Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetisk fasövergång av TDP-43 i spinalmotoriska nervceller av zebrafisk larver

Published: February 25, 2022 doi: 10.3791/62932
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, 2Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, 3Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

Summary

Vi beskriver ett protokoll för att inducera fas övergång av TAR DNA-bindande protein 43 (TDP-43) med ljus i spinal motor nervceller med zebrafisk som modell.

Abstract

Onormal protein aggregering och selektiv neuronal sårbarhet är två stora kännetecken för neurodegenerativa sjukdomar. Orsakssamband mellan dessa funktioner kan ifrågasättas genom att kontrollera fasövergången av ett sjukdomsassocierat protein i en sårbar celltyp, även om detta experimentella tillvägagångssätt har begränsats hittills. Här beskriver vi ett protokoll för att inducera fasövergång av RNA/DNA-bindande protein TDP-43 i spinal motor nervceller av zebrafish larver för modellering cytoplasmic aggregering av TDP-43 förekommer i degenererande motor nervceller i amyotrofisk laterala skleros (ALS). Vi beskriver en bakteriell konstgjord kromosom (BAC)-baserade genetisk metod för att leverera en optogenetic TDP-43 variant selektivt till spinal motor nervceller av zebrafish. Zebrafisklarvernas höga genomskinlighet möjliggör fasövergången av den optogenetiska TDP-43 i ryggradsmotoriska nervceller genom en enkel extern belysning med hjälp av en ljusemitterande diod (LED) mot ohämmad fisk. Vi presenterar också ett grundläggande arbetsflöde för live imaging av zebrafisk spinal motor nervceller och bildanalys med fritt tillgängliga Fiji / ImageJ programvara för att karakterisera svar av optogenetic TDP-43 till ljus belysningen. Detta protokoll möjliggör karakterisering av TDP-43 fas övergång och aggregerad bildning i en ALS-sårbar cellulär miljö, vilket bör underlätta en undersökning av dess cellulära och beteendemässiga konsekvenser.

Introduction

Ribonucleoprotein (RNP) granulat styr en myriad av cellulära aktiviteter i kärnan och cytoplasman genom att montera membranfria skiljeväggar via flytande-flytande fasseparation (LLPS), ett fenomen där en homogen vätska blandas till två distinkta vätskefaser1,2. Den dysreglerade LLPS av RNA-bindande proteiner som normalt fungerar som RNP granulatkomponenter främjar onormal fasövergång, vilket leder till proteinaggregering. Denna process har varit inblandad i neurodevelopmental och neurodegenerativa sjukdomar3,4,5. Den exakta utvärderingen av ett orsakssamband mellan avvikande LLPS av RNA-bindande proteiner och sjukdomspatogenes är avgörande för att avgöra om och hur LLPS kan utnyttjas som ett effektivt terapeutiskt mål. LLPS av RNA-bindande proteiner är relativt lätt att studera in vitro och i encelliga modeller men är svårt i multicellulära organismer, särskilt hos ryggradsdjur. Ett kritiskt krav för att analysera sådan LLPS i enskilda celler i en vävnadsmiljö är att stabilt uttrycka en sond för avbildning och manipulering av LLPS i en sjukdoms sårbar celltyp av intresse.

Amyotrofisk lateral skleros (ALS) är en ytterst dödlig neurologisk sjukdom där motoriska nervceller i hjärnan och ryggmärgen selektivt och gradvis förloras på grund av degeneration. Hittills har mutationer i mer än 25 gener associerats med ärftlig (eller familjär) form av ALS, som står för 5%-10% av de totala ALS-fallen, och några av dessa ALS-orsakande gener kodar RNA-bindande proteiner bestående av RNPs, såsom hnRNPA1, TDP-43 och FUS6,7. Dessutom kännetecknas den sporadiska formen av ALS, som står för 90-95% av de totala ALS-fallen, av den cytoplasmiska aggregeringen av TDP-43 deponeras i degenererande motoriska nervceller. En viktig egenskap hos dessa ALS-associerade RNA-bindande proteiner är deras inneboende oordnade regioner (IDR) eller områden med låg komplexitet som saknar ordnade tredimensionella strukturer och förmedlar svaga protein-proteininteraktioner med många olika proteiner som driver LLPS7,8. Det faktum att ALS-orsakande mutationer ofta förekommer i IDR har lett till tanken att avvikande LLPS och fasövergång av dessa ALS-relaterade proteiner kan ligga till grund för ALS patogenes9,10.

Nyligen utvecklades optoDroplet-metoden, en Cryptochrome 2-baserad optogenetisk teknik som möjliggör modulering av protein-proteininteraktioner med ljus, för att inducera fasövergång av proteiner med IDR11. Eftersom denna teknik har utvidgats framgångsrikt till TDP-43, har det börjat avslöja mekanismerna bakom patologisk fas övergång av TDP-43 och dess associerade cytotoxicitet12,13,14,15. I detta protokoll skisserar vi en genetisk metod för att leverera en optogenetisk TDP-43 till ALS-sårbara celltyper, nämligen spinal motor nervceller i zebrafisk med hjälp av BAC för mnr2b/mnx2b genen kodar ett homeodomain protein för motor neuron specifikation16,17. Zebrafisklarvernas höga genomskinlighet möjliggör enkel, icke-invasiv ljusstimulering av den optogenetiska TDP-43 som utlöser dess fasövergång i ryggradsmotoriska nervceller. Vi presenterar också ett grundläggande arbetsflöde för live imaging av zebrafisk spinal motor nervceller och bildanalys med hjälp av den fritt tillgängliga Fiji / ImageJ programvara för att karakterisera svaren av optogenetic TDP-43 till ljusstimulering. Dessa metoder möjliggör en undersökning av TDP-43 fas övergång i en ALS-sårbar cellulär miljö och bör bidra till att utforska dess patologiska konsekvenser på cellulära och beteendemässiga nivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Allt fiskearbete utfördes i enlighet med guiden för vård och användning av laboratoriedjur i den institutionella kommittén för djuromsorg och användning (godkännandenummer 24-2) vid National Institute of Genetics (Japan), som har en djurskyddsgaranti registrerad (försäkringsnummer A5561-01) vid Kontoret för laboratoriedjurvälfärd vid National Institutes of Health (NIH, USA).

1. Konstruktion av BAT för uttryck av optogenetisk TDP-43-gen från mnr2b-promotorn

  1. BAC-förberedelse
    1. Köp en zebrafisk BAC klon som innehåller zebrafish mnr2b locus (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Rena BAC DNA från en 5 mL över natten LB kultur av DH10B Escherichia coli (E. coli) som hyser CH211-172N16 som beskrivs i Warming et al.18.
    2. Omvandla CH211-172N16 till SW102 E. coli-celler genom elektroporation, enligt beskrivningen i Warming et al.18.
      OBS: Rening av BAC DNA från E. coli på samma dag av elektroporation ger vanligtvis en högre framgångsgrad för BAC-omvandling18. I annat fall hålls det renade BAC-DNA:t vid -20 °C fram till användning.
    3. Introducera iTol2-amp-kassetten för Tol2 transposon-medierad BAC-transgenes19 i ryggraden i CH211-172N16 genom elektroporation, enligt beskrivningen i Asakawa et al.20.
      1. Gör ett glycerol lager av E. coli cell kloner som bär CH211-172N16 med iTol2-amp kassettintegration (CH211-172N16-iTol2A) efter att ha bekräftat den homologa rekombinationsmedierade integrationen genom polymeraskedjereaktion (PCR) (Ex Taq) Med användning av primerparet Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') och pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') och följande villkor: En denatureringssteg vid 98 °C i 1 min, följt av 25 cykler av denaturering vid 95 °C för 10 s, primerglödgning vid 55 °C för 15 s och primerförlängning vid 72 °C i 1 min, vilket förstärker en PCR-produkt på 354 baspar (bp).
  2. mnr2b-hs:opTDP-43h konstruktion
    1. Konstruera en plasmid som bär uttryckskassetten för den mänskliga vilda typen TDP-43/TARDBP (TDP-43h) som är märkt med mRFP1 respektive CRY2olig vid N- respektive C-termini (nedan kallad opTDP-43h)14.
      OBS: OpTDP-43h fragmentet bör flankeras med zebrafisk hsp70l genpromotor sekvens (650 bp) och polyadenylation (polyA) signalsekvens, följt av en kanamycin resistens gen (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. Förstärk hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan-kassetten med primers som glödghsp70l och Kan och innehåller 45 bp-sekvenser av uppströms och nedströms initiativtagarens kodoner av mnr2b-genen med PCR (GXL DNA Polymerase) med hjälp av primerparet mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') och Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc vidC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') med följande villkor: en denatureringssteg vid 98 °C i 1 min, följt av 30 cykler av denaturering vid 95 °C för 10 s, primerglödgell vid 55 °C för 15 s och primerförlängning vid 68 °C för 68 °C för 30 °C, förstärka en PCR-produkt på ~ 5,7 bp.
    3. Separera PCR-produkterna med agarose gel elektrofores (100 V) och rena hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA-bandet med en DNA-kolumn. Justera koncentrationen av den renade hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan-kassetten till 50 ng/μL i Tris-EDTA-buffert (TE) som innehåller 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) och 1 mM EDTA.
    4. Introducera hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan-kassetten i CH211-172N16-iTol2A genom elektroporation enligt beskrivningen i Warming et al.18 och välj ampicillin- och kängamycinresistenta transformanter på LB agarplattor. CH211-172N16-iTol2A som bär hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan kassetten betecknas som mnr2b-hs:opTDP-43h.
    5. Rena mnr2b-hs:opTDP-43h med hjälp av en BAC-reningssats och lös upp den vid 250 ng/μL i TE efter fenol/kloroform extraktion.
  3. mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z konstruktion
    1. Konstruera en annan plasmid som bär zebrafiskens vilda tardbp som är märkt med förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP) vid dess N-terminus (EGFP-TDP-43z) istället för opTDP-43h men är annars identisk med hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan-konstruktion (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Använd EGFP-TDP-43z som en intern kontroll för ljusstimulering av opTDP-43h.
    2. Bygg CH211-172N16-iTol2A som hyser hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan-kassetten i mnr2b locus enligt beskrivningen i 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A som bär hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan kassetten betecknas som mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Tol2 transposonmedierad BAC-transgenes i zebrafisk

  1. Förbered injektionslösningen som innehåller 40 mM KCl, fenolrött (10% v/v), 25 ng/μL av mnr2b-hs:opTDP-43h DNA och 25 ng/μL Tol2 transposase mRNA19.
  2. Injicera 1 nL av injektionslösningen (en droppe med en diameter på cirka 123 μm kalibrerad i mineralolja) i cytosolen hos zebrafiskembryon av vild typ i encellsstadiet. Screena den injicerade fisken för bildandet av röda fluorescerande protein (RFP) positiva aggregat i olika embryonala vävnader, inklusive spinalmotoriska nervceller, under ett fluorescensstereomikroscope vid 2-3 dagar efter befruktning (dpf). Höj den RFP-positiva fisken till vuxen ålder.
  3. Injicera mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA enligt beskrivningen i 2.1 och 2.2. Höj EGFP-positiv fisk till vuxen ålder.
  4. Efter några månader, sätt sexuellt mogna injicerad fisk och vild typ fisk i par i standard 2 L parningsburar för att få F1-avkommor. Screen F1 fisk vid 3 dpf för RFP (opTDP-43h) eller EGFP (EGFP-TDP-43z) fluorescens i ryggraden med hjälp av ett epifluorescensmikroskop utrustat med en Plan-Neofluar 5x/0.15 objektiv. Vanligtvis identifieras en grundarfisk från 10−20 injicerad fisk (bakterieöverföringshastigheten är 5%−10%).
  5. Isolera och jämför flera Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] och Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] skär från olika grundare fisk, som intensitet, men inte mönstret, av opTDP-43h eller EGFP-TDP-43z uttryck kan variera mellan grundare fisk på grund av kromosomala position effekter.
  6. Cross Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] och Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] fisklinjer för att erhålla avkommor som innehåller Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgen fisk i ett mendelian-förhållande.
  7. Höj fisken i en plastskål som innehåller 30 ml E3-buffert (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10-5% Metylenblå) och tillsätt 0,003% (w/v) N-fenylthiourea vid 8-10 h efter befruktningen (hpf) för att hämma melano.
  8. Täck plastskålen med aluminiumfolie efter 30 hkf.

3. Förberedelse av LED för blåljusbelysning

  1. Slå på en LED-panel med hjälp av det tillhörande programmet som är installerat på en surfplatta/telefon. Placera sonden av en spektrometer i en tom brunn på en 6-brunnsskål och justera LED-lampan till våglängden som når en topp på ~ 456 nm genom applikationen. Placera den optiska sensorn för en optisk effektmätare i den tomma brunnen och justera led-lampans effekt (~0,61 mW/cm2). LED-ljusinställningen kan sparas och kan hämtas i applikationen.
  2. Sätt skålen/LED-panelinställningen i inkubatorn vid 28 °C. Avsluta det här steget innan avbildningen av fisk börjar på 48 hkf.

4. Avbildning av zebrafisk larver uttrycker optogenetisk TDP-43

  1. Välj Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgen fisk minst före 47 hkf, baserat på RFP (opTDP-43h) eller EGFP (EGFP-TDP-43z) fluorescens i ryggraden med hjälp av epifluorescensmikroskopuppsättningen som beskrivs ovan.
  2. Dechorionate Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgen fisk.
  3. Förvärm 1% låg smälttemperatur agaros som innehåller 250 μg/ml etyl 3-aminobensoat metansulfonitsalt vid 42 °C.
  4. Bedöva Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] dubbeltransgen fisk vid 48 hkf i E3-buffert som innehåller samma koncentration av Tricane.
  5. Lägg en droppe av den förvärmda 1% låga smälttemperaturagarosen på glasbasskålen vid rumstemperatur. Diametern på den kupolformade agarosdroppen på glasfatet är 8-10 mm.
  6. Använd en Pasteur-pipett och tillsätt den sövda fisken till den låga smälttemperaturaängosen på glasbasskålen och blanda sedan genom pipettering några gånger. Minimera mängden E3-buffert som läggs till agarosen tillsammans med fisken.
  7. Håll fisken på sidan genom att använda en sprutnål under stelningen av agaros (vanligtvis ~1 min) för att säkerställa att ryggmärgen är i ett lämpligt horisontellt läge. Efter stelningen, sätt ett par droppar E3-buffert på den kupolformade agarosmonterade fisken.
  8. Skaffa seriella konfokala z-sektioner i ryggmärgen genom att skanna med ett konfokalt mikroskop utrustat med en 20x vattensänkning objektiv med den numeriska bländaren 1,00, med en skanningshastighet på 4,0 μs per pixel (12 bitar per pixel), en stegstorlek på 1,0 μm per skiva för målet och en kombination av excitation / emissionsvåglängder: Kanal 1) 473/510 nm för EGFP och Kanal 2) 559/583 nm för mRFP1.
    OBS: Cloaca på fiskens ventrala sida ingår i de områden av intresse (ROI) som referens, vilket hjälper till att identifiera och jämföra ryggradssegmenten (nivåerna 16-17) över tidspunkterna.
  9. Ta bort fisken från agaroset genom att försiktigt knäcka agaroset med en sprutnål så snart avbildningen är klar. Håll den tid fisken är inbäddad i agaroset så kort som möjligt, även om agarosinbäddningen i <30 min inte påverkar fiskens livskraft.

5. Ljusstimulering av opTDP-43h-uttryckande fisk genom fältbelysning av en blå ljusdiod (LED) ljus

  1. Lägg till 7,5 ml E3-buffert i brunnen och placera den avbildade Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgen fisk i brunnen. Placera sexbrunnen på LED-panelen genom att hålla skålen och LED-panelen 5 mm ifrån varandra med en distans (till exempel med fem skjutglas staplade).
  2. Tänd den blå LED-lampan. Förvara några av Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgen fisk i en separat sex-brunns skål täckt med aluminiumfolie när unilluminated kontrollfisk är nödvändiga (dvs. i mörka förhållanden)14.
  3. Efter belysningen (t.ex. i 24 timmar vid 72 hkf i figur 3), avbilda ryggmärgen hos den upplysta fisken genom att upprepa stegen 4,3 - 4,9.

6. Visualisering av cytoplasmisk omlokalisering av optogenetisk TDP-43 i ryggradsmotoriska nervceller

  1. Öppna bildfilen i ImageJ/Fiji21 (Version: 2.1.0/1.53c), ett Java-bildbehandlingsprogram med öppen källkod utvecklat av NIH Image, som kan laddas ner från https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Använd rullningslisten Z för att gå igenom brännplan. Skapa en maximal intensitetsprojektion av flera segment genom att klicka på Bild | Staplar | Z-projekt | Max intensitet och inställning Startskiva och Stoppskiva som täcker ryggradens hemsegment.
  3. Dela upp flerkanalsbilden i två bilder med en kanal genom att klicka på Bild | Färg | Dela kanaler.
  4. Förbättra EGFP-TDP-43z-signalen för att säkerställa att cytoplasmisk EGFP-TDP-43z syns tydligt genom att klicka på Bild | Justera | Ljusstyrka/kontrast och justering av minimum
  5. Öppna ROI-hanteraren genom att klicka på Analysera | Verktyg | ROI-chef. Hitta de celler som kan identifieras i båda bilderna vid 48 hkf och 72 hkf, baserat på cellkropparnas relativa positioner. Ställ in ROI genom att beskriva konturerna av cellkroppar av en ryggradsmotoriska nervceller visualiserade av EGFP-TDP-43z-signalen med Freehand-val och klicka sedan på Lägg till[t] i ROI-hanteraren.
  6. Ange en huvudaxel för soma genom att rita en rak linje med Straight och klicka på Analysera | Plot Profil för EGFP-TDP-43z (C1) och opTDP-43h (C2) bilder på 48 och 72 hpf.
  7. Normalisera plotprofilen genom att dividera värdena med det största värdet för varje EGFP-TDP-43z- och opTDP-43h-signal. Rita de normaliserade värdena med x-y-koordinater, där x och y representerar den stora axeln för soma respektive relativ fluorescerande intensitet med XY-graf i en statistisk programvara.

7. Ratiometrisk jämförelse mellan opTDP-43h och EGFP-TDP-43z signaler med ImageJ/Fiji

  1. Öppna bildfilen i ImageJ/Fiji och ställ in ROI för enstaka mnr2b-positiva celler med hjälp av en maximal intensitetsprojektionsbild av EGFP-TDP-43z som i 6.1-6.5. Lägg till en ROI utanför ventrala ryggmärgen (t.ex. notochord) för att representera bakgrundssignalen (bakgrunds-ROI).
  2. För varje EGFP-TDP-43z- och opTDP-43-bild skapar du en projektion av flera segment genom att klicka på Bild | Staplar | Z-projekt | Summera segment och ställ in Starta segment och stoppa segment som täcker hemispinal motorkolonnen.
  3. Öppna ROI-hanteraren som skapats med den maximala projektionsbilden för intensiteten. Visa ROI:erna på bilden Summasegment genom att markera bildfönstret för EGFP-TDP-43z och sedan klicka på Visa alla i ROI-hanteraren. Klicka på Mät i ROI-hanteraren för att hämta medelvärden för varje ROI.
  4. Förvärva medelvärden för opTDP-43h enligt samma förfarande som anges i 7.3.
  5. För varje ROI, efter subtrahering av medelvärdet för bakgrunds-ROI, dividera det subtraherade medelvärdet för opTDP-43h med det subtraherade medelvärdet för EGFP-TDP-43z för att erhålla ratiometriskt värde. Ratiometriska värden kan jämföras mellan olika tidpunkter och presenteras med hjälp av kolumndiagram i Prism-programvara.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Levande avbildning av optogenetiska och icke-optogenetiska TDP-43-proteiner i mnr2b + spinalmotoriska nervceller av zebrafisk larver
För att inducera TDP-43 fas övergång i spinal motor nervceller i zebrafisk, konstruerades en mänsklig TDP-43h som är märkt med mRFP1 och CRY2olig22 vid N- respektive C-termini, och betecknas som opTDP-43h14 (figur 1A). OpTDP-43h genfragment infördes i en BAC som innehåller mnr2b locus (figur 1B). Den resulterande BAC, betecknad som mnr2b-hs:opTDP-43h, introducerades i zebrafiskgenomet av Tol2 transposon-medierad BAC transgenesis19. För att övervaka lokalisering av icke-optogenetiska TDP-43 i spinal motor nervceller, en zebrafisk TDP-43 kodad av tardbp genen taggades med EGFP vid N-terminus (figur 1A) och EGFP-TDP-43z genfragment infördes i mnr2b BAC, liknar opTDP-43h (figur 1B). Den resulterande BAC, betecknas som mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z, introducerades i zebrafiskgenomet av Tol2 transposon-medierad BAC transgenesis. Fisken som injicerades med varje BAC-konstruktion korsades med en fisk av vild typ och den resulterande F1-fisken screenades på dag 3 för rött (Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]) eller grön (Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]) fluorescens i ventrala ryggmärgen. Den isolerade röda eller gröna fluorescenspositiva F1-fisken betecknades som Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] eller Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z], respektive.

Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgen fisk vid 48 hpf bedövades och inbäddades i en låg smältande agaros på deras sida; efter agarose stelning, de täcktes med E3 buffert för att tillåta observationer av den laterala sidan av ryggmärgen ovanifrån. Konfokal laser scanning mikroskopi utfördes med en 20x vatten nedsänkning mållins och en kombination av excitation/emission våglängder: 473/510 nm för EGFP och 559/583 nm för mRFP1. Den skannade fisken togs omedelbart och försiktigt från agaroset, överfördes till E3-bufferten i en sexbrunnsplatta och belystes av ett blått LED-ljus genom att placera plattan på en LED-panel vid 28 °C (figur 2A,B). Efter en 24-timmars belysning bedövades fisken och inbäddades igen i agaros innan den skannades med en konfokal mikroskopi med samma bildframställningsförhållanden, förutom att ROI justerades för att inkludera motsvarande ryggmärgsregion avbildad vid 48 hkf (figur 2B). Hela hemispinal sladden av 4-5 sammanhängande spinal segment avbildades under mikroskopi sessionen (vanligtvis 20-30 min), genererar z-serien bilder som innehåller 20-40 skivor beroende på horisontellheten av den längsgående axeln av ryggmärgen av den monterade fisken i förhållande till confocal skanning plan.

Visualisering av cytoplasmisk omlokalisering av optogenetisk TDP-43 i spinalmotoriska nervceller
För att visualisera cytoplasmic omlokalisering av opTDP-43h i en spinal motor nervceller, z-serien bilder (vanligtvis 20-40 skivor) förvärvats vid 48 och 72 hpf öppnades med Fiji och separerades i varje EGFP-TDP-43z och opTDP-43h kanal. Max intensitet projektion bilder av EGFP-TDP-43z skapades för bilder på 48 och 72 hpf och en enda isolerad spinal neuron identifierbar i båda bilderna vid 48 och 72 hpf valdes (figur 2B, pilar). Spinal motor nervceller med cell kroppar ligger på den dorsala sidan av motor kolonnen ansågs lämplig för mätningar av cellens kroppsform på grund av deras glesa distribution mönster.

Efter att ha justerat intensiteten hos EGFP-signalen i EGFP-TDP-43z-bilder fastställdes ROI som täcker motorneuronernas somas genom att spåra egfp-signalens kant till 48 och 72 hkf (figur 2C). Fluorescerande intensitet längs den stora axeln av soma mättes för EGFP-TDP-43z och opTDP-43h signaler vid 48 och 72 hkf (figur 2C, höger). Vid 48 hkf överlappade mönstren för opTDP-43h och EGFP-TDP-43z signaler till stor del varandra.

Däremot, vid 72 hpf, hittades toppen av opTDP-43h signalen i regionen där EGFP-TDP-43z signalen var låg, nämligen i cytoplasma, vilket indikerar cytoplasmic omlokalisering av opTDP-43h. Den ljusberoende cytoplasmic opTDP-43h omlokalisering initieras i stort sett oberoende av icke-optogenetic TDP-4314. I denna analys användes Max intensitet projektion bilder för att uppskatta positionen för kärnan/cytoplasma gränsen på bekostnad av kvantitativa mätningar.

Ratiometrisk jämförelse av fluorescensintensiteten hos optogenetisk och icke-optogenetisk TDP-43 i ryggradsmotorneuroneuroner
För att utvärdera effekterna av blå ljus stimulering på fluktuerande opTDP-43h proteinnivåer, opTDP-43h signaler i cell kroppen mättes före och efter ljus stimulering med hänvisning till EGFP-TDP-43z signalen. Z-seriens bilder, inklusive spinal hemisegment, öppnades med Fiji. För att ställa in ROI som täcker en spinal motor nervceller, Max intensitet projektion bilder av EGFP-TDP-43z signalen skapades för 48 och 72 hpf, och enstaka isolerade spinal nervceller som var identifierbara i både 48 och 72 hpf bilder valdes (figur 3A). Med hjälp av frihandsval ritades och registrerades ROI-rekommendationer i en ROI-chef för var och en av de 48 och 72 hpf-bilderna (figur 3A). Maximal intensitetsprojicering av EGFP-TDP-43z-signalen ansågs lämplig för att ställa in rois på grund av dess höga kontrast.

För att kvantifiera signalerna opTDP-43h och EGFP-TDP-43z producerades projektionsbilder för summaskivor för varje kanal i samma z-seriebilder för 48 och 72 hkf (figur 3A). Med hjälp av de registrerade ROI-uppsättningarna mättes fluorescerande intensiteter för opTDP-43h och EGFP-TDP-43z för varje tidspunkt. Relativa mängder opTDP-43h till EGFP-TDP-43z (RFP/GFP-värden) beräknades för varje cell och tidpunkt genom att dividera RFP-värdet med GFP-värdet (figur 3B). Av de fyra mnr2b-positiva celler som undersöktes visade cell #1 särskilt en mättad EGFP-TDP-43z-signal (figur 3A). Celler med mättade fluorescerande signaler bör uteslutas från datamängderna när kvantitativa analyser utförs. Cellerna #2-#4 uppvisade minskande trender av relativa opTDP-43h nivåer till EGFP-TDP-43z efter blått ljus belysning (figur 3B), även om en storskalig analys tidigare visat att minskningen av relativa opTDP-43h nivåer till EGFP-TDP-43z inte var statistiskt signifikant (65 celler från tre oberoende djur)14.

Figure 1
Figur 1: Konstruktion av BAC DNA med hjälp av mnr2b locus. (A) Strukturer av uttryckskassetter för opTDP-43h och EGFP-TDP-43z. B) Zebrafiskgenomiska regionen som bärs av CH211-172N16 BAC DNA. PCR-förstärkta uttryckskassetter för opTDP-43h och EGFP-TDP-43z sätts in nedströms 5′-oöversatta regionen (UTR) i mnr2b (röd pil) i den första exon av mnr2b genom homolog rekombination. Staplarna anger 500 (A) och 10k (B) bp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Live imaging av opTDP-43h före och efter ljusstimulering. (A) Ett schema för ljusstimulering av opTDP-43h uttryckt i ryggmärgsmotoriska nervceller av obegränsadE Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgen fisk genom en fältbelysning av blått LED-ljus från 48. (B) Max intensitet projektion bilder av z-serien konfokala bilder av ventrala ryggmärgen före (48 hpf) och efter (72 hpf) ljusstimuleringen. De streckade linjerna avgränsar ryggmärgens ventrala gräns. Siffrorna är anpassade från Asakawa et al.14 (C) Cytoplasmisk mislocalization av opTDP-43 efter 24-h blå ljus belysning. Konturerna av soma av en mnr2b-positiv cell (röda pilar i B) observerade vid 48 och 72 hpf visas i magenta. De stora yxorna i somas visades med ljusblått. Den normaliserade fluorescerande intensiteten längs de stora axlarna ritades. Asterisken indikerar ett kluster av starka opTDP-43 signaler som inte visar en stark EGFP-TDP-43z överlappande signal, vilket indikerar cytoplasmic opTDP-43h mislocalization. Staplarna anger 1 mm (A), 20 μm (B) och 4 μm (C). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Ratiometriska jämförelser av opTDP-43h och EGFP-TDP-43z före och efter ljusstimulering. (A) ROI som täcker somas av fyra enstaka mnr2b-positiva celler vid 48 och 72 hkf ritades baserat på EGFP-TDP-43z-signalen och visas i magenta. De rektangulära ROIs (bg) användes för att subtrahera bakgrundssignalen (bakgrunds-ROI). Siffrorna är anpassade från Asakawa et al.14 (B) De relativa intensiteterna för opTDP-43h till EGFP-TDP-43z ritades för varje cell vid varje tidpunkt som RFP/GFP-förhållandet. Cell #1, som indikeras av asterisken, var inte lämplig för ratiometrisk jämförelse eftersom dess EGFP-TDP-43z-signal var mättad och dess RFP/GFP-värde överskattades. Stapeln anger 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mnr2b-BAC-medierat uttryck för opTDP-43h och EGFP-TDP-43z i zebrafisk ger en unik möjlighet till levande avbildning av TDP-43 fas övergång i spinal motor nervceller. Den optiska transparensen i kroppsvävnader av zebrafisk larver möjliggör enkel och icke-invasiv optogenetisk stimulering av opTDP-43h. Jämförelser mellan en spinal motor nervceller över tiden visade att den ljusberoende oligomerization av opTDP-43h orsakar dess cytoplasmic kluster, som påminner om ALS patologi.

En av de kritiska parametrarna som definierar fasbeteendet hos ett i sig oordnat protein är intracellulär koncentration. En hög nivå av opTDP-43h uttryck kan potentiellt leda till ljus-oberoende opTDP-43h oligomerization, fas övergång och aggregering. Således är induktion av en stabil, giftfri nivå av opTDP-43h uttryck i spinal motor nervceller nyckeln till framgångsrik utvärdering av de fysiologiska och patologiska konsekvenserna av opTDP-43 fas övergången på spinal motor nervceller. Mnr2b-BAC-medierat uttryck för opTDP-43 h verkar vara lämpligt för detta ändamål eftersom Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] fisk display främst nukleära opTDP-43, de är kapabla till fri simning med en uppblåst simblåsa och de upprätthåller full livskraft även efter att ha höjts under de kontinuerliga mörka förhållandena från 1-5 dpf. I zebrafisk är ett konventionellt tillvägagångssätt som används för att exogent uttrycka en gen av intresse mRNA-injektion i encellsstadiet. En hög dos av TDP-43 proteinet översatt från injicerade mRNA orsakar dock tidigt utvecklingsmässiga defekter14 som utesluter analyser av senare differentiera spinal motor nervceller. Att sänka mängden injicerat mRNA till en tolerabel nivå misslyckas dock med att leverera tillräcklig opTDP-43h för optogenetisk modulering i spinalmotoriska nervceller vid tidpunkten för dess differentiering, vilket indikerar att mRNA injektion inte är en lämplig metod för att leverera opTDP-43h till spinal motor nervceller av zebrafisk. Ett annat möjligt tillvägagångssätt som används för att uttrycka opTDP-43h i ryggraden motor neuroner är att injicera, på en-cell scenen, en plasmid eller BAC DNA som hyser opTDP-43h konstruktion under kontroll av en promotor som är aktiv i spinal motor neuron. Även om injektionen av mnr2b-hs:opTDP-43h BAC DNA kan rikta uttrycket av opTDP-43h i spinal motor nervceller, antalet opTDP-43h-positiva motor nervceller är lågt, och i sådana numeriskt begränsade opTDP-43h-positiva celler, uttrycksnivån är vanligtvis hög, ofta associerad med ljus-oberoende opTDP-43h aggregering. Dessa observationer tyder kollektivt på att transgena uttryck är en oersättlig strategi genom vilken att stabilt uttrycka opTDP-43h i spinal motor nervceller på en giftfri nivå. Noterbart, även om mnr2b-BAC etiketter nästan alla spinal motor nervceller i zebrafish20,23, uttryck nivåer av opTDP-43h kan variera mellan enskilda mnr2b-positiva celler. Denna variation kan delvis bero på det inneboende uttryck mönstret av mnr2b associeras med dess reglerande roll i motor neuron differentiering. En annan potentiell orsak till det varierade uttrycket kan bero på en kromosomal positionseffekt på mnr2b-BAC-skären. Oavsett orsak, de varierade opTDP-43 uttryck nivåer bland mnr2b-positiva celler kan orsaka variation i cytotoxicitet är associerad med ljusberoende opTDP-43h fas övergång.

I zebrafisk larver är somas av spinalmotoriska nervceller tätt inriktade i ventrala ryggmärgen, och den somala cytoplasman har en mycket lägre volym än den axonal cytoplasman. Denna anatomiska funktion begränsar kvantitativa analyser av cytoplasmic opTDP-43h i spinal motor nervceller: opTDP-43h är endast kvantitativt mätbar i kärnan och somal cytoplasma, men inte i hela cellen av motor neuroner. Kvantitativ avbildning av ett protein i hela cellen av spinal motor nervceller, inklusive soma och perifera nerv terminal, är fortfarande en utmanande uppgift. Trots begränsningarna på kvantitativa analyser visade sig opTDP-43h/EGFP-TDP-43z förhållandet i soma vara förhöjda av ALS-orsakande mutationen i IDR (A315T)14. Därför är denna metod tillämplig på att utvärdera effekterna av TDP-43 mutationen på protein stabilitet är associerad med fas övergång i soma av spinal motor nervceller.

I princip kan mnr2b-BAC-metoden utvidgas för att modulera LLPS och utvärdera cytotoxiciteten hos andra ALS-relaterade RNP-proteiner med IDR utöver TDP-43. Flera protokoll steg kan behöva justeras för att erhålla en optimal uttrycksnivå av sådana optogenetic sonder i spinal motor nervceller. Först, i Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] transgen konstruktion, användes hsp70l promotorn som en basal promotor för att öka opTDP-43h uttryck driven av mnr2b förstärkare. Hsp70l-promotorn kan tas bort från BAC-konstruktionen om uttrycksnivån för ett protein av intresse är så hög att den orsakar ljusoberoende övergång till utomkvedshavande fas. För det andra är opTDP-43h utrustad med CRY2olig-tagg, som är en phr-domän (photolyase homology) som bär en punktmutation som förbättrar klusterkapaciteten på blå ljusbelysning22. Wild-typ proteinet CRY2PHR kan användas som en ljusberoende oligomerisering tagg om det finns behov av att dämpa ljusberoende kluster aktivitet. Slutligen, för att mer troget rekapitulera ALS-patologi i zebrafisk, är det önskvärt att upprätta ett belysningsprotokoll där fiskfysiologin påverkas minimalt av fältbelysningen av blått ljus under ungdoms- och vuxenstadierna. Den nuvarande metoden använder en kontinuerlig blå ljusbelysning från 48 till 72 hkf (för 24 h), och belysningstiden kan förlängas till 120 hkf (för 72 h) utan att förlora fiskens livskraft14, även om ljuskänsliga fysiologiska funktioner, såsom syn, kan påverkas. Genom att utveckla ett protokoll för intermittent ljusbelysning kan mycket mer långsiktig ljusstimulering bli möjlig, vilket i sin tur kan underlätta utvecklingen av opTDP-43h till mer mogna patologiska aggregat. För att uppnå detta kan andra optogenetiska sonder för modulering av protein-proteininteraktioner med olika ljusvåglängder som är mindre fysiologiskt störande24 också vara värda att undersöka vidare. Kombinationer av sådana förbättrade optogenetiska TDP-43 sonder, lämpliga promotorer som riktar sig till sjukdomskänsliga celltyper och belysningsprotokoll med minimala effekter på fysiologiska funktioner skulle öppna vägar för att troget modellera patologierna hos TDP-43 proteinopatier inte bara i ryggmärgen utan också i hjärnan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

KA och KK är uppfinnarna av de immateriella rättigheter som beskrivs i detta manuskript och provisoriska patent har lämnats in av National Institute of Genetics.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numbers JP19K06933 (KA) och JP20H05345 (KA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope Olympus FV1200
Epifluorescence microscope ZEISS Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope Leica MZ16FA
Glass base dish IWAKI 3910-035
Incubator MEE CN-25C
LED panel Nanoleaf Limited Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus TAKARA AD110
NucleoBond BAC100 MACHEREY-NAGEL 740579
NuSieve GTG Agarose LONZA 50181
Objective lens Olympus XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens ZEISS Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter HIOKI 3664
Optical sensor HIOKI 9742-10
Phenol red solution 0.5% Merck P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase TAKARA R050A
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Six-well dish FALCON 353046
Spectrometer probe BLUE-Wave StellerNet Inc. VIS-50
Syringe needle TERUMO NN-2725R
TaKaRa Ex Taq TAKARA RR001A
Tricane Sigma-Aldrich A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16 BACPAC Genomics CH211-172N16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
  2. Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
  3. Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
  4. Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
  5. Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
  6. Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
  7. Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
  8. Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
  9. Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
  10. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
  11. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  12. Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
  13. Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
  14. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
  15. Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
  16. Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
  17. Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
  18. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
  19. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  20. Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
  23. Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
  24. Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).

Tags

Neurovetenskap nummer 180 neurodegenerativ sjukdom ALS optoDroplet system Cryptochrome 2 TDP-43 zebrafisk spinal motor neuron, mnr2b BAC transgenes
Optogenetisk fasövergång av TDP-43 i spinalmotoriska nervceller av zebrafisk larver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. … More

Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (180), e62932, doi:10.3791/62932 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter