Summary
我们描述了一种以斑马鱼为模型的模式,通过光在脊髓运动神经元中诱导TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)的相变。
Abstract
异常的蛋白质聚集和选择性神经元脆弱性是神经退行性疾病的两个主要标志。可以通过控制脆弱细胞类型中疾病相关蛋白的相变来询问这些特征之间的因果关系,尽管到目前为止这种实验方法有限。在这里,我们描述了一种在斑马鱼幼虫的脊髓运动神经元中诱导RNA / DNA结合蛋白TDP-43相变的方案,用于模拟肌萎缩性侧索硬化症(ALS)中退行性运动神经元中发生的TDP-43的细胞质聚集。我们描述了一种基于细菌人工染色体(BAC)的遗传方法,该方法选择性地将光遗传学TDP-43变体传递给斑马鱼的脊柱运动神经元。斑马鱼幼虫的高半透明性允许脊髓运动神经元中的光遗传学TDP-43通过使用发光二极管(LED)对无节制的鱼进行简单的外部照明来相变。我们还提供了斑马鱼脊髓运动神经元实时成像的基本工作流程,并使用免费提供的Fiji / ImageJ软件进行图像分析,以表征光遗传学TDP-43对光照的反应。该协议能够在ALS易发细胞环境中表征TDP-43相变和聚集体形成,这应该有助于研究其细胞和行为后果。
Introduction
核糖核蛋白(RNP)颗粒通过液-液相分离(LLPS)组装无膜分区来控制细胞核和细胞质中的无数细胞活动,这是一种均匀流体分解成两种不同液相的现象1,2。通常作为RNP颗粒组分起作用的RNA结合蛋白的失调LLPS促进异常相变,导致蛋白质聚集。这一过程与神经发育和神经退行性疾病有关3,4,5。精确评估RNA结合蛋白异常LLPS与疾病发病机制之间的因果关系对于确定LLPS是否以及如何被利用为有效的治疗靶点至关重要。RNA结合蛋白的LLPS 在体外 和单细胞模型中相对容易研究,但在多细胞生物中却很困难,特别是在脊椎动物中。在组织环境中的单个细胞中分析这种LLPS的关键要求是稳定地表达探针,以便在感兴趣的疾病易感细胞类型中对LLPS进行成像和操作。
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种最终致命的神经系统疾病,其中大脑和脊髓的运动神经元由于变性而选择性地逐渐丧失。迄今为止,超过25个基因的突变与ALS的可遗传(或家族性)形式有关,ALS占ALS总病例的5%-10%,其中一些ALS致病基因编码由RNPs组成的RNA结合蛋白,如hnRNPA1,TDP-43和FUS6,7。 此外,占ALS总病例90%-95%的散发形式的特征在于沉积在退化运动神经元中的TDP-43的细胞质聚集。这些ALS相关RNA结合蛋白的一个主要特征是它们的内在无序区域(IDR)或低复杂性结构域缺乏有序的三维结构,并且介导与驱动LLPS7,8的许多不同蛋白质的弱蛋白质 - 蛋白质相互作用。ALS致病突变经常发生在IDR中,这一事实导致人们认为这些ALS相关蛋白的异常LLPS和相变可能是ALS发病机制的基础9,10。
最近,开发了optoDroplet方法,一种基于Cryptochrome 2的光遗传学技术,允许通过光调节蛋白质 - 蛋白质相互作用,以诱导具有IDRs11的蛋白质的相变。由于该技术已成功扩展到TDP-43,它已经开始揭示TDP-43病理相变及其相关细胞毒性的潜在机制12,13,14,15。在该协议中,我们概述了一种将光遗传学TDP-43传递给ALS易感细胞类型的遗传方法,即斑马鱼中的脊柱运动神经元使用BAC对 mnr2b / mnx2b 基因编码运动神经元规范的同源结构域蛋白16,17。斑马鱼幼虫的高半透明性允许对光遗传学TDP-43进行简单,无创的光刺激,从而触发其在脊髓运动神经元中的相变。我们还提供了使用免费提供的Fiji / ImageJ软件对斑马鱼脊髓运动神经元进行实时成像和图像分析的基本工作流程,以表征光遗传学TDP-43对光刺激的反应。这些方法允许在ALS易感细胞环境中研究TDP-43相变,并应有助于在细胞和行为水平上探索其病理后果。
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Protocol
所有鱼类工作均按照日本国立遗传学研究所(日本)机构动物护理和使用委员会的《实验动物护理和使用指南》(批准标识号24-2)进行,该研究所在美国国立卫生研究院(NIH) 的实验动物福利办公室(NIH, 美国)。
1. 构建用于 mnr2b 启动子光遗传学TDP-43基因表达的BACs
- BAC制备
- 购买含有斑马鱼 mnr2b 位点(CH211-172N16,BACPAC基因组学)的斑马鱼BAC克隆。从含有CH211-172N16的DH10B 大肠杆菌 (大肠杆菌)的5 mL过夜LB培养物中纯化BAC DNA,如Warming等人所述。
- 通过电穿孔将CH211-172N16转化为SW102 大肠杆菌 细胞,如Warming等人18中所述。
注意:在电穿孔的同一天从 大肠杆菌 中纯化BAC DNA通常具有更高的BAC转化成功率18。否则,纯化的BAC DNA保持在-20°C直至使用。 - 如Asakawa等人所述,将用于Tol2转座子介导的BAC transgenesis19的iTol2放大器盒通过电穿孔引入CH211-172N16的主干中。
- 使用引物对 Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') 和 pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG TAT TA-3') 和 pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG-CTT TTA-3') 确认通过聚合酶链反应 (PCR) (Ex Taq) 进行同源重组介导的整合后,制作携带 CH211-172N16 的大肠 杆菌细胞克隆的甘油储备: 在98°C下变性步骤1分钟,然后在95°C下变性25个循环10秒,在55°C下引物退火15秒,引物在72°C下延伸1分钟,扩增354个碱基对(bp)的PCR产物。
- mnr2b-hs:opTDP-43h 施工
- 构建一个质粒,携带人类野生型TDP-43 / TARDBP (TDP-43h)的表达盒,该表达盒分别在N端和C端用mRFP1和CRY2olig标记(以下简称opTDP-43h)14。
注:opTDP-43h片段的两侧应有斑马鱼hsp70l基因启动子序列(650 bp)和多腺苷酸化(polyA)信号序列,后跟卡那霉素抗性基因(hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14。 - 使用引物对 mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg ctc tgc aga tgc aga atga att CAC TGG AAG TCG ATC ATC) 和 Km-r (5'-tgt tct tcag gct aaa attc atc atc at at)通过 PCR(GXL DNA 聚合酶)扩增 hsp70l-polyA-Kan 盒,并包含 mnr2b 基因引发子密码子的上游和下游的 45 bp 序列。CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') 和 Km-r (5'-tgt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc atcctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3'),条件如下:在98°C下变性步骤1分钟,然后在95°C下变性30次循环10秒,底漆在55°C下退火15秒,引物在68°C下延伸30秒, 扩增~5.7 bp的PCR产物。
- 通过琼脂糖凝胶电泳(100 V)分离PCR产物,并用DNA柱纯化hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA条带。将纯化的hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan盒的浓度调节至50 ng / μL,在含有10 mM Tris-HCl(pH 8.0)和1 mM EDTA的Tris-EDTA缓冲液(TE)中。
- 如 Warming 等人 18 所述,通过电穿孔将 hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan 盒引入 CH211-172N16-iTol2A 中,并在 LB 琼脂平板上选择耐氨苄西林和卡那霉素的转化子。CH211-172N16-iTol2A携带hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan盒式磁带被指定为mnr2b-hs:opTDP-43h。
- 使用BAC纯化试剂盒纯化mnr2b-hs:opTDP-43h,并在苯酚/氯仿提取后将其溶解在TE中以250 ng / μL。
- 构建一个质粒,携带人类野生型TDP-43 / TARDBP (TDP-43h)的表达盒,该表达盒分别在N端和C端用mRFP1和CRY2olig标记(以下简称opTDP-43h)14。
- mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z 施工
- 构建另一个携带斑马鱼野生型tardbp的质粒,该质粒在其N端(EGFP-TDP-43z)而不是opTDP-43h上用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记,但在其他方面与hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan构建体(hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)相同14。使用EGFP-TDP-43z作为opTDP-43h光刺激的内部控制。
- 构建CH211-172N16-iTol2A,如1.2.1-1.2.5中所述,在mnr2b位点中含有hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan盒。CH211-172N16-iTol2A携带hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan盒式磁带被指定为mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z。
2. Tol2 转座子介导的斑马鱼BAC转基因
- 制备含有40 mM KCl,酚红(10%v / v),25 ng / μL mnr2b-hs:opTDP-43h DNA和25 ng / μL Tol2 转座酶mRNA19的注射溶液。
- 在单细胞阶段将1nL的注射溶液(在矿物油中校准的直径约为123μm的液滴)注射到野生型斑马鱼胚胎的细胞质基质中。在受精后2-3天,在荧光立体显微镜下,筛选注射的鱼在各种胚胎组织(包括脊柱运动神经元)中形成红色荧光蛋白(RFP)阳性聚集体。将RFP阳性的鱼养到成年。
- 注入 mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA,如 2.1 和 2.2 所述。将EGFP阳性的鱼养到成年。
- 几个月后,将性成熟的注射鱼和野生型鱼成对放入标准的2L交配笼中,以获得F1后代。使用配备Plan-Neofluar 5x / 0.15物镜的落射荧光显微镜,以3 dpf筛选F1鱼,以获得RFP(opTDP-43h)或EGFP(EGFP-TDP-43z)脊柱中的荧光。通常,从10-20条注射鱼中鉴定出一条创始鱼(种系传播率为5%-10%)。
- 分离并比较来自不同创始鱼的多个Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]和Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]插入片段,因为opTDP-43h或EGFP-TDP-43z表达的强度(但不是模式)可能因染色体位置效应而在创始人鱼之间有所不同。
- 杂交Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]和Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]鱼系,得到含有Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]双转基因鱼的后代。
- 在含有30毫升E3缓冲液(5 mM NaCl,0.17 mM KCl,0.33 mM CaCl2,0.33 mM MgSO4,10-5%亚甲蓝)的塑料培养皿中养鱼,并在受精后8-10小时(hpf)加入0.003%(w / v)N-苯基硫脲以抑制黑色素生成。
- 在30 hpf后用铝箔盖住塑料盘。
3. 蓝光照明LED的准备
- 使用平板电脑/手机上安装的关联应用程序打开 LED 面板。将光谱仪的探针放入6孔盘的空孔中,并通过应用将LED光调整到~456nm的波长峰值。将光功率计的光学传感器放在空井中,调整LED灯的功率(~0.61 mW/cm2)。LED灯设置可以保存,并且可以在应用程序中检索。
- 将碟形/LED面板设置引入28°C的培养箱。 在鱼的成像开始于48 hpf之前完成此步骤。
4. 表达光遗传学TDP-43的斑马鱼幼虫成像
- 选择Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]双转基因鱼至少在47 hpf之前,基于RFP(opTDP-43h)或EGFP(EGFP-TDP-43z)荧光在脊柱上使用上述落射荧光显微镜设置。
- 脱壳茬芷 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 双转基因鱼。
- 在42°C下预热含有250μg/ mL 3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐的1%低熔点温琼脂糖。
- 在含有相同浓度三氯烷的E3缓冲液中,以48 hpf对Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43]双转基因鱼进行短暂麻醉。
- 在室温下将预热的1%低熔点琼脂糖滴在玻璃底盘上。圆顶形琼脂糖滴在玻璃盘上的直径为8-10毫米。
- 使用巴斯德移液器,将麻醉的鱼加入玻璃底盘上的低熔融温度琼脂糖中,然后通过移液几次混合。尽量减少与鱼一起添加到琼脂糖中的E3缓冲液的量。
- 在琼脂糖凝固期间(通常约1分钟),使用注射器针头将鱼保持在一侧,以确保脊髓处于适当的水平位置。凝固后,将几滴E3缓冲液滴到圆顶形琼脂糖安装的鱼上。
- 通过使用配备数字孔径为1.00的20倍水浸物镜的共聚焦显微镜进行扫描,使用每像素4.0 μs(每像素12位)的扫描速度,物镜每片1.0μm的步长以及激发/发射波长的组合,获取脊髓的连续共聚焦z形截面: 通道 1) 473/510 nm 用于 EGFP 和通道 2) 559/583 nm 用于 mRFP1。
注意:鱼腹侧的泄殖腔作为参考包含在感兴趣的区域(ROI)中,这有助于识别和比较各个时间点的脊柱节段(16-17级)。 - 成像完成后,立即用注射器针头小心地将鱼从琼脂糖中取出。保持鱼在琼脂糖中嵌入的时间尽可能短,尽管琼脂糖嵌入<30分钟不会影响鱼的生存能力。
5. 通过蓝光发光二极管(LED)的现场照明对opTDP-43h表达鱼进行光刺激
- 向孔中加入7.5 mL的E3缓冲液,并将成像的Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]双转基因鱼放入孔中。将六孔碟形盘放在 LED 面板上,方法是用垫片(例如,堆叠五个滑动玻璃杯)将碟形盘和 LED 面板分开 5 mm。
- 打开蓝色指示灯。当需要未发光的控制鱼时(即在黑暗条件下),将一些Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]双转基因鱼保存在用铝箔覆盖的单独六孔培养皿中14。
- 照明后(例如,在 图3中以72 hpf下24小时),通过重复步骤4.3 - 4.9对被照亮的鱼的脊髓进行成像。
6. 光遗传学TDP-43在脊髓运动神经元中的细胞质重定位的可视化
- 在ImageJ/Fiji21 (版本:2.1.0/1.53c)中打开图像文件,这是一个由NIH Image开发的开源Java图像处理程序,可以从 https://imagej.net/Fiji/Downloads 下载。
- 使用 Z 滚动条在焦平面之间移动。通过单击"图像"创建多个切片的最大强度投影 |堆栈|Z 项目|最大强度 并设置覆盖脊柱半段的"开始"切片和"停止切片"。
- 通过单击"图像"将多通道图像拆分为两个单通道 图像|颜色|拆分通道。
- 增强EGFP-TDP-43z信号,以确保细胞质EGFP-TDP-43z清晰可见,方法是单击图像|调整|亮度/对比度和最小调整
- 通过单击"分析|"打开 ROI 管理器 工具|投资回报率经理。根据细胞体的相对位置,在48 hpf和72 hpf处找到两个图像中可识别的细胞。通过使用 手绘选择,通过勾勒出 EGFP-TDP-43z 信号可视化的单个脊髓运动神经元的细胞体轮廓,然后单击 ROI 管理器中的 Add[t] ,设置 ROI。
- 通过使用直线绘制一条直线并单击"分析|"来设置体马的长轴 EGFP-TDP-43z (C1) 和 opTDP-43h (C2) 图像在 48 和 72 hpf 下的绘图配置文件。
- 通过将每个 EGFP-TDP-43z 和 opTDP-43h 信号的值除以最大值,对绘图曲线进行归一化。使用统计软件中的 XY 图绘制具有 x-y 坐标的归一化值,其中 x 和 y 分别表示体细胞长轴和相对荧光强度。
7. 使用ImageJ/Fiji对opTDP-43h和EGFP-TDP-43z信号进行比率比较
- 在 ImageJ/Fiji 中打开图像文件,并使用 EGFP-TDP-43z 的最大强度投影图像(如 6.1-6.5 所示)设置单个 mnr2b 阳性细胞的投资回报率。在腹侧脊髓外添加一个ROI(例如,尾部)以表示背景信号(背景ROI)。
- 对于每个 EGFP-TDP-43z 和 opTDP-43 图像,通过单击"图像|创建多个切片的投影 堆栈|Z 项目|对切片求 和并设置覆盖半脊柱运动柱的"开始"切片和"停止切片"。
- 打开使用最大强度投影图像创建的 ROI 管理器。通过选择 EGFP-TDP-43z 的图像窗口,然后单击 ROI 管理器中的" 全部显示 ",在"求和切片"图像上显示 ROI。单击 ROI 管理器中的 度量 值以获取每个 ROI 的平均值。
- 按照 7.3 中提供的相同步骤获取 opTDP-43h 的平均值。
- 对于每个 ROI,在减去背景 ROI 的平均值后,将 opTDP-43h 的减去平均值除以 EGFP-TDP-43z 的减去平均值,得到比率值。比例值可以在不同时间点之间进行比较,并使用Prism软件中的柱形图显示。
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Representative Results
斑马鱼幼虫mnr2b+脊髓运动神经元中光遗传学和非光遗传学TDP-43蛋白的实时成像
为了在斑马鱼的脊髓运动神经元中诱导TDP-43相变,构建了一种分别在N端和C端标有mRFP1和CRY2olig22 的人TDP-43h14 ,并被指定为opTDP-43h14(图1A)。将opTDP-43h基因片段引入含有 mnr2b 位点的BAC中(图1B)。由此产生的BAC,被指定为mnr2b-hs:opTDP-43h,由 Tol2 转座子介导的BAC转基因19引入斑马鱼基因组。为了监测脊髓运动神经元中非光遗传学TDP-43的定位,在N末端用EGFP标记由 tardbp 基因编码的斑马鱼TDP-43(图1A),并将EGFP-TDP-43z基因片段引入mnr2b BAC中,类似于opTDP-43h(图1B)。由此产生的BAC,被命名为mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z,通过 Tol2 转座子介导的BAC转基因引入斑马鱼基因组。将注射了每种BAC结构的鱼与野生型鱼杂交,并在第3天对由此产生的F1鱼进行腹侧脊髓中的红色(Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h])或绿色(Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z])荧光筛查。分离出的红色或绿色荧光阳性F1鱼分别被命名为Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]或Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]。
将Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]麻醉并嵌入其侧面的低熔点琼脂糖中;琼脂糖凝固后,用E3缓冲液覆盖它们,以便从上方观察脊髓的侧侧。使用20倍水浸物镜和激发/发射波长的组合进行共聚焦激光扫描显微镜:EGFP为473/510 nm,mRFP1为559/583 nm。立即小心地从琼脂糖中取出扫描的鱼,转移到六孔板中的E3缓冲液中,并通过将板放在28°C的LED面板上,由蓝色LED灯照亮(图2A,B)。在24小时照明后,将鱼麻醉并再次嵌入琼脂糖中,然后使用相同的成像条件用共聚焦显微镜扫描,除了调整ROI以包括以48 hpf成像的相应脊髓区域(图2B)。在显微镜检查期间(通常为20-30分钟)对4-5个连续脊柱节段的整个半脊髓进行成像,根据安装的鱼的脊髓纵轴相对于共聚焦扫描平面的水平度,生成包含20-40个切片的z系列图像。
脊柱运动神经元中光遗传学TDP-43的细胞质重定位的可视化
为了可视化opTDP-43h在单个脊髓运动神经元中的细胞质重定位,在48和72 hpf处获得的z系列图像(通常为20-40切片)与斐济一起打开并分离到每个EGFP-TDP-43z和opTDP-43h通道中。为48和72 hpf的图像创建了EGFP-TDP-43z的最大强度投影图像,并选择了在48和72 hpf下在两个图像中可识别的单个孤立的脊柱神经元(图2B,箭头)。具有位于运动柱背侧的细胞体的脊柱运动神经元被认为适合测量细胞体形,因为它们的分布模式稀疏。
在调整EGFP-TDP-43z图像中EGFP信号的强度后,通过追踪EGFP信号在48和72 hpf的边缘来设置覆盖运动神经元体质的ROI(图2C)。在48和72 hpf处测量EGFP-TDP-43z和opTDP-43h信号沿体母长轴的荧光强度(图2C,右)。在48 hpf时,opTDP-43h和EGFP-TDP-43z信号的模式在很大程度上相互重叠。
相反,在72 hpf时,opTDP-43h信号的峰值在EGFP-TDP-43z信号低的区域(即细胞质中)发现,表明opTDP-43h的细胞质重移。光依赖性细胞质opTDP-43h重定位的开始在很大程度上独立于非光遗传学TDP-4314。在该测定中,使用最大强度投影图像来估计细胞核/细胞质边界的位置,但以牺牲定量测量为代价。
脊柱运动神经元中光遗传学和非光遗传学TDP-43荧光强度的比例比较
为了评估蓝光刺激对波动的opTDP-43h蛋白水平的影响,参考EGFP-TDP-43z信号测量了光刺激前后的细胞体内opTDP-43h信号。z系列图像,包括脊柱半断面,是用斐济打开的。为了设置覆盖单个脊髓运动神经元的ROI,为48和72 hpf创建了EGFP-TDP-43z信号的最大强度投影图像,并选择了在48和72 hpf图像中可识别的单个孤立的脊柱神经元(图3A)。使用手绘选择,在ROI管理器中为48和72 hpf图像中的每张绘制并注册ROI(图3A)。EGFP-TDP-43z信号的最大强度投影被认为适合设置ROI,因为它具有高对比度。
为了量化opTDP-43h和EGFP-TDP-43z信号,Sum切片了48和72 hpf的相同z系列图像的每个通道的投影图像(图3A)。使用注册的ROI集,测量每个时间点的opTDP-43h和EGFP-TDP-43z的荧光强度。通过将RFP值除以GFP值来计算每个单元和时间点的opTDP-43h到EGFP-TDP-43z(RFP / GFP值)的相对量(图3B)。在研究的四 个mnr2b阳性细胞中,1号细胞显着显示出饱和的EGFP-TDP-43z信号(图3A)。在进行定量分析时,应从数据集中排除具有饱和荧光信号的细胞。在蓝光照射后,细胞#2-#4显示出相对opTDP-43h水平与EGFP-TDP-43z的下降趋势(图3B),尽管先前的更大规模的分析表明,相对opTDP-43h水平降低到EGFP-TDP-43z没有统计学意义(来自三只独立动物的65个细胞)14。
图1:使用 mnr2b 位点构建BAC DNA (A)opTDP-43h和EGFP-TDP-43z的表达盒的结构。(B)由CH211-172N16 BAC DNA携带的斑马鱼基因组区域。通过同源重组将opTDP-43h和EGFP-TDP-43z的PCR扩增表达盒插入 mnr2b (红色箭头)第一个外显子 的mnr2b (红色箭头)的5′-未翻译区域(UTR)的下游。条形表示 500 (A) 和 10k (B) bp。 请单击此处查看此图的放大版本。
图2:光刺激前后opTDP-43h的实时成像(A)在不受限制的Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]双转基因鱼的野外照明中表达的opTDP-43h的光刺激方案,通过48至72 hpf的蓝色LED光的现场照明。(B)z系列共聚焦图像的最大强度投影图像,在(48 hpf)和(72 hpf)光刺激之前和之后的腹侧脊髓共聚焦图像。虚线划定了脊髓的腹侧极限。图改编自Asakawa等人14(C)在24小时蓝光照射后opTDP-43的细胞质错位。在48和72 hpf处观察到的mnr2b阳性细胞(B中的红色箭头)的体细胞的轮廓以洋红色显示。索马的主轴以浅蓝色显示。绘制了沿主轴的归一化荧光强度图。星号表示一簇强opTDP-43信号,这些信号不显示强烈的EGFP-TDP-43z重叠信号,表明细胞质opTDP-43h定位错误。条形表示 1 毫米 (A)、20 微米 (B) 和 4 微米 (C)。请点击此处查看此图的放大版本。
图3:光刺激前后opTDP-43h和EGFP-TDP-43z的比例比较。 (A)基于EGFP-TDP-43z信号绘制的覆盖4个单mnr2b阳性细胞体细胞体细胞的ROI以洋红色显示。矩形ROI(bg)用于减去背景信号(背景ROI)。数字改编自Asakawa等人14 (B)在每个时间点为每个细胞绘制opTDP-43h到EGFP-TDP-43z的相对强度作为RFP / GFP比率。由星号表示的单元格 #1 不适合比率比较,因为其 EGFP-TDP-43z 信号饱和,其 RFP/GFP 值被高估。该条表示 10 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
斑马鱼中opTDP-43h和EGFP-TDP-43z的 mnr2b-BAC介导的表达为脊髓运动神经元中TDP-43相变的活体成像提供了独特的机会。斑马鱼幼虫身体组织的光学透明度允许对opTDP-43h进行简单和无创的光遗传学刺激。随着时间的推移,单个脊髓运动神经元之间的比较表明,opTDP-43h的光依赖性齐聚化导致其细胞质聚类,这让人联想到ALS病理学。
定义内在无序蛋白质的相行为的关键参数之一是细胞内浓度。高水平的opTDP-43h表达可能导致光依赖性opTDP-43h寡聚化,相变和聚集。因此,在脊髓运动神经元中诱导稳定,无毒水平的opTDP-43h表达是成功评估opTDP-43相变对脊髓运动神经元的生理和病理后果的关键。opTDP-43 h的 mnr2b-BAC介导的表达似乎适合于此目的,因为Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]鱼主要显示核opTDP-43,它们能够用膨胀的游泳鳔自由游泳,即使在1-5 dpf的连续黑暗条件下饲养后也能保持完全生存能力。在斑马鱼中,用于外源表达目的基因的传统方法是在单细胞阶段注射mRNA。然而,从注射的mRNA中翻译出的高剂量TDP-43蛋白同时导致早期发育缺陷14 ,从而排除了对后来分化脊髓运动神经元的分析。然而,将注射的mRNA的量降低到可耐受的水平,在分化时无法为脊髓运动神经元的光遗传学调节提供足够的opTDP-43h,这表明mRNA注射不是将opTDP-43h递送到斑马鱼脊髓运动神经元的合适方法。用于在脊髓运动神经元中表达opTDP-43h的另一种可能方法是在单细胞阶段,在脊髓运动神经元中活跃的启动子的控制下,注入含有opTDP-43h构建体的质粒或BAC DNA。虽然注射mnr2b-hs:opTDP-43h BAC DNA可以指导opTDP-43h在脊髓运动神经元中的表达,但opTDP-43h阳性运动神经元的数量较低,并且在这种数值受限的opTDP-43h阳性细胞中,表达水平通常很高,通常与光无关的opTDP-43h聚集有关。这些观察结果共同表明,转基因表达是一种不可替代的策略,通过这种策略可以在无毒水平上稳定地表达脊髓运动神经元中的opTDP-43h。值得注意的是,尽管 mnr2b-BAC标记了斑马鱼20,23中几乎所有的脊髓运动神经元,但opTDP-43h的表达水平在单个 mnr2b阳性细胞之间可能有所不同。这种变化可能部分是由于 mnr2b 的内在表达模式与其在运动神经元分化的调节作用有关。杂交表达的另一个潜在原因可能是由于对 mnr2b-BAC插入物的染色体位置效应。无论原因如何, mnr2b阳性细胞中不同的opTDP-43表达水平都可能导致与光依赖性opTDP-43h相变相关的细胞毒性变化。
在斑马鱼幼虫中,脊髓运动神经元的体质在腹侧脊髓中密集排列,并且体质细胞质的体积远低于轴突细胞质的体积。这种解剖学特征限制了脊髓运动神经元中细胞质opTDP-43h的定量分析:opTDP-43h仅在细胞核和体质细胞质中可定量测量,但在运动神经元的整个细胞中则不可定量测量。对脊髓运动神经元(包括体细胞和周围神经末梢)的整个细胞中的蛋白质进行定量成像仍然是一项具有挑战性的任务。尽管对定量测定有限制,但体细胞中的opTDP-43h/EGFP-TDP-43z比值被IDR(A315T)中引起ALS的突变升高14。因此,本方法适用于评价TDP-43突变对脊髓运动神经元体相变相关蛋白稳定性的影响。
原则上, mnr2b-BAC方法可以扩展到调节LLPS并评估IDR超过TDP-43的其他ALS相关RNP蛋白的细胞毒性。可能需要调整几个方案步骤,以获得脊柱运动神经元中这种光遗传学探针的最佳表达水平。首先,在Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]转基因构建体中, 将hsp70l 启动子作为基础启动子,以增强 mnr2b 增强子驱动的opTDP-43h表达。如果目标蛋白的表达水平如此之高,以至于引起光无关的异位相变,则可以从BAC构建体中除去 hsp70l 启动子。其次,opTDP-43h配备了CRY2olig标签,这是一个光解酶同源(PHR)结构域,携带点突变,增强了蓝光照明下的聚类能力22。野生型蛋白CRY2PHR 可用作光依赖性寡聚化标记,如果需要减弱光依赖性聚类活性。最后,为了更忠实地概括斑马鱼中的ALS病理学,希望建立一种照明方案,其中鱼类生理学在幼年和成年阶段受到蓝光现场照明的影响最小。本方法使用48至72 hpf的连续蓝光照明(持续24小时),并且照明持续时间可以延长至120 hpf(持续72小时),而不会失去鱼类的生存能力14,尽管光响应的生理功能,如视力,可能会受到影响。通过开发间歇性光照射方案,可以进行更长期的光刺激,这反过来可能促进opTDP-43h发展成更成熟的病理聚集体。为了实现这一目标,其他用于使用不同光波长调节蛋白质 - 蛋白质相互作用的光遗传学探针也值得进一步研究,这些光波长在生理上干扰较小24 。这种改进的光遗传学TDP-43探针,针对疾病易感细胞类型的适当启动子以及对生理功能影响最小的照明方案的组合将为忠实地模拟TDP-43蛋白病的病理学开辟途径,不仅在脊髓中而且在大脑中。
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Disclosures
KA和KK是本手稿中描述的知识产权的发明人,临时专利已由国家遗传学研究所提交。
Acknowledgments
这项工作得到了SERIKA基金(KA),KAKENHI拨款编号JP19K06933(KA)和JP20H05345(KA)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
Incubator | MEE | CN-25C | |
LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
Six-well dish | FALCON | 353046 | |
Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
References
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F.
Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014). - Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
- Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
- Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
- Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
- Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
- Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
- Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
- Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
- Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
- Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
- Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K.
Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011). - Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
- Redchuk, T. A., et al.
Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).