi e l'unica differenza è quando i composti vengono aggiunti prima di utilizzare il colorante fluorogenico.
5. Visualizzazione dello stress ossidativo in organoidi 3D mediante microscopia confocale
- Prelevare gli organoidi placcati nelle camere del pozzo μ-Slide 8 e aggiungere 1 μL di soluzione madre NAC nei pozzetti corrispondenti per ottenere una concentrazione finale di 1 mM.
- Incubare per 1 ora a 37 °C e 5% di CO2.
- Aggiungere 1 μL di soluzione madre tBHP nei pozzetti corrispondenti per ottenere una concentrazione finale di 200 μM.
- Incubare per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
- Aggiungere 1 μL per pozzetto della diluizione di 1,25 mM della sonda fluorogenica per ottenere una concentrazione finale di 5 μM.
- Aggiungere 1 μL per pozzetto della diluizione di Hoescht da 1,25 mg/mL per ottenere una concentrazione finale di 5 μg/mL.
- Incubare per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
- Rimuovere il supporto senza disturbare il BMM. Aggiungere delicatamente 250μL di DMEM caldo senza rosso fenolo.
NOTA: se è prevista un'acquisizione a lungo termine, aggiungere composti dei fattori di crescita al DMEM senza rosso fenolo. - Immagina gli organoidi usando un microscopio confocale dotato di una camera termica e di un'alimentazione di gas che rileva la sonda fluorogenica (ROS).
NOTA: L'eccitazione/emissione (ex/em) per la sonda fluorogenica è 644/665, ex/em per Hoechst (nuclei) è 361/486 ed ex/em per GFP (cellula staminale intestinale dei topi Lgr5-GFP) è 488/510. Un obiettivo di immersione in olio 63x viene utilizzato per rilevare i segnali nelle cellule staminali. Non modificare le impostazioni laser tra i campioni. Un obiettivo 20x potrebbe essere utilizzato per consentire una panoramica della produzione ROS. - Utilizzare il controllo positivo per impostare l'intensità del laser e l'esposizione temporale per il segnale ROS e verificare che questo segnale sia inferiore nel controllo negativo.
- Utilizzando lo schermo oculare la diapositiva per identificare gli organoidi GFP che esprimono e regolare l'intensità del laser.
NOTA: questo passaggio viene eseguito manualmente. - Definire le posizioni per ottenere un'immagine cucita dell'intero organoide. Impostare uno z-stack di 25 μm (dimensione del gradino 5 μm) per ottenere una sezione degli organoidi che mostra uno strato di cellule.
NOTA: fare riferimento al manuale utente del microscopio per ottimizzare la configurazione. Utilizzando cellule viventi, l'acquisizione dovrebbe essere effettuata entro 1 ora dalla fine dell'incubazione. - Aprire le immagini in un software di elaborazione delle immagini open source (vedere Tabella dei materiali).
- Passa attraverso lo z-stack e scegli la sezione in cui il centro degli organoidi è ben rappresentato e crea una nuova immagine con l'area selezionata.
- Quantificare le immagini secondo i passaggi 5.15.1 - 5.15.5.
- Selezionare lo strumento linea a mano libera.
- Disegna una linea seguendo i nuclei.
NOTA: selezionare solo le regioni che presentano cellule GFP-positive se vengono analizzate solo le cellule staminali. - Aumentare la larghezza della linea per coprire lo strato cellulare con la linea senza includere i detriti luminali.
- Selezionare il canale per il segnale ROS e misurare l'intensità di fluorescenza nella regione selezionata e annotare i valori.
- Disegna una linea dove non c'è segnale e misura l'intensità fluorescente dello sfondo che verrà sottratta al valore precedente per ottenere l'intensità finale.
6. Quantificazione dello stress ossidativo sugli organoidi dissociati mediante citometro a flusso
- Aggiungere 1 μL di soluzione madre NAC nei pozzetti per i controlli negativi per ottenere una concentrazione finale di 1 mM.
NOTA: Utilizzare gli organoidi placcati nelle piastre a fondo tondo a 96 pozzetti. - Incubare per 1 ora a 37 °C e 5% di CO2.
- Aggiungere 1 μL di soluzione madre tBHP nei pozzetti corrispondenti per ottenere una concentrazione finale di 200 μM.
- Incubare per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
- Con una pipetta multicanale, rimuovere il mezzo senza disturbare il BMM collegato e trasferirlo su un'altra piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti. Tieni da parte questo piatto.
- Aggiungere 100 μL di tripsina e, con una pipetta multicanale, pipettare su e giù almeno cinque volte per distruggere il BMM.
- Incubare per non più di 5 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
- Con una pipetta multicanale, pipetta su e giù almeno cinque volte per dissociare gli organoidi.
- Girare a 300 x g per 5 minuti a RT.
- Scartare il surnatante invertendo la piastra. Aggiungere nuovamente il mezzo raccolto nel passaggio 6.3 ai pozzetti corrispondenti e risospesciare le celle tubando su e giù 5 volte.
- Aggiungere la sonda fluorogenica alla concentrazione finale di 1 μM. Aggiungere 1 μL per pozzetto dalla diluizione di 250 μM e incubare per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
NOTA: Non aggiungere la sonda fluorogenica ai pozzetti necessari per le impostazioni dello strumento (Figura 2B). - Girare a 300 x g per 5 minuti a RT.
- Risospendare le celle con 250 μL di soluzione DAPI da 0,1 μg/mL. Trasferire i campioni nelle apposite provette citometriche a flusso, tenere le provette sul ghiaccio e procedere con l'analisi.
NOTA: Aggiungere PBS anziché DAPI ai pozzetti necessari per le impostazioni dello strumento (Figura 2B). - Ottimizza le impostazioni della tensione di dispersione anteriore e laterale sul controllo non macchiato e sulle tensioni laser per ciascun fluoroforo utilizzando campioni monomacchiati.
- Utilizzando una strategia di gating appropriata (Figura 4A), raccogliere un minimo di 20.000 eventi.
NOTA: sono preferiti 50.000 eventi. Le impostazioni di acquisizione dettagliate variano a seconda dello strumento utilizzato.
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Representative Results
Come prova di concetto del protocollo descritto, sono state utilizzate le cripte ottenute dalla linea di topi Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 in cui le cellule staminali intestinali mostrano un'espressione GFP a mosaico, che è stata stabilita da Barker et al., per caratterizzare inizialmente le cellule staminali intestinali10 e consentire di mappare queste cellule in base alla loro espressione GFP. Viene quindi fornito un modello per confrontare i livelli di ROS in una specifica popolazione di tipo cellulare con trattamenti diversi. È stato utilizzato un inibitore ROS (NAC) e un induttore (tBHP), noto per agire sui ROS cellulari per visualizzare i cambiamenti nei loro livelli.
Le figure 1A e 1B mostrano immagini rappresentative delle frazioni F1 e F4 ottenute durante la procedura di estrazione delle cripte per la coltura organoide intestinale. Ogni frazione deve essere controllata al microscopio o binocolo durante la procedura di estrazione per seguire il distacco delle cripte e definire quelle frazioni arricchite in cripte, piuttosto che villi, singole cellule o detriti. Le frazioni scelte vengono quindi raggruppate insieme e passate attraverso un filtro cellulare da 70 μm per rimuovere tutti i restanti frammenti di villi e ottenere una preparazione con solo cripte (Figura 1C). Le cripte iniziano a chiudersi entro poche ore dall'incorporazione in BMM, e a D1 sono stati osservati organoidi rotondi (Figura 1D). Dopo 3-5 giorni, gli organoidi appariranno con strutture in erba che rappresentano le "cripte appena formate". Gli organoidi sono pronti per l'analisi ROS (Figure 1E e 1F).
Nel protocollo di imaging dello stress ossidativo mediante microscopia confocale, il vetrino contenente gli organoidi, incubato con la sonda, è stato ripreso con un microscopio a fluorescenza confocale dotato di laser e filtri per rilevare i segnali Hoechst (ex/em: 361/486), GFP (ex/em: 488/510) e sonda fluorogenica (ex/em): 644/665). Un microscopio confocale dotato di 20x aria e 63x obiettivo di immersione in olio ha permesso la visualizzazione di ROS. Nei topi Lgr5-GFP, le cellule GFP-positive sono cellule staminali intestinali che esprimono Lgr5. La Figura 1 supplementare mostra immagini rappresentative ottenute con l'obiettivo 20x fornendo una panoramica del ROS in diversi organoidi. La Figura 3 mostra immagini rappresentative, ottenute con l'obiettivo olio 63x, di organoidi intestinali che esprimono GFP, non trattati (NT), o pre-incubati o meno con l'inibitore ROS NAC, e stimolati o meno per 30 minuti con l'induttore ROS tBHP.
In presenza dell'inibitore, è visibile l'unico segnale proveniente dalle cellule morte contenute nel lume dell'organoide. Nell'organoide non trattato, vengono mostrati i livelli basali di ROS, dimostrando che le cellule staminali producono ROS più elevati rispetto alle cellule differenziate (secondo le impostazioni del microscopio, il segnale ROS potrebbe anche essere visualizzato in cellule non staminali). Le cellule GFP-positive presentano un segnale citoplasmatico più significativo con l'induttore in presenza della sonda fluorogenica, dimostrando che i livelli di ROS aumentano in particolare nelle cellule staminali dopo il trattamento.
La Figura 4 mostra i risultati rappresentativi ottenuti analizzando la produzione di ROS in organoidi intestinali stimolati o meno con inibitore o induttore ROS, utilizzando un citometro a flusso dotato di laser a 405 nm, 488 nm e 630 nm. La strategia di gating presentata in Figura 4A consente di valutare la produzione di ROS a livello dell'intera popolazione cellulare di organoidi, definendo cellule intatte e viventi in base a parametri fisici ed esclusione DAPI (SSC-A vs. FSC-A e DAPI vs. FSC-A) e FSC-H vs. FSC-A) o solo nelle cellule staminali intestinali, ulteriormente recintate su cellule con GFP ad alto segnale. La figura 4B mostra i livelli di ROS nella popolazione totale al momento della raccolta di 50.000 eventi. I livelli di ROS basali nelle cellule non trattate (NT) diminuiscono dopo la stimolazione con l'inibitore (NAC) e, al contrario, aumentano dopo la sfida con l'induttore (tBHP). Le cellule pre-trattate con l'inibitore e poi stimolate con l'induttore presentano un livello inferiore rispetto a quelle stimolate con il solo induttore. I risultati sono stati poi analizzati utilizzando un software appropriato, ottenendo l'intensità fluorescente mediana (MFI). I valori ottenuti sono presentati come un rapporto rispetto alle cellule non trattate, come mostrato nel grafico presentato a destra della Figura 4B. La Figura 4C mostra gli stessi parametri descritti nella Figura 4B nelle cellule staminali, gated come cellule GFP positive, mostrando una diminuzione di 3,5 volte del livello di ROS dopo il trattamento con NAC e un aumento di 4 volte dopo il trattamento con tBHP rispetto alle cellule non stimolate. Questo risultato dimostra che seguendo questo protocollo, è possibile quantificare le differenze nei livelli di ROS a livello dell'intera popolazione cellulare o nelle cellule staminali GFP positive al loro trattamento degli organoidi con composti specifici.
Figura 1: Immagini rappresentative di cripte e organoidi. (A) Esempio di frazione F1 ottenuta dopo la prima incubazione con EDTA, arricchita in villi (quadrati), con alcuni detriti (stella) e cripte (cerchio). (B) Esempio di frazione F4 arricchita in cripte. (C) Sospensione che presenta solo cripte isolate ottenute dopo la filtrazione con un filtro cellulare da 70 μm (barra di scala, 200 μm). (D, E e F). Gli organoidi tipici sono stati ottenuti dopo 1, 3 e 5 giorni rispettivamente, dopo aver incorporato le cripte in BMM (barra della scala, 100 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema del piano sperimentale. (A) Condizioni utilizzate in questo protocollo incluse in ciascun esperimento: pozzetti non trattati (NT), pozzetti trattati con induttore (idroperossido di terz-butile - tBHP), pozzetti trattati con inibitori (N-acetil cisteina - NAC) e pozzi trattati con inibitori e induttori (NAC-tBHP). (B) Formato della piastra per il saggio di citometria a flusso. Ogni condizione è placcata in triplice copia (linea A). Le linee B, C e D includono pozzetti per l'impostazione del citometro a flusso con solo la sonda fluorogenica, solo CAMPIONI DAPI o non colorati (NS). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini confocali rappresentative della colorazione ROS negli organoidi. Le immagini cucite sono state ottenute con un microscopio confocale dotato di una telecamera EMCCD ad alta velocità, obiettivo olio 63x / 1.4 e fessura 35 μm, utilizzando i laser 405, 488, 640 e filtri 460/50, 535/50, 700/75 per acquisire rispettivamente Hoechst, GFP e la sonda fluorogenica. Sezioni ottiche confocali di organoidi non trattati (NT), trattati con l'inibitore ROS (NAC), con l'induttore ROS (tBHP), o pre-trattati con l'inibitore ROS e quindi stimolati con l'induttore ROS (NAC-tBHP). In grigio, nuclei macchiati con Hoechst; in verde, cellule Lgr5-GFP; in rosso, la sonda fluorogenica (barra della scala, 50 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi rappresentativa della citometria a flusso dei ROS in cellule derivate da organoidi. (A) Rappresentazione schematica della strategia di gating utilizzata nell'analisi della citometria a flusso: gating per la forma cellulare (esclusione di cellule morte e detriti accumulati nel lume degli organoidi), gating per cellule viventi (cellule che non incorporano DAPI-laser 405), gating per singole cellule (discriminazione del doppietto) e cellule staminali (GFP positive cells-laser 488) (FSC: forward scatter, SSC: side scatter). Il segnale ROS è stato acquisito utilizzando il laser 630. (B) A sinistra, gli istogrammi sono stati ottenuti con un software appropriato che mostra i segnali ROS di intensità per la popolazione vivente totale (dopo aver gating circa 10.000 eventi per condizione) nei diversi campioni NT: non trattati; NAC: trattato con inibitori; tBHP induttore-trattato; NAC-tBHP: trattato con inibitori e induttori. A destra, un tipico esempio del rapporto calcolato per i valori MFI sui campioni NT ottenuti durante un esperimento a partire da 3 campioni per condizione (media ± SD) (*** P = 0,0003). (C) Come in B per la popolazione GFP positiva (1.000 eventi per condizione) (* P = 0,02). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Immagini confocali rappresentative della colorazione ROS negli organoidi. Gli image cuciti sono stati ottenuti con un microscopio confocale dotato di una telecamera EMCCD ad alta velocità, obiettivo 20x e fessura 35 μm, utilizzando i laser 405, 488, 640 e filtri 460/50, 535/50, 700/75 per acquisire rispettivamente Hoechst, GFP e sonda fluorogenica. Sezioni ottiche confocali di organoidi non trattati (NT), trattati con l'inibitore ROS (NAC), con l'induttore ROS (tBHP), o pre-trattati con l'inibitore ROS e quindi stimolati con l'induttore ROS (NAC-tBHP). In grigio, nuclei macchiati con Hoechst; in verde, cellule Lgr5-GFP; in rosso, sonda fluorogenica (barra della scala, 100 μm). Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo lavoro fornisce un protocollo passo-passo per isolare le cripte digiunali murine, coltivarle in organoidi 3D e analizzare i ROS negli organoidi combinando una sonda fluorogenica sensibile ai ROS con l'imaging al microscopio qualitativo di organidi interi e la misurazione quantitativa dei ROS utilizzando la citometria a flusso su singole cellule dopo la dissociazione organoide.
Il primo passo critico in questo metodo è la procedura di estrazione delle cripte. In effetti, la qualità della preparazione delle cripte è la chiave per il successo della formazione di organoidi. È quindi essenziale ottenere frazioni con cripte arricchite e pochi detriti cellulari o cellule morenti. Le cripte possono essere trovate in frazioni diverse da quelle indicate nel protocollo, in quanto la dissociazione può variare con l'età e lo stato di salute del topo. Il numero di incubazioni EDTA può essere modificato di conseguenza. Se le cripte non sembrano staccarsi dopo la frazione 4, è necessario ripetere un'incubazione EDTA di 3 minuti. Inversamente, supponiamo che le cripte si stacchino già dopo la prima incubazione EDTA. In tal caso, la seconda incubazione EDTA potrebbe non essere necessaria e le fasi sequenziali del vortice in DPBS dovrebbero essere eseguite fino a quando non si ottengono frazioni con abbastanza cripte prive di detriti. Se non si verifica alcuna dissociazione, assicurarsi che DPBS senza Ca2+ e Mg2+ sia utilizzato per preparare i tubi di raccolta e sostituire EDTA con una nuova soluzione. Le cripte sono strutture fragili, quindi dovrebbero essere tenute il più possibile sul ghiaccio e rapidamente placcate dopo l'isolamento.
Diverse piastre e volumi di gocce possono essere utilizzati per coltivare organoidi. Ad esempio, le cripte possono anche essere placcate in 24 o 48 piastre di pozzo dopo aver regolato la concentrazione delle cripte, il volume della goccia BMM e il mezzo aggiunto in ciascun pozzetto. Più gocce possono essere placcate nello stesso pozzo in una piastra a 12 o 6 pozzetti. Generalmente, le cripte diminuiscono di dimensioni e si arrotondano per formare piccoli organoidi rotondi al giorno 1 della coltura. La formazione di nuove gemme deve essere osservata 2-3 giorni dopo la placcatura.
Per studiare i cambiamenti nei livelli di ROS nelle cellule staminali intestinali, è stato preso il vantaggio della linea di topi Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2. Un avvertimento di questo modello è il silenziamento selettivo dell'allele bussato e il conseguente mosaicismo dell'espressione GFP, che può essere assente in chiazze di cellule staminali o intere cripte. Durante il protocollo di imaging, non tutti gli organoidi presenteranno cellule staminali che esprimono GFP; pertanto, non tutti gli organoidi saranno considerati a meno che non sia possibile fare affidamento sulla posizione spaziale delle cellule. Invece, questo deve essere considerato quando si analizza la popolazione cellulare negativa GFP nel protocollo di citometria a flusso. Infatti, poiché è impossibile fare affidamento sulla posizione spaziale, la popolazione GFP-negativa sarà composta da cellule non staminali e cellule staminali GFP-negative.
Qui viene fornito un protocollo per la valutazione qualitativa dei ROS negli organoidi intestinali. Un aspetto critico per questa parte è legato alla distanza di lavoro degli obiettivi che vengono utilizzati. Gli organoidi sono coltivati in BMM; non sono attaccati al fondo del pozzo, introducendo una distanza dal piano di messa a fuoco obiettivo. Per questo motivo, è fondamentale placcare gli organoidi in un sottile strato di BMM, per ridurre al minimo questo problema. Anche in questa impostazione ottimizzata, non tutti gli organoidi saranno nella posizione corretta per essere adeguatamente ripresi.
Un'analisi quantitativa delle immagini potrebbe essere effettuata utilizzando un software di analisi delle immagini appropriato, valutando l'intensità fluorescente media delle immagini nel canale del segnale ROS come descritto nel protocollo. A tal fine, è necessario acquisire un numero elevato di immagini per ottenere un numero sufficiente di eventi per essere statisticamente significativi. Come accennato in precedenza, utilizzando i topi Lgr5-GFP, non tutti gli organoidi esprimeranno GFP, richiedendo un numero considerevole di campioni per essere ripresi.
Durante la procedura di citometria a flusso, un passaggio critico è la dissociazione degli organoidi in singole cellule. Se la dissociazione è troppo dura, le cellule possono morire e rilasciare DNA. Un inibitore della roccia, Y-27632, per contrastare l'anoikis e il DNAse possono essere aggiunti al tampone di dissociazione se non interferiscono con la via studiata. Possono essere utilizzati diluizione della tripsina o tempi di incubazione ridotti.
Infine, è fondamentale definire il momento migliore per analizzare la produzione di ROS dopo i diversi trattamenti (anti- o pro-ossidanti) testati. Nel caso di farmaci che inducono rapidamente ROS in pochi minuti o ore, il test di imaging può essere utilizzato per determinare quando vi è la massima induzione aggiungendo la sonda fluorogenica prima dei composti testati. L'intensità di fluorescenza della sonda dopo la stimolazione degli organoidi può variare tra gli esperimenti eseguiti in giorni diversi. Pertanto, è fondamentale calcolare sempre il rapporto con i campioni non stimolati e aggiungere controlli (ossidante/antiossidante) per verificare la reattività della sonda. NAC e tBHP sono stati utilizzati come controlli negativi e positivi in quanto hanno dato i risultati più conclusivi. Tuttavia, possono essere utilizzati altri reagenti, come il resveratrolo come antiossidante o paraquat / menadione come ossidanti. L'incubazione delle cellule per troppo tempo con la sonda fluorogenica può essere tossica e persino modificare l'equilibrio redox cellulare, quindi anche i tempi di incubazione devono essere strettamente controllati. Le cellule macchiate con la sonda possono essere riparate e analizzate poche ore dopo. In questo caso, per l'analisi della citometria a flusso, il DAPI non può discriminare tra cellule vive e morte. Invece, un colorante fissabile per la discriminazione viva / morta dovrebbe essere usato prima della fissazione.
Gli organoidi possono anche essere coltivati per diversi giorni (più di 7), ma questo aumenterà il numero di cellule viventi e proliferative e le cellule morte che si accumulano nei lumen degli organoidi, generando uno sfondo elevato, in particolare nel test di imaging. Se si osserva un aumento anomalo del segnale della sonda fluorogenica, assicurarsi che la soluzione utilizzata per risospesso i composti stimolanti non sia pro-ossidante di per sé (cioè etanolo).
Una preoccupazione da considerare quando si utilizza questo protocollo è che l'imaging dal vivo e la dissociazione cellulare seguita dalla citometria a flusso possono indurre stress ossidativo nelle cellule e generare un segnale di fondo. La fissazione degli organoidi può essere considerata in base all'esperimento. Un'altra limitazione deriva dalla difficoltà nell'imaging approfondito di organoidi coltivati in una matrice 3D. Come accennato nel protocollo, il BMM dovrebbe essere distribuito sulla diapositiva come uno strato sottile per limitare questo aspetto.
Qui, il protocollo è progettato utilizzando un colorante fluorogenico disponibile in commercio. Il suo vantaggio principale è la sua compatibilità con la colorazione multicolore di organoidi in modo che specifici tipi di cellule. Ad esempio, la colorazione anticorpale per i marcatori della superficie cellulare immediatamente dopo l'incubazione della sonda fluorogenica può essere eseguita per rilevare particolari sottotipi. Tuttavia, la sonda non è specifica per una specifica specie ROS in quanto può rilevare superossido, perossido di nitrito e perossido di idrogeno11,12,13. Per questo motivo, viene generalmente utilizzato per rilevare lo stress ossidativo globale. Sebbene commercializzata come sonda solo citosolica, la sonda fluorogenica selezionata potrebbe raggiungere i mitocondri14. Poiché la sua specificità può variare tra diversi contesti cellulari, suggeriamo di utilizzare altri approcci complementari per misurare i ROS quando possibile. Potrebbero essere utilizzati coloranti alternativi come sonde specifiche per rilevare anioni superossido generati dai mitocondri10. È stato inoltre sviluppato un repertorio di sonde chemiluminescenti per rilevare specifiche specie ros ad alta sensibilità, come le sonde a base di luciferina15,16. Questi hanno il vantaggio di essere compatibili con l'imaging in vivo, ma non possono essere utilizzati per mappare la produzione di ROS con tipi di cellule specifici. Infine, questo protocollo può essere applicato ad altri tipi di organoidi, ad esempio organoidi del colon derivati da biopsie umane. In questo caso, il terreno di coltura dovrebbe essere adattato di conseguenza17. Per analizzare ulteriormente il meccanismo redox all'interno delle cellule intestinali, le procedure di coltura e dissociazione degli organoidi descritte in questo protocollo possono essere combinate con approcci trascrittomici e proteomici su organoidi interi o cellule organoidi a cellule attivate a fluorescenza (FACS).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 17-CE14-0022 (i-Stress) dell'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
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