我们描述了一种利用斑马鱼作为模型，在脊髓运动神经元中通过光照诱导 TAR DNA 结合蛋白 43（TDP-43）发生相变的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
异常蛋白质聚集和选择性神经元易损性是神经退行性疾病的两大主要特征。尽管目前此类实验方法仍受限，但通过在易损细胞类型中调控致病相关蛋白的相变过程，可探究这些特征之间的因果关系。本文介绍了一种在斑马鱼幼鱼脊髓运动神经元中诱导RNA/DNA结合蛋白TDP-43发生相变的实验方案，用于模拟肌萎缩侧索硬化症（ALS）中变性运动神经元内TDP-43的胞质聚集现象。我们描述了一种基于细菌人工染色体（BAC）的遗传学方法，可将光遗传学TDP-43变体特异性地递送至斑马鱼的脊髓运动神经元。由于斑马鱼幼鱼具有高度透明的特性，因此仅需使用发光二极管（LED）对自由活动的斑马鱼进行外部光照，即可诱导其脊髓运动神经元中光遗传学TDP-43的相变。此外，我们还提供了对斑马鱼脊髓运动神经元进行活体成像以及利用免费开源软件Fiji/ImageJ进行图像分析的基本工作流程，以表征光遗传学TDP-43对光照的响应特性。该方案能够在ALS易损的细胞环境中表征TDP-43的相变过程及聚集体形成，有助于进一步研究其细胞层面和行为学层面的后果。
引言
核糖核蛋白（RNP）颗粒通过液-液相分离（LLPS）形成无膜区室，调控细胞核和细胞质中的多种细胞活动，该现象指均一液体分离为两种不同液相的过程1,2RNA结合蛋白通常作为核糖核蛋白颗粒组分发挥作用，其液-液相分离（LLPS）的失调会促进异常的相变，导致蛋白质聚集。该过程已被证实在神经发育和神经退行性疾病中起重要作用。3,4,5异常RNA结合蛋白的液-液相分离与疾病发病机制之间因果关系的精确评估，对于确定液-液相分离能否以及如何作为有效的治疗靶点至关重要。RNA结合蛋白的液-液相分离相对易于研究 体外 在单细胞模型中较为可行，但在多细胞生物尤其是脊椎动物中则较为困难。在组织环境中分析此类液-液相分离（LLPS）的一个关键要求是，能够在易受疾病影响的特定细胞类型中稳定表达一种用于LLPS成像与操控的探针。
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种最终致命的神经系统疾病，其特征是由于变性导致脑和脊髓中的运动神经元被选择性且进行性地丧失。迄今为止，已发现超过25个基因的突变与遗传性（即家族性）ALS相关，该类型占所有ALS病例的5%–10%，其中一些致病基因编码含有核糖核蛋....
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方案
所有鱼类实验均按照日本国家遗传学研究所机构动物照护与使用委员会（批准编号24-2）发布的《实验动物照护与使用指南》进行，该机构已在美国国立卫生研究院（NIH，美国）实验室动物福利办公室备案动物福利保证书（保证书编号A5561-01）。
1. 利用 mnr2b 启动子表达光遗传学 TDP-43 基因的 BAC 构建
- BAC 制备
- 购买含有斑马鱼基因的斑马鱼BAC克隆 mnr2b 位点（CH211-172N16，BACPAC基因组学）。从5 mL DH10B菌株过夜LB培养物中纯化BAC DNA 大肠杆菌 (E. coli) 携带 CH211-172N16，如 Warming 等所述18.
- 将 CH211-172N16 转化至 SW102 中 E. coli 通过电穿孔法将细胞转染，如 Warming 等所述18.
注意：从BAC DNA中纯化 E. coli 同一天进行电穿孔通常能获得更高的BAC转化成功率18否则，将纯化的BAC DNA保存在-20 °C直至使用。 - 引入 iTol2-amp....
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结果
光遗传学与非光遗传学TDP-43蛋白的活体成像 mnr2b+ 斑马鱼幼虫的脊髓运动神经元
为了在斑马鱼脊髓运动神经元中诱导TDP-43相变，使用带有mRFP1和CRY2olig标记的人源TDP-43h22 分别在N端和C端构建了opTDP-43h，并予以命名14 (图1A）。将 opTDP-43h 基因片段导入含有一个 BAC 的 mnr2b 位点（图1B）。将由此获得的BAC命名为mnr2b-hs:opTDP-43h，并通过以下方式导入斑马鱼基因组中 Tol2 转座子介导的BAC转基因技术19为了监测非光遗传学TDP-43在脊髓运动神经元中的定位，一种由斑马鱼编码的TDP-43 tardbp 基因.......
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讨论
利用 mnr2b-BAC 介导在斑马鱼中表达 opTDP-43h 和 EGFP-TDP-43z，为在脊髓运动神经元中实时成像 TDP-43 相变过程提供了独特的机会。斑马鱼幼体组织的光学透明性使得对 opTDP-43h 进行简单且非侵入性的光遗传学刺激成为可能。随时间对单个脊髓运动神经元进行比较表明，opTDP-43h 的光依赖性寡聚化会引发其在细胞质中的聚集，这一现象类似于肌萎缩侧索硬化症（ALS）的病理特征。
决定内在无序蛋白相行为的关键参数之一是细胞内浓度。opTDP-43h 的高水平表达可能引发不依赖光照的 opTDP-43h 寡聚化、相变及聚集。因此，在脊髓运动神经元中诱导稳定且无毒性的 opTDP-43h 表达水平，是成功评估 opTDP-43 相变对脊髓运动神经元生理与病理影响的关键。由 mnr2b-BAC 介导的 opTDP-43h 表达似乎适用于此目的，因为 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] 转基因鱼主要表现为核内表达 opTDP-43h，能够自由游动并具有充气的 swim bladder，即使在 1–5 dpf 期.......
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披露
KA 和 KK 是本论文所述知识产权的发明人，相关临时专利已由日本遗传学研究所提交。
致谢
本工作由 SERIKA 基金（KA）、KAKENHI 项目基金编号 JP19K06933（KA）和 JP20H05345（KA）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 共聚焦显微镜 | Olympus | FV1200 | |
| 落射荧光显微镜 | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| 荧光体视显微镜 | Leica | MZ16FA | |
| 玻璃底培养皿 | IWAKI | 3910-035 | |
| 培养箱 | MEE | CN-25C | |
| LED 面板 | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG 琼脂糖 | LONZA | 50181 | |
| 物镜 | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| 物镜 | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| 光功率计 | HIOKI | 3664 | |
| 光学传感器 | HIOKI | 9742-10 | |
| 0.5% 酚红溶液 | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶 | TAKARA | R050A | |
| QIAquick 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | |
| 六孔板 | FALCON | 353046 | |
| 光谱仪探头 BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| 注射器针头 | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 斑马鱼 BAC 克隆 CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
参考文献
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biol....
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重印与许可
