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Neuroscience

Transição de fase optogenética do TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish

Published: February 25, 2022 doi: 10.3791/62932
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, 2Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, 3Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

Summary

Descrevemos um protocolo para induzir a transição de fase da proteína de ligação de DNA TAR 43 (TDP-43) por luz nos neurônios motores espinhais usando zebrafish como modelo.

Abstract

A agregação anormal de proteínas e a vulnerabilidade neuronal seletiva são duas marcas principais de doenças neurodegenerativas. As relações causais entre essas características podem ser interrogadas controlando a transição de fase de uma proteína associada à doença em um tipo celular vulnerável, embora essa abordagem experimental tenha sido limitada até agora. Aqui, descrevemos um protocolo para induzir a transição de fase da proteína de ligação de RNA/DNA TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish para modelagem da agregação citoplasmática de TDP-43 ocorrendo em neurônios motores degenerados na esclerose lateral amiotrófica (ELA). Descrevemos um método genético baseado em cromossomo artificial bacteriano (BAC) para fornecer uma variante optogenética TDP-43 seletivamente aos neurônios motores espinhais de zebrafish. A alta translucência das larvas de zebrafish permite a transição de fase do TDP-43 optogenético nos neurônios motores espinhais por uma simples iluminação externa usando um diodo emissor de luz (LED) contra peixes desenfreados. Também apresentamos um fluxo básico de imagens ao vivo dos neurônios motores espinhais do zebrafish e análise de imagem com software Fiji/ImageJ livremente disponível para caracterizar respostas do TDP-43 optogenético à iluminação da luz. Este protocolo permite a caracterização da transição de fase TDP-43 e formação agregada em um ambiente celular vulnerável à ALS, o que deve facilitar a investigação de suas consequências celulares e comportamentais.

Introduction

Os grânulos de ribonucleoproteína (RNP) controlam uma miríade de atividades celulares no núcleo e citoplasma, montando partições sem membrana através da separação de fase líquido-líquido (LLPS), fenômeno no qual um fluido homogêneo se mistura em duas fases líquidas distintas1,2. Os LLPS desregulados de proteínas de ligação de RNA que normalmente funcionam como componentes de grânulo RNP promovem a transição de fase anormal, levando à agregação de proteínas. Esse processo foi implicado em doenças neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativas3,4,5. A avaliação precisa de uma relação causal entre LLPS aberrantes de proteínas ligantes de RNA e patogênese de doenças é crucial para determinar se e como o LLPS pode ser explorado como um alvo terapêutico eficaz. LLPS de proteínas de ligação de RNA é relativamente fácil de estudar in vitro e em modelos unicelulares, mas é difícil em organismos multicelulares, especialmente em vertebrados. Um requisito crítico para analisar tais LLPS em células individuais dentro de um ambiente tecidual é expressar uma sonda para a imagem e manipulação de LLPS em um tipo de interesse celular vulnerável à doença.

A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurológica fatal na qual os neurônios motores do cérebro e da medula espinhal são perdidos seletivamente e progressivamente devido à degeneração. Até o momento, mutações em mais de 25 genes foram associadas à forma herediável (ou familiar) da ELA, que representa 5%-10% do total de casos de ELA, e alguns desses genes causadores de ELA codificam proteínas de ligação de RNA constituídas por RNPs, como hnRNPA1, TDP-43 e FUS6,7. Além disso, a forma esporádica da ELA, que responde por 90%-95% do total de casos de ELA, é caracterizada pela agregação citoplasmática do TDP-43 depositado em neurônios motores degenerados. Uma das principais características dessas proteínas ligadas à RNA associadas à ALS são suas regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) ou domínios de baixa complexidade que carecem de estruturas tridimensionais ordenadas e mediam interações proteína-proteína fracas com muitas proteínas diferentes que impulsionam LLPS7,8. O fato de que mutações causadoras de ELA ocorrem frequentemente nos IDRs levou à ideia de que LLPS aberrantes e transição de fase dessas proteínas relacionadas à ELA podem estar por trás da patogênese da ALS9,10.

Recentemente, o método optoDroplet, uma técnica optogenética baseada em Cryptochrome 2 que permite a modulação de interações proteína-proteína por luz, foi desenvolvido para induzir a transição de fase de proteínas com IDRs11. Como esta técnica foi estendida com sucesso ao TDP-43, começou a descobrir os mecanismos subjacentes à transição de fase patológica do TDP-43 e sua citotoxicidade associada12,13,14,15. Neste protocolo, descrevemos um método genético para fornecer um TDP-43 optogenético para tipos de células vulneráveis à ALS, ou seja, neurônios motores espinhais em zebrafish usando o BAC para o gene mnr2b/mnx2b codificando uma proteína homeodomina para especificação de neurônio motor16,17. A alta translucência das larvas de zebrafish permite uma estimulação leve simples e não invasiva do TDP-43 optogenético que desencadeia sua transição de fase nos neurônios motores espinhais. Também apresentamos um fluxo de trabalho básico para a imagem ao vivo dos neurônios motores espinhais do zebrafish e análise de imagem usando o software Fiji/ImageJ livremente disponível para caracterizar as respostas do TDP-43 optogenético à estimulação da luz. Esses métodos permitem uma investigação da transição de fase do TDP-43 em um ambiente celular vulnerável à ALS e devem ajudar a explorar suas consequências patológicas em níveis celulares e comportamentais.

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Protocol

Todo o trabalho de pesca foi realizado de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais De Laboratório do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (identificação de aprovação nº 24-2) do Instituto Nacional de Genética (Japão), que possui uma Garantia de Bem-Estar Animal no arquivo (número de garantia A5561-01) no Escritório de Bem-Estar Animal Laboratorial dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH, EUA).

1. Construção de BACs para expressão de gene TDP-43 optogenético do promotor mnr2b

  1. Preparação bac
    1. Compre um clone bac de zebrafish contendo o lócus zebrafish mnr2b (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Purifique o DNA BAC de uma cultura LB de 5 mL durante a noite de DH10B Escherichia coli (E. coli) abrigando CH211-172N16 como descrito em Warming et al.18.
    2. Transforme as células CH211-172N16 em SW102 E. coli por eletroporação, como descrito em Warming et al.18.
      NOTA: A purificação do DNA BAC do E. coli no mesmo dia da eletroporação geralmente dá uma maior taxa de sucesso de transformação bac18. Caso contrário, o DNA BAC purificado é mantido a -20 °C até o uso.
    3. Introduza o iTol2-amp para transgênese BAC mediada por Tol2 transposon19 na espinha dorsal de CH211-172N16 por eletroporação, como descrito em Asakawa et al.20.
      1. Faça um estoque de glicerol do E. clones de célula coli carregando CH211-172N16 com a integração do iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) depois de confirmar a integração homologous recombinação mediada pela reação em cadeia de polimerase (PCR) (Ex Taq) usando o par de primer Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') e pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') e as seguintes condições: um passo de desnaturação a 98 °C por 1 min, seguido por 25 ciclos de desnaturação a 95 °C para 10 s, primer annealing a 55 °C para 15 s, e extensão de primer a 72 °C por 1 min, amplificando um produto PCR de 354 pares de base (bp).
  2. mnr2b-hs:opTDP-43h construção
    1. Construa um plasmídeo carregando o de expressão para o TDP-43/TARDBP (TDP-43h) humano que é marcado com mRFP1 e CRY2olig no N- e C-termini, respectivamente (doravante, opTDP-43h)14.
      NOTA: O fragmento opTDP-43h deve ser flanqueado com a sequência de promotor de genes hsp70l de zebrafish hsp70l (650 bp) e a sequência de sinal de poliadenylation (polyA), seguido por um gene de resistência à kanamicina (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. Amplie o hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan com primers que anneal hsp70l e Kan e contenha sequências de 45 bps do upstream e downstream dos codons iniciadores do gene mnr2b por PCR (GXL DNA Polymerase) usando o par de primer mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa cta taa aca caa caa aag tgt tgc tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') e Km-r (5'-ggt tct tct tct aaa agg gcg tcg atcc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') com as seguintes condições: um passo de desnaturação a 98 °C por 1 min, seguido por 30 ciclos de denaturação a 95 °C para 10 s, primer annealing a 55 °C para 15 s, e extensão primer a 68 °C para 30 s, amplificando um produto PCR de ~5,7 bp.
    3. Separe os produtos PCR por eletroforese de gel agarose (100 V) e purifique a banda de DNA hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan com uma coluna de DNA. Ajuste a concentração do hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan purificado para 50 ng/μL no buffer Tris-EDTA (TE) contendo 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) e 1 mM EDTA.
    4. Introduza o hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan em CH211-172N16-iTol2A por eletroporação conforme descrito em Warming et al.18 e selecione transformadores resistentes à ampicilina e kanamycina em placas de ágar LB. CH211-172N16-iTol2A carregando o hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan é designado como mnr2b-hs:opTDP-43h.
    5. Purifique mnr2b-hs:opTDP-43h usando um kit de purificação BAC e dissolva-o a 250 ng/μL em TE após extração fenol/clorofórmio.
  3. mnr2b-hs:Construção EGFP-TDP-43z
    1. Construa outro plasmídeo carregando o tardbp tipo zebrafish que é marcado com proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP) em seu N-terminus (EGFP-TDP-43z) em vez de opTDP-4 3h mas é idêntico ao convígimento hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Use EGFP-TDP-43z como um controle interno para a estimulação de luz de opTDP-43h.
    2. Construa o CH211-172N16-iTol2A abrigando o hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan no lócus mnr2b, conforme descrito em 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A carregando o hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan é designado como mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Transgênese bac mediada por transposon de Tol2 em zebrafish

  1. Prepare a solução de injeção contendo 40 mM KCl, vermelho fenol (10% v/v), 25 ng/μL do mnr2b-hs:opTDP-43h DNA e 25 ng/μL Tol2 transposase mRNA19.
  2. Injete 1 nL da solução de injeção (uma gotícula com diâmetro de aproximadamente 123 μm calibrado em óleo mineral) no citosol de embriões de zebrafish tipo selvagem no estágio de uma célula. Trie o peixe injetado para a formação de agregados positivos de proteína fluorescente vermelha (RFP) em vários tecidos embrionários, incluindo neurônios motores espinhais, sob um estereópio de fluorescência em 2-3 dias após a fertilização (dpf). Elevar o peixe RFP positivo para a idade adulta.
  3. Injete o DNA mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z conforme descrito em 2.1 e 2.2. Elevar o peixe positivo do EGFP para a idade adulta.
  4. Depois de alguns meses, coloque peixes injetados sexualmente e peixes selvagens em pares em gaiolas de acasalamento padrão 2 L para obter descendentes de F1. Tela F1 peixe a 3 dpf para RFP (opTDP-43h) ou Fluorescência EGFP (EGFP-TDP-43z) na coluna motora espinhal usando um microscópio de epifluorescência equipado com uma lente objetiva Plan-Neofluar 5x/0.15. Normalmente, um peixe fundador é identificado entre 10 e 20 peixes injetados (a taxa de transmissão de germes é de 5%-10%).
  5. Isole e compare múltiplos Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] e Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] inserções de diferentes peixes fundadores, como a intensidade, mas não o padrão, de expressão opTDP-43h ou EGFP-TDP-43z pode variar entre peixes fundadores devido aos efeitos de posição cromossômica.
  6. Cross Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] e Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] linhas de peixe para obter descendentes contendo Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo em uma razão mendeliana.
  7. Levante o peixe em um prato plástico contendo 30 mL de tampão E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10-5% Methylene Blue) e adicionar 0,003% (w/v) N-phenylthiourea a 8-10 h pós-fertilização (hpf) para inibir melanogênese.
  8. Cubra o prato de plástico com papel alumínio após 30 cvf.

3. Preparação de LED para iluminação de luz azul

  1. Ligue um painel LED usando o aplicativo associado instalado em um tablet/telefone. Coloque a sonda de um espectrômetro em um poço vazio de um prato de 6 poços e ajuste a luz LED para o comprimento de onda atingindo ~456 nm através da aplicação. Coloque o sensor óptico de um medidor óptico no poço vazio e ajuste a potência da luz LED (~0,61 mW/cm2). A configuração da luz LED pode ser salva e pode ser recuperada no aplicativo.
  2. Introduza a configuração do painel prato/LED à incubadora a 28 °C. Termine esta etapa antes que a imagem do peixe comece em 48 hpf.

4. Imagem de larvas de zebrafish expressando TDP-43 optogenética

  1. Selecione Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo pelo menos antes de 47 hpf, com base na fluorescência RFP (opTDP-43h) ou EGFP (EGFP-TDP-43z) na coluna motora espinhal usando a configuração do microscópio de epifluorescência descrito acima.
  2. Deschorionato o Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo.
  3. Pré-aqueça 1% de baixa temperatura de fusão agarose contendo 250 μg/mL de etil 3-aminobenzoato de metanosulfonato a 42 °C.
  4. Anestesiar brevemente Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] peixe transgênico duplo a 48 hpf no buffer E3 contendo a mesma concentração de Tricane.
  5. Coloque uma gota da temperatura de fusão pré-aquecido de 1% baixa agarose no prato de base de vidro à temperatura ambiente. O diâmetro da gota de agarose em forma de cúpula no prato de vidro é de 8-10 mm.
  6. Usando uma pipeta Pasteur, adicione o peixe anestesiado à baixa temperatura de fusão no prato da base de vidro e, em seguida, misture por pipetação algumas vezes. Minimize a quantidade do tampão E3 adicionado à agarose junto com o peixe.
  7. Mantenha o peixe de lado usando uma agulha de seringa durante a solidificação da agarose (tipicamente ~1 min) para garantir que a medula espinhal esteja em uma posição horizontal apropriada. Após a solidificação, coloque algumas gotas de tampão E3 no peixe montado em agarose em forma de cúpula.
  8. Adquira seções z confocal serial da medula espinhal através da varredura com um microscópio confocal equipado com uma lente objetiva de imersão de água de 20x com a abertura numérica 1.00, usando uma velocidade de varredura de 4,0 μs por pixel (12 bits por pixel), um tamanho de passo de 1,0 μm por fatia para o objetivo, e uma combinação de excitação/emissão de ondas: Canal 1) 473/510 nm para EGFP e Canal 2) 559/583 nm para mRFP1.
    NOTA: A cloaca no lado ventral do peixe está incluída nas regiões de interesse (ROI) como referência, o que ajuda a identificar e comparar os segmentos espinhais (níveis 16-17) nos pontos de tempo.
  9. Remova o peixe da agarose, rachando cuidadosamente a agarose com uma agulha de seringa assim que a imagem estiver completa. Mantenha a quantidade de tempo que o peixe está embutido na agarose o mais curto possível, embora a incorporação de agarose por <30 min não afete a viabilidade do peixe.

5. Estimulação leve de peixe opTDP-43h expressando por iluminação de campo de uma luz diodo emissor de luz azul (LED)

  1. Adicione 7,5 mL de tampão E3 ao poço e coloque o tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo no poço. Coloque o prato de seis poços no painel LED mantendo o prato e o painel LED 5 mm separados com um espaçador (por exemplo, com cinco copos de slides empilhados).
  2. Ligue a luz LED azul. Mantenha alguns dos peixes Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo em um prato separado de seis poços coberto com folha de alumínio quando peixes de controle nãoilluminados são necessários (ou seja, em condições escuras)14.
  3. Após a iluminação (por exemplo, por 24h a 72 cvf na Figura 3), imagine a medula espinhal do peixe iluminado repetindo os passos 4.3 - 4.9.

6. Visualização da realocação citoplasmática do TDP-43 optogenético nos neurônios motores espinhais

  1. Abra o arquivo de imagem em ImageJ/Fiji21 (Versão: 2.1.0/1.53c), um programa de processamento de imagem Java de código aberto desenvolvido pela NIH Image, que pode ser baixado a partir de https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Use a barra de rolagem Z para mover-se através dos planos focais. Crie uma projeção de intensidade máxima de várias fatias clicando em | de imagem Pilhas | | do projeto Z Intensidade máxima e configuração Inicie a fatia e Pare a fatia que cubra os hemisegmentos da coluna motora espinhal.
  3. Divida a imagem multicanal em duas imagens de um único canal clicando em Imagem | | de cor Canais divididos.
  4. Melhore o sinal EGFP-TDP-43z para garantir que o EGFP-TDP-43z citoplasmámico seja visível claramente clicando em | Ajuste | Brilho/Contraste e ajuste mínimo
  5. Abra o gerenciador de ROI clicando em Analisar | Ferramentas | Gerente do ROI. Encontre as células identificáveis em ambas as imagens a 48 hpf e 72 hpf, com base nas posições relativas dos corpos celulares. Defina os ROIs delineando os contornos dos corpos celulares de neurônios motores espinhal únicos visualizados pelo sinal EGFP-TDP-43z usando seleções freehand e, em seguida, clicando em Adicionar[t] no gerenciador de ROI.
  6. Defina um eixo principal da soma, desenhando uma linha reta usando Reta e clicando em Analisar | Perfil de enredo para imagens EGFP-TDP-43z (C1) e opTDP-43h (C2) a 48 e 72 cvf.
  7. Normalize o Perfil de Parcela dividindo os valores pelo maior valor para cada sinal EGFP-TDP-43z e opTDP-43h. Plote os valores normalizados com coordenadas x-y, onde x e y representam o eixo principal das intensidades soma e relativa fluorescentes, respectivamente, utilizando gráfico XY em um software estatístico.

7. Comparação ratiométrica entre os sinais opTDP-43h e EGFP-TDP-43z usando imageJ/fiji

  1. Abra o arquivo de imagem em ImageJ/Fiji e defina ROIs para células mnr2b-positivas usando uma imagem de projeção de intensidade máxima de EGFP-TDP-43z como em 6.1-6.5. Adicione um ROI fora da medula espinhal ventral (por exemplo, notochord) para representar o sinal de fundo (ROI de fundo).
  2. Para cada imagem EGFP-TDP-43z e opTDP-43, crie uma projeção de várias fatias clicando em Imagem | Pilhas | | do projeto Z Soma Fatias e definir Iniciar fatia e Parar fatia que cubra a coluna do motor hemispinal.
  3. Abra o gerenciador de ROI criado com a imagem de projeção de intensidade máxima. Exibir os ROIs na imagem Sum Slices selecionando a janela de imagem para EGFP-TDP-43z e, em seguida, clicando em Mostrar Tudo no gerenciador de ROI. Clique em Medir no gerenciador de ROI para obter valores médios para cada ROI.
  4. Adquirir valores médios para opTDP-43h seguindo o mesmo procedimento previsto em 7.3.
  5. Para cada ROI, depois de subtrair a média para o ROI de fundo, divida a média subtraída para opTDP-43h pela média subtraída para EGFP-TDP-43z para obter o valor ratiométrico. Os valores ratiométricos podem ser comparados entre diferentes pontos de tempo e apresentados usando gráfico de coluna no software Prism.

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Representative Results

Imagem ao vivo de proteínas TDP-43 optogenéticas e não optogenéticas nos neurônios motores espinhais mnr2b+ de larvas de zebrafish
Para induzir a transição de fase TDP-43 nos neurônios motores espinhais em zebrafish, um TDP-43h humano que é marcado com mRFP1 e CRY2olig22 no N-e C-termini, respectivamente, foi construído e designado como opTDP-43h14 (Figura 1A). O fragmento genético opTDP-43h foi introduzido em um BAC contendo o lócus mnr2b (Figura 1B). O BAC resultante, designado como mnr2b-hs:opTDP-43h, foi introduzido no genoma dos zebrafish pela transgênese BAC mediada por Tol2 transposon19. Para monitorar a localização do TDP-43 não optogenético nos neurônios motores espinhais, um peixe-zebra TDP-43 codificado pelo gene tardbp foi marcado com EGFP no N-terminus (Figura 1A) e o fragmento genético EGFP-TDP-43z foi introduzido no bac mnr2b, semelhante ao opTDP-43h (Figura 1B). O BAC resultante, designado como mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z, foi introduzido no genoma dos zebrafish pela transgênese BAC mediada por Tol2. Os peixes injetados a cada construção bac foram cruzados com um peixe tipo selvagem e os peixes F1 resultantes foram examinados no dia 3 para fluorescência vermelha (Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]) ou verde (Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]) fluorescência na medula espinhal ventral. Os peixes F1 vermelhos ou verdes isolados foram designados como Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] ou Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z], respectivamente.

Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixes transgênicos duplos a 48 hpf foram anestesiados e incorporados em uma agarose de baixo derretimento ao seu lado; após a solidificação da ágarose, foram cobertos com tampão E3 para permitir observações do lado lateral da medula espinhal de cima. A microscopia de escaneamento a laser confocal foi realizada com uma lente objetiva de imersão de água de 20x e uma combinação de comprimentos de onda de excitação/emissão: 473/510 nm para EGFP e 559/583 nm para mRFP1. O peixe escaneado foi imediatamente e cuidadosamente retirado da agarose, transferido para o tampão E3 em uma placa de seis poços, e iluminado por uma luz LED azul colocando a placa em um painel led a 28 °C (Figura 2A,B). Após uma iluminação de 24h, o peixe foi anestesiado e incorporado novamente em agarose antes de ser escaneado com uma microscopia confocal usando as mesmas condições de imagem, exceto que o ROI foi ajustado para incluir a região correspondente da medula espinhal visualizada a 48 hpf (Figura 2B). Todo o cordão hemispinal de 4-5 segmentos coíguos da coluna vertebral foi imageado durante a sessão de microscopia (tipicamente 20-30 min), gerando imagens da série Z contendo 20-40 fatias dependendo da horizontalidade do eixo longitudinal da medula espinhal do peixe montado em relação ao plano de varredura confocal.

Visualização de realocação citoplasmática do TDP-43 optogenético em neurônios motores espinhais
Para visualizar a realocação citoplasmática de opTDP-43h em neurônios motores espinhal únicos, as imagens da série Z (tipicamente 20-40 fatias) adquiridas a 48 e 72 hpf foram abertas com Fiji e separadas em cada canal EGFP-TDP-43z e opTDP-43h. Foram criadas imagens de projeção de intensidade máxima do EGFP-TDP-43z para imagens de 48 e 72 cvf e foi selecionada uma única neurônio espinhal isolada identificável em ambas as imagens de 48 e 72 hpf (Figura 2B, setas). Neurônios motores espinhais com corpos celulares localizados no lado dorsal da coluna motora foram considerados adequados para medições da forma do corpo celular devido aos seus padrões de distribuição esparsos.

Após ajustar a intensidade do sinal EGFP nas imagens EGFP-TDP-43z, os ROIs que cobrem as somas dos neurônios motores foram definidos rastreando a borda do sinal EGFP a 48 e 72 hpf (Figura 2C). A intensidade fluorescente ao longo do eixo principal da soma foi medida para os sinais EGFP-TDP-43z e opTDP-43h a 48 e 72 cvf (Figura 2C, à direita). A 48 hpf, os padrões dos sinais opTDP-43h e EGFP-TDP-43z se sobrepuseram em grande parte.

Em contraste, a 72 hpf, o pico do sinal opTDP-43h foi encontrado na região onde o sinal EGFP-TDP-43z era baixo, ou seja, no citoplasma, indicando a realocação citoplasmática de opTDP-43h. A realocação citoplasmática dependente da luzTDP-43h é iniciada em grande parte independentemente do TDP-4314 não optogenético. Neste ensaio, foram utilizadas imagens de projeção de intensidade máxima para estimar a posição do limite núcleo/citoplasma em detrimento de medições quantitativas.

Comparação ratiométrica da intensidade de fluorescência do TDP-43 optogenético e não optogenético nos neurônios motores espinhais
Para avaliar os efeitos da estimulação da luz azul nos níveis flutuantes de proteína opTDP-43h, os sinais opTDP-43h no corpo celular foram medidos antes e depois da estimulação da luz com referência ao sinal EGFP-TDP-43z. As imagens da série Z, incluindo o hemisegment espinhal, foram abertas com Fiji. Para definir ROIs cobrindo neurônios motores espinhal únicos, foram selecionadas imagens de projeção de intensidade máxima do sinal EGFP-TDP-43z para 48 e 72 hpf, e foram selecionados neurônios espinhais isolados únicos que foram identificáveis em imagens de 48 e 72 hpf (Figura 3A). Utilizando seleções à mão livre, os ROIs foram sorteados e registrados em um gerenciador de ROI para cada uma das imagens de 48 e 72 hpf (Figura 3A). A projeção de intensidade máxima do sinal EGFP-TDP-43z foi considerada adequada para definir os ROIs devido ao seu alto contraste.

Para quantificar os sinais opTDP-43h e EGFP-TDP-43z, a Sum corta imagens de projeção para cada canal das mesmas imagens da série Z para 48 e 72 cvf (Figura 3A). Utilizando os conjuntos de ROI registrados, as intensidades fluorescentes de opTDP-43h e EGFP-TDP-43z foram medidas para cada ponto de tempo. Foram calculados quantidades relativas de opTDP-43h para EGFP-TDP-43z (valores RFP/GFP) para cada célula e ponto de tempo dividindo o valor RFP pelo valor de GFP (Figura 3B). Das quatro células mnr2b positivos que foram investigadas, a célula nº 1 apresentou notavelmente um sinal EGFP-TDP-43z saturado (Figura 3A). As células com sinais fluorescentes saturados devem ser excluídas dos conjuntos de dados na realização de análises quantitativas. As células #2-#4 apresentaram tendências decrescentes dos níveis relativos de opTDP-43h para EGFP-TDP-43z após a iluminação da luz azul (Figura 3B), embora uma análise em maior escala anteriormente demonstrou que a diminuição dos níveis relativos de opTDP-43h para EGFP-TDP-43z não foi estatisticamente significante (65 células de três animais independentes)14.

Figure 1
Figura 1: Construção de DNA BAC utilizando o lócus mnr2b . (A) Estruturas das fitas de expressão para opTDP-43h e EGFP-TDP-43z. (B) A região genômica dos zebrafish transportada pelo DNA CH211-172N16 BAC. As fitas de expressão amplificadas por PCR para opTDP-43h e EGFP-TDP-43z são inseridas a jusante da região não traduzida (UTR) de 5′', do mnr2b (seta vermelha) no primeiro exon de mnr2b por recombinação homóloga. As barras indicam 500 (A) e 10k (B) bp. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagem ao vivo de opTDP-43h antes e depois da estimulação da luz. (A) Um esquema de estimulação leve de opTDP-43h expresso nos neurônios motores espinhais de Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo através de uma iluminação de campo de luz LED azul de 48 a 72 hpf. (B) Imagens de projeção de intensidade máxima das imagens confocal da série Z da medula espinhal ventral antes (48 cvf) e depois (72 hpf) da estimulação da luz. As linhas tracejadas demarcam o limite ventral da medula espinhal. As figuras são adaptadas de Asakawa et al.14 (C) Mislocalização citoplasmática de opTDP-43 após a iluminação de luz azul de 24 horas. Os contornos da soma de uma célula mnr2b-positiva (setas vermelhas em B) observadas a 48 e 72 hpf são mostrados em magenta. Os principais eixos das somas foram mostrados com azul claro. A intensidade fluorescente normalizada ao longo dos eixos principais foi traçada. O asterisco indica um aglomerado de sinais fortes opTDP-43 que não exibem um forte sinal de sobreposição EGFP-TDP-43z, indicando mislocalização de opTDP-43h citoplasmica. As barras indicam 1 mm (A), 20 μm (B) e 4 μm (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Comparações ratiométricas de opTDP-43h e EGFP-TDP-43z antes e depois da estimulação da luz. (A) ROIs que cobrem as somas de quatro células mnr2b positivas a 48 e 72 hpf foram desenhadas com base no sinal EGFP-TDP-43z e são mostradas em magenta. Os ROIs retangulares (bg) foram usados para subtrair o sinal de fundo (ROI de fundo). As figuras são adaptadas de Asakawa et al.14 (B) As intensidades relativas de opTDP-43h para EGFP-TDP-43z foram traçadas para cada célula em cada ponto de tempo como a razão RFP/GFP. A célula #1, indicada pelo asterisco, não foi adequada para a comparação ratiométrica porque seu sinal EGFP-TDP-43z estava saturado e seu valor RFP/GFP foi superestimado. A barra indica 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A expressão mediada por mnr2b-BAC de opTDP-43h e EGFP-TDP-43z em zebrafish fornece uma oportunidade única para imagens ao vivo da transição de fase TDP-43 nos neurônios motores espinhais. A transparência óptica dos tecidos corporais das larvas de zebrafish permite a simples e não invasiva estimulação optogenética de opTDP-43h. Comparações entre neurônios motores espinhais únicos ao longo do tempo demonstraram que a oligomerização dependente da luz do opTDP-43h causa seu agrupamento citoplasmical, que lembra a patologia da ELA.

Um dos parâmetros críticos que definem o comportamento de fase de uma proteína intrinsecamente desordenada é a concentração intracelular. Um alto nível de expressão opTDP-43h poderia potencialmente levar à oligomerização opTDP-43h independente, transição de fase e agregação. Assim, a indução de um nível estável e nãotóxico de expressão opTDP-43h nos neurônios motores espinhais é fundamental para a avaliação bem sucedida das consequências fisiológicas e patológicas da transição de fase opTDP-43 nos neurônios motores espinhais. A expressão mediada por mnr2b-BAC de opTDP-43 h parece ser adequada para este fim, pois os peixes Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] exibem predominantemente opTDP-43 nuclear, são capazes de nadar livremente com uma bexiga de natação inflada e mantêm total viabilidade mesmo depois de serem criados sob as condições escuras contínuas de 1-5 dpf. No zebrafish, uma abordagem convencional usada para expressar exogenously um gene de interesse é a injeção de mRNA no estágio de uma célula. No entanto, uma alta dose da proteína TDP-43 traduzida do mRNA injetado de uma só vez causa defeitos de desenvolvimento precoce14 que impedem análises de neurônios motores espinhais posteriores diferenciados. No entanto, reduzir a quantidade de mRNA injetado para um nível tolerável não fornece opTDP-43h suficiente para modulação optogenética nos neurônios motores espinhais no momento de sua diferenciação, indicando que a injeção de mRNA não é um método adequado para fornecer opTDP-43h aos neurônios motores espinhais do zebrafish. Outra possível abordagem usada para expressar opTDP-43h nos neurônios motores espinhais é injetar, no estágio de uma célula, um plasmido ou DNA BAC abrigando a construção opTDP-43h sob o controle de um promotor que está ativo no neurônio motor espinhal. Embora a injeção de mnr2b-hs:opTDP-43h BAC DNA pode direcionar a expressão de opTDP-43h nos neurônios motores espinhais, o número de neurônios motores opTDP-43h positivos é baixo, e em células opTDP-43h-positivas numericamente restritas, o nível de expressão é geralmente alto, muitas vezes associado à agregação opTDP-43h independente da luz. Essas observações sugerem coletivamente que a expressão transgênica é uma estratégia insubstituível pela qual expressa de forma estável opTDP-43h nos neurônios motores espinhais a um nível nãotóxico. Notavelmente, embora o mnr2b-BAC rotule quase todos os neurônios motores espinhais em zebrafish20,23, os níveis de expressão de opTDP-43h podem variar entre células individuais mnr2b-positivas. Essa variação pode ser em parte devido ao padrão de expressão intrínseca de mnr2b associado ao seu papel regulatório na diferenciação do neurônio motor. Outra causa potencial para a expressão variegated pode resultar de um efeito de posição cromossômica nas pastilhas mnr2b-BAC. Seja qual for a causa, os variados níveis de expressão opTDP-43 entre células mnr2b positivos podem causar variação na citotoxicidade associada à transição de fase opTDP-43h dependente da luz.

Em larvas de zebrafish, as somas de neurônios motores espinhais estão densamente alinhadas na medula espinhal ventral, e o citoplasma somal tem um volume muito menor do que o do citoplasma axonal. Esta característica anatômica limita as análises quantitativas do opTDP-43h citoplasmático nos neurônios motores espinhais: opTDP-43h é apenas quantitativamente mensurável no núcleo e citoplasma somal, mas não em toda a célula de neurônios motores. A imagem quantitativa de uma proteína em toda a célula de neurônios motores espinhais, incluindo a soma e o terminal nervoso periférico, continua sendo uma tarefa desafiadora. Apesar das restrições aos ensaios quantitativos, a razão opTDP-43h/EGFP-TDP-43z na soma mostrou-se elevada pela mutação causadora de ELA no IDR (A315T)14. Portanto, o presente método é aplicável à avaliação dos efeitos da mutação TDP-43 sobre a estabilidade proteica associada à transição de fase na soma dos neurônios motores espinhais.

Em princípio, a abordagem mnr2b-BAC pode ser estendida para modular o LLPS e avaliar a citotoxicidade de outras proteínas RNP relacionadas à ALS com IDRs além do TDP-43. Várias etapas de protocolo podem precisar ser ajustadas para obter um nível de expressão ideal de tais sondas optogenéticas nos neurônios motores espinhais. Primeiro, na construção transgênica Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h], o promotor hsp70l foi usado como promotor basal para impulsionar a expressão opTDP-43h impulsionada por realçadores mnr2b . O promotor hsp70l pode ser removido da construção bac se o nível de expressão de uma proteína de interesse for tão alto que causa transição de fase ectópica independente da luz. Em segundo lugar, o oTDP-43h é equipado com a tag CRY2olig, que é um domínio de folologista (PHR) portador de uma mutação de ponto que aumenta a capacidade de agrupamento na iluminação de luz azul22. A proteína do tipo selvagem CRY2PHR pode ser usada como uma tag de oligomerização dependente da luz se houver necessidade de atenuar a atividade de agrupamento dependente da luz. Finalmente, para recapitular mais fielmente a patologia da ELA em zebrafish, é desejável estabelecer um protocolo de iluminação onde a fisiologia dos peixes é minimamente afetada pela iluminação do campo da luz azul durante os estágios juvenil e adulto. O presente método utiliza uma iluminação contínua de luz azul de 48 a 72 cvf (por 24 horas), e a duração da iluminação pode ser estendida até 120 cvf (por 72 h) sem perder a viabilidade do peixe14, embora funções fisiológicas responsivas à luz, como a visão, possam ser afetadas. Ao desenvolver um protocolo para iluminação intermitente da luz, a estimulação de luz de longo prazo pode se tornar possível, o que pode, por sua vez, facilitar o desenvolvimento de opTDP-43h em agregados patológicos mais maduros. Para isso, outras sondas optogenéticas para modulação de interações proteína-proteína usando diferentes comprimentos de onda de luz que são menos fisiologicamente perturbadores24 também podem valer a pena investigar mais adiante. Combinações de sondas TDP-43 optogenéticas melhoradas, promotores apropriados direcionados a tipos de células vulneráveis a doenças e protocolos de iluminação com efeitos mínimos sobre funções fisiológicas abririam caminhos para modelar fielmente as patologias das proteinopatias TDP-43 não apenas na medula espinhal, mas também no cérebro.

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Disclosures

KA e KK são os inventores da propriedade intelectual descrita neste manuscrito e patentes provisórias foram apresentadas pelo Instituto Nacional de Genética.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant números JP19K06933 (KA) e JP20H05345 (KA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope Olympus FV1200
Epifluorescence microscope ZEISS Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope Leica MZ16FA
Glass base dish IWAKI 3910-035
Incubator MEE CN-25C
LED panel Nanoleaf Limited Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus TAKARA AD110
NucleoBond BAC100 MACHEREY-NAGEL 740579
NuSieve GTG Agarose LONZA 50181
Objective lens Olympus XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens ZEISS Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter HIOKI 3664
Optical sensor HIOKI 9742-10
Phenol red solution 0.5% Merck P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase TAKARA R050A
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Six-well dish FALCON 353046
Spectrometer probe BLUE-Wave StellerNet Inc. VIS-50
Syringe needle TERUMO NN-2725R
TaKaRa Ex Taq TAKARA RR001A
Tricane Sigma-Aldrich A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16 BACPAC Genomics CH211-172N16

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References

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Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (180), e62932, doi:10.3791/62932 (2022).

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