Summary
El presente protocolo describe un método para detectar especies reactivas de oxígeno (ROS) en los organoides murinos intestinales utilizando imágenes cualitativas y ensayos de citometría cuantitativa. Este trabajo se puede extender potencialmente a otras sondas fluorescentes para probar el efecto de compuestos seleccionados en ROS.
Abstract
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel esencial en la homeostasis intestinal. Las ROS son subproductos naturales del metabolismo celular. Se producen en respuesta a una infección o lesión a nivel de la mucosa, ya que están involucrados en las respuestas antimicrobianas y la cicatrización de heridas. También son mensajeros secundarios críticos, que regulan varias vías, incluido el crecimiento y la diferenciación celular. Por otro lado, los niveles excesivos de ROS conducen al estrés oxidativo, que puede ser perjudicial para las células y favorecer enfermedades intestinales como la inflamación crónica o el cáncer. Este trabajo proporciona un método sencillo para detectar ROS en los organoides murinos intestinales mediante imágenes en vivo y citometría de flujo, utilizando una sonda fluorogénica disponible comercialmente. Aquí el protocolo describe el ensayo del efecto de los compuestos que modulan el equilibrio redox en organoides intestinales y detectan los niveles de ROS en tipos específicos de células intestinales, ejemplificado aquí por el análisis de las células madre intestinales genéticamente marcadas con GFP. Este protocolo se puede utilizar con otras sondas fluorescentes.
Introduction
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son subproductos naturales del metabolismo celular. También pueden ser producidos activamente por complejos enzimáticos especializados como las NADPH-Oxidasas (NOX) y las Oxidasas Duales (DUOX) unidas a la membrana, que generan anión superóxido y peróxido de hidrógeno1. Al expresar enzimas antioxidantes y eliminadores de ROS, las células pueden ajustar finamente su equilibrio redox, protegiendo así la homeostasis tisular2. Aunque las ROS pueden ser altamente tóxicas para las células y dañar el ADN, las proteínas y los lípidos, son moléculas de señalización cruciales2. En el epitelio intestinal, se requieren niveles moderados de ROS para la proliferación de células madre y progenitoras3; los niveles altos de ROS conducen a su apoptosis4. El estrés oxidativo crónico está relacionado con muchas enfermedades gastrointestinales, como las enfermedades inflamatorias intestinales o el cáncer. Como ejemplo, en un modelo de ratón de cáncer intestinal impulsado por Wnt, se encontró que la producción elevada de ROS a través de la activación de NADPH-oxidasas era necesaria para la hiperproliferación de las células cancerosas5,6. Definir cómo las células intestinales, en particular las células madre, las células madre gestionan el estrés oxidativo y cómo el entorno celular puede afectar a esta capacidad es esencial para comprender mejor la etiología de esta enfermedad7.
En un tejido, diferentes tipos de células presentan un estado oxidativo basal que puede variar según su función y metabolismo y la expresión de niveles variables de moléculas oxidantes y antioxidantes4,7. El monitoreo de ROS in vivo es muy desafiante. Se han desarrollado colorantes permeables a las células que emiten fluorescencia de acuerdo con su estado redox para visualizar y medir las ROS celulares en células vivas y animales. Sin embargo, su eficacia depende de su difusión en el interior de los tejidos vivos y de su rápida lectura, lo que dificulta su uso en modelos animales8.
En el pasado, el estudio del efecto de los compuestos en la generación de ROS se realizaba utilizando líneas celulares, pero esto puede no reflejar la situación in vivo . El modelo organoide intestinal, desarrollado por el grupo de Clevers9, permite el crecimiento de células primarias intestinales ex vivo. El cultivo de criptas intestinales en matrices, en presencia de factores de crecimiento definidos, conduce a estructuras tridimensionales, llamadas organoides (mini-intestino), que reproducen la organización cripta-vellosidad, con células de los diferentes linajes epiteliales que recubren una luz interna, y las células madre intestinales que residen en pequeñas protuberancias similares a criptas.
Aquí, aprovechando este modelo, se describe un método simple para estudiar el estrés oxidativo en células intestinales primarias a la resolución de una sola célula mediante la adición de un tinte sensible a ROS disponible comercialmente en el medio de cultivo de organoides.
Los lectores de placas se utilizan a menudo para detectar la producción de ROS en una población total. Este protocolo utiliza citometría de flujo o ensayo de imágenes para detectar ROS en un tipo de célula en particular con células modificadas genéticamente o tinción de anticuerpos específicos. Este trabajo involucra el cultivo de organoides intestinales de ratón y la visualización de ROS por imágenes confocales y la cuantificación por citometría de flujo. Utilizando organoides del intestino delgado derivados de ratones Lgr5-GFP, es posible analizar específicamente el nivel de estrés oxidativo en las células madre intestinales en diferentes tratamientos. Este protocolo se puede adaptar para probar la influencia de moléculas exógenas, como el muramilo-dipéptido derivado de la microbiota (MDP)10, en el equilibrio de las ROS, después de estimular los organoides con los compuestos seleccionados.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo después de la aprobación del Comité de Uso del Instituto Pasteur y del Ministerio de Agricultura francés n.º 2016-0022. Todos los pasos se realizan dentro de una campana de cultivo de tejidos.
1. Preparación de reactivos y materiales para el cultivo de organoides intestinales
- Para preparar el medio de cultivo de crecimiento, mezcle DMEM/F-12 avanzado suplementado con 1x glutamina, 1x solución de penicilina/estreptomicina (P/S), 10 mM de HEPES, 50 ng/mL de EGF murino, 20 μg/mL de Noggin murino 500 ng/mL de R-Spondin1 de ratón (ver Tabla de Materiales). Deje el medio a temperatura ambiente (RT) durante la extracción de la cripta.
NOTA: Congele el medio no utilizado en alícuotas a -20 °C. Evite congelar y descongelar. - Llene un tubo de 50 ml con 40 ml de DMEM/F-12 avanzado y manténgalo en hielo.
NOTA: Mantenga el medio no utilizado a 4 °C. Se utilizará para el pasaje de organoides. - Precaliente las placas de cultivo celular (cámaras de pozo μ-Slide 8 y/o fondo redondo de 96 pocillos) en la incubadora a 37 °C.
- Descongelar la matriz de membrana basal (BMM) (ver Tabla de Materiales) alícuotas sobre hielo (antes de iniciar el protocolo o al menos 1 h antes de emplatar criptas).
NOTA: El BMM se solidificará rápidamente si no se mantiene frío. - Prepare la solución de lavado/lavado agregando una solución de penicilina-estreptomicina al 1% a DPBS (DPBS-P/S).
- Llene una placa de Petri de 100 mm con 10 ml de DPBS-P/S frío. Llene seis tubos de 15 ml con 10 ml de DPBS y etiquételos de F1 a F6.
- Preparar 30 ml de solución de EDTA de 10 mM por dilución a partir de 0,5 m de EDTA en DPBS. Llene dos tubos de 15 ml con 10 ml de EDTA de 10 ml y etiquételos como E1 y E2.
- Mantenga todas las soluciones preenfriadas a 4 ° C y manténgalas en el hielo durante el procedimiento.
2. Cultivo de organoides intestinales
- Sacrifice un ratón Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) de 8-10 semanas de edad de acuerdo con las normas y regulaciones nacionales.
- Recolecte 5-8 cm del yeyuno que abarca la región entre el duodeno (a 5 cm del estómago) y el íleon (a 10 cm del ciego) y manténgalo en frío DPBS-P / S en hielo.
- Limpie el contenido intestinal enjuagando con 5-10 ml de DPBS-P/S frío.
NOTA: Las jeringas de lavado caseras se pueden obtener tapando una punta de 200 μL en una boquilla de jeringa de 10 ml. - Abra el intestino longitudinalmente usando tijeras de punta de bola (ver Tabla de Materiales) (para evitar dañar el tejido).
- Usando fórceps, transfiera el tejido a una placa de Petri que contenga DPBS-P/S frío a temperatura ambiente y agítelo para enjuagar.
- Con una pipeta Pasteur de plástico, agarre el intestino por aspiración y transfiéralo a un tubo de 15 ml etiquetado como E1 que contenga 10 ml de EDTA frío de 10 mM.
- Invierta el tubo 3 veces e incube en hielo durante 10 minutos.
- Usando una pipeta Pasteur de plástico, transfiera el tejido en el tubo F1 que contiene 10 ml dpbs. Vórtice durante 2 min (en vórtice normal, sosteniendo el tubo con la mano y asegurándose de que el intestino se arremolina bien).
- Coloque 10 μL de la fracción en una placa de Petri y evalúe la calidad de la fracción bajo un microscopio.
NOTA: Todos los pasos del vórtice se realizan a la máxima velocidad, y la calidad de cada fracción debe evaluarse bajo el microscopio (Figura 1). - Con una pipeta Pasteur de plástico, agarre el intestino por aspiración y transfiéralo en el tubo F2 que contiene 10 ml de DPBS y vórtice durante 2 min.
- Repita el paso 2.10, transfiriendo el tejido en el tubo F3 que contiene 10 ml de DPBS y vórtice durante 2 min.
- Repita la incubación de EDTA como en el paso 2.6, transfiriendo el tejido en el tubo E2 que contiene 10 mM de EDTA.
- Invierta el tubo 3 veces e incube en hielo durante 5 min.
- Repita el paso 2.10, transfiriendo el tejido en el tubo F4 que contiene 10 ml de DPBS y vórtice durante 3 min.
- Repita el paso 2.14, transfiriendo el tejido en el tubo F5 que contiene 10 ml de DPBS y vórtice durante 3 min.
- Repita el paso 2.15, transfiriendo el tejido en el tubo F6 que contiene 10 ml de DPBS y vórtice durante 3 min.
- Combine las mejores fracciones filtradas por gravedad a través de un colador celular de 70 μm en un tubo de 50 ml (sobre hielo) para eliminar las vellosidades y los desechos significativos.
NOTA: Por lo general, F5 y F6 son las fracciones que contienen numerosas criptas y menos escombros. - Girar las criptas a 150 x g a 4 °C durante 3 min.
- Vacíe el tubo, interrumpa el pellet mecánicamente y agregue 5 ml de DMEM/F12 frío.
- Coloque 10 μL de la suspensión en una placa de Petri y cuente el número de criptas presentes en la alícuota manualmente bajo un microscopio.
NOTA: No cuente células individuales o escombros pequeños. - Calcule el volumen (V) de suspensión de criptas requerida en μL, considerando que 300 criptas están chapadas por pozo, W es el número de pozos y N es el número de criptas contadas de 10 μL de la suspensión. Transfiera las criptas a un nuevo tubo de 15 ml.
NOTA: V = 300 x W x 10/N. Si se utiliza un volumen pequeño en el experimento planificado, se puede utilizar un tubo centrífugo de 1,5 ml. - Girar las criptas a 200 x g a 4 °C durante 3 min.
- Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.
- Interrumpa mecánicamente el pellet y agregue suavemente el medio de cultivo de crecimiento para obtener una concentración de 90 criptas / μL.
- Agregue 2 volúmenes de BMM sin diluir para tener una concentración final de 30 criptas / μL. Pipetee cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo sin introducir burbujas de aire en la mezcla.
NOTA: Siempre mantenga el tubo sobre hielo para evitar la solidificación de BMM. - Placa 10 μL de la mezcla criptas/BMM en cada pozo. Para el análisis de citometría de flujo, use placas de fondo redondo de 96 pocillos. Distribuya 10 μL en el centro de cada pozo como una cúpula. Para la obtención de imágenes, utilice μ-slide 8 (consulte la Tabla de materiales) y deposite los 10 μL como una capa delgada.
NOTA: Coloque los organoides como una capa delgada para el ensayo de imágenes para permitir su imagen en profundidad. - Deje la placa durante 5 minutos en RT para permitir que el BMM se solidifique. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 15 min.
- Agregue 250 μL de medio de crecimiento en cada pozo, teniendo cuidado de no desprender el BMM.
- Coloque las placas en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
- Realizar el análisis ROS entre los días 4 y 6 de cultivo. De lo contrario, cambie el medio y divida los organoides después de la aparición de varias y largas estructuras en ciernes y cuando las células muertas se acumulen en los lúmenes de los organoides.
3. Paseo de organoides
- Comience a pasar organoides del intestino delgado a partir del 6º día de cultivo, cuando se hayan formado estructuras en ciernes significativas y los lúmenes de los organoides se hayan oscurecido.
NOTA: La luz del organoide se oscurece debido a la acumulación de células muertas, escombros y moco. Evite dejar que los organoides crezcan demasiado antes de dividirse. La relación de división depende del crecimiento de los organoides. Se recomienda pasar los organoides con una proporción de 1:2 en el día 6 y 1:3 en el día 10. - Llene un tubo de 15 ml con 4 ml de DMEM/F-12 avanzado frío y manténgalo en hielo.
NOTA: Aquí, se proporcionan volúmenes para una placa de cultivo de 96 pocillos. Si se utiliza un formato diferente, ajuste el volumen en consecuencia. - Aspire cuidadosamente el medio con una pipeta o una bomba de vacío de los pozos sin tocar las cúpulas BMM, y deséchelo.
- Añadir 100 μL de DMEM/F-12 avanzado en frío por pocillo. Pipete hacia arriba y hacia abajo para romper el BMM y transferir el contenido del pozo al tubo de 15 ml.
- Lavar el pozo con 200 μL frío Advanced DMEM/F-12 y recogerlo en el mismo tubo.
NOTA: Si pasa varios pozos de la misma condición experimental, el contenido de los pozos se puede agrupar en el mismo tubo colector de 15 ml. - Gire el tubo colector de 15 ml a 100 x g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y agregue 1 ml de DMEM/F-12 avanzado frío al pellet. Usando una punta P1000, tome una punta P10 (sin filtro) y binote hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces.
- Añadir 4 ml de DMEM/F-12 avanzado frío al tubo. Girar a 300 x g durante 5 min a 4°C.
- Aspire el sobrenadante con una pipeta o una bomba de vacío sin molestar el pellet. Luego, interrumpa el pellet mecánicamente.
- Añadir BMM diluido en medio de cultivo de crecimiento (ratio 2:1). Pipete con cuidado hacia arriba y hacia abajo sin introducir burbujas de aire en la mezcla.
- Placa 10 μL de la mezcla criptas/BMM en cada pozo.
- Mantenga la placa durante 5 minutos en RT para permitir que el BMM se solidifique. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 15 min.
- Agregue 250 μL de medio de crecimiento en cada pozo.
NOTA: Tenga cuidado de no separar el BMM. - Coloque las placas en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
4. Preparación de reactivos y materiales para evaluar el estrés oxidativo en organoides intestinales
- Preparar una solución madre de 250 mM de inhibidor de N-acetilcisteína (NAC) (ver Tabla de Materiales), resuspend 10 mg con 245 μL de DPBS. Utilizar a 1 mM de concentración final.
- Preparar una solución madre de 50 mM de inductor Tert-butil hidroperóxido (tBHP), 70% en agua, diluir 3.22 μL con 496.8 μL de DPBS. Utilizar a una concentración final de 200 μM.
- Para el estudio de citometría de flujo, prepare una solución de trabajo de 250 μM de una sonda fluorogénica (ver Tabla de materiales) diluyendo la solución madre 1/10 en DMSO. Utilizar a 1 μM de concentración final.
NOTA: Como se indica en las instrucciones del fabricante, la sonda fluorogénica es sensible a la luz y al oxígeno. Las acciones y alícuotas no deben estar abiertas y cerrar demasiadas veces. - Para el estudio de imágenes, prepare una solución de trabajo de 1,25 mM de la sonda fluorogénica diluyendo la solución madre 1/2 en DMSO. Utilizar a una concentración final de 5 μM.
- Preparar una solución final de 0,1 μg/ml DAPI en DPBS, que se utilizará para la discriminación de células muertas en el ensayo de citometría de flujo.
- Diluir Hoechst 33342 a 1,25 mg/ml en DPBS. Utilizar a una concentración final de 5 μg/ml para ser utilizado para la tinción nuclear en el ensayo de imagen.
- DMEM caliente sin rojo fenol a 37 °C.
NOTA: Estos pasos describen el uso de controles negativos y positivos que deben incluirse en cualquier ensayo, utilizando las condiciones indicadas en la Figura 2A. El ensayo se puede utilizar para probar compuestos antioxidantes o prooxidantes. Los pasos son los mismos, y la única diferencia es cuando se agregan los compuestos antes de usar el tinte fluorogénico.
5. Visualización del estrés oxidativo en organoides 3D mediante microscopía confocal
- Tome los organoides chapados en las cámaras de pozos μ-Slide 8 y agregue 1 μL de solución madre de NAC en los pozos correspondientes para obtener una concentración final de 1 mM.
- Incubar durante 1 h a 37 °C y 5% de CO2.
- Añadir 1 μL de solución madre de tBHP en los pozos correspondientes para obtener una concentración final de 200 μM.
- Incubar durante 30 min a 37 °C y 5% de CO2.
- Añadir 1 μL por pocillo de la dilución de 1,25 mM de la sonda fluorogénica para obtener una concentración final de 5 μM.
- Añadir 1 μL por pocillo de la dilución de 1,25 mg/ml de Hoescht para obtener una concentración final de 5 μg/ml.
- Incubar durante 30 min a 37 °C y 5% de CO2.
- Retire el medio sin molestar al BMM. Suavemente, agregue 250μL de DMEM caliente sin rojo fenol.
NOTA: Si se planea una adquisición a largo plazo, agregue compuestos de factores de crecimiento a DMEM sin rojo fenol. - Tome una imagen de los organoides utilizando un microscopio confocal equipado con una cámara térmica y suministro de gas que detecta la sonda fluorogénica (ROS).
NOTA: La excitación/emisión (ex/em) para la sonda fluorogénica es 644/665, ex/em para Hoechst (núcleos) es 361/486, y ex/em para GFP (célula madre intestinal de los ratones Lgr5-GFP) es 488/510. Se utiliza un objetivo de inmersión en aceite 63x para detectar señales en células madre. No cambie la configuración del láser entre muestras. Se podría utilizar un objetivo 20x para permitir una visión general de la producción de ROS. - Utilice el control positivo para configurar la intensidad del láser y la exposición temporal para la señal ROS y compruebe que esta señal es menor en el control negativo.
- Usando el ocular, la diapositiva para identificar los organoides GFP que expresan y ajustan la intensidad del láser.
NOTA: Este paso se realiza manualmente. - Definir posiciones para obtener una imagen cosida de todo el organoide. Configure una pila z de 25 μm (tamaño de paso 5 μm) para obtener una sección de los organoides que muestre una capa de células.
NOTA: Consulte el manual del usuario del microscopio para optimizar la configuración. Usando células vivas, la adquisición debe hacerse dentro de 1 h después del final de la incubación. - Abra las imágenes en un software de procesamiento de imágenes de código abierto (consulte la Tabla de materiales).
- Vaya a través de la pila z y elija la sección en la que el centro de los organoides está bien representado y cree una nueva imagen con el área seleccionada.
- Cuantifique las imágenes según los pasos 5.15.1 - 5.15.5.
- Seleccione la herramienta de línea a mano alzada.
- Dibuja una línea siguiendo los núcleos.
NOTA: Seleccione solo las regiones que presentan células GFP positivas si solo se analizan las células madre. - Aumente el ancho de la línea para cubrir la capa de celda con la línea sin incluir los desechos luminales.
- Seleccione el canal para la señal ROS y mida la intensidad de fluorescencia en la región seleccionada y anote los valores.
- Dibuja una línea donde no haya señal y mide la intensidad fluorescente del fondo que se restará al valor anterior para obtener la intensidad final.
6. Cuantificación del estrés oxidativo sobre los organoides disociados utilizando citómetro de flujo
- Añadir 1 μL de solución madre de NAC en los pocillos para controles negativos para obtener una concentración final de 1 mM.
NOTA: Use los organoides chapados en las placas de fondo redondo de 96 pocillos. - Incubar durante 1 h a 37 °C y 5% de CO2.
- Añadir 1 μL de solución madre de tBHP en los pozos correspondientes para obtener una concentración final de 200 μM.
- Incubar durante 30 min a 37 °C y 5% de CO2.
- Con una pipeta multicanal, retire el medio sin molestar el BMM conectado y transfiéralo a otra placa inferior redonda de 96 pocillos. Mantenga este plato a un lado.
- Agregue 100 μL de tripsina, y con una pipeta multicanal, binote hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces para destruir el BMM.
- Incubar durante no más de 5 min a 37 °C y 5% de CO2.
- Con una pipeta multicanal, pipetee hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces para disociar los organoides.
- Girar a 300 x g durante 5 min en RT.
- Deseche el sobrenadante invirtiendo la placa. Vuelva a agregar el medio recolectado en el paso 6.3 a los pozos correspondientes y vuelva a suspender las celdas canalizando hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
- Añadir la sonda fluorogénica a la concentración final de 1 μM. Añadir 1 μL por pocillo de la dilución de 250 μM e incubar durante 30 min a 37 °C y 5% de CO2.
NOTA: No agregue la sonda fluorogénica a los pocillos necesarios para la configuración del instrumento (Figura 2B). - Girar a 300 x g durante 5 min en RT.
- Resuspendir las células con 250 μL de solución DAPI de 0,1 μg/ml. Transfiera las muestras en los tubos de citometría de flujo adecuados, mantenga los tubos en hielo y proceda con el análisis.
NOTA: Agregue PBS en lugar de DAPI a los pozos necesarios para la configuración del instrumento (Figura 2B). - Optimice la configuración de voltaje de dispersión hacia adelante y lateral en el control no manchado y los voltajes láser para cada fluoróforo utilizando muestras monoteñidas.
- Utilizando una estrategia de cierre adecuada (Figura 4A), recopile un mínimo de 20.000 eventos.
NOTA: Se prefieren 50.000 eventos. Los ajustes detallados de adquisición varían según el instrumento utilizado.
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Representative Results
Como prueba de concepto del protocolo descrito, se utilizaron las criptas obtenidas de la línea de ratones Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 en la que las células madre intestinales muestran expresión GFP en mosaico, que fue establecida por Barker et al., para caracterizar inicialmente las células madre intestinales10 y permitir mapear estas células en función de su expresión GFP. De este modo, se proporciona un modelo para comparar los niveles de ROS en una población de tipo celular específico en diferentes tratamientos. Se utilizó un inhibidor de ROS (NAC) y un inductor (tBHP), conocido por actuar sobre ros celulares para visualizar los cambios en sus niveles.
Las figuras 1A y 1B muestran imágenes representativas de las fracciones F1 y F4 obtenidas durante el procedimiento de extracción de criptas para el cultivo de organoides intestinales. Cada fracción debe verificarse bajo un microscopio o binocular durante el procedimiento de extracción para seguir el desprendimiento de criptas y definir aquellas fracciones enriquecidas en criptas, en lugar de vellosidades, células individuales o escombros. Las fracciones elegidas se agrupan y se pasan a través de un colador celular de 70 μm para eliminar todos los fragmentos restantes de vellosidades y obtener una preparación con solo criptas (Figura 1C). Las criptas comienzan a cerrarse a las pocas horas de la incrustación en BMM, y en D1, se observaron organoides redondos (Figura 1D). Después de 3-5 días, los organoides aparecerán con estructuras en ciernes que representan las "criptas recién formadas". Los organoides están listos para el análisis ROS (Figuras 1E y 1F).
En el protocolo de imagen del estrés oxidativo por microscopía confocal, la diapositiva que contiene los organoides, incubada con la sonda, fue fotografiada con un microscopio de fluorescencia confocal equipado con láseres y filtros para detectar las señales Hoechst (ex/em: 361/486), GFP (ex/em: 488/510) y la sonda fluorogénica (ex/em): 644/665). Un microscopio confocal equipado con 20x aire y 63x objetivo de inmersión en aceite permitió la visualización de ROS. En ratones Lgr5-GFP, las células GFP positivas son células madre intestinales que expresan Lgr5. La Figura Complementaria 1 muestra imágenes representativas obtenidas con el objetivo 20x proporcionando una visión general de las ROS en varios organoides. La Figura 3 muestra imágenes representativas, obtenidas con el objetivo de aceite 63x, de organoides intestinales que expresan GFP, no tratados (NT), o preincubanos o no con el inhibidor de ROS NAC, y estimulados o no durante 30 min con el inductor de ROS tBHP.
En presencia del inhibidor, la única señal de las células muertas contenidas en la luz del organoide es visible. En el organoide no tratado, se muestran los niveles basales de ROS, lo que demuestra que las células madre producen ROS más altas que las células diferenciadas (de acuerdo con la configuración del microscopio, la señal de ROS también podría visualizarse en células no madre). Las células GFP positivas presentan una señal citoplasmática más significativa con el inductor en presencia de la sonda fluorogénica, lo que demuestra que los niveles de ROS aumentan particularmente en las células madre después del tratamiento.
La Figura 4 muestra resultados representativos obtenidos al analizar la producción de ROS en organoides intestinales estimulados o no con inhibidor o inductor de ROS, utilizando un citómetro de flujo equipado con láseres de 405 nm, 488 nm y 630 nm. La estrategia de gating presentada en la Figura 4A permite evaluar la producción de ROS a nivel de toda la población de células organoides, definiendo células intactas y vivas en función de parámetros físicos y exclusión de DAPI (SSC-A vs. FSC-A y DAPI vs. FSC-A) y FSC-H vs. FSC-A) o solo en las células madre intestinales, más cercadas en células con señal alta de GFP. La Figura 4B muestra los niveles de ROS en la población total tras la recolección de 50,000 eventos. Los niveles basales de ROS en las células no tratadas (NT) disminuyen después de la estimulación con el inhibidor (NAC) y, por el contrario, aumentan después del desafío con el inductor (tBHP). Las células pretratadas con el inhibidor y luego estimuladas con el inductor presentan un nivel más bajo que las estimuladas con el inductor solo. Los resultados se analizaron utilizando el software apropiado, obteniendo la intensidad fluorescente media (IMF). Los valores obtenidos se presentan como una relación sobre las células no tratadas, como se muestra en el gráfico presentado a la derecha de la Figura 4B. La Figura 4C muestra los mismos parámetros descritos en la Figura 4B en las células madre, cerradas como células GFP positivas, mostrando una disminución de 3,5 veces en el nivel de ROS en el tratamiento con NAC y un aumento de 4 veces en el tratamiento con tBHP sobre las células no estimuladas. Este resultado demuestra que siguiendo este protocolo, es posible cuantificar las diferencias en los niveles de ROS a nivel de toda la población celular o en las células madre GFP positivas en su tratamiento de los organoides con compuestos específicos.
Figura 1: Imágenes representativas de criptas y organoides. (A) Ejemplo de fracción F1 obtenida tras la primera incubación con EDTA, enriquecida en vellosidades (cuadrado), con algunos escombros (estrella) y criptas (círculo). (B) Ejemplo de fracción F4 enriquecida en criptas. (C) Suspensión que presenta solo criptas aisladas obtenidas después de la filtración con un colador celular de 70 μm (barra de escala, 200 μm). (D, E y F). Los organoides típicos se obtuvieron después de 1, 3 y 5 días respectivamente, después de incrustar las criptas en BMM (barra de escala, 100 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema del plan experimental. (A) Condiciones utilizadas en este protocolo incluidas en cada experimento: pozos no tratados (NT), pozos tratados con inductores (hidroperóxido de terc-butilo - tBHP), pozos tratados con inhibidores (N-acetil cisteína - NAC) y pozos tratados con inhibidores e inductores (NAC-tBHP). (B) Formato de placa para el ensayo de citometría de flujo. Cada condición está chapada en triplicado (línea A). Las líneas B, C y D incluyen pozos para el ajuste del citómetro de flujo con solo la sonda fluorogénica, solo DAPI o muestras no teñidas (NS). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes confocales representativas de la tinción ROS en organoides. Las imágenes cosidas se obtuvieron con un microscopio confocal equipado con una cámara EMCCD de alta velocidad, un objetivo de aceite de 63x/1.4 y una hendidura de 35 μm, utilizando los láseres 405, 488, 640 y los filtros 460/50, 535/50, 700/75 para adquirir Hoechst, GFP y la sonda fluorogénica respectivamente. Secciones ópticas confocales de organoides no tratados (NT), tratados con el inhibidor de ROS (NAC), con el inductor de ROS (tBHP), o pretratados con el inhibidor de ROS y luego estimulados con el inductor de ROS (NAC-tBHP). En gris, núcleos teñidos con Hoechst; en verde, células Lgr5-GFP; en rojo, la sonda fluorogénica (barra de escala, 50 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de citometría de flujo representativa de ROS en células derivadas de organoides. (A) Representación esquemática de la estrategia de gating utilizada en el análisis de citometría de flujo: gating para la forma celular (exclusión de células muertas y desechos acumulados en la luz de los organoides), gating para células vivas (células que no incorporan DAPI-laser 405), gating para células individuales (discriminación de doblete) y células madre (GFP positive cells-laser 488) (FSC: forward scatter, SSC: side scatter). La señal ROS se ha adquirido utilizando el láser 630. (B) A la izquierda, se obtuvieron histogramas con un software apropiado que muestra la intensidad de las señales ROS para la población viva total (después de marcar alrededor de 10,000 eventos por condición) en las diferentes muestras NT: no tratadas; NAC: tratado con inhibidores; tBHP tratado con inductor; NAC-tBHP: tratamiento con inhibidores e inductores. A la derecha, un ejemplo típico de la relación calculada para los valores de IMF sobre las muestras de NT obtenidas durante un experimento a partir de 3 muestras por condición (media ± DE) (*** P = 0,0003). (C) Igual que en B para la población GFP positiva (1.000 eventos por condición) (* P = 0,02). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Imágenes confocales representativas de la tinción ROS en organoides. Los images cosidos se obtuvieron con un microscopio confocal equipado con una cámara EMCCD de alta velocidad, objetivo 20x y hendidura de 35 μm, utilizando los láseres 405, 488, 640 y filtros 460/50, 535/50, 700/75 para adquirir Hoechst, GFP y sonda fluorogénica respectivamente. Secciones ópticas confocales de organoides no tratados (NT), tratados con el inhibidor de ROS (NAC), con el inductor de ROS (tBHP), o pretratados con el inhibidor de ROS y luego estimulados con el inductor de ROS (NAC-tBHP). En gris, núcleos teñidos con Hoechst; en verde, células Lgr5-GFP; en rojo, sonda fluorogénica (barra de escala, 100 μm). Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Este trabajo proporciona un protocolo paso a paso para aislar criptas yeyunales murinas, cultivarlas en organoides 3D y analizar ROS en organoides mediante la combinación de una sonda fluorogénica sensible a ROS con imágenes de microscopía cualitativa de organoides completos y medición cuantitativa de ROS utilizando citometría de flujo en células individuales después de la disociación organoide.
El primer paso crítico en este método es el procedimiento de extracción de criptas. De hecho, la calidad de la preparación de criptas es la clave para la formación exitosa de organoides. Por lo tanto, es esencial obtener fracciones con criptas enriquecidas y pocos restos celulares o células moribundas. Las criptas se pueden encontrar en fracciones diferentes a las indicadas en el protocolo, ya que la disociación puede variar con la edad y el estado de salud del ratón. El número de incubaciones de EDTA puede modificarse en consecuencia. Si las criptas no parecen estar desprendiéndose después de la fracción 4, se debe repetir una incubación de EDTA de 3 minutos. Inversamente, supongamos que las criptas ya se desprenden después de la primera incubación de EDTA. En ese caso, la segunda incubación de EDTA puede no ser necesaria, y los pasos secuenciales del vórtice en DPBS deben realizarse hasta que se obtengan fracciones con suficientes criptas desprovistas de escombros. Si no se produce disociación, asegúrese de que se utiliza DPBS sin Ca2+ y Mg2+ para preparar los tubos colectores y reemplace el EDTA con una nueva solución. Las criptas son estructuras frágiles, por lo que deben mantenerse tanto como sea posible en hielo y enchaparse rápidamente después del aislamiento.
Se pueden usar diferentes placas y volúmenes de gota para cultivar organoides. Por ejemplo, las criptas también se pueden enchapar en placas de 24 o 48 pocillos después de ajustar la concentración de criptas, el volumen de la gota de BMM y el medio agregado en cada pozo. Se pueden colocar múltiples gotas en el mismo pozo en una placa de 12 o 6 pocillos. En general, las criptas disminuyen de tamaño y se redondean para formar pequeños organoides redondos en el día 1 de cultivo. La formación de nuevos brotes debe observarse 2-3 días después del recubrimiento.
Para estudiar los cambios en los niveles de ROS en las células madre intestinales, se tomó la ventaja de la línea de ratón Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2. Una advertencia de este modelo es el silenciamiento selectivo del alelo knocked-in y el consiguiente mosaicismo de la expresión GFP, que puede estar ausente en parches de células madre o criptas enteras. Durante el protocolo de imagen, no todos los organoides presentarán células madre que expresen GFP; por lo tanto, no todos los organoides serán considerados a menos que sea posible confiar en la posición espacial de las células. En cambio, esto debe tenerse en cuenta al analizar la población de células GFP negativas en el protocolo de citometría de flujo. De hecho, como es imposible confiar en la posición espacial, la población GFP negativa estará compuesta por células no madre y células madre GFP negativas.
Aquí se proporciona un protocolo para la evaluación cualitativa de ROS en organoides intestinales. Un aspecto crítico para esta parte está vinculado a la distancia de trabajo de los objetivos que se utilizan. Los organoides se cultivan en BMM; no están unidos al fondo del pozo, introduciendo una distancia del plan de enfoque objetivo. Por esta razón, es fundamental colocar los organoides en una capa delgada de BMM, para minimizar este problema. Incluso en este entorno optimizado, no todos los organoides estarán en la posición correcta para ser fotografiados adecuadamente.
Se puede realizar un análisis cuantitativo de las imágenes utilizando un software de análisis de imágenes apropiado, evaluando la intensidad fluorescente media de las imágenes en el canal de señal ROS como se describe en el protocolo. Para ello, es necesario adquirir un elevado número de imágenes para conseguir un número suficiente de eventos que sean estadísticamente significativos. Como se mencionó anteriormente, utilizando los ratones Lgr5-GFP, no todos los organoides expresarán GFP, lo que requiere un número considerable de muestras para ser fotografiadas.
Durante el procedimiento de citometría de flujo, un paso crítico es la disociación de los organoides en células individuales. Si la disociación es demasiado dura, las células pueden morir y liberar ADN. Un inhibidor de rocas, Y-27632, para contrarrestar los anoikis, y DNAse se pueden agregar al tampón de disociación si no interfieren con la vía estudiada. Se puede utilizar la dilución de tripsina o tiempos de incubación reducidos.
Finalmente, es crucial definir el mejor punto de tiempo para analizar la producción de ROS después de los diferentes tratamientos (antioxidantes o prooxidantes) probados. En el caso de fármacos que inducen rápidamente ROS en cuestión de minutos u horas, el ensayo de imagen se puede utilizar para determinar cuándo existe la inducción máxima mediante la adición de la sonda fluorógena antes de los compuestos probados. La intensidad de fluorescencia de la sonda después de la estimulación de organoides puede variar entre los experimentos realizados en diferentes días. Por lo tanto, es crucial siempre calcular la proporción con las muestras no estimuladas y agregar controles (oxidante / antioxidante) para verificar la reactividad de la sonda. NAC y tBHP se utilizaron como controles negativos y positivos, ya que dieron los resultados más concluyentes. Aún así, se pueden usar otros reactivos, como el resveratrol como antioxidante o el paraquat/menadiona como oxidantes. La incubación de células durante demasiado tiempo con la sonda fluorogénica puede ser tóxica e incluso modificar el equilibrio redox celular, por lo que los tiempos de incubación también deben controlarse estrictamente. Las células teñidas con la sonda pueden fijarse y analizarse unas horas después. En este caso, para el análisis de citometría de flujo, el DAPI no puede discriminar entre células vivas y muertas. En su lugar, se debe usar un tinte reparable para la discriminación de vivos / muertos antes de la fijación.
Los organoides también se pueden cultivar durante varios días (más de 7), pero esto aumentará el número de células vivas y proliferativas y las células muertas que se acumulan en los lúmenes de los organoides, generando un alto fondo, particularmente en el ensayo de imágenes. Si se observa un aumento anormal en la señal de la sonda fluorogénica, asegúrese de que la solución utilizada para resuspend los compuestos estimulantes no sea prooxidante per se (es decir, etanol).
Una preocupación a considerar al usar este protocolo es que las imágenes en vivo y la disociación celular seguidas de citometría de flujo pueden inducir estrés oxidativo en las células y generar una señal de fondo. La fijación de los organoides puede considerarse de acuerdo con el experimento. Otra limitación surge de la dificultad en la imagen en profundidad de organoides cultivados en una matriz 3D. Como se mencionó en el protocolo, el BMM debe distribuirse en la diapositiva como una capa delgada para limitar este aspecto.
Aquí, el protocolo está diseñado utilizando un colorante fluorogénico disponible comercialmente. Su principal ventaja es su compatibilidad con la tinción multicolor de organoides para que los tipos de células específicas. Por ejemplo, la tinción de anticuerpos para los marcadores de la superficie celular inmediatamente después de la incubación de la sonda fluorogénica se puede realizar para detectar subtipos particulares. Sin embargo, la sonda no es específica de una especie específica de ROS, ya que puede detectar superóxido, peróxido de nitrito y peróxido de hidrógeno11,12,13. Por esta razón, generalmente se utiliza para detectar el estrés oxidativo global. Aunque se comercializó como una sonda solo citosólica, se pudo encontrar que la sonda fluorogénica seleccionada alcanza las mitocondrias14. Como su especificidad puede variar entre diferentes contextos celulares, sugerimos usar otros enfoques complementarios para medir ros cuando sea posible. Se podrían utilizar colorantes alternativos, como sondas específicas para detectar aniones superóxido generados por mitocondrias10. También se desarrolló un repertorio de sondas quimioluminiscentes para detectar especies específicas de ROS con alta sensibilidad, como las sondas a base de luciferina15,16. Estos tienen la ventaja de ser compatibles con imágenes in vivo, pero no se pueden usar para mapear la producción de ROS con tipos de células específicos. Finalmente, este protocolo se puede aplicar a otros tipos de organoides, por ejemplo, organoides colónicos derivados de biopsias humanas. En este caso, el medio de crecimiento del cultivo debe adaptarse en consecuencia17. Para analizar más a fondo la maquinaria redox dentro de las células intestinales, los procedimientos de cultivo y disociación de organoides descritos en este protocolo se pueden combinar con enfoques transcriptómicos y proteómicos en organoides enteros o células organoides clasificadas por células activadas por fluorescencia (FACS).
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la agencia nacional de investigación francesa (ANR) subvención 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
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