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Neuroscience

Transición de fase optogenética de TDP-43 en neuronas motoras espinales de larvas de pez cebra

Published: February 25, 2022 doi: 10.3791/62932
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, 2Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, 3Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

Summary

Describimos un protocolo para inducir la transición de fase de la proteína 43 de unión al ADN TAR (TDP-43) por la luz en las neuronas motoras espinales utilizando el pez cebra como modelo.

Abstract

La agregación anormal de proteínas y la vulnerabilidad neuronal selectiva son dos características principales de las enfermedades neurodegenerativas. Las relaciones causales entre estas características pueden interrogarse mediante el control de la transición de fase de una proteína asociada a la enfermedad en un tipo de célula vulnerable, aunque este enfoque experimental ha sido limitado hasta ahora. Aquí, describimos un protocolo para inducir la transición de fase de la proteína de unión al ARN / ADN TDP-43 en las neuronas motoras espinales de larvas de pez cebra para modelar la agregación citoplasmática de TDP-43 que ocurre en las neuronas motoras degeneradas en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Describimos un método genético basado en el cromosoma artificial bacteriano (BAC) para administrar una variante optogenética de TDP-43 selectivamente a las neuronas motoras espinales del pez cebra. La alta translucidez de las larvas de pez cebra permite la transición de fase del TDP-43 optogenético en las neuronas motoras espinales mediante una simple iluminación externa utilizando un diodo emisor de luz (LED) contra peces sin restricciones. También presentamos un flujo de trabajo básico de imágenes en vivo de las neuronas motoras espinales del pez cebra y análisis de imágenes con el software Fiji / ImageJ disponible gratuitamente para caracterizar las respuestas del TDP-43 optogenético a la iluminación de la luz. Este protocolo permite la caracterización de la transición de fase de TDP-43 y la formación de agregados en un entorno celular vulnerable a la ELA, lo que debería facilitar la investigación de sus consecuencias celulares y de comportamiento.

Introduction

Los gránulos de ribonucleoproteína (RNP) controlan una miríada de actividades celulares en el núcleo y el citoplasma mediante el ensamblaje de particiones sin membrana a través de la separación de fase líquido-líquido (LLPS), un fenómeno en el que un fluido homogéneo se demezcla en dos fases líquidas distintas1,2. El LLPS desregulado de las proteínas de unión al ARN que normalmente funcionan como componentes de gránulos RNP promueve la transición de fase anormal, lo que lleva a la agregación de proteínas. Este proceso se ha implicado en enfermedades del neurodesarrollo y neurodegenerativas3,4,5. La evaluación precisa de una relación causal entre el LLPS aberrante de las proteínas de unión al ARN y la patogénesis de la enfermedad es crucial para determinar si y cómo el LLPS puede ser explotado como un objetivo terapéutico eficaz. El LLPS de proteínas de unión al ARN es relativamente fácil de estudiar in vitro y en modelos unicelulares, pero es difícil en organismos multicelulares, especialmente en vertebrados. Un requisito crítico para analizar dicho LLPS en células individuales dentro de un entorno tisular es expresar de manera estable una sonda para la obtención de imágenes y la manipulación de LLPS en un tipo de interés celular vulnerable a la enfermedad.

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es un trastorno neurológico finalmente mortal en el que las neuronas motoras del cerebro y la médula espinal se pierden selectiva y progresivamente debido a la degeneración. Hasta la fecha, las mutaciones en más de 25 genes se han asociado con la forma hereditaria (o familiar) de ELA, que representa el 5%-10% del total de casos de ELA, y algunos de estos genes causantes de ELA codifican proteínas de unión al ARN que consisten en RNP, como hnRNPA1, TDP-43 y FUS6,7. Además, la forma esporádica de ELA, que representa el 90%-95% del total de casos de ELA, se caracteriza por la agregación citoplasmática de TDP-43 depositada en neuronas motoras degeneradas. Una característica importante de estas proteínas de unión al ARN asociadas a la ELA son sus regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) o dominios de baja complejidad que carecen de estructuras tridimensionales ordenadas y median interacciones proteína-proteína débiles con muchas proteínas diferentes que impulsan LLPS7,8. El hecho de que las mutaciones causantes de ELA ocurran a menudo en los IDR ha llevado a la idea de que el LLPS aberrante y la transición de fase de estas proteínas relacionadas con la ELA pueden ser la base de la patogénesis de la ELA9,10.

Recientemente, se desarrolló el método optoDroplet, una técnica optogenética basada en Cryptochrome 2 que permite la modulación de las interacciones proteína-proteína por la luz, para inducir la transición de fase de proteínas con IDRs11. A medida que esta técnica se ha extendido con éxito a TDP-43, se han comenzado a descubrir los mecanismos subyacentes a la transición de fase patológica de TDP-43 y su citotoxicidad asociada12,13,14,15. En este protocolo, esbozamos un método genético para administrar un TDP-43 optogenético a tipos de células vulnerables a la ELA, a saber, las neuronas motoras espinales en el pez cebra utilizando el BAC para el gen mnr2b / mnx2b que codifica una proteína homeodominio para la especificación de la neurona motora16,17. La alta translucidez de las larvas de pez cebra permite una estimulación lumínica simple y no invasiva del TDP-43 optogenético que desencadena su transición de fase en las neuronas motoras espinales. También presentamos un flujo de trabajo básico para la obtención de imágenes en vivo de las neuronas motoras espinales del pez cebra y el análisis de imágenes utilizando el software Fiji / ImageJ disponible gratuitamente para caracterizar las respuestas del TDP-43 optogenético a la estimulación de la luz. Estos métodos permiten una investigación de la transición de fase de TDP-43 en un entorno celular vulnerable a la ELA y deberían ayudar a explorar sus consecuencias patológicas a nivel celular y conductual.

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Protocol

Todo el trabajo con peces se llevó a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (número de identificación de aprobación 24-2) del Instituto Nacional de Genética (Japón), que tiene un Aseguramiento de Bienestar Animal en el archivo (número de garantía A5561-01) en la Oficina de Bienestar de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, Estados Unidos).

1. Construcción de BAC para la expresión del gen optogenético TDP-43 a partir del promotor mnr2b

  1. Preparación bac
    1. Compre un clon de BAC de pez cebra que contenga el locus mnr2b de pez cebra (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Purificar el ADN BAC de un cultivo de LB de 5 ml durante la noche de DH10B Escherichia coli (E. coli) que alberga CH211-172N16 como se describe en Warming et al.18.
    2. Transformar CH211-172N16 en células SW102 E. coli por electroporación, como se describe en Warming et al.18.
      NOTA: La purificación del ADN BAC de la E. coli el mismo día de la electroporación suele dar una mayor tasa de éxito de transformación bac18. De lo contrario, el ADN BAC purificado se mantiene a -20 °C hasta su uso.
    3. Introducir el casete iTol2-amp para la transgénesis BAC mediada por transposón Tol219 en la columna vertebral de CH211-172N16 por electroporación, como se describe en Asakawa et al.20.
      1. Hacer un stock de glicerol de los clones de células de E. coli portadores de CH211-172N16 con la integración de cassette iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) después de confirmar la integración homóloga mediada por recombinación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Ex Taq) utilizando el par de cebadores Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') y pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') y las siguientes condiciones: un paso de desnaturalización a 98 °C durante 1 min, seguido de 25 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s, recocido por imprimación a 55 °C durante 15 s y extensión del cebador a 72 °C durante 1 min, amplificando un producto de PCR de 354 pares de bases (pb).
  2. mnr2b-hs:opTDP-43h construcción
    1. Construir un plásmido portador del casete de expresión para el TDP-43/TARDBP humano de tipo salvaje (TDP-43h) que esté marcado con mRFP1 y CRY2olig en el N- y C-termini, respectivamente (en adelante, opTDP-43h)14.
      NOTA: El fragmento opTDP-43h debe estar flanqueado con la secuencia de señales promotora del gen hsp70l del pez cebra (650 pb) y poliadenilación (poliA), seguida de un gen de resistencia a la kanamicina (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. Amplificar el casete hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan con cebadores que annean hsp70l y Kan y contener secuencias de 45 pb de los codones aguas arriba y aguas abajo de los codones iniciadores del gen mnr2b por PCR (GXL DNA Polymerase) utilizando el par de cebadores mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') y Km-r (5'-ggt tct tct tct tct gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') con las siguientes condiciones: un paso de desnaturalización a 98 °C durante 1 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s, recocido por imprimación a 55 °C durante 15 s y extensión de imprimación a 68 °C durante 30 s, amplificando un producto de PCR de ~5.7 bp.
    3. Separe los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa (100 V) y purifique la banda de ADN hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan con una columna de ADN. Ajuste la concentración del casete purificado hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan a 50 ng/μL en tampón Tris-EDTA (TE) que contiene 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) y 1 mM EDTA.
    4. Introducir el cassette hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan en CH211-172N16-iTol2A por electroporación como se describe en Warming et al.18 y seleccionar transformadores resistentes a la ampicilina y la kanamicina en placas de agar LB. CH211-172N16-iTol2A que transporta el casete hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan se designa como mnr2b-hs:opTDP-43h.
    5. Purifique mnr2b-hs:opTDP-43h utilizando un kit de purificación BAC y disuelva a 250 ng/μL en TE después de la extracción de fenol/cloroformo.
  3. mnr2b-hs: construcción EGFP-TDP-43z
    1. Construir otro plásmido portador del pez cebra de tipo salvaje tardbp que está marcado con proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) en su N-terminal (EGFP-TDP-43z) en lugar de opTDP-43h pero que por lo demás es idéntico al hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan constructo (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Utilice EGFP-TDP-43z como control interno para la estimulación lumínica de opTDP-43h.
    2. Construya CH211-172N16-iTol2A que alberga el casete hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan en el locus mnr2b como se describe en 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A que lleva el casete hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan está designado como mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Transgénesis BAC mediada por transposón Tol2 en pez cebra

  1. Preparar la solución inyectable que contenga 40 mM KCl, rojo fenol (10% v/v), 25 ng/μL del ADN mnr2b-hs:opTDP-43h y 25 ng/μL Tol2 transposasa mRNA19.
  2. Inyecte 1 nL de la solución inyectable (una gota con un diámetro de aproximadamente 123 μm calibrada en aceite mineral) en el citosol de embriones de pez cebra de tipo salvaje en la etapa de una célula. Examinar a los peces inyectados para detectar la formación de agregados positivos para proteínas fluorescentes rojas (RFP) en varios tejidos embrionarios, incluidas las neuronas motoras espinales, bajo un estereomicroscopio de fluorescencia a los 2-3 días después de la fertilización (dpf). Elevar los peces positivos para RFP a la edad adulta.
  3. Inyecte el ADN mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z como se describe en 2.1 y 2.2. Elevar los peces EGFP positivos a la edad adulta.
  4. Después de unos meses, coloque peces inyectados sexualmente maduros y peces de tipo silvestre en parejas en jaulas de apareamiento estándar de 2 L para obtener descendencia F1. Cribe peces F1 a 3 dpf para la fluorescencia RFP (opTDP-43h) o EGFP (EGFP-TDP-43z) en la columna vertebral motora utilizando un microscopio de epifluorescencia equipado con una lente de objetivo Plan-Neofluar 5x / 0.15. Por lo general, se identifica un pez fundador a partir de 10-20 peces inyectados (la tasa de transmisión de la línea germinal es del 5%-10%).
  5. Aislar y comparar múltiples insertos Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] y Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] de diferentes peces fundadores, ya que la intensidad, pero no el patrón, de la expresión de opTDP-43h o EGFP-TDP-43z puede variar entre los peces fundadores debido a los efectos de posición cromosómica.
  6. Cruce líneas de peces Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] y Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] para obtener crías que contengan Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peces de doble transgenuro en proporción mendeliana.
  7. Críe el pescado en un plato de plástico que contenga 30 mL de tampón E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 10-5% Azul de Metileno) y agregue 0.003% (p/ v) N-feniltiorea a las 8-10 h después de la fertilización (hpf) para inhibir la melanogénesis.
  8. Cubra el plato de plástico con papel de aluminio después de 30 hpf.

3. Preparación de LED para iluminación de luz azul

  1. Encienda un panel LED utilizando la aplicación asociada instalada en una tableta / teléfono. Coloque la sonda de un espectrómetro en un pozo vacío de un plato de 6 pocillos y ajuste la luz LED a la longitud de onda que alcanza un máximo de ~ 456 nm a través de la aplicación. Coloque el sensor óptico de un medidor de potencia óptica en el pozo vacío y ajuste la potencia de la luz LED (~ 0.61 mW / cm2). La configuración de la luz LED se puede guardar y se puede recuperar en la aplicación.
  2. Introduzca el ajuste del plato/panel LED en la incubadora a 28 °C. Termine este paso antes de que la imagen de los peces comience a 48 hpf.

4. Imágenes de larvas de pez cebra que expresan TDP-43 optogenético

  1. Seleccione peces Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] de doble transgénico al menos antes de 47 hpf, según la fluorescencia RFP (opTDP-43h) o EGFP (EGFP-TDP-43z) en la columna motora espinal utilizando la configuración del microscopio de epifluorescencia descrita anteriormente.
  2. Decorionar el pez Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] de doble transgénico.
  3. Precalentar al 1% la agarosa a baja temperatura de fusión que contenga 250 μg/ml de sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato a 42 °C.
  4. Anestesiar brevemente Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] peces de doble transgénico a 48 hpf en tampón E3 que contiene la misma concentración de tricano.
  5. Coloque una gota de la agarosa precalentada a baja temperatura de fusión al 1% en el plato base de vidrio a temperatura ambiente. El diámetro de la gota de agarosa en forma de cúpula en el plato de vidrio es de 8-10 mm.
  6. Usando una pipeta Pasteur, agregue el pescado anestesiado a la agarosa de baja temperatura de fusión en el plato base de vidrio, y luego mezcle pipeteando varias veces. Minimice la cantidad del tampón E3 agregado a la agarosa junto con los peces.
  7. Mantenga el pez de lado usando una aguja de jeringa durante la solidificación de la agarosa (generalmente ~ 1 min) para asegurarse de que la médula espinal esté en una posición horizontal adecuada. Después de la solidificación, coloque un par de gotas de tampón E3 en el pez montado en agarosa en forma de cúpula.
  8. Adquiera secciones z confocales en serie de la médula espinal mediante escaneo con un microscopio confocal equipado con una lente de objetivo de inmersión en agua 20x con la apertura numérica 1.00, utilizando una velocidad de escaneo de 4.0 μs por píxel (12 bits por píxel), un tamaño de paso de 1.0 μm por rebanada para el objetivo y una combinación de longitudes de onda de excitación / emisión: Canal 1) 473/510 nm para EGFP y Canal 2) 559/583 nm para mRFP1.
    NOTA: La cloaca en el lado ventral del pez se incluye en las regiones de interés (ROI) como referencia, lo que ayuda a identificar y comparar los segmentos espinales (niveles 16-17) a través de los puntos de tiempo.
  9. Retire el pescado de la agarosa agrietando cuidadosamente la agarosa con una aguja de jeringa tan pronto como se complete la imagen. Mantenga la cantidad de tiempo que el pez está incrustado en la agarosa lo más corto posible, aunque la incrustación de agarosa durante <30 min no afecta la viabilidad del pez.

5. Estimulación lumínica de peces que expresan opTDP-43h mediante la iluminación de campo de una luz de diodo emisor de luz azul (LED)

  1. Agregue 7.5 mL de tampón E3 al pozo y coloque el pez Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doble transgénico en el pozo. Coloque el plato de seis pocillos en el panel LED manteniendo el plato y el panel LED separados 5 mm con un espaciador (por ejemplo, con cinco vasos deslizantes apilados).
  2. Encienda la luz LED azul. Mantenga algunos de los peces Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doble transgénico en un plato separado de seis pocillos cubierto con papel de aluminio cuando sea necesario un pescado de control no iluminado (es decir, en condiciones de oscuridad)14.
  3. Después de la iluminación (por ejemplo, durante 24 h a 72 hpf en la Figura 3), obtenga una imagen de la médula espinal del pez iluminado repitiendo los pasos 4.3 - 4.9.

6. Visualización de la reubicación citoplasmática de TDP-43 optogenético en las neuronas motoras espinales

  1. Abra el archivo de imagen en ImageJ/Fiji21 (Versión: 2.1.0/1.53c), un programa de procesamiento de imágenes Java de código abierto desarrollado por NIH Image, que se puede descargar desde https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Utilice la barra de desplazamiento Z para desplazarse por los planos focales. Cree una proyección de máxima intensidad de varios sectores haciendo clic en Imagen | Pilas | | del proyecto Z Intensidad máxima y ajuste Corte de inicio y Corte de parada que cubren los hemisegmentos de la columna vertebral motora.
  3. Divida la imagen multicanal en dos imágenes de un solo canal haciendo clic en Imagen | | de color Canales divididos.
  4. Mejore la señal EGFP-TDP-43z para garantizar que el EGFP-TDP-43z citoplasmático sea visible claramente haciendo clic en Imagen | Ajustar | Brillo/Contraste y ajuste mínimo
  5. Abra el administrador de ROI haciendo clic en Analizar | Herramientas | Gestor de ROI. Encuentre las células que son identificables en ambas imágenes a 48 hpf y 72 hpf, según las posiciones relativas de los cuerpos celulares. Establezca el ROI delineando los contornos de los cuerpos celulares de las neuronas motoras espinales individuales visualizadas por la señal EGFP-TDP-43z utilizando selecciones a mano alzada y, a continuación, haga clic en Agregar[t] en el administrador de ROI.
  6. Establezca un eje principal del soma dibujando una línea recta usando Recto y haciendo clic en Analizar | Perfil de trazado para imágenes EGFP-TDP-43z (C1) y opTDP-43h (C2) a 48 y 72 hpf.
  7. Normalice el perfil de trazado dividiendo los valores por el valor máximo para cada señal EGFP-TDP-43z y opTDP-43h. Trazar los valores normalizados con coordenadas x-y, donde x e y representan el eje mayor del soma y las intensidades fluorescentes relativas, respectivamente, utilizando el gráfico XY en un software estadístico.

7. Comparación ratiométrica entre señales opTDP-43h y EGFP-TDP-43z utilizando ImageJ/Fiji

  1. Abra el archivo de imagen en ImageJ/Fiji y establezca ROI para celdas mnr2b positivas individuales utilizando una imagen de proyección de máxima intensidad de EGFP-TDP-43z como en 6.1-6.5. Agregue un ROI fuera de la médula espinal ventral (por ejemplo, notocorda) para representar la señal de fondo (ROI de fondo).
  2. Para cada imagen EGFP-TDP-43z y opTDP-43, cree una proyección de varios sectores haciendo clic en Imagen | Pilas | | del proyecto Z Suma sectores y establece Sectores de inicio y Sector de parada que cubren la columna del motor hemispinal.
  3. Abra el gestor de ROI creado con la imagen de proyección de máxima intensidad. Para mostrar el ROI en la imagen Suma de sectores, seleccione la ventana de imagen de EGFP-TDP-43z y, a continuación, haga clic en Mostrar todo en el administrador de ROI. Haga clic en Medir en el gestor de ROI para obtener los valores medios de cada ROI.
  4. Adquirir valores medios para opTDP-43h siguiendo el mismo procedimiento previsto en 7.3.
  5. Para cada ROI, después de restar la media para el ROI de fondo, divida la media restada para opTDP-43h por la media restada para EGFP-TDP-43z para obtener el valor ratiométrico. Los valores ratiométricos se pueden comparar entre diferentes puntos de tiempo y presentarse utilizando el gráfico de columnas en el software Prism.

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Representative Results

Imágenes en vivo de proteínas TDP-43 optogenéticas y no optogenéticas en las neuronas motoras espinales mnr2b + de larvas de pez cebra
Para inducir la transición de fase de TDP-43 en las neuronas motoras espinales en el pez cebra, se construyó un TDP-43h humano que está marcado con mRFP1 y CRY2olig22 en el N- y C-termini, respectivamente, y designado como opTDP-43h14 (Figura 1A). El fragmento del gen opTDP-43h se introdujo en un BAC que contenía el locus mnr2b (Figura 1B). El BAC resultante, designado como mnr2b-hs:opTDP-43h, fue introducido en el genoma del pez cebra por la transgénesis BAC mediada por transposón Tol219. Para monitorear la localización de TDP-43 no optogenético en las neuronas motoras espinales, se etiquetó un pez cebra TDP-43 codificado por el gen tardbp con EGFP en el extremo N (Figura 1A) y se introdujo el fragmento del gen EGFP-TDP-43z en el BAC mnr2b, similar a opTDP-43h (Figura 1B). El BAC resultante, designado como mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z, fue introducido en el genoma del pez cebra por la transgénesis BAC mediada por transposón Tol2. El pez inyectado con cada construcción de BAC se cruzó con un pez de tipo salvaje y los peces F1 resultantes se examinaron el día 3 para detectar fluorescencia roja (Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]) o verde (Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]) en la médula espinal ventral. Los peces F1 aislados rojos o verdes positivos para fluorescencia fueron designados como Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] o Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z], respectivamente.

Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] los peces dobles transgénicos a 48 hpf fueron anestesiados e incrustados en una agarosa de baja fusión en su lado; después de la solidificación de la agarosa, se cubrieron con tampón E3 para permitir observaciones del lado lateral de la médula espinal desde arriba. La microscopía de barrido láser confocal se realizó con una lente de objetivo de inmersión en agua 20x y una combinación de longitudes de onda de excitación/emisión: 473/510 nm para EGFP y 559/583 nm para mRFP1. El pez escaneado se tomó inmediata y cuidadosamente de la agarosa, se transfirió al búfer E3 en una placa de seis pocillos y se iluminó con una luz LED azul colocando la placa en un panel LED a 28 ° C (Figura 2A, B). Después de una iluminación de 24 horas, el pez fue anestesiado e incrustado nuevamente en agarosa antes de ser escaneado con una microscopía confocal utilizando las mismas condiciones de imagen, excepto que el ROI se ajustó para incluir la región de la médula espinal correspondiente fotografiada a 48 hpf (Figura 2B). Toda la médula hemispinal de 4-5 segmentos espinales contiguos se tomó una imagen durante la sesión de microscopía (típicamente 20-30 min), generando imágenes de la serie Z que contienen 20-40 cortes dependiendo de la horizontalidad del eje longitudinal de la médula espinal del pez montado en relación con el plano de escaneo confocal.

Visualización de la reubicación citoplasmática de TDP-43 optogenético en neuronas motoras espinales
Para visualizar la reubicación citoplasmática de opTDP-43h en neuronas motoras espinales individuales, las imágenes de la serie z (típicamente 20-40 cortes) adquiridas a 48 y 72 hpf se abrieron con Fiji y se separaron en cada canal EGFP-TDP-43z y opTDP-43h. Se crearon imágenes de proyección de intensidad máxima de EGFP-TDP-43z para imágenes a 48 y 72 hpf y se seleccionó una sola neurona espinal aislada identificable en ambas imágenes a 48 y 72 hpf (Figura 2B, flechas). Las neuronas motoras espinales con cuerpos celulares ubicados en el lado dorsal de la columna motora se consideraron adecuadas para las mediciones de la forma del cuerpo celular debido a sus escasos patrones de distribución.

Después de ajustar la intensidad de la señal EGFP en imágenes EGFP-TDP-43z, se establecieron ROI que cubren los somas de las neuronas motoras trazando el borde de la señal EGFP a 48 y 72 hpf (Figura 2C). La intensidad fluorescente a lo largo del eje principal del soma se midió para las señales EGFP-TDP-43z y opTDP-43h a 48 y 72 hpf (Figura 2C, derecha). A 48 hpf, los patrones de señales opTDP-43h y EGFP-TDP-43z se superponían en gran medida entre sí.

En contraste, a 72 hpf, el pico de la señal opTDP-43h se encontró en la región donde la señal EGFP-TDP-43z era baja, es decir, en el citoplasma, lo que indica la reubicación citoplasmática de opTDP-43h. La reubicación citoplasmática dependiente de la luz opTDP-43h se inicia en gran medida independientemente de la TDP-4314 no optogenética. En este ensayo, se utilizaron imágenes de proyección de intensidad máxima para estimar la posición del límite núcleo/citoplasma a expensas de las mediciones cuantitativas.

Comparación ratiométrica de la intensidad de fluorescencia de TDP-43 optogenética y no optogenética en las neuronas motoras espinales
Para evaluar los efectos de la estimulación con luz azul en los niveles fluctuantes de proteína opTDP-43h, se midieron las señales opTDP-43h en el cuerpo celular antes y después de la estimulación lumínica con referencia a la señal EGFP-TDP-43z. Las imágenes de la serie Z, incluido el hemisegmento espinal, se abrieron con Fiji. Para establecer el ROI que cubre neuronas motoras espinales individuales, se crearon imágenes de proyección de intensidad máxima de la señal EGFP-TDP-43z para 48 y 72 hpf, y se seleccionaron neuronas espinales aisladas individuales que eran identificables en imágenes de 48 y 72 hpf (Figura 3A). Utilizando selecciones a mano alzada, los ROI se dibujaron y registraron en un administrador de ROI para cada una de las imágenes de 48 y 72 hpf (Figura 3A). La proyección de intensidad máxima de la señal EGFP-TDP-43z se consideró adecuada para establecer el ROI debido a su alto contraste.

Para cuantificar las señales opTDP-43h y EGFP-TDP-43z, se produjeron imágenes de proyección de cortes sum para cada canal de las mismas imágenes de la serie z para 48 y 72 hpf (Figura 3A). Utilizando los conjuntos de ROI registrados, se midieron las intensidades fluorescentes de opTDP-43h y EGFP-TDP-43z para cada punto de tiempo. Se calcularon las cantidades relativas de opTDP-43h a EGFP-TDP-43z (valores RFP/GFP) para cada celda y punto de tiempo dividiendo el valor rfp por el valor GFP (Figura 3B). De las cuatro células mnr2b positivas que se investigaron, la celda # 1 mostró notablemente una señal saturada egFP-TDP-43z (Figura 3A). Las células con señales fluorescentes saturadas deben excluirse de los conjuntos de datos al realizar análisis cuantitativos. Las celdas #2-#4 mostraron tendencias decrecientes de los niveles relativos de opTDP-43h a EGFP-TDP-43z después de la iluminación con luz azul (Figura 3B), aunque un análisis a mayor escala demostró previamente que la disminución en los niveles relativos de opTDP-43h a EGFP-TDP-43z no fue estadísticamente significativa (65 células de tres animales independientes)14.

Figure 1
Figura 1: Construcción de ADN BAC utilizando el locus mnr2b . (A) Estructuras de los casetes de expresión para opTDP-43h y EGFP-TDP-43z. (B) La región genómica del pez cebra transportada por el ADN BAC CH211-172N16. Los casetes de expresión amplificados por PCR para opTDP-43h y EGFP-TDP-43z se insertan aguas abajo de la región 5′-no traducida (UTR) del mnr2b (flecha roja) en el primer exón de mnr2b por recombinación homóloga. Las barras indican 500 (A) y 10k (B) bp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes en vivo de opTDP-43h antes y después de la estimulación de la luz. (A) Un esquema de la estimulación lumínica de opTDP-43h expresada en las neuronas motoras espinales de peces Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doble transgénico a través de una iluminación de campo de luz LED azul de 48 a 72 hpf. (B) Imágenes de proyección de intensidad máxima de las imágenes confocales de la serie Z de la médula espinal ventral antes (48 hpf) y después (72 hpf) de la estimulación lumínica. Las líneas discontinuas demarcan el límite ventral de la médula espinal. Las figuras están adaptadas de Asakawa et al.14 (C) La localización citoplasmática errónea de opTDP-43 después de la iluminación de luz azul de 24 horas. Los contornos del soma de una célula mnr2b positiva (flechas rojas en B) observados a 48 y 72 hpf se muestran en magenta. Los ejes principales de los somas se mostraron con azul claro. Se trazó la intensidad fluorescente normalizada a lo largo de los ejes principales. El asterisco indica un grupo de señales opTDP-43 fuertes que no muestran una señal superpuesta EGFP-TDP-43z fuerte, lo que indica una mala localización citoplasmática opTDP-43h. Las barras indican 1 mm (A), 20 μm (B) y 4 μm (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Comparaciones ratiométricas de opTDP-43h y EGFP-TDP-43z antes y después de la estimulación de la luz. (A) Los ROI que cubren los somas de cuatro células mnr2b-positivas individuales a 48 y 72 hpf se dibujaron en función de la señal EGFP-TDP-43z y se muestran en magenta. Los ROI rectangulares (bg) se utilizaron para restar la señal de fondo (ROI de fondo). Las cifras se adaptan de Asakawa et al.14 (B) Las intensidades relativas de opTDP-43h a EGFP-TDP-43z se trazaron para cada célula en cada punto temporal como la relación RFP/GFP. La celda #1, indicada por el asterisco, no fue adecuada para la comparación ratiométrica porque su señal EGFP-TDP-43z estaba saturada y su valor RFP/GFP estaba sobreestimado. La barra indica 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La expresión mediada por mnr2b-BAC de opTDP-43h y EGFP-TDP-43z en pez cebra proporciona una oportunidad única para la obtención de imágenes en vivo de la transición de fase de TDP-43 en las neuronas motoras espinales. La transparencia óptica de los tejidos corporales de las larvas de pez cebra permite la estimulación optogenética simple y no invasiva de opTDP-43h. Las comparaciones entre neuronas motoras espinales individuales a lo largo del tiempo demostraron que la oligomerización dependiente de la luz de opTDP-43h causa su agrupamiento citoplasmático, que recuerda a la patología de la ELA.

Uno de los parámetros críticos que definen el comportamiento de fase de una proteína intrínsecamente desordenada es la concentración intracelular. Un alto nivel de expresión de opTDP-43h podría conducir potencialmente a la oligomerización, transición de fase y agregación de opTDP-43h independientes de la luz. Por lo tanto, la inducción de un nivel estable y no tóxico de expresión de opTDP-43h en las neuronas motoras espinales es clave para la evaluación exitosa de las consecuencias fisiológicas y patológicas de la transición de fase de opTDP-43 en las neuronas motoras espinales. La expresión mediada por mnr2b-BAC de opTDP-43 h parece ser adecuada para este propósito porque los peces Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] muestran predominantemente opTDP-43 nuclear, son capaces de nadar libremente con una vejiga natatoria inflada y mantienen la viabilidad completa incluso después de ser criados en las condiciones de oscuridad continua de 1-5 dpf. En el pez cebra, un enfoque convencional utilizado para expresar exógenamente un gen de interés es la inyección de ARNm en la etapa de una célula. Sin embargo, una dosis elevada de la proteína TDP-43 traducida a partir del ARNm inyectado de una sola vez provoca defectos de desarrollo tempranos14 que impiden los análisis de las neuronas motoras espinales diferenciadoras posteriormente. Sin embargo, la reducción de la cantidad de ARNm inyectado a un nivel tolerable no proporciona suficiente opTDP-43h para la modulación optogenética en las neuronas motoras espinales en el momento de su diferenciación, lo que indica que la inyección de ARNm no es un método adecuado para administrar opTDP-43h a las neuronas motoras espinales del pez cebra. Otro posible enfoque utilizado para expresar opTDP-43h en las neuronas motoras espinales es inyectar, en la etapa de una célula, un plásmido o ADN BAC que alberga la construcción opTDP-43h bajo el control de un promotor que está activo en la neurona motora espinal. Aunque la inyección de mnr2b-hs:opTDP-43h BAC DNA puede dirigir la expresión de opTDP-43h en las neuronas motoras espinales, el número de neuronas motoras opTDP-43h positivas es bajo, y en tales células opTDP-43h-positivas numéricamente restringidas, el nivel de expresión suele ser alto, a menudo asociado con la agregación de opTDP-43h independiente de la luz. Estas observaciones sugieren colectivamente que la expresión transgénica es una estrategia insustituible mediante la cual expresar de manera estable opTDP-43h en las neuronas motoras espinales a un nivel no tóxico. En particular, aunque el mnr2b-BAC marca casi todas las neuronas motoras espinales en el pez cebra20,23, los niveles de expresión de opTDP-43h podrían variar entre las células mnr2b-positivas individuales. Esta variación puede deberse en parte al patrón de expresión intrínseco de mnr2b asociado con su papel regulador en la diferenciación de las neuronas motoras. Otra causa potencial para la expresión abigarrada puede resultar de un efecto de posición cromosómica en los insertos mnr2b-BAC. Cualquiera que sea la causa, los variados niveles de expresión de opTDP-43 entre las células mnr2b-positivas podrían causar variación en la citotoxicidad asociada con la transición de fase opTDP-43h dependiente de la luz.

En las larvas de pez cebra, los somas de las neuronas motoras espinales están densamente alineados en la médula espinal ventral, y el citoplasma somal tiene un volumen mucho menor que el del citoplasma axonal. Esta característica anatómica limita los análisis cuantitativos de opTDP-43h citoplasmático en las neuronas motoras espinales: opTDP-43h solo es cuantitativamente medible en el núcleo y el citoplasma somal, pero no en toda la célula de las neuronas motoras. La obtención de imágenes cuantitativas de una proteína en toda la célula de las neuronas motoras espinales, incluido el soma y la terminal nerviosa periférica, sigue siendo una tarea desafiante. A pesar de las restricciones en los ensayos cuantitativos, la relación opTDP-43h/EGFP-TDP-43z en el soma se mostró elevada por la mutación causante de ELA en el IDR (A315T)14. Por lo tanto, el presente método es aplicable a la evaluación de los efectos de la mutación TDP-43 sobre la estabilidad de la proteína asociada con la transición de fase en el soma de las neuronas motoras espinales.

En principio, el enfoque mnr2b-BAC puede extenderse para modular el LLPS y evaluar la citotoxicidad de otras proteínas RNP relacionadas con la ELA con IDR más allá de TDP-43. Es posible que sea necesario ajustar varios pasos del protocolo para obtener un nivel de expresión óptimo de tales sondas optogenéticas en las neuronas motoras espinales. En primer lugar, en la construcción transgénica Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h], el promotor hsp70l se utilizó como promotor basal para aumentar la expresión de opTDP-43h impulsada por potenciadores mnr2b . El promotor hsp70l puede eliminarse de la construcción BAC si el nivel de expresión de una proteína de interés es tan alto que causa una transición de fase ectópica independiente de la luz. En segundo lugar, opTDP-43h está equipado con la etiqueta CRY2olig, que es un dominio de homología de fotoliasa (PHR) que lleva una mutación puntual que mejora la capacidad de agrupamiento en la iluminación de luz azul22. La proteína de tipo salvaje CRY2PHR se puede utilizar como una etiqueta de oligomerización dependiente de la luz si existe la necesidad de atenuar la actividad de agrupamiento dependiente de la luz. Finalmente, para recapitular más fielmente la patología de la ELA en el pez cebra, es deseable establecer un protocolo de iluminación donde la fisiología de los peces se vea mínimamente afectada por la iluminación de campo de la luz azul durante las etapas juvenil y adulta. El presente método utiliza una iluminación continua de luz azul de 48 a 72 hpf (durante 24 h), y la duración de la iluminación se puede extender hasta 120 hpf (durante 72 h) sin perder la viabilidad de los peces14, aunque las funciones fisiológicas sensibles a la luz, como la visión, pueden verse afectadas. Al desarrollar un protocolo para la iluminación intermitente de la luz, puede ser posible la estimulación de la luz a largo plazo, lo que a su vez puede facilitar el desarrollo de opTDP-43h en agregados patológicos más maduros. Para lograr esto, también puede valer la pena investigar más a fondo otras sondas optogenéticas para modular las interacciones proteína-proteína utilizando diferentes longitudes de onda de luz que son menos perturbadoras fisiológicamente2424 . Las combinaciones de tales sondas optogenéticas TDP-43 mejoradas, promotores apropiados dirigidos a tipos de células vulnerables a la enfermedad y protocolos de iluminación con efectos mínimos en las funciones fisiológicas abrirían vías para modelar fielmente las patologías de las proteinopatías TDP-43 no solo en la médula espinal sino también en el cerebro.

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Disclosures

KA y KK son los inventores de la propiedad intelectual descrita en este manuscrito y las patentes provisionales han sido presentadas por el Instituto Nacional de Genética.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant números JP19K06933 (KA) y JP20H05345 (KA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope Olympus FV1200
Epifluorescence microscope ZEISS Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope Leica MZ16FA
Glass base dish IWAKI 3910-035
Incubator MEE CN-25C
LED panel Nanoleaf Limited Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus TAKARA AD110
NucleoBond BAC100 MACHEREY-NAGEL 740579
NuSieve GTG Agarose LONZA 50181
Objective lens Olympus XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens ZEISS Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter HIOKI 3664
Optical sensor HIOKI 9742-10
Phenol red solution 0.5% Merck P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase TAKARA R050A
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Six-well dish FALCON 353046
Spectrometer probe BLUE-Wave StellerNet Inc. VIS-50
Syringe needle TERUMO NN-2725R
TaKaRa Ex Taq TAKARA RR001A
Tricane Sigma-Aldrich A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16 BACPAC Genomics CH211-172N16

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References

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Neurociencia Número 180 enfermedad neurodegenerativa ELA sistema optoDroplet Criptocromo 2 TDP-43 pez cebra neurona motora espinal, mnr2b transgénesis BAC
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Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (180), e62932, doi:10.3791/62932 (2022).

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