Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Transition de phase optogénétique du TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre

Published: February 25, 2022 doi: 10.3791/62932
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, 2Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, 3Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

Summary

Nous décrivons un protocole pour induire la transition de phase de la protéine 43 de liaison à l’ADN TAR (TDP-43) par la lumière dans les motoneurones de la colonne vertébrale en utilisant le poisson-zèbre comme modèle.

Abstract

L’agrégation anormale des protéines et la vulnérabilité neuronale sélective sont deux caractéristiques majeures des maladies neurodégénératives. Les relations causales entre ces caractéristiques peuvent être interrogées en contrôlant la transition de phase d’une protéine associée à la maladie dans un type de cellule vulnérable, bien que cette approche expérimentale ait été limitée jusqu’à présent. Ici, nous décrivons un protocole pour induire la transition de phase de la protéine de liaison ARN/ADN TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre pour modéliser l’agrégation cytoplasmique de TDP-43 se produisant dans les motoneurones en dégénérescence dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Nous décrivons une méthode génétique basée sur le chromosome artificiel bactérien (BAC) pour administrer une variante optogénétique du TDP-43 de manière sélective aux motoneurones spinaux du poisson-zèbre. La translucidité élevée des larves de poisson zèbre permet la transition de phase du TDP-43 optogénétique dans les motoneurones spinaux par un simple éclairage externe à l’aide d’une diode électroluminescente (LED) contre les poissons non retenus. Nous présentons également un flux de travail de base d’imagerie en direct des motoneurones rachidiens du poisson-zèbre et d’analyse d’images avec le logiciel Fiji/ImageJ disponible gratuitement pour caractériser les réponses du TDP-43 optogénétique à l’éclairage lumineux. Ce protocole permet de caractériser la transition de phase du TDP-43 et la formation d’agrégats dans un environnement cellulaire vulnérable à la SLA, ce qui devrait faciliter l’étude de ses conséquences cellulaires et comportementales.

Introduction

Les granules de ribonucléoprotéines (RNP) contrôlent une myriade d’activités cellulaires dans le noyau et le cytoplasme en assemblant des partitions sans membrane via la séparation de phase liquide-liquide (LLPS), un phénomène dans lequel un fluide homogène se décompose en deux phases liquides distinctes1,2. Le LLPS dérégulé des protéines de liaison à l’ARN qui fonctionnent normalement comme des composants de granules RNP favorise une transition de phase anormale, conduisant à l’agrégation des protéines. Ce processus a été impliqué dans les maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives3,4,5. L’évaluation précise d’une relation causale entre le LLPS aberrant des protéines de liaison à l’ARN et la pathogenèse de la maladie est cruciale pour déterminer si et comment le LLPS peut être exploité comme cible thérapeutique efficace. Le LLPS des protéines de liaison à l’ARN est relativement facile à étudier in vitro et dans des modèles unicellulaires, mais est difficile dans les organismes multicellulaires, en particulier chez les vertébrés. Une exigence critique pour l’analyse d’un tel LLPS dans des cellules individuelles dans un environnement tissulaire est d’exprimer de manière stable une sonde pour l’imagerie et la manipulation du LLPS dans un type de cellule vulnérable à la maladie.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est un trouble neurologique finalement mortel dans lequel les motoneurones du cerveau et de la moelle épinière sont perdus sélectivement et progressivement en raison de la dégénérescence. À ce jour, des mutations dans plus de 25 gènes ont été associées à la forme héréditaire (ou familiale) de la SLA, qui représente 5 % à 10 % du total des cas de SLA, et certains de ces gènes causant la SLA codent pour des protéines de liaison à l’ARN constituées de RNI, telles que hnRNPA1, TDP-43 et FUS6,7. De plus, la forme sporadique de la SLA, qui représente 90% à 95% du total des cas de SLA, est caractérisée par l’agrégation cytoplasmique de TDP-43 déposée dans les motoneurones en dégénérescence. Une caractéristique majeure de ces protéines de liaison à l’ARN associées à la SLA est leurs régions intrinsèquement désordonnées (IDR) ou domaines de faible complexité qui manquent de structures tridimensionnelles ordonnées et interviennent dans de faibles interactions protéine-protéine avec de nombreuses protéines différentes qui conduisent LLPS7,8. Le fait que des mutations causant la SLA se produisent souvent dans les IDR a conduit à l’idée que le LLP aberrant et la transition de phase de ces protéines liées à la SLA peuvent sous-tendre la pathogenèse de la SLA9,10.

Récemment, la méthode optoDroplet, une technique optogénétique basée sur Cryptochrome 2 qui permet la modulation des interactions protéine-protéine par la lumière, a été développée pour induire la transition de phase des protéines avec IDRs11. Comme cette technique a été étendue avec succès au TDP-43, elle a commencé à découvrir les mécanismes sous-jacents à la transition de phase pathologique du TDP-43 et sa cytotoxicité associée12,13,14,15. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode génétique pour délivrer un TDP-43 optogénétique aux types de cellules vulnérables à la SLA, à savoir les motoneurones spinaux chez le poisson-zèbre en utilisant le BAC pour le gène mnr2b / mnx2b codant pour une protéine homéodomaine pour la spécification des motoneurones16,17. La translucidité élevée des larves de poisson zèbre permet une stimulation lumineuse simple et non invasive du TDP-43 optogénétique qui déclenche sa transition de phase dans les motoneurones spinaux. Nous présentons également un flux de travail de base pour l’imagerie en direct des motoneurones rachidiens du poisson-zèbre et l’analyse d’images à l’aide du logiciel Fidji/ImageJ disponible gratuitement pour caractériser les réponses du TDP-43 optogénétique à la stimulation lumineuse. Ces méthodes permettent d’étudier la transition de phase du TDP-43 dans un environnement cellulaire vulnérable à la SLA et devraient aider à explorer ses conséquences pathologiques aux niveaux cellulaire et comportemental.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tous les travaux sur les poissons ont été effectués conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (numéro d’identification d’approbation 24-2) de l’Institut national de génétique (Japon), qui a une assurance du bien-être animal dans ses dossiers (numéro d’assurance A5561-01) au Bureau du bien-être des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (NIH, États-Unis).

1. Construction de CBC pour l’expression du gène optogénétique TDP-43 à partir du promoteur mnr2b

  1. Préparation bac
    1. Achetez un clone BAC de poisson zèbre contenant le locus mnr2b du poisson-zèbre (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Purifier l’ADN BAC d’une culture LB de 5 mL pendant la nuit d’Escherichia coli DH10B (E. coli) hébergeant CH211-172N16 comme décrit dans Warming et al.18.
    2. Transformer CH211-172N16 en cellules SW102 E. coli par électroporation, comme décrit dans Warming et al.18.
      REMARQUE: La purification de l’ADN BAC de L’E. coli le même jour d’électroporation donne généralement un taux de réussite plus élevé de la transformation BAC18. Sinon, l’ADN BAC purifié est maintenu à -20 °C jusqu’à utilisation.
    3. Introduisez la cassette iTol2-amp pour la transgénèse BAC médiée par transposon Tol219 dans l’épine dorsale du CH211-172N16 par électroporation, comme décrit dans Asakawa et al.20.
      1. Fabriquer un stock de glycérol des clones de cellules d’E. coli porteurs de CH211-172N16 avec l’intégration de cassette iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) après avoir confirmé l’intégration médiée par recombinaison homologue par réaction en chaîne par polymérase (PCR) (Ex Taq) en utilisant la paire d’amorces Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') et pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') et les conditions suivantes: une étape de dénaturation à 98 °C pendant 1 min, suivie de 25 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s, d’un recuit d’apprêt à 55 °C pendant 15 s et d’une extension d’amorce à 72 °C pendant 1 min, amplifiant un produit PCR de 354 paires de bases (pb).
  2. mnr2b-hs:opTDP-43h construction
    1. Construire un plasmide portant la cassette d’expression pour le TDP-43/TARDBP de type sauvage humain (TDP-43h) qui est marqué avec mRFP1 et CRY2olig aux termini N et C, respectivement (ci-après, opTDP-43h)14.
      REMARQUE: Le fragment opTDP-43h doit être flanqué de la séquence promotrice du gène hsp70l du poisson-zèbre (650 pb) et de la séquence de signal de polyadénylation (polyA), suivie d’un gène de résistance à la kanamycine (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. Amplifier la cassette hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan avec des amorces qui recuit hsp70l et Kan et contiennent des séquences de 45 bp de l’amont et de l’aval des codons initiateurs du gène mnr2b par PCR (GXL DNA Polymerase) en utilisant la paire d’amorces mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') et Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') avec les conditions suivantes : une étape de dénaturation à 98 °C pendant 1 min, suivie de 30 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s, un recuit d’apprêt à 55 °C pendant 15 s et une extension d’apprêt à 68 °C pendant 30 s, amplification d’un produit PCR d’environ 5,7 pb.
    3. Séparez les produits pcR par électrophorèse sur gel d’agarose (100 V) et purifiez la bande d’ADN hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan avec une colonne d’ADN. Ajuster la concentration de la cassette hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan purifiée à 50 ng/μL dans un tampon Tris-EDTA (TE) contenant 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) et 1 mM d’EDTA.
    4. Introduire la cassette hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan dans CH211-172N16-iTol2A par électroporation comme décrit dans Warming et al.18 et sélectionner des transformants résistants à l’ampicilline et à la kanamycine sur des plaques de gélose LB. Ch211-172N16-iTol2A transportant la cassette hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan est désigné comme mnr2b-hs:opTDP-43h.
    5. Purifier mnr2b-hs:opTDP-43h à l’aide d’un kit de purification BAC et le dissoudre à 250 ng/μL dans TE après extraction phénol/chloroforme.
  3. mnr2b-hs:Construction EGFP-TDP-43z
    1. Construire un autre plasmide portant le tardbp de type sauvage du poisson-zèbre qui est marqué avec une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) à son terminus N (EGFP-TDP-43z) au lieu de opTDP-43h mais qui est par ailleurs identique à la construction hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Utilisez EGFP-TDP-43z comme contrôle interne pour la stimulation lumineuse de l’opTDP-43h.
    2. Construire CH211-172N16-iTol2A hébergeant la cassette hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan dans le locus mnr2b comme décrit dans 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A transportant la cassette hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan est désigné comme mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Transgénèse BAC médiée par transposon Tol2 chez le poisson-zèbre

  1. Préparer la solution injectable contenant 40 mM de KCl, du rouge phénol (10 % v/v), 25 ng/μL d’ADN mnr2b-hs:opTDP-43h et 25 ng/μL d’ARNm transposase Tol219.
  2. Injecter 1 nL de la solution injectable (une gouttelette d’un diamètre d’environ 123 μm calibrée dans de l’huile minérale) dans le cytosol d’embryons de poisson zèbre de type sauvage au stade unicellulaire. Dépister les poissons injectés pour la formation d’agrégats positifs de protéines fluorescentes rouges (RFP) dans divers tissus embryonnaires, y compris les motoneurones spinaux, sous un stéréomicroscope à fluorescence 2-3 jours après la fécondation (dpf). Élever le poisson rfP positif à l’âge adulte.
  3. Injecter l’ADN mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z comme décrit aux points 2.1 et 2.2. Élever les poissons POSITIFS À l’EGFP jusqu’à l’âge adulte.
  4. Après quelques mois, mettez les poissons injectés sexuellement matures et les poissons de type sauvage par paires dans des cages d’accouplement standard de 2 L pour obtenir une progéniture F1. Cribler les poissons F1 à 3 dpf pour la fluorescence RFP (opTDP-43h) ou EGFP (EGFP-TDP-43z) dans la colonne vertébrale motrice à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé d’une lentille d’objectif Plan-Neofluar 5x/0.15. En règle générale, un poisson fondateur est identifié à partir de 10 à 20 poissons injectés (le taux de transmission germinale est de 5% à 10%).
  5. Isolez et comparez plusieurs inserts Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] et Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] de différents poissons fondateurs, car l’intensité, mais pas le motif, de l’expression opTDP-43h ou EGFP-TDP-43z peut varier d’un poisson fondateur à l’autre en raison des effets de position chromosomique.
  6. Croisez les lignées de poissons Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] et Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] pour obtenir une progéniture contenant des poissons double transgéniques Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dans un rapport mendélien.
  7. Élever le poisson dans un plat en plastique contenant 30 mL de tampon E3 (5 mM naCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10-5 % de bleu de méthylène) et ajouter 0,003 % (p/v) de N-phénylthiourée à 8-10 h après la fécondation (HPF) pour inhiber la mélanogenèse.
  8. Couvrir le plat en plastique avec du papier d’aluminium après 30 hpf.

3. Préparation de la LED pour l’éclairage de la lumière bleue

  1. Allumez un panneau LED à l’aide de l’application associée installée sur une tablette/un téléphone. Placez la sonde d’un spectromètre dans un puits vide d’une antenne parabolique de 6 puits et ajustez la lumière LED à la longueur d’onde culminant à ~ 456 nm à travers l’application. Placez le capteur optique d’un capteur de puissance optique dans le puits vide et réglez la puissance de la lumière LED (~ 0,61 mW / cm2). Le réglage de la lumière LED peut être enregistré et peut être récupéré dans l’application.
  2. Introduisez le réglage du panneau plat/LED dans l’incubateur à 28 °C. Terminez cette étape avant que l’imagerie des poissons ne commence à 48 hpf.

4. Imagerie de larves de poisson zèbre exprimant le TDP-43 optogénétique

  1. Sélectionnez Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] poisson double transgénique au moins avant 47 hpf, basé sur la fluorescence RFP (opTDP-43h) ou EGFP (EGFP-TDP-43z) dans la colonne motrice spinale à l’aide de la configuration du microscope à épifluorescence décrite ci-dessus.
  2. Déchorionate le poisson double transgénique Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z].
  3. Préchauffer 1 % d’agarose à basse température de fusion contenant 250 μg/mL de sel de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate à 42 °C.
  4. Anesthésier brièvement le poisson double transgénique Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] à 48 hpf dans le tampon E3 contenant la même concentration de Tricane.
  5. Mettez une goutte de l’agarose préchauffée à basse température de fusion de 1% sur le plat de base en verre à la température ambiante. Le diamètre de la goutte d’agarose en forme de dôme sur le plat en verre est de 8 à 10 mm.
  6. À l’aide d’une pipette Pasteur, ajouter le poisson anesthésié à l’agarose à basse température de fusion sur le plat de base en verre, puis mélanger en pipetant plusieurs fois. Minimisez la quantité de tampon E3 ajoutée à l’agarose avec le poisson.
  7. Maintenez le poisson sur le côté en utilisant une aiguille de seringue pendant la solidification de l’agarose (généralement ~ 1 min) pour s’assurer que la moelle épinière est dans une position horizontale appropriée. Après la solidification, placez quelques gouttes de tampon E3 sur le poisson monté sur l’agarose en forme de dôme.
  8. Acquérir des sections z confocales en série de la moelle épinière en scannant avec un microscope confocal équipé d’une lentille d’objectif à immersion dans l’eau 20x avec l’ouverture numérique 1,00, en utilisant une vitesse de balayage de 4,0 μs par pixel (12 bits par pixel), une taille de pas de 1,0 μm par tranche pour l’objectif et une combinaison de longueurs d’onde d’excitation / émission: Canal 1) 473/510 nm pour EGFP et canal 2) 559/583 nm pour mRFP1.
    REMARQUE: Le cloaque sur la face ventrale du poisson est inclus dans les régions d’intérêt (ROI) comme référence, ce qui aide à identifier et à comparer les segments de la colonne vertébrale (niveaux 16-17) à travers les points temporels.
  9. Retirez le poisson de l’agarose en craquant soigneusement l’agarose avec une aiguille de seringue dès que l’imagerie est terminée. Gardez la durée pendant laquelle le poisson est incrusté dans l’agarose aussi courte que possible, bien que l’encastrement de l’agarose pendant <30 min n’affecte pas la viabilité du poisson.

5. Stimulation lumineuse des poissons exprimant l’opTDP-43h par l’éclairage sur le terrain d’une diode électroluminescente bleue (LED)

  1. Ajouter 7,5 mL de tampon E3 au puits et placer le poisson double transgénique Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] imagé dans le puits. Placez la parabole à six puits sur le panneau LED en gardant la parabole et le panneau LED espacés de 5 mm avec une entretoise (par exemple, avec cinq verres coulissants empilés).
  2. Allumez le voyant LED bleu. Conservez une partie du poisson Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] à double transg dans un plat séparé de six puits recouvert de papier d’aluminium lorsque des poissons témoins non éclairés sont nécessaires (c.-à-d. dans des conditions sombres)14.
  3. Après l’éclairage (par exemple, pendant 24 h à 72 hpf sur la figure 3), imagez la moelle épinière du poisson illuminé en répétant les étapes 4.3 - 4.9.

6. Visualisation de la relocalisation cytoplasmique du TDP-43 optogénétique dans les motoneurones spinaux

  1. Ouvrez le fichier image dans ImageJ/Fiji21 (Version: 2.1.0/1.53c), un programme de traitement d’image Java open-source développé par NIH Image, qui peut être téléchargé à partir de https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Utilisez la barre de défilement Z pour vous déplacer dans les plans focaux. Créez une projection d’intensité maximale de plusieurs tranches en cliquant sur Image | Piles | | de projet Z Intensité maximale et réglage Tranche de démarrage et tranche d’arrêt qui couvrent les hémisegments de la colonne motrice spinale.
  3. Divisez l’image multicanal en deux images monocanal en cliquant sur Image | | de couleur Fractionner les canaux.
  4. Améliorez le signal EGFP-TDP-43z pour vous assurer que l’EGFP-TDP-43z cytoplasmique est clairement visible en cliquant sur Image | Ajuster | Luminosité/Contraste et réglage minimum
  5. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement. Trouvez les cellules identifiables dans les deux images à 48 hpf et 72 hpf, en fonction des positions relatives des corps cellulaires. Définissez les ROI en décrivant les contours des corps cellulaires des motoneurones spinaux uniques visualisés par le signal EGFP-TDP-43z à l’aide de sélections à main levée, puis en cliquant sur Ajouter[t] dans le gestionnaire de retour sur investissement.
  6. Définissez un axe principal du soma en traçant une ligne droite à l’aide de Droite et en cliquant sur Analyser | Profil de tracé pour les images EGFP-TDP-43z (C1) et opTDP-43h (C2) à 48 et 72 chf.
  7. Normalisez le profil du tracé en divisant les valeurs par la valeur la plus élevée pour chaque signal EGFP-TDP-43z et opTDP-43h. Tracez les valeurs normalisées avec les coordonnées x-y, où x et y représentent l’axe principal des intensités fluorescentes soma et relatives, respectivement, à l’aide du graphique XY dans un logiciel statistique.

7. Comparaison ratiométrique entre les signaux opTDP-43h et EGFP-TDP-43z à l’aide d’ImageJ/Fiji

  1. Ouvrez le fichier image dans ImageJ/Fiji et définissez les retours sur investissement des cellules mnr2b positives uniques à l’aide d’une image de projection d’intensité maximale de EGFP-TDP-43z comme dans 6.1-6.5. Ajoutez un retour sur investissement à l’extérieur de la moelle épinière ventrale (par exemple, notochord) pour représenter le signal de fond (retour sur investissement d’arrière-plan).
  2. Pour chaque image EGFP-TDP-43z et opTDP-43, créez une projection de plusieurs tranches en cliquant sur Image | Piles | | de projet Z Additionnez les tranches et définissez la tranche Démarrer et la tranche Stop qui couvrent la colonne du moteur hémispinal.
  3. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement créé avec l’image de projection d’intensité maximale. Affichez les retours sur investissement sur l’image Sum Slices en sélectionnant la fenêtre d’image pour EGFP-TDP-43z, puis en cliquant sur Afficher tout dans le gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir des valeurs moyennes pour chaque retour sur investissement.
  4. Acquérir des valeurs moyennes pour opTDP-43h en suivant la même procédure que celle prévue à la section 7.3.
  5. Pour chaque ROI, après avoir soustrait la moyenne du ROI de fond, divisez la moyenne soustraite pour opTDP-43h par la moyenne soustraite pour EGFP-TDP-43z pour obtenir la valeur ratiométrique. Les valeurs ratiométriques peuvent être comparées entre différents points temporels et présentées à l’aide du graphique en colonnes dans le logiciel Prism.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Imagerie en direct des protéines TDP-43 optogénétiques et non optogénétiques dans les motoneurones rachidiens mnr2b+ des larves de poisson zèbre
Pour induire la transition de phase TDP-43 dans les motoneurones spinaux chez le poisson-zèbre, un TDP-43h humain marqué avec mRFP1 et CRY2olig22 aux N- et C-termini, respectivement, a été construit et désigné comme opTDP-43h14 (Figure 1A). Le fragment du gène opTDP-43h a été introduit dans un BAC contenant le locus mnr2b (Figure 1B). Le BAC résultant, désigné mnr2b-hs:opTDP-43h, a été introduit dans le génome du poisson-zèbre par la transgénèse BAC médiée par le transposon Tol219. Pour surveiller la localisation du TDP-43 non optogénétique dans les motoneurones rachidiens, un poisson-zèbre TDP-43 codé par le gène tardbp a été marqué avec EGFP au N-terminus (Figure 1A) et le fragment du gène EGFP-TDP-43z a été introduit dans le BAC mnr2b, similaire à opTDP-43h (Figure 1B). Le BAC résultant, désigné comme mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z, a été introduit dans le génome du poisson-zèbre par transgénèse BAC médiée par transposon Tol2. Le poisson injecté avec chaque construction BAC a été croisé avec un poisson de type sauvage et les poissons F1 résultants ont été examinés le jour 3 pour la fluorescence rouge (Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]) ou verte (Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]) dans la moelle épinière ventrale. Les poissons F1 rouges ou verts à fluorescence positive isolés ont été désignés comme Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] ou Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z], respectivement.

Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] les poissons double transgéniques à 48 hpf ont été anesthésiés et incorporés dans une agarose à faible fonte sur le côté; après solidification de l’agarose, ils ont été recouverts d’un tampon E3 pour permettre l’observation du côté latéral de la moelle épinière d’en haut. La microscopie confocale à balayage laser a été réalisée avec une lentille d’objectif à immersion dans l’eau 20x et une combinaison de longueurs d’onde d’excitation / émission: 473/510 nm pour EGFP et 559/583 nm pour mRFP1. Le poisson scanné a été immédiatement et soigneusement prélevé de l’agarose, transféré dans le tampon E3 dans une plaque à six puits et éclairé par une lumière LED bleue en plaçant la plaque sur un panneau LED à 28 ° C (Figure 2A, B). Après un éclairage de 24 heures, le poisson a été anesthésié et réincorporé dans l’agarose avant d’être scanné avec une microscopie confocale utilisant les mêmes conditions d’imagerie, sauf que le retour sur investissement a été ajusté pour inclure la région correspondante de la moelle épinière imagée à 48 hpf (Figure 2B). L’ensemble de la moelle hémispinale de 4 à 5 segments rachidiens contigus a été imagé pendant la séance de microscopie (généralement 20 à 30 minutes), générant des images de la série Z contenant 20 à 40 tranches en fonction de l’horizontalité de l’axe longitudinal de la moelle épinière du poisson monté par rapport au plan de balayage confocal.

Visualisation de la relocalisation cytoplasmique du TDP-43 optogénétique dans les motoneurones spinaux
Pour visualiser la relocalisation cytoplasmique de l’opTDP-43h dans les motoneurones spinaux simples, les images de la série z (généralement 20 à 40 tranches) acquises à 48 et 72 hpf ont été ouvertes avec Fiji et séparées dans chaque canal EGFP-TDP-43z et opTDP-43h. Des images de projection d’intensité maximale de l’EGFP-TDP-43z ont été créées pour des images à 48 et 72 hpf et un seul neurone spinal isolé identifiable dans les deux images à 48 et 72 hpf a été sélectionné (Figure 2B, flèches). Les motoneurones spinaux dont le corps cellulaire était situé sur la face dorsale de la colonne motrice ont été considérés comme appropriés pour les mesures de la forme du corps cellulaire en raison de leurs modèles de distribution clairsemés.

Après ajustement de l’intensité du signal EGFP dans les images EGFP-TDP-43z, les ROI couvrant les somas des motoneurones ont été définis en traçant le bord du signal EGFP à 48 et 72 hpf (Figure 2C). L’intensité fluorescente le long de l’axe principal du soma a été mesurée pour les signaux EGFP-TDP-43z et opTDP-43h à 48 et 72 hpf (Figure 2C, à droite). À 48 chf, les modèles de signaux opTDP-43h et EGFP-TDP-43z se chevauchaient largement.

En revanche, à 72 hpf, le pic du signal opTDP-43h a été trouvé dans la région où le signal EGFP-TDP-43z était faible, à savoir dans le cytoplasme, indiquant la relocalisation cytoplasmique de l’opTDP-43h. La relocalisation cytoplasmique opTDP-43h dépendante de la lumière est initiée en grande partie indépendamment du TDP-4314 non optogénétique. Dans ce test, des images de projection d’intensité maximale ont été utilisées pour estimer la position de la frontière noyau/cytoplasme au détriment des mesures quantitatives.

Comparaison ratiométrique de l’intensité de fluorescence du TDP-43 optogénétique et non optogénétique dans les motoneurones spinaux
Pour évaluer les effets de la stimulation par la lumière bleue sur les niveaux fluctuants de protéines opTDP-43h, les signaux opTDP-43h dans le corps cellulaire ont été mesurés avant et après la stimulation lumineuse en référence au signal EGFP-TDP-43z. Les images de la série z, y compris l’hémisphère spinal, ont été ouvertes avec Fidji. Pour définir des ROI couvrant des motoneurones spinaux uniques, des images de projection d’intensité maximale du signal EGFP-TDP-43z ont été créées pour 48 et 72 hpf, et des neurones spinaux isolés uniques identifiables dans des images de 48 et 72 hpf ont été sélectionnés (Figure 3A). À l’aide de sélections à main levée, les rois ont été dessinés et enregistrés dans un gestionnaire de retour sur investissement pour chacune des images de 48 et 72 hpf (Figure 3A). La projection d’intensité maximale du signal EGFP-TDP-43z a été jugée appropriée pour régler les rois en raison de son contraste élevé.

Pour quantifier les signaux opTDP-43h et EGFP-TDP-43z, des images de projection en tranches Sum pour chaque canal des mêmes images de la série Z ont été produites pour 48 et 72 hpf (Figure 3A). En utilisant les ensembles de retour sur investissement enregistrés, les intensités fluorescentes de opTDP-43h et EGFP-TDP-43z ont été mesurées pour chaque point de temps. Des quantités relatives d’opTDP-43h à EGFP-TDP-43z (valeurs RFP/GFP) ont été calculées pour chaque cellule et point temporel en divisant la valeur RFP par la valeur GFP (Figure 3B). Sur les quatre cellules mnr2b positives étudiées, la cellule #1 présentait notamment un signal EGFP-TDP-43z saturé (Figure 3A). Les cellules avec des signaux fluorescents saturés doivent être exclues des ensembles de données lors de la réalisation d’analyses quantitatives. Les cellules #2-#4 ont montré des tendances à la baisse des niveaux relatifs d’opTDP-43h à EGFP-TDP-43z après l’éclairage de la lumière bleue (Figure 3B), bien qu’une analyse à plus grande échelle ait précédemment démontré que la diminution des niveaux relatifs d’opTDP-43h par rapport à EGFP-TDP-43z n’était pas statistiquement significative (65 cellules de trois animaux indépendants)14.

Figure 1
Figure 1 : Construction de l’ADN BAC à l’aide du locus mnr2b. (A) Structures des cassettes d’expression pour opTDP-43h et EGFP-TDP-43z. (B) La région génomique du poisson-zèbre transportée par l’ADN BAC CH211-172N16. Les cassettes d’expression amplifiées par PCR pour opTDP-43h et EGFP-TDP-43z sont insérées en aval de la région 5′-non traduite (UTR) du mnr2b (flèche rouge) dans le premier exon du mnr2b par recombinaison homologue. Les barres indiquent 500 (A) et 10k (B) pb. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Imagerie en direct de l’opTDP-43h avant et après la stimulation lumineuse. (A) Schéma de la stimulation lumineuse de l’opTDP-43h exprimée dans les motoneurones spinaux de Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] poisson double transgénique grâce à un éclairage de champ de lumière LED bleue de 48 à 72 hpf. (B) Images de projection d’intensité maximale des images confocales de la série z de la moelle épinière ventrale avant (48 hpf) et après (72 hpf) la stimulation lumineuse. Les lignes pointillées délimitent la limite ventrale de la moelle épinière. Les chiffres sont adaptés d’Asakawa et al.14 (C) Cytoplasmic mislocalization of opTDP-43 after the 24-h blue light illumination. Les contours du soma d’une cellule mnr2b-positive (flèches rouges en B) observés à 48 et 72 hpf sont représentés en magenta. Les principaux axes des somas étaient représentés en bleu clair. L’intensité fluorescente normalisée le long des principaux axes a été tracée. L’astérisque indique un groupe de signaux opTDP-43 forts qui n’affichent pas un signal de chevauchement EGFP-TDP-43z fort, indiquant une mauvaise localisation cytoplasmique opTDP-43h. Les barres indiquent 1 mm (A), 20 μm (B) et 4 μm (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Comparaisons ratiométriques de l’opTDP-43h et de l’EGFP-TDP-43z avant et après la stimulation lumineuse. (A) Les rois couvrant les somas de quatre cellules mnr2b positives simples à 48 et 72 hpf ont été dessinés sur la base du signal EGFP-TDP-43z et sont représentés en magenta. Les ROI rectangulaires (bg) ont été utilisés pour soustraire le signal d’arrière-plan (ROI d’arrière-plan). Les chiffres sont adaptés d’Asakawa et al.14 (B) Les intensités relatives de l’opTDP-43h à l’EGFP-TDP-43z ont été tracées pour chaque cellule à chaque point temporel comme le rapport RFP/GFP. La cellule #1, indiquée par l’astérisque, ne convenait pas à la comparaison ratiométrique parce que son signal EGFP-TDP-43z était saturé et que sa valeur RFP/GFP était surestimée. La barre indique 10 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L’expression médiée par mnr2b-BAC de l’opTDP-43h et de l’EGFP-TDP-43z chez le poisson-zèbre offre une occasion unique d’imagerie en direct de la transition de phase TDP-43 dans les motoneurones spinaux. La transparence optique des tissus corporels des larves de poisson zèbre permet la stimulation optogénétique simple et non invasive de l’opTDP-43h. Les comparaisons entre les motoneurones spinaux uniques au fil du temps ont démontré que l’oligomérisation dépendante de la lumière de l’opTDP-43h provoque son regroupement cytoplasmique, qui rappelle la pathologie de la SLA.

L’un des paramètres critiques qui définissent le comportement de phase d’une protéine intrinsèquement désordonnée est la concentration intracellulaire. Un niveau élevé d’expression d’opTDP-43h pourrait potentiellement conduire à une oligomérisation, à une transition de phase et à une agrégation d’opTDP-43h indépendantes de la lumière. Ainsi, l’induction d’un niveau stable et non toxique d’expression de l’opTDP-43h dans les motoneurones spinaux est la clé de l’évaluation réussie des conséquences physiologiques et pathologiques de la transition de phase de l’opTDP-43 sur les motoneurones spinaux. L’expression médiée par mnr2b-BAC de l’opTDP-43 h semble convenir à cette fin parce que les poissons Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] présentent principalement de l’opTDP-43 nucléaire, ils sont capables de nager librement avec une vessie natatoire gonflée et ils maintiennent leur pleine viabilité même après avoir été élevés dans des conditions sombres continues de 1 à 5 dpf. Chez le poisson-zèbre, une approche conventionnelle utilisée pour exprimer de manière exogène un gène d’intérêt est l’injection d’ARNm au stade unicellulaire. Cependant, une forte dose de la protéine TDP-43 traduite à partir de l’ARNm injecté en une seule fois provoque des défauts de développement précoces14 qui empêchent les analyses de motoneurones spinals différenciants ultérieurs. Cependant, l’abaissement de la quantité d’ARNm injecté à un niveau tolérable ne fournit pas suffisamment d’opTDP-43h pour la modulation optogénétique dans les motoneurones spinaux au moment de sa différenciation, ce qui indique que l’injection d’ARNm n’est pas une méthode appropriée pour délivrer opTDP-43h aux motoneurones spinaux du poisson-zèbre. Une autre approche possible utilisée pour exprimer opTDP-43h dans les motoneurones spinaux consiste à injecter, au stade unicellulaire, un plasmide ou un ADN BAC hébergeant la construction opTDP-43h sous le contrôle d’un promoteur actif dans le motoneurone spinal. Bien que l’injection d’ADN BAC mnr2b-hs:opTDP-43h puisse diriger l’expression de l’opTDP-43h dans les motoneurones spinaux, le nombre de motoneurones opTDP-43h positifs est faible, et dans ces cellules opTDP-43h-positives numériquement restreintes, le niveau d’expression est généralement élevé, souvent associé à une agrégation opTDP-43h indépendante de la lumière. Ces observations suggèrent collectivement que l’expression transgénique est une stratégie irremplaçable par laquelle exprimer de manière stable l’opTDP-43h dans les motoneurones spinaux à un niveau non toxique. Notamment, bien que le mnr2b-BAC marque presque tous les motoneurones spinaux chez le poisson-zèbre20,23, les niveaux d’expression de l’opTDP-43h pourraient varier entre les cellules mnr2b positives individuelles. Cette variation peut être en partie due au modèle d’expression intrinsèque du mnr2b associé à son rôle régulateur dans la différenciation des motoneurones. Une autre cause potentielle de l’expression panachée peut résulter d’un effet de position chromosomique sur les inserts mnr2b-BAC. Quelle qu’en soit la cause, les niveaux variés d’expression de l’opTDP-43 parmi les cellules mnr2b positives pourraient provoquer une variation de la cytotoxicité associée à la transition de phase opTDP-43h dépendante de la lumière.

Chez les larves de poisson zèbre, les somas des motoneurones spinaux sont densément alignés dans la moelle épinière ventrale, et le cytoplasme somal a un volume beaucoup plus faible que celui du cytoplasme axonal. Cette caractéristique anatomique limite les analyses quantitatives de l’opTDP-43h cytoplasmique dans les motoneurones spinaux : l’opTDP-43h n’est mesurable quantitativement que dans le noyau et le cytoplasme somal, mais pas dans la cellule entière des motoneurones. L’imagerie quantitative d’une protéine dans la cellule entière des motoneurones spinaux, y compris le soma et le terminal nerveux périphérique, reste une tâche difficile. Malgré les restrictions imposées aux essais quantitatifs, il a été démontré que le rapport opTDP-43h/EGFP-TDP-43z dans le soma était élevé par la mutation causant la SLA dans l’IDR (A315T)14. Par conséquent, la présente méthode est applicable à l’évaluation des effets de la mutation TDP-43 sur la stabilité des protéines associée à la transition de phase dans le soma des motoneurones spinaux.

En principe, l’approche mnr2b-BAC peut être étendue pour moduler le LLPS et évaluer la cytotoxicité d’autres protéines RNP liées à la SLA avec des IDR au-delà du TDP-43. Plusieurs étapes du protocole peuvent devoir être ajustées pour obtenir un niveau d’expression optimal de ces sondes optogénétiques dans les motoneurones spinaux. Tout d’abord, dans la construction transgénique Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h], le promoteur hsp70l a été utilisé comme promoteur basal pour stimuler l’expression d’opTDP-43h entraînée par des amplificateurs mnr2b . Le promoteur hsp70l peut être retiré de la construction BAC si le niveau d’expression d’une protéine d’intérêt est si élevé qu’il provoque une transition de phase ectopique indépendante de la lumière. Deuxièmement, opTDP-43h est équipé de la balise CRY2olig, qui est un domaine d’homologie photolyase (PHR) porteur d’une mutation ponctuelle améliorant la capacité de regroupement sur l’éclairage de la lumière bleue22. La protéine de type sauvage CRY2PHR peut être utilisée comme marqueur d’oligomérisation dépendant de la lumière s’il est nécessaire d’atténuer l’activité de regroupement dépendante de la lumière. Enfin, pour récapituler plus fidèlement la pathologie de la SLA chez le poisson-zèbre, il est souhaitable d’établir un protocole d’éclairage où la physiologie du poisson est peu affectée par l’éclairage de champ de la lumière bleue pendant les stades juvénile et adulte. La présente méthode utilise un éclairage continu de la lumière bleue de 48 à 72 hpf (pendant 24 h), et la durée d’éclairage peut être prolongée jusqu’à 120 hpf (pendant 72 h) sans perdre la viabilité du poisson14, bien que les fonctions physiologiques sensibles à la lumière, telles que la vision, puissent être affectées. En développant un protocole pour l’éclairage intermittent de la lumière, une stimulation lumineuse à beaucoup plus long terme peut devenir possible, ce qui peut à son tour faciliter le développement de l’opTDP-43h en agrégats pathologiques plus matures. Pour ce faire, d’autres sondes optogénétiques pour moduler les interactions protéine-protéine en utilisant différentes longueurs d’onde lumineuses moins dérangeantes physiologiquement24 peuvent également valoir la peine d’être étudiées plus avant. Des combinaisons de telles sondes optogénétiques TDP-43 améliorées, de promoteurs appropriés ciblant les types de cellules vulnérables à la maladie et de protocoles d’éclairage ayant des effets minimes sur les fonctions physiologiques ouvriraient la voie à une modélisation fidèle des pathologies des protéopathies TDP-43 non seulement dans la moelle épinière, mais aussi dans le cerveau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

KA et KK sont les inventeurs de la propriété intellectuelle décrite dans ce manuscrit et des brevets provisoires ont été déposés par l’Institut national de génétique.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numbers JP19K06933 (KA) et JP20H05345 (KA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope Olympus FV1200
Epifluorescence microscope ZEISS Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope Leica MZ16FA
Glass base dish IWAKI 3910-035
Incubator MEE CN-25C
LED panel Nanoleaf Limited Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus TAKARA AD110
NucleoBond BAC100 MACHEREY-NAGEL 740579
NuSieve GTG Agarose LONZA 50181
Objective lens Olympus XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens ZEISS Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter HIOKI 3664
Optical sensor HIOKI 9742-10
Phenol red solution 0.5% Merck P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase TAKARA R050A
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Six-well dish FALCON 353046
Spectrometer probe BLUE-Wave StellerNet Inc. VIS-50
Syringe needle TERUMO NN-2725R
TaKaRa Ex Taq TAKARA RR001A
Tricane Sigma-Aldrich A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16 BACPAC Genomics CH211-172N16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
  2. Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
  3. Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
  4. Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
  5. Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
  6. Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
  7. Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
  8. Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
  9. Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
  10. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
  11. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  12. Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
  13. Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
  14. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
  15. Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
  16. Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
  17. Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
  18. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
  19. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  20. Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
  23. Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
  24. Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).

Tags

Neurosciences Numéro 180 maladie neurodégénérative SLA système optoDroplet Cryptochrome 2 TDP-43 poisson-zèbre motoneurone spinal, mnr2b transgénèse BAC
Transition de phase optogénétique du TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. … More

Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (180), e62932, doi:10.3791/62932 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter