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Biology

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों-संवेदनशील फ्लोरोजेनिक जांच का उपयोग करके मुरीन आंतों के ऑर्गेनोइड्स में ऑक्सीडेटिव तनाव का विश्लेषण करना

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62880
Automatic Translation
1,3, 1,4, 1,2,5, 1,6
1Molecular Microbial Pathogenesis Unit, Institut Pasteur, 2Chaire de Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Institut de Biologie Paris Seine (IBPS) - Developmental Biology Unit, Sorbonne Université, CNRS UMR7622, INSERM U1156, 4Molecular Radiotherapy, INSERM U1030, Gustave Roussy, Université Paris-Saclay, 5The Center for Microbes, Development and Health, Institut Pasteur Shanghai and Chinese Academy of Sciences, 6Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल गुणात्मक इमेजिंग और मात्रात्मक साइटोमेट्री एसेस का उपयोग करके आंतों के म्यूरीन ऑर्गेनोइड्स में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इस काम को संभावित रूप से आरओएस पर चयनित यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए अन्य फ्लोरोसेंट जांच तक बढ़ाया जा सकता है।

Abstract

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) आंतों के होमियोस्टैसिस में आवश्यक भूमिका निभाती हैं। ROS सेल चयापचय के प्राकृतिक उप-उत्पाद हैं। वे म्यूकोसल स्तर पर संक्रमण या चोट के जवाब में उत्पादित होते हैं क्योंकि वे रोगाणुरोधी प्रतिक्रियाओं और घाव भरने में शामिल होते हैं। वे महत्वपूर्ण माध्यमिक दूत भी हैं, जो सेल विकास और भेदभाव सहित कई मार्गों को विनियमित करते हैं। दूसरी ओर, अत्यधिक आरओएस स्तर ऑक्सीडेटिव तनाव का कारण बनता है, जो कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकता है और पुरानी सूजन या कैंसर जैसी आंतों की बीमारियों का पक्ष ले सकता है। यह काम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोजेनिक जांच का उपयोग करके लाइव इमेजिंग और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा आंतों के म्यूरीन ऑर्गेनोइड्स में आरओएस का पता लगाने के लिए एक सरल विधि प्रदान करता है। यहां प्रोटोकॉल यौगिकों के प्रभाव का वर्णन करता है जो आंतों के ऑर्गेनोइड्स में रेडॉक्स संतुलन को संशोधित करते हैं और विशिष्ट आंतों के सेल प्रकारों में आरओएस के स्तर का पता लगाते हैं, यहां जीएफपी के साथ आनुवंशिक रूप से लेबल किए गए आंतों के स्टेम कोशिकाओं के विश्लेषण द्वारा उदाहरण दिया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य फ्लोरोसेंट जांच के साथ किया जा सकता है।

Introduction

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) सेलुलर चयापचय के प्राकृतिक उप-उत्पाद हैं। उन्हें झिल्ली-बाध्य NADPH-Oxidases (NOX) और दोहरी ऑक्सीडेज (DUOX) जैसे विशेष एंजाइमेटिक परिसरों द्वारा भी सक्रिय रूप से उत्पादित किया जा सकता है, जो सुपरऑक्साइड अनियन और हाइड्रोजन पेरोक्साइड 1 उत्पन्न करते हैं। एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों और आरओएस स्कैवेंजर्स को व्यक्त करके, कोशिकाएं अपने रेडॉक्स संतुलन को बारीक ढंग से ट्यून कर सकती हैं, जिससे ऊतक होमियोस्टैसिस 2 की रक्षा हो सकती है। हालांकि आरओएस कोशिकाओं के लिए अत्यधिक विषाक्त हो सकता है और डीएनए, प्रोटीन और लिपिड को नुकसान पहुंचा सकता है, वे महत्वपूर्ण सिग्नलिंग अणु हैं2। आंतों के उपकला में, स्टेम और पूर्वज सेल प्रसार के लिए मध्यम आरओएस स्तर की आवश्यकता होती है3; उच्च ROS स्तर उनके apoptosis4 के लिए नेतृत्व करते हैं। क्रोनिक ऑक्सीडेटिव तनाव कई जठरांत्र संबंधी बीमारियों से जुड़ा हुआ है, जैसे कि सूजन आंत्र रोग या कैंसर। एक उदाहरण के रूप में, WNT-संचालित आंतों के कैंसर के माउस मॉडल में, NADPH-oxidases के सक्रियण के माध्यम से ऊंचा ROS उत्पादन कैंसर कोशिकाओं hyperproliferation5,6 के लिए आवश्यक पाया गया था। यह परिभाषित करना कि आंतों की कोशिकाएं, विशेष रूप से स्टेम कोशिकाओं में, स्टेम कोशिकाएं ऑक्सीडेटिव तनाव का प्रबंधन कैसे करती हैं और सेलुलर वातावरण इस क्षमता को कैसे प्रभावित कर सकता है, इस बीमारी के एटियलजि को बेहतर ढंग से समझने के लिए आवश्यक है।

एक ऊतक में, विभिन्न सेल प्रकार एक बेसल ऑक्सीडेटिव राज्य पेश करते हैं जो उनके कार्य और चयापचय और ऑक्सीडेंट और एंटीऑक्सिडेंट अणुओं के विभिन्न स्तरों की अभिव्यक्ति के अनुसार भिन्न हो सकते हैं4,7। वीवो में आरओएस की निगरानी बहुत चुनौतीपूर्ण है। सेल पारगम्य रंजक जो उनके रेडॉक्स राज्य के अनुसार प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करते हैं, उन्हें जीवित कोशिकाओं और जानवरों में सेलुलर आरओएस की कल्पना और मापने के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, उनकी प्रभावकारिता जीवित ऊतकों के अंदर उनके प्रसार और उनके तेजी से रीडआउट पर निर्भर करती है, जिससे उन्हें पशु मॉडल 8 में उपयोग करना मुश्किल हो जाता है।

अतीत में, आरओएस पीढ़ी पर यौगिकों के प्रभाव का अध्ययन सेल लाइनों का उपयोग करके किया गया था, लेकिन यह इन विवो स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं कर सकता है। आंतों organoid मॉडल, Clevers9 के समूह द्वारा विकसित, आंतों की प्राथमिक कोशिकाओं पूर्व vivo के विकास में सक्षम बनाता है। आव्यूहों में आंतों के क्रिप्ट्स की संस्कृति, परिभाषित विकास कारकों की उपस्थिति में, तीन आयामी संरचनाओं की ओर ले जाती है, जिन्हें ऑर्गेनोइड्स (मिनी-आंत) कहा जाता है, जो क्रिप्ट-विलस संगठन को पुन: पेश करते हैं, जिसमें विभिन्न उपकला वंशों से कोशिकाएं एक आंतरिक लुमेन को अस्तर करती हैं, और आंतों की स्टेम कोशिकाएं छोटे क्रिप्ट्स-जैसे प्रोट्रूशन में रहती हैं।

यहां, इस मॉडल का लाभ उठाते हुए, ऑर्गेनोइड संस्कृति माध्यम में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरओएस-संवेदनशील डाई जोड़कर एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर प्राथमिक आंतों की कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव का अध्ययन करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन किया गया है।

प्लेट पाठकों का उपयोग अक्सर कुल आबादी में आरओएस उत्पादन का पता लगाने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल प्रवाह cytometry या इमेजिंग परख आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं या विशिष्ट एंटीबॉडी धुंधला के साथ एक विशेष सेल प्रकार में आरओएस का पता लगाने के लिए उपयोग करता है। इस काम में माउस आंत्र ऑर्गेनोइड संस्कृति और आरओएस विज़ुअलाइज़ेशन शामिल है कॉन्फोकल इमेजिंग और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा परिमाणीकरण। Lgr5-GFP चूहों-व्युत्पन्न छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके, विभिन्न उपचारों पर आंतों की स्टेम कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव के स्तर का विशेष रूप से विश्लेषण करना संभव है। इस प्रोटोकॉल को एक्सोजेनस अणुओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि माइक्रोबायोटा-व्युत्पन्न म्यूरिल-डाइपेप्टाइड (एमडीपी) 10, आरओएस संतुलन पर, चयनित यौगिकों के साथ ऑर्गेनोइड्स को उत्तेजित करने के बाद।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों को इंस्टीट्यूट पाश्चर उपयोग समिति द्वारा अनुमोदन के बाद और फ्रांसीसी कृषि मंत्रालय संख्या 2016-0022 द्वारा किया गया था। सभी चरणों को एक ऊतक संस्कृति हुड के अंदर किया जाता है।

1. अभिकर्मकों और आंतों organoids culturing के लिए सामग्री की तैयारी

  1. विकास संस्कृति माध्यम तैयार करने के लिए, उन्नत DMEM / F-12 को 1x glutamine, 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) समाधान, HEPES के 10 mM, मुरीन EGF के 50 ng / mL, माउस R-Spondin1 के 500 ng / mL के मुरीन नोगिन 500 ng / mL के 20 μg / mL के साथ पूरक मिश्रण करें ( सामग्री की तालिका देखें)। तहखाने के निष्कर्षण के दौरान कमरे के तापमान (आरटी) पर माध्यम छोड़ दें।
    नोट: -20 °C पर ऐलीकोट में अप्रयुक्त माध्यम को फ्रीज करें। फ्रीज और पिघलने से बचें।
  2. उन्नत DMEM / F-12 के 40 mL के साथ एक 50 mL ट्यूब भरें और इसे बर्फ पर रखें।
    नोट: अप्रयुक्त माध्यम को 4 °C पर रखें। इसका उपयोग ऑर्गेनोइड्स पासिंग के लिए किया जाएगा।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में सेल कल्चर प्लेटों (μ-स्लाइड 8 अच्छी तरह से कक्षों और / या 96-अच्छी तरह से गोल नीचे) को पूर्व-गर्म करें।
  4. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (BMM) ( सामग्री की तालिका देखें) बर्फ पर एलीकोट (प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले या क्रिप्ट चढ़ाना से पहले कम से कम 1 घंटे)।
    नोट: बीएमएम जल्दी से ठोस हो जाएगा अगर ठंडा नहीं रखा जाता है।
  5. 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान को DPBS (DPBS-P/S) में जोड़कर धोने /फ्लशिंग समाधान तैयार करें।
  6. ठंडे DPBS-P/S के 10 mL के साथ एक 100 मिमी पेट्री-डिश भरें। 10 मिलीलीटर DPBS के साथ छह 15 mL ट्यूब भरें और उन्हें F1 से F6 तक लेबल करें।
  7. DPBS में 0.5 M EDTA से कमजोर पड़ने से 10 mM EDTA समाधान के 30 mL तैयार करें। 10 mM EDTA के 10 mL के साथ दो 15 mL ट्यूबों को भरें, और उन्हें E1 और E2 लेबल करें।
  8. सभी समाधानों को 4 डिग्री सेल्सियस पर पहले से ठंडा रखें और प्रक्रिया के दौरान उन्हें बर्फ पर रखें।

2. आंत्र organoids संस्कृति

  1. राष्ट्रीय नियमों और विनियमों के अनुसार एक 8-10 सप्ताह पुराने Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) माउस का बलिदान करें।
  2. ग्रहणी (पेट से 5 सेमी) और इलियम (सीकम से 10 सेमी) के बीच के क्षेत्र को शामिल करने वाले जेजुनम के 5-8 सेमी को इकट्ठा करें और बर्फ पर ठंडे डीपीबीएस-पी / एस में रखें।
  3. ठंडे DPBS-P/S के 5-10 mL के साथ flushing द्वारा आंतों की सामग्री को साफ करें।
    नोट: घर का बना फ्लशिंग सिरिंज एक 10 मिलीलीटर सिरिंज नोजल पर एक 200 μL टिप plugging द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।
  4. गेंद टिप कैंची का उपयोग करके आंत को अनुदैर्ध्य रूप से खोलें ( सामग्री की तालिका देखें) (ऊतक को नुकसान पहुंचाने से रोकने के लिए)।
  5. संदंश का उपयोग करके, ऊतक को कमरे के तापमान पर ठंडे डीपीबीएस-पी / एस युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और इसे कुल्ला करने के लिए हिलाएं।
  6. एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ, आकांक्षा द्वारा आंत को पकड़ो और इसे 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, जिसे ई 1 लेबल किया गया है जिसमें 10 एमएल ठंडा 10 एमएम ईडीटीए होता है।
  7. ट्यूब को 3 बार उलटें और 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  8. एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करते हुए, 10 एमएल DPBS युक्त ट्यूब F1 में ऊतक को स्थानांतरित करें। 2 मिनट के लिए भंवर (सामान्य भंवर पर, हाथ से ट्यूब को पकड़ना और यह सुनिश्चित करना कि आंत अच्छी तरह से घूमती है)।
  9. एक पेट्री डिश में अंश के 10 μL रखो और एक माइक्रोस्कोप के तहत अंश की गुणवत्ता का आकलन करें।
    नोट: सभी भंवर चरण अधिकतम गति से किए जाते हैं, और प्रत्येक अंश की गुणवत्ता का मूल्यांकन माइक्रोस्कोप (चित्रा 1) के तहत किया जाना चाहिए।
  10. एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ, आकांक्षा द्वारा आंत को पकड़ो और इसे ट्यूब एफ 2 में स्थानांतरित करें जिसमें 10 एमएल डीपीबीएस और 2 मिनट के लिए भंवर होता है।
  11. चरण 2.10 को दोहराएं, ट्यूब F3 में ऊतक को स्थानांतरित करते हुए जिसमें 10 mL DPBS और 2 मिनट के लिए भंवर होता है।
  12. चरण 2.6 के रूप में इनक्यूबेशन EDTA को दोहराएं, 10 mM EDTA युक्त ट्यूब E2 में ऊतक को स्थानांतरित करना।
  13. ट्यूब को 3 बार उलटें और 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  14. चरण 2.10 को दोहराएं, 10 mL DPBS और भंवर युक्त ट्यूब F4 में ऊतक को 3 मिनट के लिए स्थानांतरित करना।
  15. चरण 2.14 को दोहराएं, 10 mL DPBS और भंवर युक्त ट्यूब F5 में ऊतक को 3 मिनट के लिए स्थानांतरित करना।
  16. चरण 2.15 को दोहराएं, ट्यूब F6 में ऊतक को स्थानांतरित करते हुए जिसमें 10 mL DPBS और भंवर 3 मिनट के लिए होते हैं।
  17. विल्ली और महत्वपूर्ण मलबे को खत्म करने के लिए एक 50 मिली ट्यूब (बर्फ पर) में एक 70 μm सेल छलनी के माध्यम से गुरुत्वाकर्षण द्वारा फ़िल्टरिंग सबसे अच्छा अंशों को संयोजित करें।
    नोट: आमतौर पर, F5 और F6 कई crypts और कम मलबे युक्त अंश हैं।
  18. क्रिप्ट्स को 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 150 x g पर स्पिन करें।
  19. ट्यूब को खाली करें, गोली को यांत्रिक रूप से बाधित करें, और 5 मिलीलीटर ठंडे डीएमईएम / एफ 12 जोड़ें।
  20. एक पेट्री डिश में निलंबन के 10 μL रखो और एक माइक्रोस्कोप के तहत मैन्युअल रूप से एलीकोट में मौजूद क्रिप्ट्स की संख्या की गणना करें।
    नोट: एकल कोशिकाओं या छोटे मलबे की गिनती न करें।
  21. μL में आवश्यक क्रिप्ट्स निलंबन की मात्रा (V) की गणना करें, यह देखते हुए कि 300 क्रिप्ट्स प्रति अच्छी तरह से मढ़वाया जाता है, W कुओं की संख्या है, और N निलंबन के 10 μL में से गिने गए क्रिप्ट्स की संख्या है। क्रिप्ट्स को एक नई 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: V = 300 x W x 10/N. यदि नियोजित प्रयोग में एक छोटी मात्रा का उपयोग किया जाता है, तो एक 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग किया जा सकता है।
  22. 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 200 x g पर क्रिप्ट्स स्पिन।
  23. सावधानी से एक पिपेट का उपयोग करके supernatant निकालें।
  24. यंत्रवत् गोली को बाधित करें और धीरे-धीरे 90 क्रिप्ट्स / μL की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए विकास संस्कृति माध्यम जोड़ें।
  25. 30 crypts/μL की अंतिम सांद्रता रखने के लिए undiluted BMM के 2 वॉल्यूम जोड़ें। मिश्रण में हवा के बुलबुले पेश किए बिना सावधानीपूर्वक ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    नोट: हमेशा बीएमएम solidification से बचने के लिए बर्फ पर ट्यूब रखें।
  26. प्लेट 10 क्रिप्ट्स / BMM मिश्रण के 10 μL प्रत्येक अच्छी तरह से में मिश्रण. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए, राउंड-बॉटम 96-वेल प्लेटों का उपयोग करें। प्रत्येक के केंद्र में 10 μL वितरित करें और एक गुंबद के रूप में अच्छी तरह से। इमेजिंग के लिए, μ-स्लाइड 8 का अच्छी तरह से उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें) और 10 μL को एक पतली परत के रूप में जमा करें।
    नोट: प्लेट इमेजिंग परख के लिए एक पतली परत के रूप में organoids में उनके में गहराई इमेजिंग सक्षम करने के लिए.
  27. बीएमएम को ठोस करने की अनुमति देने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए प्लेट छोड़ दें। प्लेट को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 15 मिनट के लिए रखें।
  28. प्रत्येक अच्छी तरह से में विकास माध्यम के 250 μL जोड़ें, ध्यान रखने के लिए BMM अलग नहीं है.
  29. प्लेटों को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रखें।
  30. संस्कृति के दिनों 4 और 6 के बीच आरओएस विश्लेषण करें। अन्यथा, माध्यम को बदलें और कई और लंबे नवोदित संरचनाओं की उपस्थिति के बाद ऑर्गेनोइड्स को विभाजित करें और जब मृत कोशिकाएं ऑर्गेनोइड्स लुमेन में जमा होती हैं।

3. Organoids passaging

  1. संस्कृति के 6 वें दिन से छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स को पास करना शुरू करें, जब महत्वपूर्ण नवोदित संरचनाएं बन गई हैं, और ऑर्गेनोइड्स लुमेन अंधेरे हो गए हैं।
    नोट: मृत कोशिकाओं, मलबे और बलगम के संचय के कारण ऑर्गेनोइड का लुमेन अंधेरा हो जाता है। विभाजित करने से पहले ऑर्गेनोइड्स को अधिक बढ़ने से बचें। विभाजन अनुपात ऑर्गेनोइड्स के विकास पर निर्भर करता है। दिन 6 पर 1: 2 और दिन 10 पर 1: 3 के अनुपात के साथ ऑर्गेनोइड्स को पास करने की सिफारिश की जाती है।
  2. ठंडे उन्नत DMEM / F-12 के 4 mL के साथ एक 15 mL ट्यूब भरें और इसे बर्फ पर रखें।
    नोट: यहाँ, एक 96-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के लिए वॉल्यूम प्रदान किए जाते हैं। यदि किसी भिन्न स्वरूप का उपयोग किया जाता है, तो तदनुसार वॉल्यूम समायोजित करें.
  3. ध्यान से BMM गुंबदों को छूने के बिना कुओं से एक पिपेट या एक वैक्यूम पंप के साथ माध्यम aspirate, और इसे त्याग दें।
  4. ठंड उन्नत DMEM / F-12 प्रति अच्छी तरह से के 100 μL जोड़ें। बीएमएम को तोड़ने और 15 एमएल ट्यूब में कुएं की सामग्री को स्थानांतरित करने के लिए पिपेट ऊपर और नीचे।
  5. 200 μL ठंडा उन्नत DMEM / F-12 के साथ अच्छी तरह से धोएं और इसे एक ही ट्यूब में इकट्ठा करें।
    नोट: यदि एक ही प्रयोगात्मक स्थिति से कई कुओं passaging, कुओं की सामग्री एक ही 15 mL संग्रह ट्यूब में pooled किया जा सकता है।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 100 x g पर 15 mL संग्रह ट्यूब स्पिन।
  7. supernatant त्यागें और गोली के लिए ठंडा उन्नत DMEM / F-12 के 1mL जोड़ें। एक P1000 टिप का उपयोग करते हुए, एक P10 टिप (फ़िल्टर के बिना) लें और कम से कम 20 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  8. ट्यूब के लिए ठंडा उन्नत DMEM / F-12 के 4 मिलीलीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर स्पिन करें।
  9. गोली को परेशान किए बिना एक पिपेट या एक वैक्यूम पंप के साथ supernatant aspirate. फिर, गोली को यंत्रवत् रूप से बाधित करें।
  10. विकास संस्कृति माध्यम (2: 1 अनुपात) में पतला BMM जोड़ें। ध्यान से मिश्रण में हवा के बुलबुले पेश किए बिना ऊपर और नीचे पिपेट।
  11. प्लेट 10 क्रिप्ट्स / BMM मिश्रण के 10 μL प्रत्येक अच्छी तरह से में मिश्रण.
  12. बीएमएम को ठोस करने की अनुमति देने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए प्लेट रखें। प्लेट को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 15 मिनट के लिए रखें।
  13. प्रत्येक अच्छी तरह से में विकास माध्यम के 250 μL जोड़ें।
    नोट: BMM को अलग न करने के लिए सावधान रहें।
  14. प्लेटों को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रखें।

4. आंतों organoids में ऑक्सीडेटिव तनाव का आकलन करने के लिए अभिकर्मकों और सामग्री की तैयारी

  1. अवरोधक एन-एसिटाइलसिस्टीन (एनएसी) का 250 एमएम स्टॉक समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें), डीपीबीएस के 245 μL के साथ 10 मिलीग्राम को फिर से निलंबित करें। 1 mM अंतिम एकाग्रता पर उपयोग करें।
  2. Inducer Tert-butyl hydroperoxide (tBHP) का 50 mM स्टॉक समाधान तैयार करें, पानी में 70%, DPBS के 496.8 μL के साथ 3.22 μL पतला करें। 200 μM अंतिम एकाग्रता पर उपयोग करें।
  3. फ्लो साइटोमेट्री अध्ययन के लिए, डीएमएसओ में स्टॉक समाधान 1/10 को पतला करके एक फ्लोरोजेनिक जांच ( सामग्री की तालिका देखें) का 250 μM काम करने वाला समाधान तैयार करें। 1 μM अंतिम एकाग्रता पर उपयोग करें।
    नोट: जैसा कि निर्माता के निर्देशों में इंगित किया गया है, फ्लोरोजेनिक जांच प्रकाश और ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील है। स्टॉक और एलीकोट खुले नहीं होने चाहिए और कई बार बंद नहीं होने चाहिए।
  4. इमेजिंग अध्ययन के लिए, डीएमएसओ में स्टॉक समाधान 1/2 को पतला करके फ्लोरोजेनिक जांच का 1.25 एमएम काम करने वाला समाधान तैयार करें। 5 μM अंतिम एकाग्रता पर उपयोग करें।
  5. DPBS में 0.1 μg / mL DAPI का एक अंतिम समाधान तैयार करें, प्रवाह cytometry परख में मृत सेल भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए।
  6. डीपीबीएस में Hoechst 33342 से 1.25 मिलीग्राम / एमएल पतला करें। इमेजिंग परख में परमाणु धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए 5 μg / mL अंतिम एकाग्रता पर उपयोग करें।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर फिनोल लाल के बिना गर्म DMEM.
    नोट:: इन चरणों का वर्णन नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण जो किसी भी assays में शामिल किया जाना चाहिए, चित्रा 2A में इंगित शर्तों का उपयोग कर का उपयोग कर। परख विरोधी या समर्थक ऑक्सीडेंट यौगिकों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चरण समान हैं, और एकमात्र अंतर तब होता है जब फ्लोरोजेनिक डाई का उपयोग करने से पहले यौगिकों को जोड़ा जाता है।

5. confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 डी organoids में ऑक्सीडेटिव तनाव के दृश्य

  1. μ-स्लाइड 8 अच्छी तरह से कक्षों में मढ़वाया organoids ले लो और इसी कुओं में 1 μL एनएसी स्टॉक समाधान जोड़ने के लिए 1 mM की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. 200 μM की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए संबंधित कुओं में 1 μL tBHP स्टॉक समाधान जोड़ें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. 5 μM की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए फ्लोरोजेनिक जांच के 1.25 mM कमजोर पड़ने के प्रति 1 μL प्रति अच्छी तरह से 1 μL जोड़ें।
  6. 5 μg / mL की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए Hoescht के 1.25 mg / mL कमजोर पड़ने के प्रति 1 μL अच्छी तरह से जोड़ें।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. BMM को परेशान किए बिना माध्यम को निकालें। धीरे से, फिनोल लाल के बिना गर्म DMEM के 250μL जोड़ें।
    नोट: यदि एक दीर्घकालिक अधिग्रहण की योजना बनाई गई है, तो फिनोल लाल के बिना DMEM में विकास कारक यौगिक जोड़ें।
  9. एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर organoids छवि एक थर्मिक कक्ष और गैस की आपूर्ति है कि फ्लोरोजेनिक जांच (ROS) का पता लगाता है के साथ सुसज्जित.
    नोट: फ्लोरोजेनिक जांच के लिए उत्तेजना / उत्सर्जन (पूर्व / ईएम) 644/665 है, होचस्ट (नाभिक) के लिए पूर्व / एम 361/486 है, और जीएफपी (एलजीआर 5-जीएफपी चूहों से आंतों के स्टेम सेल) के लिए पूर्व / ईएम 488/ 510 है। स्टेम कोशिकाओं में संकेतों का पता लगाने के लिए एक 63x तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग किया जाता है। नमूनों के बीच लेजर सेटिंग्स न बदलें। आरओएस उत्पादन के अवलोकन की अनुमति देने के लिए एक 20x उद्देश्य का उपयोग किया जा सकता है।
  10. आरओएस सिग्नल के लिए लेजर तीव्रता और समय जोखिम स्थापित करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें और जांचें कि यह संकेत नकारात्मक नियंत्रण में कम है।
  11. आईपीस स्क्रीन का उपयोग करके स्लाइड को जीएफपी ऑर्गेनोइड्स की पहचान करने और लेजर तीव्रता को समायोजित करने के लिए।
    नोट:: यह चरण मैन्युअल रूप से किया जाता है।
  12. पूरे ऑर्गेनोइड की एक सिली हुई छवि प्राप्त करने के लिए पदों को परिभाषित करें। कोशिकाओं की एक परत दिखाने वाले ऑर्गेनोइड्स का एक खंड प्राप्त करने के लिए 25 μm (चरण आकार 5 μm) का एक z-स्टैक सेटअप करें।
    नोट:: सेटअप को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए माइक्रोस्कोप उपयोगकर्ता मैन्युअल को देखें। जीवित कोशिकाओं का उपयोग करके, अधिग्रहण इनक्यूबेशन के अंत के बाद 1 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए।
  13. छवियों को एक ओपन-सोर्स इमेज प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर में खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  14. जेड-स्टैक के माध्यम से जाएं और उस अनुभाग का चयन करें जिसमें ऑर्गेनोइड्स के मध्य को अच्छी तरह से दर्शाया गया है और चयनित क्षेत्र के साथ एक नई छवि बनाएं।
  15. 5.15.1 - 5.15.5 चरणों के अनुसार छवियों को मापें।
    1. फ्रीहैंड लाइन टूल का चयन करें।
    2. नाभिक के बाद एक रेखा खींचें।
      नोट:: केवल स्टेम सेल का विश्लेषण किया जाता है, तो GFP-धनात्मक कक्षों को प्रस्तुत करने वाले क्षेत्रों का ही चयन करें।
    3. ल्यूमिनल मलबे को शामिल किए बिना लाइन के साथ सेल परत को कवर करने के लिए लाइन की चौड़ाई बढ़ाएं।
    4. ROS संकेत के लिए चैनल का चयन करें और चयनित क्षेत्र में प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने और मूल्यों को एनोटेट करें।
    5. एक रेखा खींचें जहां कोई संकेत नहीं है और पृष्ठभूमि की फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापें जिसे अंतिम तीव्रता प्राप्त करने के लिए पिछले मूल्य पर घटाया जाएगा।

6. प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर विघटित organoids पर ऑक्सीडेटिव तनाव का परिमाणीकरण

  1. 1 mM की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के लिए कुओं में 1 μL एनएसी स्टॉक समाधान जोड़ें।
    नोट: 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेटों में मढ़वाया organoids का उपयोग करें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. 200 μM की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए संबंधित कुओं में 1 μL tBHP स्टॉक समाधान जोड़ें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. एक multichannel पिपेट के साथ, संलग्न BMM को परेशान किए बिना माध्यम को हटा दें और इसे एक और 96-अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट में स्थानांतरित करें। इस प्लेट को एक तरफ रख दें।
  6. ट्रिप्सिन के 100 μL जोड़ें, और एक multichannel पिपेट के साथ, BMM को नष्ट करने के लिए कम से कम पांच बार पिपेट ऊपर और नीचे।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर 5 मिनट से अधिक के लिए इनक्यूबेट न करें।
  8. एक multichannel पिपेट के साथ, पिपेट ऊपर और नीचे कम से कम पांच बार organoids को अलग करने के लिए.
  9. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर स्पिन करें।
  10. प्लेट को उलटकर supernatant को छोड़ दें। इसी कुओं के लिए चरण 6.3 में एकत्र किए गए माध्यम को वापस जोड़ें और 5 बार ऊपर और नीचे पिपेट करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  11. 1 μM की अंतिम सांद्रता पर फ्लोरोजेनिक प्रोब जोड़ें। 250 μM कमजोर पड़ने से प्रति अच्छी तरह से 1 μL जोड़ें और 37 °C और 5% CO2 पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: उपकरण की सेटिंग्स (चित्रा 2B) के लिए आवश्यक कुओं के लिए फ्लोरोजेनिक जांच न जोड़ें।
  12. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर स्पिन करें।
  13. 0.1 μg/mL DAPI समाधान के 250 μL के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। उचित प्रवाह cytometry ट्यूबों में नमूनों को स्थानांतरित करें, बर्फ पर ट्यूब रखें, और विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।
    नोट:: DAPI के बजाय PBS उपकरण की सेटिंग्स (चित्रा 2B) के लिए आवश्यक कुओं के लिए जोड़ें।
  14. मोनो-दाग वाले नमूनों का उपयोग करके प्रत्येक fluorophore के लिए unstained नियंत्रण और लेजर वोल्टेज पर आगे और पक्ष तितर बितर वोल्टेज सेटिंग्स का अनुकूलन।
  15. एक उपयुक्त गेटिंग रणनीति (चित्रा 4A) का उपयोग करके, न्यूनतम 20,000 ईवेंट एकत्र करें।
    नोट: 50,000 ईवेंट पसंद किए जाते हैं। विस्तृत अधिग्रहण सेटिंग्स उपयोग किए गए उपकरण के अनुसार भिन्न होती हैं।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल की अवधारणा के प्रमाण के रूप में, Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 माउस लाइन से प्राप्त क्रिप्ट्स का उपयोग किया गया था जिसमें आंतों की स्टेम कोशिकाएं मोज़ेक GFP अभिव्यक्ति प्रदर्शित करती हैं, जिसे बार्कर एट अल द्वारा स्थापित किया गया था, शुरू में आंतों के स्टेम सेल 10 को चिह्नित करने और उनकी GFP अभिव्यक्ति के आधार पर इन कोशिकाओं को मैप करने की अनुमति देने के लिए। इस प्रकार विभिन्न उपचारों पर एक विशिष्ट सेल प्रकार की आबादी में आरओएस स्तरों की तुलना करने के लिए एक मॉडल प्रदान किया जाता है। एक आरओएस अवरोधक (एनएसी) का उपयोग किया गया था, और एक प्रेरक (टीबीएचपी), जो सेलुलर आरओएस पर कार्य करने के लिए जाना जाता है ताकि उनके स्तरों में परिवर्तन की कल्पना की जा सके।

आंकड़े 1A और 1B आंतों organoid संस्कृति के लिए crypts निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान प्राप्त अंशों F1 और F4 के प्रतिनिधि छवियों को दिखाते हैं। प्रत्येक अंश को निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान माइक्रोस्कोप या दूरबीन के तहत जांचा जाना चाहिए ताकि क्रिप्ट्स टुकड़ी का पालन किया जा सके और विली, एकल कोशिकाओं या मलबे के बजाय क्रिप्ट्स में समृद्ध उन अंशों को परिभाषित किया जा सके। चुने गए अंशों को फिर एक साथ पूल किया जाता है और 70 μm सेल छलनी के माध्यम से पारित किया जाता है ताकि विली के सभी शेष टुकड़ों को हटा दिया जा सके और केवल क्रिप्ट्स (चित्रा 1 सी) के साथ तैयारी प्राप्त की जा सके। क्रिप्ट्स बीएमएम में एम्बेडिंग के कुछ घंटों के भीतर बंद होने लगते हैं, और डी 1 पर, गोल ऑर्गेनोइड्स देखे गए थे (चित्रा 1 डी)। 3-5 दिनों के बाद, ऑर्गेनोइड्स नवोदित संरचनाओं के साथ दिखाई देंगे जो "नवगठित क्रिप्ट्स" का प्रतिनिधित्व करते हैं। ऑर्गेनोइड्स आरओएस विश्लेषण के लिए तैयार हैं (आंकड़े 1 ई और 1 एफ)।

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रोटोकॉल में, जांच के साथ इनक्यूबेट किए गए ऑर्गेनोइड्स युक्त स्लाइड को होचस्ट (पूर्व / ईएम: 361/486), जीएफपी (पूर्व / ईएम: 488 / 510) और फ्लोरोजेनिक जांच (पूर्व / ईएम): 644 / 665) संकेतों का पता लगाने के लिए लेजर और फिल्टर से लैस एक कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया गया था। 20x हवा और 63x तेल विसर्जन उद्देश्य से सुसज्जित एक confocal माइक्रोस्कोप ROS के दृश्य की अनुमति दी। Lgr5-GFP चूहों में, GFP-सकारात्मक कोशिकाएं Lgr5-व्यक्त करने वाली आंतों की स्टेम कोशिकाएं हैं। अनुपूरक चित्रा 1 20x उद्देश्य के साथ प्राप्त प्रतिनिधि छवियों को दर्शाता है जो कई ऑर्गेनोइड्स में आरओएस का अवलोकन प्रदान करता है। चित्रा 3 प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है, 63x तेल उद्देश्य के साथ प्राप्त, आंतों के organoids जीएफपी, गैर-उपचारित (NT), या पूर्व incubated या ROS अवरोधक एनएसी के साथ नहीं व्यक्त, और ROS inducer tBHP के साथ 30 मिनट के लिए उत्तेजित या नहीं।

अवरोधक की उपस्थिति में, ऑर्गेनोइड के लुमेन में निहित मृत कोशिकाओं से एकमात्र संकेत दिखाई देता है। गैर-उपचारित ऑर्गेनोइड में, बेसल आरओएस स्तर दिखाए जाते हैं, यह साबित करते हुए कि स्टेम कोशिकाएं विभेदित कोशिकाओं की तुलना में उच्च आरओएस का उत्पादन करती हैं (माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के अनुसार, आरओएस सिग्नल को गैर-स्टेम कोशिकाओं में भी देखा जा सकता है)। जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाएं फ्लोरोजेनिक जांच की उपस्थिति में प्रेरक के साथ एक अधिक महत्वपूर्ण साइटोप्लाज्मिक सिग्नल प्रस्तुत करती हैं, यह दर्शाती हैं कि उपचार के बाद विशेष रूप से स्टेम कोशिकाओं में आरओएस का स्तर बढ़ता है।

चित्रा 4 405 एनएम, 488 एनएम और 630 एनएम लेजर से लैस फ्लो साइटोमीटर का उपयोग करके आंतों के ऑर्गेनोइड्स में आरओएस उत्पादन का विश्लेषण करते समय प्राप्त प्रतिनिधि परिणामों को दर्शाता है। चित्रा 4ए में प्रस्तुत गेटिंग रणनीति पूरे ऑर्गेनोइड्स सेल आबादी के स्तर पर आरओएस उत्पादन का मूल्यांकन करना संभव बनाती है, भौतिक मापदंडों और डीएपीआई बहिष्करण (एसएससी-ए बनाम एफएससी-ए और डीएपीआई बनाम एफएससी-ए) और एफएससी-एच बनाम एफएससी-ए) के आधार पर बरकरार और जीवित कोशिकाओं को परिभाषित करती है या केवल आंतों के स्टेम कोशिकाओं में, जीएफपी उच्च संकेत के साथ कोशिकाओं पर आगे गेटेड होती है। चित्रा 4B 50,000 घटनाओं के संग्रह पर कुल आबादी में ROS स्तर ों को दर्शाता है। गैर-उपचारित (NT) कोशिकाओं में बेसल ROS का स्तर अवरोधक (एनएसी) के साथ उत्तेजना के बाद कम हो जाता है, और इसके विपरीत, प्रेरक (tBHP) के साथ चुनौती के बाद बढ़ता है। कोशिकाओं को अवरोधक के साथ पूर्व-उपचारित किया जाता है और फिर प्रेरक के साथ उत्तेजित किया जाता है जो अकेले प्रेरक के साथ उत्तेजित लोगों की तुलना में कम स्तर पर पेश करते हैं। परिणामों को तब उचित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था, जो औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) प्राप्त कर रहा था। प्राप्त मानों को गैर-उपचारित कोशिकाओं पर एक अनुपात के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, जैसा कि चित्र 4 B के दाईं ओर प्रस्तुत ग्राफ में दिखाया गया है। चित्रा 4C स्टेम कोशिकाओं में चित्रा 4B में वर्णित समान मापदंडों को दर्शाता है, जो GFP सकारात्मक कोशिकाओं के रूप में गेटेड है, जो एनएसी उपचार पर ROS स्तर में 3.5 गुना कमी दिखाता है और गैर-उत्तेजित कोशिकाओं पर tBHP उपचार पर 4 गुना वृद्धि दिखाता है। यह परिणाम दर्शाता है कि इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, विशिष्ट यौगिकों के साथ ऑर्गेनोइड्स के उपचार पर पूरे सेल आबादी के स्तर पर या जीएफपी सकारात्मक स्टेम कोशिकाओं में आरओएस स्तरों में अंतर को मापना संभव है।

Figure 1
चित्र 1: क्रिप्ट्स और ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि छवियां। (ए) ईडीटीए के साथ पहली इनक्यूबेशन के बाद प्राप्त अंश F1 का उदाहरण, कुछ मलबे (स्टार) और क्रिप्ट्स (सर्कल) के साथ विली (वर्ग) में समृद्ध। (बी) क्रिप्ट्स में समृद्ध अंश एफ 4 का उदाहरण। (सी) एक 70 μm सेल छलनी (स्केल बार, 200 μm) के साथ निस्पंदन के बाद प्राप्त केवल अलग crypts प्रस्तुत निलंबन. (D, E, और F)। विशिष्ट ऑर्गेनोइड्स क्रमशः 1, 3, और 5 दिनों के बाद प्राप्त किए गए थे, बीएमएम (स्केल बार, 100 μm) में क्रिप्ट्स को एम्बेड करने के बाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रयोगात्मक योजना की रूपरेखा। (ए) प्रत्येक प्रयोग में शामिल इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली शर्तें: गैर-उपचारित कुओं (एनटी), प्रेरित करने वाले-उपचारित कुओं (टर्ट-ब्यूटाइल हाइड्रोपेरोक्साइड - टीबीएचपी), अवरोधक-उपचारित कुओं (एन-एसिटाइल सिस्टीन - एनएसी), और अवरोधक- और प्रेरक-उपचारित कुओं (एनएसी-टीबीएचपी)। (बी) प्रवाह cytometry परख के लिए प्लेट प्रारूप. प्रत्येक स्थिति को तीन प्रतियों (लाइन ए) में चढ़ाया जाता है। लाइन बी, सी, और डी में केवल फ्लोरोजेनिक जांच, केवल डीएपीआई, या गैर-दाग (एनएस) नमूनों के साथ प्रवाह साइटोमीटर सेटिंग के लिए कुएं शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ऑर्गेनोइड्स में आरओएस स्टेनिंग की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां। सिले हुए चित्रों को एक उच्च गति वाले EMCCD कैमरा, 63x / 1.4 तेल उद्देश्य, और भट्ठा 35 μm से सुसज्जित एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया था, लेजर 405, 488, 640, और फ़िल्टर 460/50, 535/50, 700/75 क्रमशः Hoechst, GFP, और फ्लोरोजेनिक जांच प्राप्त करने के लिए। ऑर्गेनोइड्स गैर-उपचारित (एनटी) के कॉन्फोकल ऑप्टिकल वर्गों, आरओएस-इनहिबिटर (एनएसी) के साथ इलाज किया जाता है, आरओएस-इनड्यूसर (टीबीएचपी) के साथ, या आरओएस अवरोधक के साथ पूर्व-उपचारित और फिर आरओएस-इनड्यूसर (एनएसी-टीबीएचपी) के साथ प्रेरित किया जाता है। ग्रे में, नाभिक Hoechst के साथ सना हुआ; हरे रंग में, Lgr5-GFP कोशिकाओं; लाल रंग में, फ्लोरोजेनिक जांच (स्केल बार, 50 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ऑर्गेनोइड्स से व्युत्पन्न कोशिकाओं में आरओएस का प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण। (ए) प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व: सेल आकार के लिए गेटिंग (ऑर्गेनोइड्स लुमेन में संचित मृत कोशिकाओं और मलबे का बहिष्करण), जीवित कोशिकाओं के लिए गेटिंग (डीएपीआई-लेजर 405 को शामिल नहीं करने वाली कोशिकाएं), एकल कोशिकाओं के लिए गेटिंग (डबलट भेदभाव), और स्टेम सेल (जीएफपी सकारात्मक कोशिकाएं-लेजर 488) (एफएससी: फॉरवर्ड स्कैटर, एसएससी: साइड स्कैटर)। आरओएस सिग्नल को 630 लेजर का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया है। (बी) बाईं ओर, हिस्टोग्राम को एक उपयुक्त सॉफ़्टवेयर के साथ प्राप्त किया गया था, जिसमें विभिन्न नमूनों में कुल जीवित आबादी के लिए तीव्रता आरओएस संकेतों को दिखाया गया था (प्रति शर्त लगभग 10,000 घटनाओं को गेट करने के बाद): गैर-उपचारित; एनएसी: अवरोधक-उपचारित; tBHP inducer-treated; एनएसी-टीबीएचपी: अवरोधक- और प्रेरक-उपचार। दाईं ओर, NT नमूनों पर MFI मानों के लिए परिकलित अनुपात का एक विशिष्ट उदाहरण प्रति शर्त 3 नमूनों से शुरू होने वाले एक प्रयोग के दौरान प्राप्त किया गया (मतलब ± एसडी) (*** P = 0.0003)। (C) GFP सकारात्मक जनसंख्या (प्रति शर्त 1,000 घटनाओं) (* P = 0.02) के लिए B के समान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: ऑर्गेनोइड्स में आरओएस धुंधला होने की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां। सिले हुए images एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ एक उच्च गति EMCCD कैमरा, 20x उद्देश्य, और भट्ठा 35 μm के साथ सुसज्जित के साथ प्राप्त किया गया था, लेजर 405, 488, 640, और फिल्टर 460/50, 535/50, 700/75 क्रमशः Hoechst, GFP, और फ्लोरोजेनिक जांच प्राप्त करने के लिए का उपयोग कर। ऑर्गेनोइड्स गैर-उपचारित (एनटी) के कॉन्फोकल ऑप्टिकल वर्गों, आरओएस-इनहिबिटर (एनएसी) के साथ इलाज किया जाता है, आरओएस-इनड्यूसर (टीबीएचपी) के साथ, या आरओएस अवरोधक के साथ पूर्व-उपचारित और फिर आरओएस-इनड्यूसर (एनएसी-टीबीएचपी) के साथ प्रेरित किया जाता है। ग्रे में, नाभिक Hoechst के साथ सना हुआ; हरे रंग में, Lgr5-GFP कोशिकाओं; लाल रंग में, फ्लोरोजेनिक जांच (स्केल बार, 100 μm)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यह काम मुरीन जेजुनल क्रिप्ट्स को अलग करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करता है, उन्हें 3 डी ऑर्गेनोइड्स में संस्कृति करता है, और ऑर्गेनोइड्स में आरओएस का विश्लेषण करता है, पूरे ऑर्गेनोइड्स के गुणात्मक माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ आरओएस-संवेदनशील फ्लोरोजेनिक जांच के संयोजन से ऑर्गेनोइड्स और मात्रात्मक आरओएस माप ऑर्गेनोइड पृथक्करण के बाद एकल कोशिकाओं पर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके।

इस विधि में पहला महत्वपूर्ण कदम crypts निष्कर्षण प्रक्रिया है। दरअसल, क्रिप्ट्स तैयारी की गुणवत्ता सफल ऑर्गेनोइड्स गठन की कुंजी है। इसलिए समृद्ध क्रिप्ट्स और कुछ सेलुलर मलबे या मरने वाली कोशिकाओं के साथ अंश प्राप्त करना आवश्यक है। क्रिप्ट्स को प्रोटोकॉल में इंगित किए गए लोगों के लिए अलग-अलग अंशों में पाया जा सकता है, क्योंकि पृथक्करण माउस की उम्र और स्वास्थ्य स्थिति के साथ भिन्न हो सकता है। ईडीटीए ऊष्मायन की संख्या को तदनुसार संशोधित किया जा सकता है। यदि क्रिप्ट्स अंश 4 के बाद अलग नहीं होते हैं, तो एक 3 मिनट ईडीटीए इनक्यूबेशन को दोहराया जाना चाहिए। इसके विपरीत, मान लीजिए कि पहले ईडीटीए इनक्यूबेशन के बाद क्रिप्ट्स पहले से ही अलग हो जाते हैं। उस मामले में, दूसरा ईडीटीए इनक्यूबेशन आवश्यक नहीं हो सकता है, और डीपीबीएस में अनुक्रमिक भंवर चरणों को तब तक किया जाना चाहिए जब तक कि अंशों को मलबे से रहित पर्याप्त क्रिप्ट्स के साथ प्राप्त नहीं किया जाता है। यदि कोई पृथक्करण नहीं होता है, तो सुनिश्चित करें कि Ca2 + और Mg2 + के बिना DPBS का उपयोग संग्रह ट्यूबों को तैयार करने के लिए किया जाता है, और EDTA को एक नए समाधान के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है। क्रिप्ट्स नाजुक संरचनाएं हैं, इसलिए उन्हें बर्फ पर जितना संभव हो उतना रखा जाना चाहिए और अलगाव के बाद तेजी से चढ़ाया जाना चाहिए।

ऑर्गेनोइड्स की खेती के लिए विभिन्न प्लेटों और ड्रॉप वॉल्यूम का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, क्रिप्ट्स को क्रिप्ट्स एकाग्रता, बीएमएम ड्रॉप की मात्रा, और प्रत्येक कुएं में जोड़े गए माध्यम को समायोजित करने के बाद 24 या 48 अच्छी तरह से प्लेटों में भी चढ़ाया जा सकता है। एकाधिक बूंदों को एक 12- या 6-अच्छी तरह से प्लेट में एक ही कुएं में चढ़ाया जा सकता है। आम तौर पर, क्रिप्ट आकार में कमी करते हैं और संस्कृति के दिन 1 पर छोटे गोल ऑर्गेनोइड्स बनाने के लिए गोल होते हैं। नई कलियों के गठन को चढ़ाना के 2-3 दिनों के बाद मनाया जाना चाहिए।

आंतों के स्टेम कोशिकाओं में आरओएस के स्तर में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए, Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 माउस लाइन का लाभ उठाया गया था। इस मॉडल की एक चेतावनी नॉक-इन एलील की चयनात्मक चुप्पी और जीएफपी अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप मोज़ेकवाद है, जो स्टेम कोशिकाओं या पूरे क्रिप्ट्स के पैच में अनुपस्थित हो सकती है। इमेजिंग प्रोटोकॉल के दौरान, सभी ऑर्गेनोइड्स जीएफपी को व्यक्त करने वाली स्टेम कोशिकाओं को प्रस्तुत नहीं करेंगे; इसलिए, सभी ऑर्गेनोइड्स पर विचार नहीं किया जाएगा जब तक कि कोशिकाओं की स्थानिक स्थिति पर भरोसा करना संभव न हो। इसके बजाय, फ्लो साइटोमेट्री प्रोटोकॉल में जीएफपी नकारात्मक सेल आबादी का विश्लेषण करते समय इस पर विचार किया जाना चाहिए। दरअसल, जैसा कि स्थानिक स्थिति पर भरोसा करना असंभव है, जीएफपी-नकारात्मक आबादी गैर-स्टेम कोशिकाओं और जीएफपी-नकारात्मक स्टेम कोशिकाओं से बनी होगी।

यहां आंतों के ऑर्गेनोइड्स में आरओएस के गुणात्मक मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। इस भाग के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू उपयोग किए जाने वाले उद्देश्यों की कार्य दूरी से जुड़ा हुआ है। ऑर्गेनोइड्स बीएमएम में उगाए जाते हैं; वे अच्छी तरह से नीचे से जुड़े नहीं हैं, उद्देश्य फोकस योजना से एक दूरी का परिचय देते हैं। इस कारण से, इस मुद्दे को कम करने के लिए, बीएमएम की एक पतली परत में ऑर्गेनोइड्स को प्लेट करना महत्वपूर्ण है। यहां तक कि इस अनुकूलित सेटिंग में, सभी ऑर्गेनोइड्स पर्याप्त रूप से चित्रित होने के लिए सही स्थिति में नहीं होंगे।

छवियों का एक मात्रात्मक विश्लेषण एक उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जा सकता है, जो प्रोटोकॉल में वर्णित आरओएस सिग्नल चैनल में छवियों की औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता का मूल्यांकन करता है। इस उद्देश्य के लिए, सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण होने के लिए पर्याप्त संख्या में घटनाओं को प्राप्त करने के लिए छवियों की एक उच्च संख्या प्राप्त करना आवश्यक है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, Lgr5-GFP चूहों का उपयोग करके, सभी ऑर्गेनोइड्स GFP को व्यक्त नहीं करेंगे, जिसके लिए काफी संख्या में नमूनों की आवश्यकता होती है।

प्रवाह साइटोमेट्री प्रक्रिया के दौरान, एक महत्वपूर्ण कदम एकल कोशिकाओं में ऑर्गेनोइड्स का पृथक्करण है। यदि पृथक्करण बहुत कठोर है, तो कोशिकाएं मर सकती हैं और डीएनए जारी कर सकती हैं। एक रॉक-इनहिबिटर, वाई -27632, एनोइकिस का मुकाबला करने के लिए, और डीएनएस को पृथक्करण बफर में जोड़ा जा सकता है यदि वे अध्ययन किए गए मार्ग में हस्तक्षेप नहीं करते हैं। ट्रिप्सिन कमजोर पड़ने या कम इनक्यूबेशन बार का उपयोग किया जा सकता है।

अंत में, विभिन्न उपचारों (एंटी- या प्रो-ऑक्सीडेंट) परीक्षण के बाद आरओएस उत्पादन का विश्लेषण करने के लिए सबसे अच्छा समय बिंदु को परिभाषित करना महत्वपूर्ण है। दवाओं के मामले में जो मिनटों या घंटों के भीतर आरओएस को तेजी से प्रेरित करते हैं, इमेजिंग परख का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि परीक्षण किए गए यौगिकों से पहले फ्लोरोजेनिक जांच को जोड़कर अधिकतम प्रेरण कब है। ऑर्गेनोइड्स उत्तेजना के बाद जांच की प्रतिदीप्ति तीव्रता अलग-अलग दिनों में किए गए प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकती है। इसलिए, गैर-उत्तेजित नमूनों के साथ अनुपात की गणना करना और जांच की प्रतिक्रियाशीलता को सत्यापित करने के लिए नियंत्रण (ऑक्सीडेंट / एंटीऑक्सिडेंट) जोड़ना हमेशा महत्वपूर्ण होता है। एनएसी और टीबीएचपी का उपयोग नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था क्योंकि उन्होंने सबसे निर्णायक परिणाम दिए थे। फिर भी, अन्य अभिकर्मकों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि एंटीऑक्सिडेंट के रूप में रेस्वेराट्रोल या ऑक्सीडेंट के रूप में पैराक्वाट / मेनाडिओन। फ्लोरोजेनिक जांच के साथ बहुत लंबे समय तक कोशिकाओं को इनक्यूबेट करना विषाक्त हो सकता है और यहां तक कि सेल रेडॉक्स संतुलन को भी संशोधित कर सकता है, इसलिए इनक्यूबेशन बार भी कसकर नियंत्रित किया जाना चाहिए। जांच के साथ सना हुआ कोशिकाओं को कुछ घंटों के बाद तय और विश्लेषण किया जा सकता है। इस मामले में, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए, DAPI जीवित और मृत कोशिकाओं के बीच भेदभाव नहीं कर सकता है। इसके बजाय, स्थिरीकरण से पहले जीवित / मृत भेदभाव के लिए एक फिक्सेबल डाई का उपयोग किया जाना चाहिए।

Organoids भी कई दिनों के लिए उगाया जा सकता है (7 से अधिक), लेकिन यह जीवित और proliferative कोशिकाओं और मृत कोशिकाओं है कि organoids lumens में जमा की संख्या में वृद्धि होगी, उच्च पृष्ठभूमि पैदा, विशेष रूप से इमेजिंग परख में. यदि फ्लोरोजेनिक जांच संकेत में असामान्य वृद्धि देखी जाती है, तो सुनिश्चित करें कि उत्तेजक यौगिकों को फिर से निलंबित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला समाधान प्रो-ऑक्सीडेंट प्रति से (यानी, इथेनॉल) नहीं है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय विचार करने के लिए एक चिंता यह है कि प्रवाह साइटोमेट्री के बाद लाइव इमेजिंग और सेल पृथक्करण कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित कर सकता है और पृष्ठभूमि संकेत उत्पन्न कर सकता है। प्रयोग के अनुसार ऑर्गेनोइड्स के निर्धारण पर विचार किया जा सकता है। एक और सीमा एक 3 डी मैट्रिक्स में उगाए गए ऑर्गेनोइड्स की गहराई से इमेजिंग में कठिनाई से उत्पन्न होती है। जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है, बीएमएम को इस पहलू को सीमित करने के लिए स्लाइड पर एक पतली परत के रूप में वितरित किया जाना चाहिए।

यहां, प्रोटोकॉल को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोजेनिक डाई का उपयोग करके डिज़ाइन किया गया है। इसका प्राथमिक लाभ ऑर्गेनोइड्स के बहु-रंग धुंधला होने के साथ इसकी संगतता है ताकि विशिष्ट सेल प्रकार। उदाहरण के लिए, फ्लोरोजेनिक जांच इनक्यूबेशन के तुरंत बाद सेल सतह मार्करों के लिए एंटीबॉडी धुंधला हो जाता है, विशेष उप-प्रकारों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, जांच एक विशिष्ट आरओएस प्रजातियों के लिए विशिष्ट नहीं है क्योंकि यह सुपरऑक्साइड, नाइट्राइट पेरोक्साइड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड 11,12,13 का पता लगा सकती है। इस कारण से, इसका उपयोग आमतौर पर वैश्विक ऑक्सीडेटिव तनाव का पता लगाने के लिए किया जाता है। हालांकि एक साइटोसोलिक-केवल जांच के रूप में व्यावसायीकरण किया गया है, चयनित फ्लोरोजेनिक जांच को माइटोकॉन्ड्रिया 14 तक पहुंचने के लिए पाया जा सकता है। चूंकि इसकी विशिष्टता विभिन्न सेलुलर संदर्भों के बीच भिन्न हो सकती है, इसलिए हम संभव होने पर आरओएस को मापने के लिए अन्य पूरक दृष्टिकोणों का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। माइटोकॉन्ड्रिया-जनित सुपरऑक्साइड ऋणायनों का पता लगाने के लिए विशिष्ट जांच जैसे वैकल्पिक रंजक का उपयोग किया जा सकता है10। उच्च संवेदनशीलता के साथ विशिष्ट आरओएस प्रजातियों का पता लगाने के लिए केमिलुमिनेसेंट जांच का एक प्रदर्शन भी विकसित किया गया था, जैसे कि लूसिफेरिन-आधारित जांच 15,16। इनमें विवो इमेजिंग के साथ संगत होने का लाभ है लेकिन विशिष्ट सेल प्रकारों के साथ आरओएस उत्पादन को मैप करने के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल को अन्य प्रकार के ऑर्गेनोइड्स पर लागू किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, मानव बायोप्सी से व्युत्पन्न कोलोनिक ऑर्गेनोइड्स। इस मामले में, संस्कृति विकास माध्यम को तदनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए17। आंतों की कोशिकाओं के भीतर रेडॉक्स मशीनरी का आगे विश्लेषण करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में वर्णित ऑर्गेनोइड्स संस्कृति और पृथक्करण प्रक्रियाओं को पूरे ऑर्गेनोइड्स या फ्लोरोसेंस एक्टिवेटेड सेल सॉर्टेड (एफएसीएस) ऑर्गेनोइड्स कोशिकाओं पर ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटिओमिक दृष्टिकोण के साथ जोड़ा जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (एएनआर) अनुदान 17-CE14-0022 (i-Stress) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) The Jackson Laboratory
Growth culture medium
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) ThermoFisher 12634010
B-27 Supplement, minus vitamin A ThermoFisher 12587010 Stock Concentration: 50x
GlutaMAX (glutamine) ThermoFisher 35050038 Stock Concentration: 100x
Hepes ThermoFisher 15630056 Stock Concentration: 1 M
Murine EGF R&D 2028-EG-200 Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS
murine Noggin R&D 1967-NG/CF Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS
Murine R-spondin1 R&D 3474-RS-050 Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS
N-2 Supplement ThermoFisher 17502048 Stock Concentration: 100x
Penicillin-Streptomycin (P/S) ThermoFisher 15140122 Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin)
Material
70 µm cell strainer Corning 352350
96-well round bottom Corning 3799
ball tip scissor Fine Science Tools GMBH 14086-09
CellROX® Deep Red Reagent ThermoFisher C10422
DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) ThermoFisher D1306 stock at 10 mg/mL
DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) ThermoFisher 14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) ThermoFisher A1896701
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570 stock at 10 mg/mL
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) Corning 356231 once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C
µ-Slide 8 Well chambers Ibidi 80826
N-acetylcysteine (NAC) Sigma A9165
tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) Sigma 458139
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) ThermoFisher 12604013
UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 ThermoFisher 15575020
Y-27632 Sigma Y0503 Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation
Programs and Equipment
Attune NxT (Flow Cytometer) ThermoFischer Flow cytometer analyzer
Fiji/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/downloads images generation
FlowJo BD Bioscience FACS analysis
Observer.Z1 Zeiss confocal system
Opterra (swept-field confocal) Bruker confocal system
high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 Photometrics confocal system
Prism GraphPad Software statistical analysis

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References

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जीव विज्ञान अंक 175 Murine आंत्र organoids आरओएस का पता लगाने प्रवाह cytometry विश्लेषण लाइव इमेजिंग का पता लगाने आंतों स्टेम कोशिकाओं ROS संवेदनशील डाई ऑक्सीडेटिव तनाव फ्लोरोजेनिक जांच
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों-संवेदनशील फ्लोरोजेनिक जांच का उपयोग करके मुरीन आंतों के ऑर्गेनोइड्स में ऑक्सीडेटिव तनाव का विश्लेषण करना
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Stedman, A., Levy, A., Sansonetti, P. J., Nigro, G. Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe. J. Vis. Exp. (175), e62880, doi:10.3791/62880 (2021).

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