Summary
Descriviamo un protocollo per indurre la transizione di fase della proteina 43 legante il DNA TAR (TDP-43) dalla luce nei motoneuroni spinali usando zebrafish come modello.
Abstract
L'aggregazione proteica anormale e la vulnerabilità neuronale selettiva sono due dei principali tratti distintivi delle malattie neurodegenerative. Le relazioni causali tra queste caratteristiche possono essere interrogate controllando la transizione di fase di una proteina associata alla malattia in un tipo di cellula vulnerabile, sebbene questo approccio sperimentale sia stato finora limitato. Qui, descriviamo un protocollo per indurre la transizione di fase della proteina legante l'RNA / DNA TDP-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish per modellare l'aggregazione citoplasmatica di TDP-43 che si verifica nei motoneuroni degenerativi nella sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Descriviamo un metodo genetico basato sul cromosoma artificiale batterico (BAC) per fornire una variante optogenetica TDP-43 in modo selettivo ai motoneuroni spinali del pesce zebra. L'elevata traslucenza delle larve di zebrafish consente la transizione di fase dell'optogenetico TDP-43 nei motoneuroni spinali mediante una semplice illuminazione esterna utilizzando un diodo a emissione luminosa (LED) contro pesci sfrenati. Presentiamo anche un flusso di lavoro di base di imaging dal vivo dei motoneuroni spinali zebrafish e analisi delle immagini con il software Fiji / ImageJ disponibile gratuitamente per caratterizzare le risposte optogenetiche TDP-43 all'illuminazione della luce. Questo protocollo consente la caratterizzazione della transizione di fase TDP-43 e della formazione di aggregati in un ambiente cellulare vulnerabile alla SLA, che dovrebbe facilitare un'indagine delle sue conseguenze cellulari e comportamentali.
Introduction
I granuli di ribonucleoproteine (RNP) controllano una miriade di attività cellulari nel nucleo e nel citoplasma assemblando partizioni senza membrana tramite separazione di fase liquido-liquido (LLPS), un fenomeno in cui un fluido omogeneo demixes in due fasi liquide distinte1,2. Il LLPS disregolato delle proteine leganti l'RNA che normalmente funzionano come componenti del granulo RNP promuove una transizione di fase anormale, portando all'aggregazione proteica. Questo processo è stato implicato nelle malattie dello sviluppo neurologico e neurodegenerative3,4,5. La valutazione precisa di una relazione causale tra LLPS aberrante di proteine leganti l'RNA e patogenesi della malattia è cruciale per determinare se e come LLPS può essere sfruttato come bersaglio terapeutico efficace. LLPS delle proteine leganti l'RNA è relativamente facile da studiare in vitro e in modelli unicellulari, ma è difficile negli organismi multicellulari, specialmente nei vertebrati. Un requisito critico per l'analisi di tale LLPS in singole cellule all'interno di un ambiente tissutale è quello di esprimere stabilmente una sonda per l'imaging e la manipolazione di LLPS in un tipo di cellula vulnerabile alla malattia di interesse.
La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è un disturbo neurologico in definitiva fatale in cui i motoneuroni del cervello e del midollo spinale vengono persi selettivamente e progressivamente a causa della degenerazione. Ad oggi, mutazioni in più di 25 geni sono state associate alla forma ereditaria (o familiare) della SLA, che rappresenta il 5%-10% dei casi totali di SLA, e alcuni di questi geni che causano la SLA codificano per proteine leganti l'RNA costituite da RNP, come hnRNPA1, TDP-43 e FUS6,7. Inoltre, la forma sporadica di SLA, che rappresenta il 90%-95% dei casi totali di SLA, è caratterizzata dall'aggregazione citoplasmatica di TDP-43 depositato in motoneuroni degeneranti. Una delle principali caratteristiche di queste proteine leganti l'RNA associate alla SLA sono le loro regioni intrinsecamente disordinate (IDR) o domini a bassa complessità che mancano di strutture tridimensionali ordinate e mediano deboli interazioni proteina-proteina con molte proteine diverse che guidano LLPS7,8. Il fatto che le mutazioni che causano la SLA si verifichino spesso negli esami approfonditi ha portato all'idea che la LLPS aberrante e la transizione di fase di queste proteine correlate alla SLA possano essere alla base della patogenesi della SLA9,10.
Recentemente, il metodo optoDroplet, una tecnica optogenetica basata su Cryptochrome 2 che consente la modulazione delle interazioni proteina-proteina da parte della luce, è stato sviluppato per indurre la transizione di fase delle proteine con IDR11. Poiché questa tecnica è stata estesa con successo a TDP-43, ha iniziato a scoprire i meccanismi alla base della transizione di fase patologica di TDP-43 e la sua citotossicità associata12,13,14,15. In questo protocollo, delineiamo un metodo genetico per fornire un TDP-43 optogenetico a tipi di cellule vulnerabili alla SLA, vale a dire, motoneuroni spinali nel pesce zebra utilizzando il BAC per il gene mnr2b / mnx2b che codifica per una proteina omeodominio per la specifica del motoneurone16,17. L'elevata traslucenza delle larve di zebrafish consente una stimolazione luminosa semplice e non invasiva del TDP-43 optogenetico che innesca la sua transizione di fase nei motoneuroni spinali. Presentiamo anche un flusso di lavoro di base per l'imaging dal vivo dei motoneuroni spinali zebrafish e l'analisi delle immagini utilizzando il software Fiji / ImageJ disponibile gratuitamente per caratterizzare le risposte del TDP-43 optogenetico alla stimolazione della luce. Questi metodi consentono un'indagine sulla transizione di fase del TDP-43 in un ambiente cellulare vulnerabile alla SLA e dovrebbero aiutare a esplorare le sue conseguenze patologiche a livello cellulare e comportamentale.
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Protocol
Tutto il lavoro sui pesci è stato condotto in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (numero di identificazione di approvazione 24-2) dell'Istituto nazionale di genetica (Giappone), che ha una garanzia del benessere degli animali in archivio (numero di garanzia A5561-01) presso l'Ufficio per il benessere degli animali da laboratorio del National Institutes of Health (NIH, STATI UNITI).
1. Costruzione di BAC per l'espressione del gene optogenetico TDP-43 dal promotore mnr2b
- Preparazione BAC
- Acquista un clone BAC di zebrafish contenente il locus zebrafish mnr2b (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Purificare il DNA BAC da una coltura LB notturna di 5 mL di DH10B Escherichia coli (E. coli) che ospita CH211-172N16 come descritto in Warming et al.18.
- Trasformare CH211-172N16 in celle SW102 E. coli mediante elettroporazione, come descritto in Warming et al.18.
NOTA: La purificazione del DNA BAC dall'E. coli lo stesso giorno dell'elettroporazione di solito dà un tasso di successo più elevato della trasformazione BAC18. In caso contrario, il DNA BAC purificato viene mantenuto a -20 °C fino all'uso. - Introdurre la cassetta iTol2-amp per la transgenesi BAC mediata da trasposone Tol219 nella spina dorsale di CH211-172N16 mediante elettroporazione, come descritto in Asakawa et al.20.
- Creare uno stock di glicerolo dei cloni cellulari di E. coli portatori di CH211-172N16 con l'integrazione della cassetta iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) dopo aver confermato l'integrazione omologa mediata dalla ricombinazione mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) (Ex Taq) utilizzando la coppia di primer Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') e pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') e le seguenti condizioni: una fase di denaturazione a 98 °C per 1 min, seguita da 25 cicli di denaturazione a 95 °C per 10 s, ricottura del primer a 55 °C per 15 s ed estensione del primer a 72 °C per 1 min, amplificando un prodotto PCR di 354 paia di basi (bp).
- mnr2b-hs:opTDP-43h costruzione
- Costruisci un plasmide che trasporta la cassetta di espressione per il wild-type umano TDP-43/TARDBP (TDP-43h) che è etichettato con mRFP1 e CRY2olig rispettivamente a N- e C-termini, (di seguito, opTDP-43h)14.
NOTA: Il frammento opTDP-43h deve essere affiancato dalla sequenza del promotore del gene zebrafish hsp70l (650 bp) e dalla sequenza di segnale di poliadenilazione (polyA), seguita da un gene di resistenza alla kanamicina (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14. - Amplificare la cassetta hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan con primer che ricottura hsp70l e Kan e contengono sequenze 45 bp dei codoni iniziatori a monte e a valle del gene iniziatore del gene mnr2b mediante PCR (GXL DNA Polymerase) utilizzando la coppia di primer mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') e Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') con le seguenti condizioni: una fase di denaturazione a 98 °C per 1 min, seguita da 30 cicli di denaturazione a 95 °C per 10 s, ricottura del primer a 55 °C per 15 s ed estensione del primer a 68 °C per 30 s, amplificare un prodotto PCR di ~5,7 bp.
- Separare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio (100 V) e purificare la banda di DNA hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan con una colonna di DNA. Regolare la concentrazione della cassetta hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan purificata a 50 ng/μL nel tampone Tris-EDTA (TE) contenente 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) e 1 mM EDTA.
- Introdurre la cassetta hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan in CH211-172N16-iTol2A mediante elettroporazione come descritto in Warming et al.18 e selezionare i trasformatori resistenti all'ampicillina e alla kanamicina su piastre lb agar. CH211-172N16-iTol2A che trasporta la cassetta hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan è designata come mnr2b-hs:opTDP-43h.
- Purificare mnr2b-hs:opTDP-43h utilizzando un kit di purificazione BAC e scioglierlo a 250 ng/μL in TE dopo estrazione di fenolo/cloroformio.
- Costruisci un plasmide che trasporta la cassetta di espressione per il wild-type umano TDP-43/TARDBP (TDP-43h) che è etichettato con mRFP1 e CRY2olig rispettivamente a N- e C-termini, (di seguito, opTDP-43h)14.
- mnr2b-hs:Costruzione EGFP-TDP-43z
- Costruisci un altro plasmide che trasporta il tardbp di tipo zebrafish wild che è etichettato con una proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) al suo N-terminus (EGFP-TDP-43z) invece di opTDP-43h ma è altrimenti identico al costrutto hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Utilizzare EGFP-TDP-43z come controllo interno per la stimolazione luminosa di opTDP-43h.
- Costruire CH211-172N16-iTol2A che ospita la cassetta hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan nel locus mnr2b come descritto in 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A che trasporta la cassetta hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan è designata come mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.
2. Transgenesi BAC mediata da trasposone Tol2 nel pesce zebra
- Preparare la soluzione iniettabile contenente 40 mM KCl, rosso fenolo (10% v/v), 25 ng/μL del DNA mnr2b-hs:opTDP-43h e 25 ng/μL Tol2 trasposasi mRNA19.
- Iniettare 1 nL della soluzione iniettabile (una goccia con un diametro di circa 123 μm calibrata in olio minerale) nel citosol di embrioni di zebrafish selvatici allo stadio unicellulare. Esaminare il pesce iniettato per la formazione di aggregati positivi alla proteina fluorescente rossa (RFP) in vari tessuti embrionali, compresi i motoneuroni spinali, sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza a 2-3 giorni dopo la fecondazione (dpf). Allevare il pesce RFP-positivo all'età adulta.
- Iniettare il DNA mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z come descritto in 2.1 e 2.2. Allevare pesci positivi all'EGFP fino all'età adulta.
- Dopo alcuni mesi, mettere pesce iniettato sessualmente maturo e pesce selvatico in coppia in gabbie di accoppiamento standard da 2 L per ottenere prole F1. Pesce F1 a 3 dpf per la fluorescenza RFP (opTDP-43h) o EGFP (EGFP-TDP-43z) nella colonna motoria spinale utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato di una lente obiettivo Plan-Neofluar 5x / 0,15. In genere, un pesce fondatore viene identificato da 10-20 pesci iniettati (il tasso di trasmissione germinale è del 5% -10%).
- Isolare e confrontare più inserti Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] e Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] di diversi pesci fondatori, poiché l'intensità, ma non il modello, dell'espressione opTDP-43h o EGFP-TDP-43z può variare tra i pesci fondatori a causa degli effetti della posizione cromosomica.
- Incrociare le linee di pesce Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] e Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] per ottenere prole contenente Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] pesce doppio-transgenico in un rapporto mendeliano.
- Allevare il pesce in un piatto di plastica contenente 30 mL di tampone E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10-5% Blu di Metilene) e aggiungere lo 0,003% (p/v) di N-feniltiourea a 8-10 ore dopo la fecondazione (hpf) per inibire la melanogenesi.
- Coprire il piatto di plastica con un foglio di alluminio dopo 30 hpf.
3. Preparazione del LED per l'illuminazione a luce blu
- Accendere un pannello LED utilizzando l'applicazione associata installata su un tablet/telefono. Mettere la sonda di uno spettrometro in un pozzo vuoto di un piatto a 6 pozzetti e regolare la luce LED alla lunghezza d'onda che raggiunge il picco a ~ 456 nm attraverso l'applicazione. Posizionare il sensore ottico di un misuratore di potenza ottica nel pozzo vuoto e regolare la potenza della luce LED (~ 0,61 mW / cm2). L'impostazione della luce LED può essere salvata ed è recuperabile nell'applicazione.
- Introdurre l'impostazione del piatto/pannello LED nell'incubatore a 28 °C. Completa questo passaggio prima che l'imaging del pesce inizi a 48 hpf.
4. Imaging di larve di zebrafish che esprimono TDP-43 optogenetico
- Selezionare Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] pesce doppio transgenico almeno prima di 47 hpf, in base alla fluorescenza RFP (opTDP-43h) o EGFP (EGFP-TDP-43z) nella colonna motoria spinale utilizzando il set-up del microscopio a epifluorescenza sopra descritto.
- Decoerniare il pesce doppio transgenico Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z].
- Preriscaldare l'1% di agarosio a bassa temperatura di fusione contenente 250 μg/mL di sale di metanosolfonato di etile 3-amminobenzoato a 42 °C.
- Anestetizzare brevemente Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] pesce doppio transgenico a 48 hpf in tampone E3 contenente la stessa concentrazione di Tricano.
- Mettere una goccia dell'agarosio preriscaldato a bassa temperatura di fusione dell'1% sulla piastra di base in vetro a temperatura ambiente. Il diametro della goccia di agarosio a forma di cupola sul piatto di vetro è di 8-10 mm.
- Usando una pipetta Pasteur, aggiungere il pesce anestetizzato all'agarosio a bassa temperatura di fusione sulla piastra di base di vetro, quindi mescolare pipettando un paio di volte. Ridurre al minimo la quantità di tampone E3 aggiunto all'agarosio insieme al pesce.
- Mantenere il pesce su un fianco utilizzando un ago a siringa durante la solidificazione dell'agarosio (in genere ~ 1 min) per garantire che il midollo spinale sia in una posizione orizzontale appropriata. Dopo la solidificazione, metti un paio di gocce di tampone E3 sul pesce montato su agarose a forma di cupola.
- Acquisire sezioni z confocali seriali del midollo spinale eseguendo la scansione con un microscopio confocale dotato di una lente obiettivo ad immersione in acqua 20x con apertura numerica 1,00, utilizzando una velocità di scansione di 4,0 μs per pixel (12 bit per pixel), una dimensione del passo di 1,0 μm per fetta per l'obiettivo e una combinazione di lunghezze d'onda di eccitazione / emissione: Canale 1) 473/510 nm per EGFP e Canale 2) 559/583 nm per mRFP1.
NOTA: La cloaca sul lato ventrale del pesce è inclusa nelle regioni di interesse (ROI) come riferimento, che aiuta a identificare e confrontare i segmenti spinali (livelli 16-17) attraverso i punti temporali. - Rimuovere il pesce dall'agarosio rompendo con cura l'agarosio con un ago per siringa non appena l'imaging è completo. Mantenere la quantità di tempo in cui il pesce è incorporato nell'agarosio il più breve possibile, anche se l'incorporamento di agarosio per <30 minuti non influisce sulla vitalità del pesce.
5. Stimolazione luminosa di pesci che esprimono opTDP-43h mediante illuminazione di campo di una luce a diodi a emissione di luce blu (LED)
- Aggiungere 7,5 mL di buffer E3 al pozzo e posizionare il pesce doppio transgenico Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] nel pozzo. Posizionare la parabola a sei pozzetti sul pannello LED tenendo la parabola e il pannello LED a 5 mm di distanza con un distanziatore (ad esempio, con cinque vetri scorrevoli impilati).
- Accendi la luce LED blu. Tenere alcuni dei pesci Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] a doppio transgenico in un piatto separato a sei pozzetti coperto con un foglio di alluminio quando sono necessari pesci di controllo non illuminati (cioè in condizioni di oscurità)14.
- Dopo l'illuminazione (ad esempio, per 24 ore a 72 HPF nella Figura 3), visualizzare il midollo spinale del pesce illuminato ripetendo i passaggi 4.3 - 4.9.
6. Visualizzazione del trasferimento citoplasmatico del TDP-43 optogenetico nei motoneuroni spinali
- Apri il file immagine in ImageJ/Fiji21 (Versione: 2.1.0/1.53c), un programma di elaborazione delle immagini Java open source sviluppato da NIH Image, che può essere scaricato da https://imagej.net/Fiji/Downloads.
- Utilizzate la barra di scorrimento Z per spostarvi tra i piani focali. Creare una proiezione di intensità massima di più sezioni facendo clic su Immagine | Stack | | del progetto Z Intensità massima e impostazione Start slice e Stop slice che coprono gli emisegmenti della colonna motoria spinale.
- Dividere l'immagine multicanale in due immagini a canale singolo facendo clic su Immagine | | colore Canali divisi.
- Migliorare il segnale EGFP-TDP-43z per garantire che il citoplasmatico EGFP-TDP-43z sia chiaramente visibile facendo clic su Immagine | Regolare | Luminosità/Contrasto e regolazione minima
- Aprire roi manager facendo clic su Analizza | Strumenti | Responsabile ROI. Trova le cellule identificabili in entrambe le immagini a 48 hpf e 72 hpf, in base alle posizioni relative dei corpi cellulari. Imposta il ROI delineando i contorni dei corpi cellulari dei singoli motoneuroni spinali visualizzati dal segnale EGFP-TDP-43z utilizzando le selezioni a mano libera, quindi facendo clic su Aggiungi[t] nel roi manager.
- Impostate un asse maggiore del soma disegnando una linea retta utilizzando Diritto (Straight ) e facendo clic su Analizza | Profilo del grafico per immagini EGFP-TDP-43z (C1) e opTDP-43h (C2) a 48 e 72 hpf.
- Normalizzare il profilo di plottaggio dividendo i valori per il valore massimo per ogni segnale EGFP-TDP-43z e opTDP-43h. Traccia i valori normalizzati con coordinate x-y, dove x e y rappresentano rispettivamente l'asse maggiore del soma e le relative intensità fluorescenti, utilizzando il grafico XY in un software statistico.
7. Confronto raziometrico tra segnali opTDP-43h e EGFP-TDP-43z utilizzando ImageJ/Fiji
- Aprire il file immagine in ImageJ/Fiji e impostare i ROI per le singole celle mnr2b-positive utilizzando un'immagine di proiezione di intensità massima di EGFP-TDP-43z come in 6.1-6.5. Aggiungi un ROI al di fuori del midollo spinale ventrale (ad esempio, notocorda) per rappresentare il segnale di sfondo (ROI di sfondo).
- Per ogni immagine EGFP-TDP-43z e opTDP-43, create una proiezione di più sezioni facendo clic su Immagine | Stack | | del progetto Z Sommare le sezioni e impostare la sezione Start e la sezione Stop che coprono la colonna del motore emispinale.
- Apri il ROI manager creato con l'immagine di proiezione di massima intensità. Visualizzare il ROI nell'immagine Sum Slices selezionando la finestra dell'immagine per EGFP-TDP-43z e quindi facendo clic su Mostra tutto nel ROI manager. Fare clic su Misura nel roi manager per ottenere i valori medi per ogni ROI.
- Acquisire valori medi per opTDP-43h seguendo la stessa procedura prevista al punto 7.3.
- Per ogni ROI, dopo aver sottratto la media per il ROI di fondo, dividere la media sottratta per opTDP-43h per la media sottratta per EGFP-TDP-43z per ottenere il valore raziometrico. I valori raziometrici possono essere confrontati tra diversi punti temporali e presentati utilizzando il grafico a colonne nel software Prism.
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Representative Results
Imaging dal vivo di proteine TDP-43 optogenetiche e non optogenetiche nei motoneuroni spinali mnr2b+ delle larve di zebrafish
Per indurre la transizione di fase TDP-43 nei motoneuroni spinali nel pesce zebra, è stato costruito un TDP-43h umano che è taggato con mRFP1 e CRY2olig22 ai termini N- e C, rispettivamente, e designato come opTDP-43h14 (Figura 1A). Il frammento del gene opTDP-43h è stato introdotto in un BAC contenente il locus mnr2b (Figura 1B). Il BAC risultante, designato come mnr2b-hs:opTDP-43h, è stato introdotto nel genoma del pesce zebra dalla transgenesi BAC mediata da trasposoni Tol219. Per monitorare la localizzazione di TDP-43 non optogenetico nei motoneuroni spinali, un pesce zebra TDP-43 codificato dal gene tardbp è stato taggato con EGFP al N-terminus (Figura 1A) e il frammento del gene EGFP-TDP-43z è stato introdotto nel BAC mnr2b, simile a opTDP-43h (Figura 1B). Il BAC risultante, designato come mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z, è stato introdotto nel genoma del pesce zebra dalla transgenesi BAC mediata da trasposoni Tol2. Il pesce iniettato con ogni costrutto BAC è stato incrociato con un pesce selvatico e il pesce F1 risultante è stato sottoposto a screening il giorno 3 per la fluorescenza rossa (Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]) o verde (Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]) nel midollo spinale ventrale. I pesci F1 isolati rossi o verdi positivi alla fluorescenza sono stati designati rispettivamente come Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] o Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z].
Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] i pesci a doppia transgenica a 48 hpf sono stati anestetizzati e incorporati in un agarosio a bassa fusione sul loro lato; dopo la solidificazione dell'agarosio, sono stati coperti con tampone E3 per consentire osservazioni del lato laterale del midollo spinale dall'alto. La microscopia a scansione laser confocale è stata eseguita con una lente ad immersione in acqua 20x e una combinazione di lunghezze d'onda di eccitazione/emissione: 473/510 nm per EGFP e 559/583 nm per mRFP1. Il pesce scansionato è stato immediatamente e accuratamente prelevato dall'agarosio, trasferito nel buffer E3 in una piastra a sei pozzetti e illuminato da una luce LED blu posizionando la piastra su un pannello LED a 28 °C (Figura 2A,B). Dopo un'illuminazione di 24 ore, il pesce è stato anestetizzato e incorporato nuovamente nell'agarosio prima di essere scansionato con una microscopia confocale utilizzando le stesse condizioni di imaging, tranne per il fatto che il ROI è stato regolato per includere la corrispondente regione del midollo spinale ripresa a 48 hpf (Figura 2B). L'intero cordone emispinale di 4-5 segmenti spinali contigui è stato ripreso durante la sessione di microscopia (tipicamente 20-30 min), generando immagini della serie z contenenti 20-40 fette a seconda dell'orizzontalità dell'asse longitudinale del midollo spinale del pesce montato rispetto al piano di scansione confocale.
Visualizzazione del trasferimento citoplasmatico di TDP-43 optogenetico nei motoneuroni spinali
Per visualizzare il trasferimento citoplasmatico di opTDP-43h in singoli motoneuroni spinali, le immagini della serie z (tipicamente 20-40 fette) acquisite a 48 e 72 hpf sono state aperte con Fiji e separate in ciascun canale EGFP-TDP-43z e opTDP-43h. Sono state create immagini di proiezione a intensità massima di EGFP-TDP-43z per immagini a 48 e 72 hpf ed è stato selezionato un singolo neurone spinale isolato identificabile in entrambe le immagini a 48 e 72 hpf (Figura 2B, frecce). I motoneuroni spinali con corpi cellulari situati sul lato dorsale della colonna motoria sono stati considerati adatti per le misurazioni della forma del corpo cellulare a causa dei loro modelli di distribuzione sparsi.
Dopo aver regolato l'intensità del segnale EGFP nelle immagini EGFP-TDP-43z, i ROI che coprono i somas dei motoneuroni sono stati impostati tracciando il bordo del segnale EGFP a 48 e 72 hpf (Figura 2C). L'intensità fluorescente lungo l'asse maggiore del soma è stata misurata per i segnali EGFP-TDP-43z e opTDP-43h a 48 e 72 hpf (Figura 2C, a destra). A 48 hpf, i modelli dei segnali opTDP-43h e EGFP-TDP-43z si sovrapponevano in gran parte l'uno all'altro.
Al contrario, a 72 hpf, il picco del segnale opTDP-43h è stato trovato nella regione in cui il segnale EGFP-TDP-43z era basso, vale a dire nel citoplasma, indicando il trasferimento citoplasmatico di opTDP-43h. Il trasferimento citoplasmatico opTDP-43h dipendente dalla luce è iniziato in gran parte indipendentemente dal TDP-4314 non optogenetico. In questo test, le immagini di proiezione di intensità massima sono state utilizzate per stimare la posizione del confine nucleo/citoplasma a scapito delle misurazioni quantitative.
Confronto raziometrico dell'intensità di fluorescenza del TDP-43 optogenetico e non optogenetico nei motoneuroni spinali
Per valutare gli effetti della stimolazione della luce blu sui livelli fluttuanti della proteina opTDP-43h, i segnali opTDP-43h nel corpo cellulare sono stati misurati prima e dopo la stimolazione luminosa con riferimento al segnale EGFP-TDP-43z. Le immagini della serie z, incluso l'emisegmento spinale, sono state aperte con le Figi. Per impostare i ROI che coprono i singoli motoneuroni spinali, sono state create immagini di proiezione a intensità massima del segnale EGFP-TDP-43z per 48 e 72 hpf e sono stati selezionati singoli neuroni spinali isolati identificabili in entrambe le immagini da 48 e 72 hpf (Figura 3A). Utilizzando selezioni a mano libera, i ROI sono stati disegnati e registrati in un ROI manager per ciascuna delle immagini da 48 e 72 hpf (Figura 3A). La proiezione di intensità massima del segnale EGFP-TDP-43z è stata considerata adatta per impostare il ROI a causa del suo elevato contrasto.
Per quantificare i segnali opTDP-43h e EGFP-TDP-43z, sono state prodotte immagini di proiezione Sum slices per ciascun canale delle stesse immagini della serie z per 48 e 72 hpf (Figura 3A). Utilizzando i set di ROI registrati, le intensità fluorescenti di opTDP-43h e EGFP-TDP-43z sono state misurate per ogni punto temporale. Le quantità relative di opTDP-43h a EGFP-TDP-43z (valori RFP/GFP) sono state calcolate per ogni cella e punto temporale dividendo il valore RFP per il valore GFP (Figura 3B). Delle quattro cellule mnr2b-positive che sono state studiate, la cella #1 ha mostrato in particolare un segnale EGFP-TDP-43z saturo (Figura 3A). Le cellule con segnali fluorescenti saturi dovrebbero essere escluse dai set di dati quando conducono analisi quantitative. Le celle #2-#4 hanno mostrato tendenze decrescenti dei livelli relativi di opTDP-43h a EGFP-TDP-43z dopo l'illuminazione a luce blu (Figura 3B), sebbene un'analisi su larga scala abbia precedentemente dimostrato che la diminuzione dei livelli relativi di opTDP-43h a EGFP-TDP-43z non era statisticamente significativa (65 cellule di tre animali indipendenti)14.
Figura 1: Costruzione del DNA BAC utilizzando il locus mnr2b . (A) Strutture delle cassette di espressione per opTDP-43h e EGFP-TDP-43z. (B) La regione genomica del pesce zebra trasportato dal DNA BAC CH211-172N16. Le cassette di espressione amplificate pcr per opTDP-43h e EGFP-TDP-43z sono inserite a valle della regione 5′-untranslated (UTR) della mnr2b (freccia rossa) nel primo esone di mnr2b mediante ricombinazione omologa. Le barre indicano 500 (A) e 10k (B) bp. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging dal vivo di opTDP-43h prima e dopo la stimolazione luminosa. (A) Uno schema di stimolazione luminosa di opTDP-43h espresso nei motoneuroni spinali di pesci non freni Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] a doppio transgenico attraverso un'illuminazione di campo di luce LED blu da 48 a 72 hpf. (B) Immagini di proiezione a intensità massima delle immagini confocali della serie z del midollo spinale ventrale prima (48 hpf) e dopo (72 hpf) della stimolazione luminosa. Le linee tratteggiate delimitano il limite ventrale del midollo spinale. Le figure sono adattate da Asakawa et al.14 (C) Mislocalizzazione citoplasmatica di opTDP-43 dopo l'illuminazione a luce blu 24 ore su 24. I contorni del soma di una cellula mnr2b-positiva (frecce rosse in B) osservati a 48 e 72 hpf sono mostrati in magenta. Gli assi principali dei soma sono stati mostrati con l'azzurro. L'intensità fluorescente normalizzata lungo gli assi principali è stata tracciata. L'asterisco indica un gruppo di forti segnali opTDP-43 che non mostrano un forte segnale sovrapposto EGFP-TDP-43z, indicando una cattiva localizzazione citoplasmatica opTDP-43h. Le barre indicano 1 mm (A), 20 μm (B) e 4 μm (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronti raziometrici di opTDP-43h e EGFP-TDP-43z prima e dopo la stimolazione luminosa. (A) I ROI che coprono i somi di quattro singole cellule mnr2b-positive a 48 e 72 hpf sono stati disegnati sulla base del segnale EGFP-TDP-43z e sono mostrati in magenta. I ROI rettangolari (bg) sono stati utilizzati per sottrarre il segnale di sfondo (ROI in background). Le cifre sono adattate da Asakawa et al.14 (B) Le intensità relative di opTDP-43h a EGFP-TDP-43z sono state tracciate per ogni cella in ogni punto temporale come rapporto RFP / GFP. La cella #1, indicata dall'asterisco, non era adatta per il confronto raziometrico perché il suo segnale EGFP-TDP-43z era saturo e il suo valore RFP/GFP era sovrastimato. La barra indica 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'espressione mediata da mnr2b-BAC di opTDP-43h e EGFP-TDP-43z nel pesce zebra offre un'opportunità unica per l'imaging dal vivo della transizione di fase TDP-43 nei motoneuroni spinali. La trasparenza ottica dei tessuti corporei delle larve di zebrafish consente la stimolazione optogenetica semplice e non invasiva di opTDP-43h. I confronti tra i singoli motoneuroni spinali nel tempo hanno dimostrato che l'oligomerizzazione dipendente dalla luce di opTDP-43h causa il suo clustering citoplasmatico, che ricorda la patologia della SLA.
Uno dei parametri critici che definiscono il comportamento di fase di una proteina intrinsecamente disordinata è la concentrazione intracellulare. Un alto livello di espressione di opTDP-43h potrebbe potenzialmente portare a oligomerizzazione opTDP-43h indipendente dalla luce, transizione di fase e aggregazione. Pertanto, l'induzione di un livello stabile e non tossico di espressione di opTDP-43h nei motoneuroni spinali è la chiave per la valutazione di successo delle conseguenze fisiologiche e patologiche della transizione di fase opTDP-43 sui motoneuroni spinali. L'espressione mediata da mnr2b-BAC di opTDP-43 h sembra essere adatta a questo scopo perché i pesci Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] mostrano prevalentemente opTDP-43 nucleare, sono in grado di nuotare liberamente con una vescica natatoria gonfiata e mantengono la piena vitalità anche dopo essere stati sollevati in condizioni di buio continuo da 1-5 dpf. Nel pesce zebra, un approccio convenzionale utilizzato per esprimere esogenamente un gene di interesse è l'iniezione di mRNA allo stadio di una cellula. Tuttavia, un'alta dose della proteina TDP-43 tradotta dall'mRNA iniettato tutto in una volta provoca difetti dello sviluppo precoce14 che precludono l'analisi dei motoneuroni spinali che si differenziano successivamente. Tuttavia, abbassare la quantità di mRNA iniettato a un livello tollerabile non riesce a fornire un opTDP-43h sufficiente per la modulazione optogenetica nei motoneuroni spinali al momento della sua differenziazione, indicando che l'iniezione di mRNA non è un metodo adatto con cui fornire opTDP-43h ai motoneuroni spinali del pesce zebra. Un altro possibile approccio utilizzato per esprimere opTDP-43h nei motoneuroni spinali è l'iniezione, allo stadio unicellulare, di un plasmide o DNA BAC che ospita il costrutto opTDP-43h sotto il controllo di un promotore attivo nel motoneurone spinale. Sebbene l'iniezione di mnr2b-hs:opTDP-43h BAC DNA possa dirigere l'espressione di opTDP-43h nei motoneuroni spinali, il numero di motoneuroni opTDP-43h-positivi è basso, e in tali cellule opTDP-43h-positive con restrizioni numeriche, il livello di espressione è solitamente elevato, spesso associato all'aggregazione opTDP-43h indipendente dalla luce. Queste osservazioni suggeriscono collettivamente che l'espressione transgenica è una strategia insostituibile con cui esprimere stabilmente opTDP-43h nei motoneuroni spinali a livello non tossico. In particolare, sebbene mnr2b-BAC etichetti quasi tutti i motoneuroni spinali in zebrafish20,23, i livelli di espressione di opTDP-43h potrebbero variare tra le singole cellule mnr2b-positive. Questa variazione può essere in parte dovuta al modello di espressione intrinseca di mnr2b associato al suo ruolo regolatore nella differenziazione dei motoneuroni. Un'altra potenziale causa dell'espressione variegata può derivare da un effetto di posizione cromosomica sugli inserti mnr2b-BAC. Qualunque sia la causa, i vari livelli di espressione di opTDP-43 tra le cellule mnr2b-positive potrebbero causare variazioni nella citotossicità associata alla transizione di fase opTDP-43h dipendente dalla luce.
Nelle larve di zebrafish, i somi dei motoneuroni spinali sono densamente allineati nel midollo spinale ventrale e il citoplasma somalo ha un volume molto più basso di quello del citoplasma assonale. Questa caratteristica anatomica limita le analisi quantitative dell'opTDP-43h citoplasmatica nei motoneuroni spinali: opTDP-43h è misurabile solo quantitativamente nel nucleo e nel citoplasma somalo, ma non nell'intera cellula dei motoneuroni. L'imaging quantitativo di una proteina nell'intera cellula dei motoneuroni spinali, compresi il soma e il terminale del nervo periferico, rimane un compito impegnativo. Nonostante le restrizioni sui saggi quantitativi, il rapporto opTDP-43h/EGFP-TDP-43z nel soma ha dimostrato di essere elevato dalla mutazione che causa la SLA nell'IDR (A315T)14. Pertanto, il presente metodo è applicabile per valutare gli effetti della mutazione TDP-43 sulla stabilità delle proteine associate alla transizione di fase nel soma dei motoneuroni spinali.
In linea di principio, l'approccio mnr2b-BAC può essere esteso per modulare il LLPS e valutare la citotossicità di altre proteine RNP correlate alla SLA con IDR oltre TDP-43. Potrebbe essere necessario regolare diverse fasi del protocollo per ottenere un livello di espressione ottimale di tali sonde optogenetiche nei motoneuroni spinali. In primo luogo, nel costrutto transgenico Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h], il promotore hsp70l è stato utilizzato come promotore basale per aumentare l'espressione di opTDP-43h guidata da potenziatori mnr2b . Il promotore hsp70l può essere rimosso dal costrutto BAC se il livello di espressione di una proteina di interesse è così alto da causare una transizione di fase ectopica indipendente dalla luce. In secondo luogo, opTDP-43h è dotato di tag CRY2olig, che è un dominio di omologia fotoliasi (PHR) che trasporta una mutazione puntiforme che migliora la capacità di clustering sull'illuminazione a luce blu22. La proteina wild-type CRY2PHR può essere utilizzata come tag di oligomerizzazione dipendente dalla luce se è necessario attenuare l'attività di clustering dipendente dalla luce. Infine, per ricapitolare più fedelmente la patologia della SLA nel pesce zebra, è auspicabile stabilire un protocollo di illuminazione in cui la fisiologia del pesce sia minimamente influenzata dall'illuminazione del campo della luce blu durante le fasi giovanile e adulta. Il presente metodo utilizza un'illuminazione continua a luce blu da 48 a 72 hpf (per 24 h) e la durata dell'illuminazione può essere estesa fino a 120 hpf (per 72 h) senza perdere la vitalità del pesce14, sebbene le funzioni fisiologiche sensibili alla luce, come la visione, possano essere influenzate. Sviluppando un protocollo per l'illuminazione intermittente della luce, può diventare possibile una stimolazione luminosa molto più a lungo termine, che a sua volta può facilitare lo sviluppo di opTDP-43h in aggregati patologici più maturi. Per raggiungere questo obiettivo, altre sonde optogenetiche per modulare le interazioni proteina-proteina utilizzando diverse lunghezze d'onda della luce che sono meno fisiologicamente disturbanti24 possono anche valere la pena di indagare ulteriormente. Combinazioni di tali sonde optogenetiche TDP-43 migliorate, promotori appropriati mirati a tipi di cellule vulnerabili alla malattia e protocolli di illuminazione con effetti minimi sulle funzioni fisiologiche aprirebbero strade per modellare fedelmente le patologie delle proteinopatie TDP-43 non solo nel midollo spinale ma anche nel cervello.
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Disclosures
KA e KK sono gli inventori della proprietà intellettuale descritta in questo manoscritto e brevetti provvisori sono stati presentati dall'Istituto Nazionale di Genetica.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numeri JP19K06933 (KA) e JP20H05345 (KA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
References
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