Summary
Här presenteras ett protokoll för den standardiserade metoden för beredning av gnagarevävnad efter ischemi-reperfusionsexperimentet och riktlinjer för att upprätta belysnings- och kamerainställningar för högupplöst bildförvärv. Denna metod är tillämplig på all experimentell smådjursorganfotografering.
Abstract
Makrofotografering är tillämplig för avbildning av olika vävnadsprover vid hög förstoring för att utföra kvalitativa och kvantitativa analyser. Vävnadsberedning och efterföljande bildtagning är steg som utförs omedelbart efter ischemi-reperfusionsexperimentet (IR) och måste utföras i tid och med lämplig försiktighet. För utvärdering av IR-inducerad skada i hjärtat och hjärnan beskriver detta papper 2,3,5-trifenyl-2H-tetrazoliumklorid (TTC) -baserad färgning följt av makrofotografering. Vetenskaplig makrofotografering kräver kontrollerad belysning och en lämplig bildinställning. Den standardiserade metoden säkerställer högkvalitativa, detaljerade digitala bilder även om en kombination av en billig uppdaterad digitalkamera och makrolins används. Korrekta tekniker och potentiella misstag i provberedning och bildförvärv diskuteras, och exempel på påverkan av korrekta och felaktiga inställningar på bildkvaliteten tillhandahålls. Specifika tips ges om hur man undviker vanliga misstag, såsom överlagring, felaktig provlagring och suboptimala ljusförhållanden. Detta dokument visar lämplig metod för skivning och färgning av råtthjärta och hjärnvävnad och ger riktlinjer för att upprätta belysnings- och kamerainställningar och fotograferingstekniker för högupplöst bildförvärv.
Introduction
I årtionden har fotografering och analys av hjärt- och hjärnvävnadsprover varit en viktig del av life science-experiment. Vetenskapliga och innovativa framsteg driver utvecklingen av dyra mikroskop som kan ersättas. Fotomikrografer erhålls i en välkontrollerad ljusmiljö enligt detaljerade instruktioner. Däremot utförs makrofotografering (vid 1: 2 eller högre förstoring) ofta i en okontrollerad ljusmiljö med hjälp av olämpliga bildinställningar. Ofta måste teknikerna för provberedning och kamerainställning optimeras väsentligt. Som ett resultat har makrofotografier av begränsad kvalitet publicerats i stor utsträckning i vetenskapliga tidskrifter. Otillräcklig bildupplösning och kontrast begränsar möjligheterna till exakt bildkvantifiering i IR-studier.
Experimentella förfaranden för hjärtinfarkt1,2 och hjärna3,4 infarkter har beskrivits i detalj. Syftet med denna studie är att ge en steg-för-steg-guide om hur man sätter upp ett system för fotografering och standardiserad analys av gnagares hjärt- och hjärnvävnadsprover efter infarktexperiment. Detta inkluderar vävnads skivning, färgning och makrofotografering av hjärt- och hjärnprover. Beredningen av vävnadsprover är en väsentlig del av experimentet, och de planimetriska bildanalysresultaten beror i hög grad på kvaliteten på de erhållna bilderna5.
Dessa metoder är särskilt användbara för att utföra mätningar och bildplanimetrisk analys i gnagarevävnader och kan vara av värde för allmän vetenskaplig makrofotografering. Dessutom tillåter bildernas höga kvalitet och konsistens att automatiserad analys av digitala fotografier utförs, vilket hjälper till att spara tid, undvika användarinmatning och minimera risken för fel eller partiskhet under bildanalys. Detta kommer att resultera i generering av robusta och tillförlitliga data och öka översättningen av prekliniska upptäckter till nya antiischemiska behandlingar på kliniker.
Protocol
De experimentella förfarandena utfördes i enlighet med Europeiska gemenskapens riktlinjer och lokala lagar och policyer (direktiv 2010/63/EU), och alla förfaranden godkändes av Food and Veterinary Service, Riga, Lettland.
1. Hjärtfärgning och skivning
OBS: Tekniker som beskrivs i detta protokoll kan användas efter både Langendorff-perfuserat isolerat råtta eller mushjärta6,7 och in vivo råtta hjärta IR-skadeanalyser8,9,10,11. För färgning efter en in vivo IR-skadeanalys antas att hjärtat är utskuret, monterat på en kanyl och kort perfuserat i Langendorff-perfusionsläget.
- Lossa hjärtkantylen från sprutan fylld med Krebs-Henseleit-lösningen och anslut den till en spruta fylld med en varm (37 ° C) lösning av 0,1% metylenblå i Krebs-Henseleit-lösningen. Använd en 5 ml spruta för råtthjärtan och en 1-2 ml spruta för mushjärtan.
OBS: Ett alternativ är att fylla den tryck- eller flödesstyrda (t.ex. Langendorff) apparaten med en blå färgämneslösning. Under lossnings- och monteringsproceduren är det viktigt att inte lämna några luftbubblor i kanylen och inte lossa suturen som används för kranskärlsreocklusion. - Vidare perfusera råtthjärtan med 4 ml av den metylenblå lösningen med en hastighet av ~ 4 ml / min och perfusera mushjärtan med 1 ml metylenblå lösning med en hastighet av ~ 0,5-1 ml / min.
OBS: Baserat på erfarenhet är båda teknikerna säkra och ger adekvat färgning; Att använda en tryckstyrd pump / hydrostatiskt trycksystem är dock ett mer tidskrävande men säkrare alternativ mot överunderhållning för nybörjare. - Koppla bort kanylen från sprutan och ta bort hjärtat från kanylen.
- Ta bort överskott av metylenblått genom att försiktigt rulla hjärtat på silkespapper. Lossa ligaturen runt kransartären genom att öppna de hemostatiska pincettarna och ta bort plastslangen från den kirurgiska suturen först efter avlägsnande av överskott av metylenblått.
OBS: I detta skede är det möjligt att placera mushjärtat i en liten plastpåse eller ett 5 ml centrifugmikrorör i frysen (-20 ° C) i upp till 5-10 min. Maximal frysningstid bör bestämmas experimentellt i varje laboratorium. Kortvarig frysning av ett mushjärta kan hjälpa en nybörjare att skära den i 1 mm tjocka skivor. Frysning av råtthjärtan rekommenderas inte. Överfrysning i mer än 10 minuter vid -20 °C måste undvikas. - Placera det färgade råtthjärtat i en matris av rostfritt stål (se materialförteckningen) för hjärtskiva (figur 1A). Skär sedan hjärtets ventriklar i 2 mm tjocka skivor (sikta på 6-7 skivor av ett vuxet råtthjärta). För mushjärtan, skär hjärtets ventriklar i 1,5 mm tjocka skivor (sikta på minst 4 skivor av ett vuxet mushjärta).
OBS: Skivmatriskompatibla rakblad måste användas. I allmänhet kan kompatibla rakblad med en kant (t.ex. tjocklek på upp till 0,01 tum (0,254 mm)) användas för skivning av råtthjärtan. Dubbelkantiga rakblad används vanligtvis för mushjärtan och är vanligtvis upp till 0,004 tum (0,1 mm) i tjocklek.
Figur 1: Matriser för råttans hjärta och hjärnsvätning. (A) Råtthjärta, (B) råtthjärna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Efter skärning, överför skivorna till ett 15 ml plaströr. Tillsätt 5 ml 1 % trifenyltetrazoliumklorid (TTC) upplöst i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i röret med hjärtskivorna och inkubera i 10 min i ett vattenbad vid 37 °C.
- Efter inkubation i TTC-lösning, tvätta hjärtskivorna minst 2-3 gånger med PBS och förbered dig för bildtagning.
2. Hjärnfärgning och skivning
- Efter det mellersta cerebrala artärocklusionsexperimentet3,12, ta bort hjärnan, inklusive hjärnstammen, från skallen och tvätta den i iskall PBS.
- Välj rätt storlek på hjärnans rostfria stålmatris (se materialförteckningen) beroende på djurens vikt (figur 1B). Placera hjärnan med sin ventrala sida uppåt i hjärnmatrisen.
OBS: När den sitter i matrisen måste hjärnans ventrala yta vara parallell med formens övre yta. - Använd blad, begränsa hjärnans främre och kaudala delar (2 blad från båda sidor).
OBS: Skivmatriskompatibla rakblad måste användas. I allmänhet kan ett kompatibelt, enkantigt rakblad (tjocklek på upp till 0,01 tum (0,254 mm)) användas för skivning av råtthjärn. - Sätt knivarna delvis (inte helt skära hjärnan) i kanalerna mellan det första och det sista bladet. När alla blad sätts in och ordnas parallellt, tryck ner alla blad med handflatan samtidigt för att skära hjärnan i 2 mm koronalskivor.
- Ta tag i bladen ordentligt längs sidorna med två fingrar och ta bort dem tillsammans med den skivade hjärnan från matrisen.
- Ordna hjärnskivorna en efter en i en bricka (70 ml, 72 x 72 mm). När du ordnar skivorna, se till att den främre ytan på varje skiva alltid är vänd uppåt.
- Häll varm (+37 °C) 1 % TTC-lösning i PBS på hjärnskivorna och ruva dem i 8 minuter vid 37 °C i mörker.
OBS: Hjärnskivorna måste vara helt nedsänkta i TTC-lösningen under inkubationen. - Efter inkubation i 1% TTC-lösning, överför hjärnskivorna till det blå plastfacket för att ta bilder. Ordna hjärnskivorna i sekventiell ordning från frontalen till den kaudala delen och använd en skalpell för att separera halvklotet i sagittalplanet.
OBS: Brickans yta ska vara tvättbar, matt och av en färg som kontrasterar hjärnskivor (dvs inte röd, vit eller blekrosa).
3. Makrofotografering
- Fotografera vävnadsskivorna omedelbart efter färgning.
OBS: Hjärtskivor kan förvaras i kall PBS (vid +4 ° C) eller formalinlösning i upp till 30 min. Hjärnskivor kan lagras i formalin under en längre period (1-2 veckor). - Ställ in valfri kamera med ett laddat batteri, minneskort och anslutet objektiv på ett stativ (Bild 2)
OBS: Tänd lamporna minst 5-10 minuter före bildtagning för att värma upp utrustningen. LED-lampor når full ljusstyrka på mikroseconds.
Bild 2: Kamera och lampor som är inställda för makrofotografering. Kameran är vinkelrät mot bildytan för att säkerställa att kamerans fokalplan är parallellt med proverna. Förkortning: LED = ljusdiod. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Beroende på tillgängliga ljuskällor väljer du lämpliga vitbalansinställningar eller utför färgtemperaturkalibrering enligt instruktionerna i kamerahandboken.
OBS: Vitt LED-ljus (färgtemperatur 6,500 K) är den föredragna ljuskällan för att undvika att ljuset flimrar av lysrör. - Växla kameran till helt manuellt läge, ställ in ISO 100 och bländare på f/10 och justera slutartiden för optimal bildexponering. Se till att kamerans fokalplan är parallellt med ytan där provet ska placeras.
OBS: Histogramfunktionen är användbar för att säkerställa att vävnadsskivor inte överexponeras. - Anslut eller aktivera en trådbunden eller trådlös fjärrutlösare för att förhindra kameraskakningar när slutaren utlöses.
OBS: Ett alternativ är att aktivera en fördröjd slutarfunktion, som fördröjer avtryckaren i 2 eller 10 s efter att ha tryckt på avtryckarknappen. - Sänk ner hjärtskivorna helt i en behållare med PBS.
OBS: Nedsänkta bilder tenderar att flyta bort från sin position. För att minimera flytningen av skivorna, använd minsta möjliga bricka i vilken alla skivor kan passa och den minimala mängden nedsänkningslösning, så att provet är helt nedsänkt. Alternativa metoder inkluderar att placera skivorna mellan glasskivor eller använda ett polariserande filter på linsen. Ett cirkulärt polariserande filter fästs på linsen och roteras tills reflektioner i en live-view-visning av kameran försvinner. - Ordna hjärnskivorna i en torr bricka utan PBS eller andra vätskor.
OBS: Ett polariserande filter är mycket bekvämt för att fånga bilder av hjärnskivor. - Placera behållaren med skivor under kameran med makrolinsen och se till att alla skivor passar helt i synfältet. Se till att skivorna är på samma plan, dvs inte böjda eller rullade.
- Kontrollera exponeringen och justera kamerainställningarna om det behövs.
OBS: När du är inställd, ändra inte exponeringen och andra inställningar under hela experimentet. - Fånga numret (eller annan identifiering) av provet och avbilda vävnadsskivan med hjälp av en fjärrutlösare.
OBS: En storleksmarkör, t.ex. en mm linjal, bör inkluderas i synfältet när absolut kvantifiering av provstorleken är nödvändig. - Rotera skivorna och ta deras bilder från andra sidan.
Representative Results
Figur 3A är ett fotografi av en metylenblå- och TTC-färgad hjärtskiva efter hjärtinfarkt, som innehåller tillräckligt med detaljer och färginformation för ytterligare planimetrisk analys av infarktstorlek (Figur 3B). Vi testade hur frysning av hjärtat i 24 timmar påverkar hjärtvävnadernas integritet (Figur 3C). Frysning under en längre period (>1 h, figur 3C) minskar mitokondriell funktion; Således är TTC-färgning av hjärtat inte röd utan blekrosa, och gränsen mellan nekrotiska och livskraftiga vävnader är suddig (Figur 3C).
Vidare jämfördes två metoder för reduktion av reflektioner i proverna. Nedsänkning är den mest effektiva metoden och ger detaljerade bilder med god kontrast (figur 4A). Den andra metoden är användningen av ett polariserande filter fäst vid linsen. Det polariserande filtret är också effektivt; Filtret minskar dock bildens upplösning och mikrokontrast något (figur 4B). En exempelbild av en hjärtskiva utan nedsänkning eller filter (figur 4C) innehåller många reflektioner och är inte lämplig för vidare analys.
Hjärnskivor är inte nedsänkta på grund av problem med skivhantering (flytande). I den planimetriska analysen är det viktigt att jämföra den opåverkade (friska) sidan av hjärnan (figur 5A) med den strokedrabbade sidan (figur 5B). Hjärnskivor är lättare att hantera på en torr platta eller bricka, och ett polariserande filter används för att ta bort reflektioner. En bricka med blå bakgrund används för fotografering av hjärnskivor (bakgrundsval som beskrivits tidigare5).
Manuella kamerainställningar användes för att säkerställa full kontroll över exponering och vitbalans. Kamerainställningarna bör justeras före eller i början av experimentet enligt den tillgängliga ljuskällan. Detta säkerställer optimal exponering och vitbalans för alla bilder för att möjliggöra enhetlig analys (figur 6A). Kamerans automatiska inställningar är inte perfekta och kan resultera i varierande kameraparametrar, vilket orsakar olämpliga resultat och införandet av bild-till-bild-variation.
Figur 6 visar exempel på överexponerade (figur 6B) och underexponerade bilder (figur 6C) av hjärtskivor. Tillräcklig uppmärksamhet bör ägnas åt kamerans korrekta vitbalansinställningar för att matcha en viss ljuskälla som används i kamerans ljusinställning. Felaktiga vitbalansinställningar kan leda till en övergång till blått eller gult (figur 6D) och magenta eller grönt (figur 6E) som kastas i bilden.
Figur 3: Bilder av råtta hjärtskivor. (A) Färsk hjärtskiva analyserades i ImageProPlus 6.3-programvara med hjälp av färgsegmentering (B). (C) TTC-färgning diskriminerar dåligt mellan livskraftig och nekrotisk vävnad i den frysta hjärtskivan (fryst i 24 timmar). Förkortning: TTC = 2,3,5-trifenyl-2H-tetrazoliumklorid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Tekniker för minskning av reflektioner. Råtthjärta skiva bild fångad nedsänkt i PBS (A) och med polariserande filter (B). (C) Hjärtskiva med reflektioner när varken nedsänkning eller filter används. Förkortning = PBS = fosfatbuffrad saltlösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Bilder av råtthjärnskivor. Råtthjärnan skars i sju skivor och färgades med TTC efter ischemi-reperfusion. Användning av polariserande filter resulterar i förvärv av reflektionsfri bild. (A) Skivor från det oskadade halvklotet ; (B) Skivor från den strokedrabbade halvklotet. Förkortning: TTC = 2,3,5-trifenyl-2H-tetrazoliumklorid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Råtthjärta skär bilder. Korrekt (A) och felaktigt (B-E) fångade hjärtskiva bilder. Felaktiga exponeringsinställningar resulterar i överexponerade (B) och underexponerade bilder (C). Felaktiga vitbalansinställningar resulterar i gul (D) eller grön gjutning i bilden (E). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Beredning av hjärtat efter IR börjar med reocclusion av blodhjärtartärer och perfusion av blått färgämne för diskriminering av riskområden från icke-riskområden. Metylenblå eller Evans blå färgämnen används oftast för detta ändamål2. Eftersom ett alltför högt tryck kan skada hjärtklaffarna och därmed delvis eller helt fläcka riskområden, är det bättre att perfusera hjärtat med ett tryckstyrt system, såsom Langendorff-apparaten eller en förenklad version av en hydrostatisk trycksystemutrustad spruta eller pump. Kontrollerad perfusion kommer att säkerställa fysiologiskt tryck, och färgämnet kommer vanligtvis inte in i hjärtats ockluderade region. Både flödeshastighets- och tryckstyrda tekniker är skydd mot överhållande.
Ett av de allvarligaste misstagen i livskraftig vävnadsbehandling är att hålla vävnader i en frys under en längre tid före färgning. Frysning används främst för att forskare vill utföra hjärtfärgning dagen efter IR-experimentet eller senare. Dessutom används frysning för att göra skärningen av hjärtat enklare. Vi fann att kortvarig frysning av hjärtat i upp till 5-10 minuter försumbart påverkar hjärtvävnadernas integritet och underlättar skärning av vävnaderna (särskilt för mushjärtan) i tunna skivor. Frysning under längre perioder skadar dock membranen och minskar cellviabiliteten och mitokondriell funktion13. Som ett resultat påverkas TTC-färgning av fungerande mitokondrier, och gränsen mellan nekrotiska och livskraftiga vävnader är dåligt avgränsad (suddig). Sammantaget bör frysning av råtthartar undvikas, och endast kortvarig frysning av mushjärtan kan användas för enklare skärning.
Nästa steg är vävnadsfärgning i 1% TTC-lösning vid 37 °C14. Färgningslösningen bör förvärras - särskilt viktigt för färgning av hjärnskivor. Vid användning av den förvärmde lösningen är den optimala färgningstiden för hjärtskivor 10 min. En längre inkubation eller en temperatur högre än 37 ° C resulterar i brunfärgning av hjärtvävnaderna. Korrekt färgning av prover och konsekvent röd färgintensitet är viktiga för vidare bildanalys. I de sista stegen före fotografering sköljs vävnadsskivorna 2-3 gånger med kall PBS eller en liknande buffert för att avlägsna TTC och överskott av metylenblått från lösningen för att undvika blå gjutning på fotografiet. Hjärtskivor bör fotograferas strax efter färgning för att få bästa bildkvalitet. Hjärtfärgning förblir av god kvalitet om den förvaras i upp till 60 minuter i den kalla (+4 ° C) PBS. Färgade hjärnskivor och aortavävnader lagras vanligtvis i en 4% neutral formaldehydlösning och behåller god kvalitet i en vecka. Nattlig lagring av hjärnvävnader i formalin (+4 °C) försämrar inte färgintensiteten hos normal vävnad och är godtagbar för bildförvärv. Formalin inducerar emellertid svullnad och kvarhållande av hjärtskivor. Därför rekommenderas inte lagring av hjärtvävnader i formalin.
Nästa steg är bildförvärv. Många laboratorier använder flatbäddsskannrar som ett bildinsamlingsverktyg som förväntas ersätta en digitalkamera och belysningsinställning. Vi bestämde oss för att skanning av skivor inte ger tillräcklig bildupplösning och färgseparation och därför inte är lämplig för avbildning av hjärtskivor. I synnerhet är skannerupplösningen otillräcklig för mushjärtan, och vi märkte dålig återgivning av metylenblått. Däremot kan en skanner vara ett alternativ till en fotokamera för avbildning av hjärnskivor färgade endast med TTC eller andra enskilda färgämnen. För skanning av vävnadsskivor är skanningsprogramvara som säkerställer konstanta exponeringsinställningar avgörande. Sammantaget är en flatbäddsskanner mindre kapabel och kan inte ersätta en digitalkamera för de flesta bildapplikationer.
Bakgrunden bakom exemplar är också viktig. Helst bör brickans botten vara av en färg som inte finns i det färgade provet. Till exempel, för att kvantifiera området för metylenblå och TTC (röd) färgning på ett automatiserat eller halvautomatiskt sätt, bör vita, röda, blå, gula och bruna bakgrunder undvikas. Således skulle en grön bakgrund vara att föredra. Ändå beror färgvalet på operatörens preferenser, som efterbehandlar bilden. Många forskare föredrar en vit bakgrund eftersom en vit bakgrund kan raderas i bildbehandling och konverteras till helt vit (RGB vit kod 255,255,255). Då bör man utesluta helt vitt från listan över valda färger som används för halvautomatisk analys och bara räkna bleka nekrotiska områden, som inte är helt vita om de inte är överexponerade. Blå och gröna bakgrunder är lämpliga för fotografering av hjärnskivor och aortor.
Det optimala bildverktyget för vävnadsfotografering är en enlinsreflex eller spegelfri digitalkamera med utbytbart objektiv med en kompatibel makrolins. Att fånga mycket små objekt kan kräva en kombination av en kamera och ett mikroskop; Ändå har en makrolins vanligtvis tillräcklig (minst 1: 2) förstoring för att få detaljerade bilder av ett mushjärta. Många tillverkare erbjuder prisvärda digitalkameror och makrolinser för att få högupplösta och högupplösta fotografier. Alla uppdaterade digitalkameror har egenskaper och funktioner som är nödvändiga för makrofotografering, inklusive möjligheten att montera på ett stativ, ett stort antal pixlar (vanligtvis >20 Mpx), livevisning, spegellåsning, time-lapse-funktioner, fjärrslutare och möjligheten att manuellt ställa in kameraparametrar, vilket säkerställer en konstant slutartid, bländare, vitbalans och ISO-inställning. Kompaktkameror med ovan nämnda funktioner och objektivförstoring på minst 1:2 kan också användas för makrofotografering. På grund av linsens egenskaper bör vissa kompaktkameror placeras i närheten av objektet, och experimenteraren måste se till att kamerahuset inte påverkar provets belysning.
För makrofotografering med alla typer av utbytbara objektivkameror krävs en makrolins med hög förstoring (1:1-1:2). Vi föreslår att du använder makroobjektiv med en brännvidd från 50 mm till 100 (120) mm eller motsvarande på fullformatssensorn (24 mm x 36 mm). Mindre sensorkameror har olika sensorstorlekar, och förstoringen bör räknas om i enlighet därefter. För fotografering av hjärtskivor är ett ergonomiskt avstånd mellan 100 mm makrolinsens främre element till motivet cirka 150 mm. Med den här inställningen kan operatörerna ha all utrustning på ett bord, med enkel åtkomst till kamerakontrollerna. En 50 mm makrolins kan övervägas för fotografering av större objekt, såsom hjärnskivor, eftersom ett bredare synfält är nödvändigt för att få alla skivor i ett enda fotografi.
För att få skarpa bilder med hög upplösning bör en kamera monteras på ett robust stativ, som tillsammans med en ljusinställning kallas ett fotokopieringsstativ. Att montera kameran på ett stativ och en fjärrkontroll (trådbunden eller trådlös) utlösare eliminerar kameraskakningar och säkerställer ett konstant avstånd från målet. En kamerabelysningsinställning med två konstanta ljuskällor från båda sidor, vinklade cirka 30-60 ° i förhållande till motivplanet, säkerställer tillräcklig belysning av prover och hjälper till att undvika reflektioner samtidigt. Kameran ska monteras exakt så att sensorn är parallell med motivplanet. För att jämnt belysa bildfältet bör båda lamporna vara lika orienterade och placerade på samma avstånd från motivet. Ljuskällor placerade på olika avstånd från motivet orsakar ojämn belysning. Dessutom är blinkande ljuskällor en orsak till variationer i bildexponering. Sammantaget är det viktigt att placera kameran och ljuskällorna exakt för att exakt få bilder av väl upplysta exemplar.
Vävnadsprover reflekterar ljus (glisten), som visas som vita fläckar i bilderna. Dessa ljusreflektionsfläckar innehåller inte användbar färginformation, och följaktligen kan dessa delar av bilderna inte användas för noggrann kvantitativ analys av bilder. Ljusreflektioner från vävnadsskivor kan avlägsnas med olika metoder. Den mest effektiva är fullständig nedsänkning av vävnadsprover i en behållare med en saltlösning eller PBS-lösning. Ett liknande tillvägagångssätt är införandet av vävnadsskivor under (eller mellan) glasplattor. Denna metod är effektiv mot reflektioner; Bildupplösningen kan dock vara lägre än för fotografier av nedsänkta vävnader.
Man kan också använda ett polariserande filter monterat på en lins för att eliminera ljusreflektioner. Cirkulära polariserande filter är allmänt tillgängliga men varierar avsevärt i kvalitet beroende på pris, och billiga filter kan avsevärt minska bildupplösningen. Reflekterat ljus kan filtreras bort genom att vrida den rörliga delen av polariseringsfiltret i en vinkel. Effekten av polariseringsfiltret kan påverkas av vissa ljuskällor (t.ex. starkt LED-ljus). Sammantaget, efter avlägsnande av extra vätska, kan ett polariserande filter eliminera alla reflektioner från hjärnskivorna; Provnedsänkning i buffertlösning är dock det enklaste och mest kostnadseffektiva tillvägagångssättet för hjärtskivor.
Manuella inställningar för slutartid, bländare, ISO och vitbalans är viktiga för att behålla full kontroll över bildprocessen. Ljuskällans prov, bakgrund och egenskaper påverkar kamerans exponeringsmätningssystem i automatiska inställningar. Därför är manuella inställningar nödvändiga för att upprätthålla konstant exponering och vitbalans mellan flera fotografier under experimentet. För makrofotografering är den föreslagna bländarinställningen mellan f/8 och f/16. Genom att minska bländaren ökar skärpedjupet, vilket är till hjälp om objektet inte består av ett enda plan. Diffraktion begränsar dock den totala upplösningen av fotografering vid mindre bländare. Den optimala bländaren för de flesta objektiv är vanligtvis f/10 eftersom upplösningsfallet i denna inställning är försumbart och skärpedjupet är tillräckligt. ISO-värden som sträcker sig från 50 till 400 (lägre är bättre) är vanligtvis optimala för att minimera bildartefakter (brus). Slutartiden återstår sedan att ändra för att få korrekt exponering med hjälp av de nämnda bländar- och ISO-inställningarna under befintliga ljusförhållanden. Manuella inställningar är viktiga för konsekvent bildanalys. Standardiserad avbildning säkerställer användningen av samma färgtröskelinställningar i alla studier, vilket kräver segmenteringsanalys. Till exempel kan halvautomatisk analys av ImagePro-programvara baserad på en segmenteringsfil med fördefinierade färger av blått, rött och vitt (+ blekrosa) användas genom åren om provbilder har konsekventa färger, vitbalans och exponering.
Vitbalansinställningen bör justeras beroende på färgtemperaturen för ljuskällan som används för att belysa ett prov. Vitbalans kan väljas från kamerans inbyggda förinställningar eller med manuell kalibrering av ett grått mål. Fördelen med bildtagning i RAW-format är att vitbalansen kan justeras under efterbehandling av bilden. Eftersom RAW-filer innehåller mycket mer information än JPEG-filer, ger RAW-fil efterbehandling ett utmärkt tillfälle för korrigering av färgbalans och exponering, samt för att få bättre bildupplösning. Eftersom de flesta kameror kan fånga JPEG- och RAW-filer samtidigt föreslår vi att du tar RAW-filen och sparar den som en säkerhetskopia.
Sammantaget beskriver detta protokoll en metod för skivning och färgning av råtthjärta och hjärnvävnad och ger riktlinjer för att fastställa belysnings- och kamerainställningar och fotograferingstekniker för högupplöst bildförvärv för vidare analys. Denna metod är tillämplig på all experimentell smådjursorganfotografering.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna fick stöd av EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 enligt bidragsavtal nr 857394, Projekt FAT4BRAIN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 50 mL syringe | Terumo | N/A | |
| Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
| Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
| Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
| Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
| Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
| Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
| Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
| Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
| Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
| Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
| Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
| Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
| Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
| Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
| Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
| Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
| Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
| Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
| Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
| Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
| Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
| Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
| Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
| Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
| Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Research in Cardiology. 113 (5), 39 (2018).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e1978 (2011).
- Zvejniece, L., Svalbe, B., Liepinsh, E., Pulks, E., Dambrova, M. The sensorimotor and cognitive deficits in rats following 90- and 120-min transient occlusion of the middle cerebral artery. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 197-204 (2012).
- Liepinsh, E., Kuka, J., Dambrova, M. Troubleshooting digital macro photography for image acquisition and the analysis of biological samples. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 98-106 (2013).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52908 (2015).
- Liepinsh, E., et al. Inhibition of L-carnitine biosynthesis and transport by methyl-gamma-butyrobetaine decreases fatty acid oxidation and protects against myocardial infarction. British Journal of Pharmacology. 172 (5), 1319-1332 (2015).
- Nakamura, K., Al-Ruzzeh, S., Ilsley, C., Yacoub, M. H., Amrani, M. Acute effect of cerivastatin on cardiac regional ischemia in a rat model mimicking off-pump coronary surgery. Journal of Cardiac Surgery. 20 (6), 507-511 (2005).
- Li, Q., Morrison, M. S., Lim, H. W. Using a cardiac anchor to refine myocardial infarction surgery in the rat. Lab Animal. 39 (10), 313-317 (2010).
- Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K.
- Vavers, E., et al. The neuroprotective effects of R-phenibut after focal cerebral ischemia. Pharmacological Research. 113, Pt B 796-801 (2016).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Kloner, R. A., Darsee, J. R., DeBoer, L. W., Carlson, N. Early pathologic detection of acute myocardial infarction. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 105 (8), 403-406 (1981).
