Summary
Den nåværende protokollen beskriver en metode for å oppdage reaktive oksygenarter (ROS) i tarm murin organoider ved hjelp av kvalitativ avbildning og kvantitative cytometrianalyser. Dette arbeidet kan potensielt utvides til andre fluorescerende sonder for å teste effekten av utvalgte forbindelser på ROS.
Abstract
Reaktive oksygenarter (ROS) spiller viktige roller i intestinal homeostase. ROS er naturlige biprodukter av cellemetabolisme. De produseres som respons på infeksjon eller skade på slimhinnenivå, da de er involvert i antimikrobielle responser og sårheling. De er også kritiske sekundære budbringere, som regulerer flere veier, inkludert cellevekst og differensiering. På den annen side fører overdreven ROS-nivåer til oksidativt stress, noe som kan være skadelig for celler og favorisere tarmsykdommer som kronisk betennelse eller kreft. Dette arbeidet gir en enkel metode for å oppdage ROS i tarm murin organoider ved levende avbildning og strømning cytometri, ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig fluorogen sonde. Her beskriver protokollen analysen av effekten av forbindelser som modulerer redoksbalansen i tarmorganoider og oppdager ROS-nivåer i spesifikke tarmcelletyper, eksemplifisert her ved analyse av tarmstammecellene genetisk merket med GFP. Denne protokollen kan brukes med andre fluorescerende sonder.
Introduction
Reaktive oksygenarter (ROS) er naturlige biprodukter av cellulær metabolisme. De kan også produseres aktivt av spesialiserte enzymatiske komplekser som membranbundet NADPH-Oxidases (NOX) og Dual Oxidases (DUOX), som genererer superoksid anion og hydrogenperoksid1. Ved å uttrykke antioksidantenzymer og ROS-scavengers, kan cellene finjustere sin redoksbalanse, og dermed beskytte vev homeostase2. Selv om ROS kan være svært giftig for cellene og skade DNA, proteiner og lipider, er de avgjørende signalmolekyler2. I tarmepitelet er det nødvendig med moderate ROS-nivåer for stam- og stamcelleproliferasjon3; høye ROS-nivåer fører til apoptose4. Kronisk oksidativt stress er knyttet til mange gastrointestinale sykdommer, som inflammatoriske tarmsykdommer eller kreft. Som et eksempel, i en musemodell av Wnt-drevet tarmkreft, ble forhøyet ROS-produksjon gjennom aktivering av NADPH-oksider funnet å være nødvendig for kreftceller hyperproliferasjon5,6. Å definere hvordan tarmceller, spesielt stamceller, styrer oksidativt stress og hvordan det cellulære miljøet kan påvirke denne kapasiteten, er avgjørende for å forstå etiologien til denne sykdommen bedre7.
I et vev presenterer forskjellige celletyper en basal oksidativ tilstand som kan variere i henhold til deres funksjon og metabolisme og uttrykket av forskjellige nivåer av oksidant- og antioksidantmolekyler4,7. Overvåking av ROS in vivo er veldig utfordrende. Cellegjennomtrengelige fargestoffer som avgir fluorescens i henhold til deres redokstilstand, er utviklet for å visualisere og måle cellulær ROS i levende celler og dyr. Imidlertid avhenger deres effekt av deres diffusjon inne i levende vev og deres raske avlesning, noe som gjør dem vanskelige å bruke i dyremodeller8.
Tidligere ble studien av effekten av forbindelser på ROS-generering gjort ved hjelp av cellelinjer, men dette gjenspeiler kanskje ikke in vivo-situasjonen . Den intestinale organoidmodellen, utviklet av gruppen Clevers9, muliggjør veksten av intestinale primære celler ex vivo. Kultur av tarmkrypter i matriser, i nærvær av definerte vekstfaktorer, fører til tredimensjonale strukturer, kalt organoider (mini-gut), som reproduserer krypt-villus-organisasjonen, med celler fra de forskjellige epiteliale avstamningene som foringer en intern lumen, og tarmstammecellene som ligger i små krypterlignende fremspring.
Her, ved å dra nytte av denne modellen, beskrives en enkel metode for å studere oksidativt stress i primære tarmceller ved encellet oppløsning ved å legge til et kommersielt tilgjengelig ROS-sensitivt fargestoff i organoidkulturmediet.
Platelesere brukes ofte til å oppdage ROS-produksjon i en total befolkning. Denne protokollen bruker strømningscytometri eller bildeanalyse for å oppdage ROS i en bestemt celletype med genetisk modifiserte celler eller spesifikk antistofffarging. Dette arbeidet innebærer mus intestinal organoid kultur og ROS visualisering ved konfikal avbildning og kvantifisering ved strømning cytometri. Ved hjelp av Lgr5-GFP mus-avledede små intestinale organoider, er det mulig å spesifikt analysere nivået av oksidativt stress i tarmstammeceller ved forskjellige behandlinger. Denne protokollen kan tilpasses for å teste påvirkningen av eksogene molekyler, for eksempel mikrobiota-avledet muramyl-dipeptid (MDP)10, på ROS-balansen, etter å ha stimulert organoider med de valgte forbindelsene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført etter godkjenning av Institut Pasteur Use Committee og av det franske landbruksdepartementet nr. Alle trinnene utføres inne i en vevskulturhette.
1. Fremstilling av reagenser og materialer for dyrking av intestinale organoider
- For å forberede vekstkulturmediet blander du avansert DMEM/F-12 supplert med 1x glutamin, 1x penicillin/streptomycin (P/S)-løsning, 10 mM HEPES, 50 ng/ml murine EGF, 20 μg/ml murine Noggin 500 ng/ml mus R-Spondin1 (se tabell over materialer). La mediet stå ved romtemperatur (RT) under kryptens ekstraksjon.
MERK: Frys det ubrukte mediet i aliquots ved -20 °C. Unngå frysing og opptining. - Fyll et 50 ml rør med 40 ml avansert DMEM/F-12 og hold det på is.
MERK: Hold det ubrukte mediet ved 4 °C. Den vil bli brukt til organoider som passerer. - Forvarm cellekulturplatene (μ-Slide 8 brønnkamre og/eller 96-brønns rund bunn) i inkubatoren ved 37 °C.
- Tine kjellermembranmatrisen (BMM) (se Materialtabell) aliquots på is (før du starter protokollen eller minst 1 time før plating krypter).
MERK: BMM vil raskt størkne hvis den ikke holdes kald. - Forbered vaske-/spyleløsning med 1% penicillin-streptomycinløsning til DPBS (DPBS-P/S).
- Fyll en 100 mm petriskål med 10 ml kald DPBS-P/S. Fyll seks 15 ml rør med 10 ml DPBS og merk dem fra F1 til F6.
- Forbered 30 ml 10 mM EDTA-oppløsning ved fortynning fra 0,5 M EDTA i DPBS. Fyll to 15 ml rør med 10 ml 10 mM EDTA, og merk dem E1 og E2.
- Hold alle løsninger forhåndskjølt ved 4 °C og hold dem på isen under prosedyren.
2. Intestinal organoider kultur
- Ofre en 8-10 uker gammel Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) mus i henhold til nasjonale regler og forskrifter.
- Samle 5-8 cm av jejunum som omfatter regionen mellom tolvfingertarmen (5 cm fra magen) og ileum (10 cm fra cecum) og hold i kaldt DPBS-P/S på is.
- Rengjør tarminnholdet ved å skylle med 5-10 ml kaldt DPBS-P/S.
MERK: Hjemmelagde spylesprøyter kan oppnås ved å koble en 200 μL spiss til en 10 ml sprøytedyse. - Åpne tarmen langsgående ved hjelp av kulespisssaks (se Materialtabell) (for å forhindre skade på vevet).
- Bruk tang, overfør vevet til en petriskål som inneholder kald DPBS-P / S ved romtemperatur og rist det for å skylle.
- Med en pasteurpipette i plast griper du tarmen ved aspirasjon og overfører den til et 15 ml rør merket E1 som inneholder 10 ml kald 10 mM EDTA.
- Snu røret 3 ganger og inkuber på is i 10 min.
- Bruk en pasteurpipette i plast til å overføre vevet i rør F1 som inneholder 10 ml DPBS. Vortex i 2 min (på normal virvel, holder røret for hånd og sikrer at tarmen virvler pent).
- Sett 10 μL av fraksjonen i en petriskål og vurder kvaliteten på fraksjonen under et mikroskop.
MERK: Alle virveltrinn utføres med maksimal hastighet, og kvaliteten på hver brøkdel bør vurderes under mikroskopet (figur 1). - Med en pasteurpipette i plast, ta tak i tarmen ved aspirasjon og overfør den i rør F2 som inneholder 10 ml DPBS og virvel i 2 minutter.
- Gjenta trinn 2.10, og oversend vevet i rør F3 som inneholder 10 ml DPBS og virvel i 2 min.
- Gjenta EDTA-inkubasjon som i trinn 2.6, og overse vevet i rør E2 som inneholder 10 mM EDTA.
- Snu røret 3 ganger og inkuber på is i 5 min.
- Gjenta trinn 2.10, og oversend vevet i rør F4 som inneholder 10 ml DPBS og virvel i 3 minutter.
- Gjenta trinn 2.14, og oversend vevet i rør F5 som inneholder 10 ml DPBS og virvel i 3 min.
- Gjenta trinn 2.15, og oversend vevet i rør F6 som inneholder 10 ml DPBS og virvel i 3 min.
- Kombiner de beste fraksjonene filtrering med tyngdekraften gjennom en 70 μm cellesil i et 50 ml rør (på is) for å eliminere villi og betydelig rusk.
MERK: Vanligvis er F5 og F6 brøkene som inneholder mange krypter og mindre rusk. - Snurr kryptene ved 150 x g ved 4 °C i 3 minutter.
- Tøm røret, forstyrre pellet mekanisk, og tilsett 5 ml kald DMEM/F12.
- Sett 10 μL av suspensjonen i en petriskål og tell antall krypter som er tilstede i aliquot manuelt under et mikroskop.
MERK: Ikke tell enkeltceller eller små rusk. - Beregn volumet (V) av krypter suspensjon som kreves i μL, med tanke på at 300 krypter er belagt per brønn, W er antall brønner, og N er antall krypter telt ut av 10 μL av suspensjonen. Overfør kryptene til et nytt 15 ml rør.
MERK: V = 300 x B x 10/N. Hvis et lite volum brukes i det planlagte eksperimentet, kan et 1,5 ml sentrifugerør brukes. - Snurr kryptene ved 200 x g ved 4 °C i 3 minutter.
- Fjern forsiktig supernatanten ved hjelp av en pipette.
- Mekanisk forstyrre pellets og forsiktig legge til vekstkultur medium for å oppnå en konsentrasjon på 90 krypter / μL.
- Tilsett 2 bind ufortynnet BMM for å ha en endelig konsentrasjon på 30 krypter/μL. Rør forsiktig opp og ned uten å introdusere luftbobler i blandingen.
MERK: Hold alltid røret på isen for å unngå BMM-størkning. - Plate 10 μL av kryptene/BMM blandes inn i hver brønn. For Flow-cytometrianalyse, bruk rundbunns 96-brønnsplater. Fordel 10 μL i midten av hver brønn og en kuppel. For avbildning, bruk μ-slide 8 brønn (se Tabell over materialer) og deponer 10 μL som et tynt lag.
MERK: Plate organoidene som et tynt lag for bildeanalysen for å muliggjøre deres dyptgående bildebehandling. - La platen stå i 5 min ved RT slik at BMM kan størkne. Plasser platen i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 i 15 minutter.
- Tilsett 250 μL vekstmedium i hver brønn, pass på at du ikke løsner BMM.
- Plasser platene i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
- Utfør ROS-analysen mellom kulturdagene 4 og 6. Ellers endrer du mediet og deler organoidene etter utseendet av flere og lange spirende strukturer og når døde celler akkumuleres i organoidene lumen.
3. Organoider som passerer
- Begynn å passere små intestinale organoider fra den sjette kulturdagen, når betydelige spirende strukturer har dannet seg, og organoidene lumen har blitt mørke.
MERK: Organoidens lumen blir mørk på grunn av opphopning av døde celler, rusk og slim. Unngå å la organoidene vokse over før de splittes. Splittingsforholdet avhenger av organoidenes vekst. Passering av organoidene med et forhold på 1:2 på dag 6 og 1:3 på dag 10 anbefales. - Fyll et 15 ml rør med 4 ml kaldt Avansert DMEM/F-12 og hold det på is.
MERK: Her er volumer for en 96-brønns kulturplate gitt. Hvis et annet format brukes, justerer du volumet tilsvarende. - Aspirer forsiktig mediet med en pipette eller en vakuumpumpe fra brønnene uten å berøre BMM-kuplene, og kast den.
- Tilsett 100 μL kald Avansert DMEM/F-12 per brønn. Pipette opp og ned for å bryte BMM og overføre innholdet i brønnen til 15 ml-røret.
- Vask brønnen med 200 μL kald Avansert DMEM/F-12 og samle den i samme rør.
MERK: Ved passering av flere brønner fra samme eksperimentelle tilstand kan innholdet i brønnene samles i samme 15 ml oppsamlingsrør. - Snurr oppsamlingsrøret på 15 ml ved 100 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Kast supernatanten og tilsett 1 ml kald Avansert DMEM/F-12 til pelletsen. Bruk en P1000-spiss til å ta opp en P10-spiss (uten filter) og pipette opp og ned minst 20 ganger.
- Tilsett 4 ml kald Avansert DMEM/F-12 til røret. Spinn ved 300 x g i 5 min ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten med en pipette eller en vakuumpumpe uten å forstyrre pelletsen. Deretter forstyrrer pellet mekanisk.
- Tilsett BMM fortynnet i vekstkulturmedium (2:1-forhold). Rør forsiktig opp og ned uten å introdusere luftbobler i blandingen.
- Plate 10 μL av kryptene/BMM blandes inn i hver brønn.
- Oppbevar platen i 5 min ved RT slik at BMM kan størkne. Plasser platen i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 i 15 minutter.
- Tilsett 250 μL vekstmedium i hver brønn.
MERK: Pass på at du ikke løsner BMM. - Plasser platene i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
4. Fremstilling av reagenser og materialer for å vurdere oksidativt stress i tarmorganoider
- Forbered en 250 mM lagerløsning av inhibitor N-acetylcysteine (NAC) (se materialtabell), resuspend 10 mg med 245 μL DPBS. Bruk ved 1 mM endelig konsentrasjon.
- Forbered en 50 mM lagerløsning av induser Tert-butylhydroksyd (tBHP), 70% i vann, fortynn 3,22 μL med 496,8 μL DPBS. Brukes ved 200 μM endelig konsentrasjon.
- For Flow cytometristudien, lag en 250 μM arbeidsløsning av en fluorogen sonde (se Materialtabell) ved å fortynne lagerløsningen 1/10 i DMSO. Brukes ved 1 μM endelig konsentrasjon.
MERK: Som angitt i produsentens anvisninger, er den fluorogene sonden følsom for lys og oksygen. Aksjer og aliquots bør ikke være åpne og lukke for mange ganger. - For bildestudien, lag en 1,25 mM arbeidsløsning av den fluorogene sonden ved å fortynne lagerløsningen 1/2 i DMSO. Brukes ved 5 μM endelig konsentrasjon.
- Forbered en endelig løsning på 0,1 μg/ml DAPI i DPBS, som skal brukes til dødcellediskriminering i Flow-cytometrianalysen.
- Fortynn Hoechst 33342 til 1,25 mg/ml i DPBS. Brukes ved 5 μg/ml endelig konsentrasjon som skal brukes til kjernefysisk farging i bildeanalysen.
- Varm DMEM uten fenolrød ved 37 °C.
MERK: Disse trinnene beskriver bruk av negative og positive kontroller som må inkluderes i analyser, ved hjelp av betingelsene som er angitt i figur 2A. Analysen kan brukes til å teste anti- eller prooksidantforbindelser. Trinnene er de samme, og den eneste forskjellen er når forbindelsene tilsettes før du bruker det fluorogene fargestoffet.
5. Visualisering av oksidativt stress hos 3D-organoider ved konfikal mikroskopi
- Ta organoidene belagt i brønnkamrene μ-Slide 8 og tilsett 1 μL NAC-lagerløsning i de tilsvarende brønnene for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 mM.
- Inkuber i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2.
- Tilsett 1 μL tBHP lagerløsning i de tilsvarende brønnene for å oppnå en endelig konsentrasjon på 200 μM.
- Inkuber i 30 min ved 37 °C og 5 % CO2.
- Tilsett 1 μL per brønn av 1,25 mM fortynning av den fluorogene sonden for å oppnå en endelig konsentrasjon på 5 μM.
- Tilsett 1 μL per brønn av 1,25 mg/ml fortynning av Hoescht for å oppnå en endelig konsentrasjon på 5 μg/ml.
- Inkuber i 30 min ved 37 °C og 5 % CO2.
- Fjern mediet uten å forstyrre BMM. Tilsett forsiktig 250μL varm DMEM uten fenolrød.
MERK: Hvis et langsiktig oppkjøp er planlagt, legg til vekstfaktorer forbindelser til DMEM uten fenol rød. - Bilde organoidene ved hjelp av et konfokalt mikroskop utstyrt med ettermisk kammer og gassforsyning som oppdager den fluorogene sonden (ROS).
MERK: Eksitasjonen/utslippet (ex/em) for den fluorogene sonden er 644/665, ex/em for Hoechst (nuclei) er 361/486, og ex/em for GFP (tarmstammecelle fra Lgr5-GFP-musene) er 488/510. Et 63x olje nedsenkingsmål brukes til å oppdage signaler i stamceller. Ikke endre laserinnstillingene mellom prøver. En 20x målsetting kan brukes til å gi en oversikt over ROS-produksjon. - Bruk den positive kontrollen til å sette opp laserintensitet og tidseksponering for ROS-signalet og kontroller at dette signalet er lavere i den negative kontrollen.
- Bruk okularskjermen til å identifisere GFP-organoidene som uttrykker og justerer laserintensiteten.
MERK: Dette trinnet utføres manuelt. - Definer posisjoner for å oppnå et sydd bilde av hele organoiden. Sett opp en z-stabel på 25 μm (trinnstørrelse 5 μm) for å få en del av organoidene som viser ett lag med celler.
MERK: Se brukerhåndboken for mikroskopet for å optimalisere oppsettet. Ved hjelp av levende celler bør oppkjøpet gjøres innen 1 time etter slutten av inkubasjonen. - Åpne bildene i en programvare for bildebehandling med åpen kildekode (se Tabell over materialer).
- Gå gjennom z-stabelen og velg delen der midten av organoidene er godt representert og opprett et nytt bilde med det valgte området.
- Kvantifisere bildene i henhold til trinn 5.15.1 - 5.15.5.
- Velg frihåndslinjeverktøyet.
- Tegn en linje etter kjernene.
MERK: Velg bare områder som presenterer GFP-positive celler hvis bare stamceller analyseres. - Øk linjebredden for å dekke cellelaget med linjen uten å inkludere lysrester.
- Velg kanalen for ROS-signalet, og mål fluorescensintensiteten i det valgte området og kommenter verdiene.
- Tegn en linje der det ikke er noe signal, og mål den fluorescerende intensiteten til bakgrunnen som vil bli trukket fra den forrige verdien for å få den endelige intensiteten.
6. Kvantifisering av oksidativt stress på de dissosierte organoidene ved bruk av strømningscytometer
- Tilsett 1 μL NAC-lagerløsning i brønnene for negative kontroller for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 mM.
MERK: Bruk organoidene som er belagt i de 96-brønns rundbunnsplatene. - Inkuber i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2.
- Tilsett 1 μL tBHP lagerløsning i de tilsvarende brønnene for å oppnå en endelig konsentrasjon på 200 μM.
- Inkuber i 30 min ved 37 °C og 5 % CO2.
- Med en flerkanals pipette, fjern mediet uten å forstyrre den vedlagte BMM og overfør det til en annen 96-brønns rund bunnplate. Hold platen til side.
- Tilsett 100 μL trypsin, og med en flerkanals pipette, pipette opp og ned minst fem ganger for å ødelegge BMM.
- Inkuber i ikke mer enn 5 min ved 37 °C og 5 % CO2.
- Med en flerkanals pipette, pipette opp og ned minst fem ganger for å dissosiere organoidene.
- Spinn på 300 x g i 5 min ved RT.
- Kast supernatanten ved å invertere platen. Tilsett mediet som ble samlet inn i trinn 6.3 til de tilsvarende brønnene, og resuspender cellene ved å pipettere opp og ned 5 ganger.
- Tilsett den fluorogene sonden ved den endelige konsentrasjonen på 1 μM. Tilsett 1 μL per brønn fra 250 μM fortynning og inkuber i 30 min ved 37 °C og 5 % CO2.
MERK: Ikke tilsett den fluorogene sonden i brønnene som trengs for instrumentets innstillinger (figur 2B). - Spinn på 300 x g i 5 min ved RT.
- Resuspend cellene med 250 μL av 0,1 μg / ml DAPI-løsning. Overfør prøvene i de riktige Flow-cytometrirørene, hold rørene på is, og fortsett med analysen.
MERK: Tilsett PBS i stedet for DAPI i brønnene som trengs for instrumentets innstillinger (figur 2B). - Optimaliser innstillingene for fremover- og sidespredningsspenning på ubegrunnet kontroll og laserspenninger for hver fluorofor ved hjelp av monofargede prøver.
- Bruk en passende gatingstrategi (figur 4A) og samle inn minst 20 000 hendelser.
MERK: 50 000 arrangementer foretrekkes. Detaljerte anskaffelsesinnstillinger varierer avhengig av instrumentet som brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et konseptbevis for den beskrevne protokollen ble kryptene hentet fra lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 muselinje brukt der tarmstammeceller viser mosaikk GFP-uttrykk, som ble etablert av Barker et al., for å karakterisere tarmstammeceller10 i utgangspunktet og tillate å kartlegge disse cellene basert på deres GFP-uttrykk. En modell er dermed gitt for å sammenligne ROS-nivåer i en bestemt celletypepopulasjon med forskjellige behandlinger. En ROS-hemmer (NAC) ble brukt, og en induser (tBHP), kjent for å handle på cellulær ROS for å visualisere endringer i nivåene.
Figur 1A og 1B viser representative bilder av fraksjoner F1 og F4 oppnådd under krypter utvinning prosedyren for tarm organoid kultur. Hver brøk må kontrolleres under et mikroskop eller kikkert under ekstraksjonsprosedyren for å følge krypter løsrivelse og definere disse fraksjonene beriket i krypter, i stedet for villi, enkeltceller eller rusk. De valgte fraksjonene samles deretter sammen og passeres gjennom en 70 μm cellesil for å fjerne alle gjenværende fragmenter av villi og oppnå et preparat med bare krypter (figur 1C). Kryptene begynner å lukkes innen få timer etter innbygging i BMM, og ved D1 ble det observert runde organoider (figur 1D). Etter 3-5 dager vil organoidene vises med spirende strukturer som representerer de "nyopprettede kryptene". Organoidene er klare for ROS-analyse (figur 1E og 1F).
I protokollen for avbildning av oksidativt stress ved konfokal mikroskopi, lysbildet som inneholder organoidene, inkubert med sonden, ble avbildet med et konfokalt fluorescensmikroskop utstyrt med lasere og filtre for å oppdage Hoechst (ex /em: 361/486), GFP (ex/em: 488/510) og den fluorogene sonden (ex/em): 644/665) signaler. Et konfokalt mikroskop utstyrt med 20x luft og 63x olje nedsenking mål tillot visualisering av ROS. I Lgr5-GFP-mus er GFP-positive celler Lgr5-uttrykkende tarmstammeceller. Supplerende figur 1 viser representative bilder innhentet med 20x-målet som gir en oversikt over ROS i flere organoider. Figur 3 viser representative bilder, oppnådd med 63x oljemål, av intestinale organoider som uttrykker GFP, ikke-behandlet (NT), eller forhåndsinkubert eller ikke med ROS-hemmeren NAC, og stimulert eller ikke i 30 minutter med ROS-induseren tBHP.
I nærvær av inhibitoren er det eneste signalet fra de døde cellene som finnes i organoidens lumen synlig. I den ikke-behandlede organoiden vises basale ROS-nivåer, som viser at stamceller produserer høyere ROS enn differensierte celler (i henhold til mikroskopinnstillingene kan ROS-signalet også visualiseres i ikke-stamceller). GFP-positive celler presenterer et mer signifikant cytoplasmisk signal med induseren i nærvær av den fluorogene sonden, noe som viser at ROS-nivåene øker spesielt i stamceller etter behandling.
Figur 4 viser representative resultater oppnådd ved analyse av ROS-produksjon i intestinale organoider stimulert eller ikke med ROS-hemmer eller induser, ved hjelp av et Flow-cytometer utstyrt med 405 nm, 488 nm og 630 nm lasere. Gating strategien presentert i figur 4A gjør det mulig å evaluere ROS-produksjon på nivået av hele organoider cellepopulasjonen, definere intakte og levende celler basert på fysiske parametere og DAPI-utelukkelse (SSC-A vs. FSC-A og DAPI vs. FSC-A) og FSC-H vs. FSC-A) eller bare i tarmstammecellene, videre inngjerdet på celler med GFP høyt signal. Figur 4B viser ROS-nivåene i den totale befolkningen ved innsamling av 50 000 hendelser. Basale ROS-nivåer i de ikke-behandlede (NT) cellene reduseres etter stimulering med inhibitoren (NAC), og tvert imot øker etter utfordring med induseren (tBHP). Celler som er forbehandlet med inhibitoren og deretter stimulert med induseren, presenterer et lavere nivå enn de som stimuleres med induseren alene. Resultatene ble deretter analysert ved hjelp av passende programvare, og fikk median fluorescerende intensitet (MFI). De oppnådde verdiene presenteres som et forhold over de ikke-behandlede cellene, som vist i grafen som presenteres til høyre for figur 4B. Figur 4C viser de samme parametrene som er beskrevet i figur 4B i stamcellene, inngjerdet som GFP-positive celler, som viser en 3,5 ganger reduksjon i ROS-nivået ved NAC-behandling og 4 ganger økning ved tBHP-behandling over ikke-stimulerte celler. Dette resultatet viser at etter denne protokollen er det mulig å kvantifisere forskjeller i ROS-nivåer på nivået av hele cellepopulasjonen eller i GFP positive stamceller ved behandling av organoider med spesifikke forbindelser.
Figur 1: Representative bilder av krypter og organoider. (A) Eksempel på brøkdel F1 oppnådd etter den første inkubasjonen med EDTA, beriket i villi (firkantet), med noe rusk (stjerne) og krypter (sirkel). (B) Eksempel på brøk F4 beriket i krypter. (C) Suspensjon som bare presenterer isolerte krypter oppnådd etter filtreringen med en 70 μm cellesil (skalastang, 200 μm). (D, E og F). Typiske organoider ble oppnådd etter henholdsvis 1, 3 og 5 dager, etter å ha innebygd kryptene i BMM (skala bar, 100 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oversikt over den eksperimentelle planen. (A) Forhold som brukes i denne protokollen som inngår i hvert eksperiment: ikke-behandlede brønner (NT), induserbehandlede brønner (tert-Butylhydroksyperoksid - tBHP), inhibitorbehandlede brønner (N-acetylcystein - NAC) og hemmer- og induserbehandlede brønner (NAC-tBHP). (B) Plateformat for strømningscytometrianalysen. Hver betingelse er belagt i triplikat (linje A). Linje B, C og D inkluderer brønner for strømningscytometerinnstilling med bare fluorogen sonde, bare DAPI- eller ikke-fargede (NS) prøver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative konfiskeringsbilder av ROS-farging i organoider. Sydde bilder ble innhentet med et konfokalt mikroskop utstyrt med et høyhastighets EMCCD-kamera, 63x/1,4 oljemål, og spalte 35 μm, ved hjelp av laserne 405, 488, 640 og filtrene 460/50, 535/50, 700/75 for å skaffe seg henholdsvis Hoechst, GFP og fluorogen sonde. Konfokale optiske seksjoner av organoider ikke-behandlet (NT), behandlet med ROS-hemmeren (NAC), med ROS-induseren (tBHP), eller forhåndsbehandlet med ROS-hemmeren og deretter stimulert med ROS-induseren (NAC-tBHP). I grå, kjerner farget med Hoechst; i grønne, Lgr5-GFP-celler; i rødt, den fluorogene sonden (skala bar, 50 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativ strømningscytometrianalyse av ROS i celler avledet fra organoider. (A) Skjematisk representasjon av gating strategien som brukes i strømning cytometri analyse: gating for celleform (utelukkelse av døde celler og rusk akkumulert i organoider lumen), gating for levende celler (celler som ikke inkorporerer DAPI-laser 405), gating for enkeltceller (doublet diskriminering), og stamceller (GFP positive celler-laser 488) (FSC: fremover scatter, SSC: side scatter). ROS-signalet er anskaffet ved hjelp av 630-laseren. (B) Til venstre ble histogrammer oppnådd med en passende programvare som viser intensiteten ROS-signaler for den totale levende befolkningen (etter å ha gitt rundt 10.000 hendelser per tilstand) i de forskjellige prøvene NT: ikke-behandlet; NAC: inhibitor-behandlet; tBHP induserbehandlet; NAC-tBHP: inhibitor- og induserbehandlet. Til høyre er et typisk eksempel på det beregnede forholdet for MFI-verdier over NT-prøvene som ble oppnådd under et eksperiment, fra 3 utvalg per betingelse (gjennomsnittlig ± SD) (*** P = 0,0003). (C) Samme som i B for den positive populasjonen i GFP (1000 hendelser per betingelse) (* P = 0,02). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Representative konfiskeringsbilder av ROS-farging i organoider. Sydde bilder ble oppnådd med et konfokalt mikroskop utstyrt med et høyhastighets EMCCD-kamera, 20x objektiv og spalte 35 μm, ved hjelp av laserne 405, 488, 640 og filtrene 460/50, 535/50, 700/75 for å skaffe seg henholdsvis Hoechst, GFP og fluorogen sonde. Konfokale optiske seksjoner av organoider ikke-behandlet (NT), behandlet med ROS-hemmeren (NAC), med ROS-induseren (tBHP), eller forhåndsbehandlet med ROS-hemmeren og deretter stimulert med ROS-induseren (NAC-tBHP). I grå, kjerner farget med Hoechst; i grønne, Lgr5-GFP-celler; i rød, fluorogen sonde (skala bar, 100 μm). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet gir en trinnvis protokoll for å isolere murine jejunale krypter, dyrke dem i 3D-organoider og analysere ROS i organoider ved å kombinere en ROS-sensitiv fluorogen sonde med kvalitativ mikroskopiavbildning av hele organoider og kvantitativ ROS-måling ved hjelp av strømningscytometri på enkeltceller etter organoid dissosiasjon.
Det første kritiske trinnet i denne metoden er krypteruttrekkingsprosedyren. Faktisk er kvaliteten på krypterpreparat nøkkelen til vellykket organoiddannelse. Det er derfor viktig å oppnå fraksjoner med berikede krypter og få cellulære rusk eller døende celler. Kryptene finnes i forskjellige brøker enn de som er angitt i protokollen, da dissosiasjon kan variere med musens alder og helsestatus. Antall EDTA-inkubasjoner kan endres tilsvarende. Hvis krypter ikke ser ut til å løsne etter brøkdel 4, må en 3 min EDTA-inkubasjon gjentas. Anta omvendt at krypter allerede løsner etter den første EDTA-inkubasjonen. I så fall kan det hende at den andre EDTA-inkubasjonen ikke er nødvendig, og de sekvensielle virveltrinnene i DPBS bør gjøres til brøker oppnås med nok krypter uten rusk. Hvis det ikke oppstår noen dissosiasjon, må du sørge for at DPBS uten Ca2+ og Mg2+ brukes til å forberede oppsamlingsrørene, og erstatte EDTA med en ny løsning. Krypter er skjøre strukturer, så de bør holdes så mye som mulig på is og raskt belagt etter isolasjon.
Ulike plater og slippvolumer kan brukes til å dyrke organoider. For eksempel kan krypter også belegges i 24 eller 48 brønnplater etter justering av kryptkonsentrasjonen, volumet av BMM-dråpen og mediet som legges til i hver brønn. Flere dråper kan være belagt i samme brønn i en 12- eller 6-brønns plate. Generelt reduseres krypter i størrelse og runder opp for å danne små runde organoider på dag 1 av kulturen. Dannelse av nye knopper bør observeres 2-3 dager etter plating.
For å studere endringer i ROS-nivåer i tarmstammeceller, ble fordelen med Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 muselinje tatt. En advarsel om denne modellen er selektiv silencing av den bankede allelen og den påfølgende mosaikken til GFP-uttrykket, som kan være fraværende i flekker av stamceller eller hele krypter. Under bildeprotokollen vil ikke alle organoidene presentere stamceller som uttrykker GFP; Derfor vil ikke alle organoidene bli vurdert med mindre det er mulig å stole på cellenes romlige stilling. I stedet må dette vurderes ved analyse av GFP negativ cellepopulasjon i Flow-cytometriprotokollen. Faktisk, da det er umulig å stole på den romlige posisjonen, vil den GFP-negative befolkningen bestå av ikke-stamceller og GFP-negative stamceller.
Her er det gitt en protokoll for kvalitativ evaluering av ROS i tarmorganoider. Et kritisk aspekt for denne delen er knyttet til arbeidsavstanden til målene som brukes. Organoidene dyrkes i BMM; de er ikke festet til bunnen av brønnen, og introduserer en avstand fra den objektive fokusplanen. Av denne grunn er det viktig å plate organoidene i et tynt lag av BMM, for å minimere dette problemet. Selv i denne optimaliserte innstillingen vil ikke alle organoidene være i riktig posisjon til å bli tilstrekkelig avbildet.
En kvantitativ analyse av bildene kan gjøres ved hjelp av en passende bildeanalyseprogramvare, og evaluerer den gjennomsnittlige fluorescerende intensiteten til bildene i ROS-signalkanalen som beskrevet i protokollen. Til dette formål er det nødvendig å skaffe seg et høyt antall bilder for å få et tilstrekkelig antall hendelser til å være statistisk signifikante. Som nevnt tidligere, ved hjelp av Lgr5-GFP-musene, vil ikke alle organoidene uttrykke GFP, noe som krever et betydelig antall prøver som skal avbildes.
Under strømningscytometriprosedyren er et kritisk skritt dissosiasjonen av organoidene i enkeltceller. Hvis dissosiasjonen er for hard, kan celler dø og frigjøre DNA. En berghemmer, Y-27632, for å motvirke anoikis, og DNAse kan legges til dissosiasjonsbufferen hvis de ikke forstyrrer den studerte banen. Trypsinfortynning eller redusert inkubasjonstid kan brukes.
Til slutt er det avgjørende å definere det beste tidspunktet for å analysere ROS-produksjon etter de forskjellige behandlingene (anti- eller pro-oksidant) testet. Når det gjelder legemidler som raskt induserer ROS i løpet av minutter eller timer, kan bildeanalysen brukes til å bestemme når det er maksimal induksjon ved å legge til den fluorogene sonden før de testede forbindelsene. Sondens fluorescensintensitet etter organoidstimulering kan variere mellom eksperimenter utført på forskjellige dager. Derfor er det alltid viktig å beregne forholdet med de ikke-stimulerte prøvene og legge til kontroller (oksidant / antioksidant) for å verifisere sondens reaktivitet. NAC og tBHP ble brukt som negative og positive kontroller da de ga de mest avgjørende resultatene. Likevel, andre reagenser kan brukes, for eksempel resveratrol som en antioksidant eller paraquat / menadione som oksidanter. Inkubering av celler for lenge med den fluorogene sonden kan være giftig og til og med endre celleredoksbalansen, så inkubasjonstidene må også kontrolleres tett. Celler farget med sonden kan festes og analyseres noen timer etter. I dette tilfellet, for strømningscytometrianalysen, kan DAPI ikke diskriminere mellom levende og døde celler. I stedet bør et fikserbart fargestoff for levende / død diskriminering brukes før fiksering.
Organoider kan også dyrkes i flere dager (mer enn 7), men dette vil øke antall levende og proliferative celler og de døde cellene som akkumuleres i organoidene lumen, og genererer høy bakgrunn, spesielt i bildeanalysen. Hvis det observeres en unormal økning i det fluorogene sondesignalet, må du sørge for at oppløsningen som brukes til å resuspendere stimulerende forbindelser, ikke er prooksidant i seg selv (dvs. etanol).
En bekymring å vurdere når du bruker denne protokollen er at levende avbildning og celledissosiasjon etterfulgt av strømningscytometri kan indusere oksidativt stress i celler og generere et bakgrunnssignal. Fiksering av organoidene kan vurderes i henhold til eksperimentet. En annen begrensning oppstår fra vanskeligheten i den dyptgående avbildningen av organoider dyrket i en 3D-matrise. Som nevnt i protokollen, bør BMM distribueres på lysbildet som et tynt lag for å begrense dette aspektet.
Her er protokollen designet ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig fluorogen fargestoff. Den primære fordelen er kompatibiliteten med flerfarget farging av organoider slik at spesifikke celletyper. For eksempel kan antistofffarging for celleoverflatemarkører umiddelbart etter den fluorogene sondeinkubasjonen gjøres for å oppdage bestemte undertyper. Sonden er imidlertid ikke spesifikk for en bestemt ROS-art, da den kan oppdage Superoksid, Nitrittperoksid og hydrogenperoksid11,12,13. Av denne grunn brukes den vanligvis til å oppdage globalt oksidativt stress. Selv om den kommersialiseres som en cytosolisk sonde, kan den valgte fluorogene sonden bli funnet å nå mitokondrier14. Siden spesifisiteten kan variere mellom ulike mobilkontekster, foreslår vi at du bruker andre komplementære tilnærminger for å måle ROS når det er mulig. Alternative fargestoffer som sonder som er spesifikke for å oppdage mitokondriergenererte superoksidioner, kan brukes10. Et repertoar av chemiluminescent sonder ble også utviklet for å oppdage spesifikke ROS-arter med høy følsomhet, for eksempel luciferinbaserte sonder15,16. Disse har fordelen av å være kompatible med in vivo-avbildning, men kan ikke brukes til å kartlegge ROS-produksjon med bestemte celletyper. Til slutt kan denne protokollen brukes på andre typer organoider, for eksempel koloniale organoider avledet fra menneskelige biopsier. I dette tilfellet bør kulturvekstmediet tilpasses tilsvarende17. For å analysere redoksmaskineriet ytterligere i tarmceller, kan organoidenes kultur- og dissosiasjonsprosedyrer beskrevet i denne protokollen kombineres med trans transcriptomiske og proteomiske tilnærminger på hele organoider eller fluorescensaktiverte cellesorterte (FACS) organoider celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av French National Research Agency (ANR) grant 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
