Summary
يظهر هنا بروتوكول للمنهجية الموحدة لإعداد أنسجة القوارض بعد تجربة نقص التروية والمبادئ التوجيهية لإنشاء إعدادات الإضاءة والكاميرا للحصول على صور عالية الدقة. تنطبق هذه الطريقة على جميع الصور التجريبية للأعضاء الحيوانية الصغيرة.
Abstract
التصوير الفوتوغرافي الماكرو قابل للتطبيق لتصوير عينات الأنسجة المختلفة عند التكبير العالي لإجراء تحليلات نوعية وكمية. يعد إعداد الأنسجة والتقاط الصور لاحقا خطوات يتم تنفيذها مباشرة بعد تجربة نقص التروية (IR) ويجب إجراؤها في الوقت المناسب وبعناية مناسبة. لتقييم الضرر الناجم عن الأشعة تحت الحمراء في القلب والدماغ ، تصف هذه الورقة التلطيخ القائم على كلوريد 2،3،5-ثلاثي فينيل - 2H-tetrazolium (TTC) يليه التصوير الماكرو. يتطلب تصوير الماكرو العلمي إضاءة يتم التحكم فيها وإعداد تصوير مناسب. تضمن المنهجية الموحدة صورا رقمية عالية الجودة ومفصلة حتى في حالة استخدام مزيج من كاميرا رقمية حديثة وغير مكلفة وعدسة ماكرو. تتم مناقشة التقنيات المناسبة والأخطاء المحتملة في إعداد العينات والحصول على الصور ، ويتم توفير أمثلة على تأثير الإعدادات الصحيحة وغير الصحيحة على جودة الصورة. يتم تقديم نصائح محددة حول كيفية تجنب الأخطاء الشائعة ، مثل التلطيخ الزائد ، وتخزين العينات غير السليم ، وظروف الإضاءة دون المستوى الأمثل. توضح هذه الورقة المنهجية المناسبة لتقطيع وتلطيخ قلب الفئران وأنسجة المخ وتوفر إرشادات لإنشاء إعدادات الإضاءة والكاميرا وتقنيات التصوير الفوتوغرافي للحصول على صور عالية الدقة.
Introduction
على مدى عقود، كان التصوير الفوتوغرافي وتحليل عينات القلب وأنسجة المخ جزءا مهما من تجارب علوم الحياة. يدفع تقدم العلم والابتكار إلى تطوير مجاهر باهظة الثمن قادرة على الدقة الفائقة. يتم الحصول على الصور الميكروغرافية في بيئة ضوئية يتم التحكم فيها جيدا باتباع تعليمات مفصلة. في المقابل، غالبا ما يتم إجراء تصوير الماكرو (عند تكبير 1:2 أو أكبر) في بيئة ضوئية غير منضبطة باستخدام إعدادات تصوير غير مناسبة. في كثير من الأحيان ، تحتاج تقنيات إعداد العينات وإعداد الكاميرا إلى تحسين كبير. ونتيجة لذلك ، تم نشر صور الماكرو ذات الجودة المحدودة على نطاق واسع في المجلات العلمية. تحد دقة الصورة والتباين غير الكافيين من إمكانيات التحديد الكمي الدقيق للصورة في دراسات الأشعة تحت الحمراء.
تم وصف الإجراءات التجريبية لاحتشاء عضلة القلب1,2 والدماغ3,4 بالتفصيل. الغرض من هذه الدراسة هو توفير دليل خطوة بخطوة حول كيفية إعداد نظام للتصوير الفوتوغرافي والتحليل الموحد لعينات قلب القوارض وأنسجة المخ بعد تجارب الاحتشاء. ويشمل ذلك تقطيع الأنسجة وتلطيخ وتصوير الماكرو لعينات القلب والدماغ. يعد إعداد عينات الأنسجة جزءا أساسيا من التجربة، وتعتمد نتائج تحليل الصور المستوية بشكل كبير على جودة الصور التي تم الحصول عليها5.
هذه الطرق مفيدة بشكل خاص لإجراء القياسات وتحليل الصور المخططة في أنسجة القوارض ويمكن أن تكون ذات قيمة للتصوير الكلي العلمي العام. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح الجودة العالية والاتساق للصور بإجراء تحليل آلي للصور الرقمية ، مما يساعد على توفير الوقت وتجنب إدخال المستخدم وتقليل مخاطر الأخطاء أو التحيز أثناء تحليل الصور. سيؤدي ذلك إلى توليد بيانات قوية وموثوقة وزيادة ترجمة الاكتشافات قبل السريرية إلى علاجات جديدة مضادة للنقص الكيميائي في العيادات.
Protocol
تم تنفيذ الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجماعة الأوروبية والقوانين والسياسات المحلية (التوجيه 2010/63/EU) ، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل دائرة الأغذية والطب البيطري ، ريغا ، لاتفيا.
1. تلطيخ القلب وتقطيع
ملاحظة: يمكن استخدام التقنيات الموصوفة في هذا البروتوكول بعد كل من لانغندورف المعزول لقلب الفئران أو الفئران6,7 وفي الجسم الحي لفحص إصابات الأشعة تحت الحمراء لقلب الفئران8,9,10,11. للتلطيخ بعد فحص إصابة الأشعة تحت الحمراء في الجسم الحي ، من المفترض أن يتم استئصال القلب ، وتثبيته على قنية ، وتثبيته لفترة وجيزة في وضع تروية Langendorff.
- افصل قنية القلب عن المحقنة المملوءة بمحلول Krebs-Henseleit وقم بتوصيلها بحقنة مملوءة بمحلول دافئ (37 درجة مئوية) من 0.1٪ من الميثيلين الأزرق في محلول Krebs-Henseleit. استخدم حقنة 5 مل لقلوب الفئران ومحقنة 1-2 مل لقلوب الفئران.
ملاحظة: البديل هو ملء الجهاز الذي يتم التحكم فيه بالضغط أو التدفق (على سبيل المثال ، Langendorff) بمحلول يحتوي على صبغة زرقاء. أثناء إجراء الانفصال والتركيب ، من الضروري عدم ترك أي فقاعات هواء في القنية وعدم تخفيف الخيط المستخدم لإعادة انسداد الشريان التاجي. - مزيد من perfuse قلوب الفئران مع 4 مل من محلول الميثيلين الأزرق بمعدل ~ 4 مل / دقيقة و perfuse قلوب الفئران مع 1 مل من محلول الميثيلين الأزرق بمعدل ~ 0.5-1 مل / دقيقة.
ملاحظة: استنادا إلى الخبرة ، فإن كلتا التقنيتين آمنتان وتوفران تلطيخا كافيا. ومع ذلك ، فإن استخدام مضخة يتم التحكم فيها بالضغط / نظام ضغط هيدروستاتيكي هو خيار أكثر استهلاكا للوقت ولكنه أكثر أمانا ضد الإفراط في التلطيخ للعلماء المبتدئين. - افصل القنية عن المحقنة وأزل القلب من الكانيولا.
- إزالة الميثيلين الأزرق الزائد عن طريق اللف لطيف للقلب على المناديل الورقية. قم بفك الرباط حول الشريان التاجي عن طريق فتح ملقط مرقئ وإزالة الأنابيب البلاستيكية من الخيط الجراحي فقط بعد إزالة أزرق الميثيلين الزائد.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، من الممكن وضع قلب الماوس في كيس بلاستيكي صغير أو أنبوب دقيق لجهاز طرد مركزي سعة 5 مل في الفريزر (-20 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 5-10 دقائق. يجب تحديد الحد الأقصى لوقت التجميد تجريبيا في كل مختبر. يمكن أن يساعد تجميد قلب الفأر على المدى القصير المجرب المبتدئ على تقطيعه إلى شرائح بسماكة 1 مم. لا ينصح بتجميد قلوب الفئران. يجب تجنب التجمد الزائد لأكثر من 10 دقائق عند -20 درجة مئوية. - ضع قلب الفئران الملون في مصفوفة من الفولاذ المقاوم للصدأ (انظر جدول المواد) لتقطيع القلب (الشكل 1A). ثم ، قطع البطينين من القلب إلى شرائح بسماكة 2 مم (تهدف إلى 6-7 شرائح من قلب الفئران البالغة). بالنسبة لقلوب الفئران، قم بقطع بطينات القلب إلى شرائح بسماكة 1.5 مم (استهدف 4 شرائح على الأقل من قلب فأر بالغ).
ملاحظة: يجب استخدام شفرات الحلاقة المتوافقة مع مصفوفة التقطيع. بشكل عام ، يمكن استخدام شفرات الحلاقة أحادية الحافة المتوافقة (على سبيل المثال ، سمك يصل إلى 0.01 بوصة (0.254 مم)) لتقطيع قلوب الفئران. تستخدم شفرات الحلاقة ذات الحدين بشكل عام لقلوب الفئران وعادة ما يصل سمكها إلى 0.004 بوصة (0.1 مم).
الشكل 1: مصفوفات لقلب الفئران وتقطيع الدماغ . (أ) قلب الفئران، (ب) دماغ الفئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- بعد القطع ، انقل الشرائح إلى أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل. أضف 5 مل من كلوريد ثلاثي فينيل تترازوليوم (TTC) المذاب في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى الأنبوب مع شرائح القلب ، واحتضنه لمدة 10 دقائق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
- بعد الحضانة في محلول TTC ، اغسل شرائح القلب على الأقل 2-3 مرات باستخدام PBS واستعد لالتقاط الصور.
2. تلطيخ الدماغ وتقطيع
- بعد تجربة انسداد الشريان الدماغي الأوسط3,12 ، قم بإزالة الدماغ ، بما في ذلك جذع الدماغ ، من الجمجمة ، واغسله في PBS البارد الجليدي.
- اختر الحجم الصحيح لمصفوفة الفولاذ المقاوم للصدأ في الدماغ (انظر جدول المواد) اعتمادا على وزن الحيوانات (الشكل 1B). ضع الدماغ مع جانبه البطني لأعلى في مصفوفة الدماغ.
ملاحظة: عند الجلوس في المصفوفة، يجب أن يكون السطح البطني للدماغ موازيا للسطح العلوي للقالب. - باستخدام الشفرات ، قم بتقييد الأجزاء الأمامية والذيلية (2 شفرات من كلا الجانبين) من الدماغ.
ملاحظة: يجب استخدام شفرات الحلاقة المتوافقة مع مصفوفة التقطيع. بشكل عام ، يمكن استخدام شفرة حلاقة متوافقة أحادية الحافة (بسماكة تصل إلى 0.01 بوصة (0.254 مم)) لتقطيع دماغ الفئران. - ضع الشفرات جزئيا (وليس قطع الدماغ بالكامل) في القنوات بين الشفرات الأولى والأخيرة. عندما يتم إدخال جميع الشفرات وترتيبها بالتوازي ، اضغط على جميع الشفرات لأسفل براحة اليد في نفس الوقت لقطع الدماغ إلى شرائح إكليلية 2 مم.
- أمسك الشفرات بإحكام على طول الجانبين بإصبعين وقم بإزالتها مع الدماغ المقطع من المصفوفة.
- رتب شرائح الدماغ واحدة تلو الأخرى في صينية (70 مل ، 72 × 72 مم). عند ترتيب الشرائح، تأكد من أن السطح الأمامي لكل شريحة متجه دائما لأعلى.
- صب محلول TTC الدافئ (+37 درجة مئوية) بنسبة 1٪ في PBS على شرائح الدماغ ، واحتضنها لمدة 8 دقائق عند 37 درجة مئوية في الظلام.
ملاحظة: يجب غمر شرائح الدماغ بالكامل في محلول TTC أثناء الحضانة. - بعد الحضانة في محلول TTC بنسبة 1٪ ، انقل شرائح الدماغ إلى الدرج البلاستيكي الأزرق لالتقاط الصور. رتب شرائح الدماغ بترتيب متسلسل من الجزء الأمامي إلى الجزء الذيلي ، واستخدم مشرطا لفصل نصفي الكرة الأرضية في المستوى السهمي.
ملاحظة: يجب أن يكون سطح الدرج قابلا للغسل وغير لامع وبلون يتناقض مع شرائح الدماغ (أي ليس أحمر أو أبيض أو وردي شاحب).
3. تصوير الماكرو
- قم بتصوير شرائح الأنسجة مباشرة بعد التلطيخ.
ملاحظة: يمكن تخزين شرائح القلب في PBS الباردة (عند +4 درجة مئوية) أو محلول الفورمالين لمدة تصل إلى 30 دقيقة. يمكن تخزين شرائح الدماغ في الفورمالين لفترة طويلة (1-2 أسابيع). - قم بإعداد الكاميرا التي تختارها باستخدام بطارية مشحونة وبطاقة ذاكرة وعدسة متصلة على حامل (الشكل 2)
ملاحظة: قم بتشغيل الأضواء قبل 5-10 دقائق على الأقل من الحصول على الصورة لتسخين الجهاز. تصل مصابيح LED إلى السطوع الكامل في ميكروثانية.
الشكل 2: الكاميرا والأضواء المعدة لتصوير الماكرو. الكاميرا عمودية على سطح التصوير للتأكد من أن المستوى البؤري للكاميرا مواز للعينات. اختصار: LED = الصمام الثنائي الباعث للضوء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- استنادا إلى مصادر الإضاءة المتاحة، حدد إعدادات توازن اللون الأبيض المناسبة أو قم بإجراء معايرة درجة حرارة اللون وفقا للإرشادات الواردة في دليل الكاميرا.
ملاحظة: ضوء LED الأبيض (درجة حرارة اللون 6500 كلفن) هو مصدر الضوء المفضل لتجنب وميض الضوء بواسطة مصابيح الفلورسنت. - قم بتبديل الكاميرا إلى الوضع اليدوي بالكامل، واضبط ISO 100 وفتحة العدسة على f/10، واضبط سرعة الغالق للحصول على أفضل تعرض للصورة. تأكد من أن المستوى البؤري للكاميرا مواز للسطح الذي سيتم وضع العينة فيه.
ملاحظة: وظيفة الرسم البياني مفيدة لضمان عدم تعرض شرائح الأنسجة بشكل مفرط. - قم بتوصيل مشغل سلكي أو لاسلكي عن بعد أو تمكينه لمنع اهتزاز الكاميرا عند تحرير الغالق.
ملاحظة: البديل هو تمكين وظيفة الغالق المتأخرة، والتي ستؤخر المشغل لمدة 2 أو 10 ثوان بعد الضغط على زر الزناد. - اغمر شرائح القلب بالكامل في وعاء مع PBS.
ملاحظة: تميل الشرائح المغمورة إلى الطفو بعيدا عن موضعها. لتقليل تعويم الشرائح إلى الحد الأدنى، استخدم أصغر درج ممكن يمكن أن تتناسب معه جميع الشرائح والحد الأدنى من محلول الغمر، مما يضمن غمر العينة بالكامل. تتضمن الطرق البديلة وضع الشرائح بين الشرائح الزجاجية أو استخدام مرشح استقطاب على العدسة. يتم توصيل مرشح استقطاب دائري بالعدسة ويتم تدويره حتى تختفي الانعكاسات في شاشة عرض مباشر للكاميرا. - رتب شرائح الدماغ في صينية جافة بدون PBS أو سوائل أخرى.
ملاحظة: مرشح الاستقطاب مناسب جدا لالتقاط صور لشرائح الدماغ. - ضع الحاوية مع شرائح أسفل الكاميرا باستخدام عدسة الماكرو وتأكد من أن جميع الشرائح مناسبة تماما في مجال الرؤية. تأكد من أن الشرائح على نفس المستوى ، أي ليست منحنية أو ملفوفة.
- تحقق من التعريض الضوئي واضبط إعدادات الكاميرا إذا لزم الأمر.
ملاحظة: بمجرد التعيين، لا تقم بتغيير التعريض الضوئي والإعدادات الأخرى أثناء التجربة بأكملها. - التقط رقم العينة (أو أي تعريف آخر) وصور شريحة الأنسجة باستخدام مشغل عن بعد.
ملاحظة: ينبغي إدراج علامة حجم، مثل مسطرة مم، في مجال الرؤية عندما يكون من الضروري تحديد حجم العينة كميا مطلقا. - قم بتدوير الشرائح والتقاط صورها من الجانب الآخر.
Representative Results
الشكل 3A هو صورة فوتوغرافية لشريحة قلب ملطخة بأزرق الميثيلين و TTC بعد احتشاء عضلة القلب ، والتي تحتوي على تفاصيل ومعلومات ملونة كافية لمزيد من التحليل الخطوي لحجم الاحتشاء (الشكل 3B). اختبرنا كيف يؤثر تجميد القلب لمدة 24 ساعة على سلامة أنسجة القلب (الشكل 3C). التجميد لفترة طويلة (>1 ساعة ، الشكل 3C) يقلل من وظيفة الميتوكوندريا ؛ وبالتالي ، فإن تلطيخ TTC للقلب ليس أحمر ولكن وردي شاحب ، والحدود بين الأنسجة الميتة والقابلة للحياة غير واضحة (الشكل 3C).
علاوة على ذلك ، تمت مقارنة طريقتين لتقليل الانعكاسات في العينات. الغمر هو الطريقة الأكثر كفاءة وينتج صورا مفصلة مع تباين جيد (الشكل 4A). الطريقة الثانية هي استخدام مرشح استقطاب متصل بالعدسة. مرشح الاستقطاب فعال أيضا. ومع ذلك ، فإن المرشح يقلل قليلا من الدقة والتباين الدقيق للصورة (الشكل 4B). مثال على صورة شريحة قلب بدون غمر أو مرشح (الشكل 4C) يحتوي على العديد من الانعكاسات وغير مناسب لمزيد من التحليل.
لا يتم غمر شرائح الدماغ بسبب مشاكل إدارة الشرائح (العائمة). في التحليل الخطوي ، من المهم مقارنة الجانب غير المصاب (الصحي) من الدماغ (الشكل 5A) مع الجانب المصاب بالسكتة الدماغية (الشكل 5B). من الأسهل إدارة شرائح الدماغ على صفيحة جافة أو صينية ، ويتم استخدام مرشح استقطاب لإزالة الانعكاسات. يتم استخدام صينية ذات خلفية زرقاء لتصوير شرائح الدماغ (اختيار الخلفية الموصوف سابقا5).
تم استخدام إعدادات الكاميرا اليدوية لضمان التحكم الكامل في التعرض وتوازن اللون الأبيض. يجب ضبط إعدادات الكاميرا قبل أو في بداية التجربة وفقا لمصدر الضوء المتاح. وهذا يضمن التعرض الأمثل وتوازن اللون الأبيض لجميع الصور للسماح بتحليل موحد (الشكل 6A). الإعدادات التلقائية للكاميرا ليست مثالية ويمكن أن تؤدي إلى اختلاف معلمات الكاميرا ، مما يتسبب في نتائج غير مناسبة وإدخال تباين من صورة إلى صورة.
ويبين الشكل 6 أمثلة على الصور المفرطة التعرض (الشكل 6 ب) والصور غير المعرضة للتعرض (الشكل 6 ج) لشرائح القلب. يجب إيلاء اهتمام كاف لإعدادات توازن اللون الأبيض الصحيحة للكاميرا لمطابقة مصدر ضوء معين يستخدم في إعداد ضوء الكاميرا. قد تؤدي إعدادات توازن اللون الأبيض غير الصحيحة إلى التحول إلى اللون الأزرق أو الأصفر (الشكل 6D) والأرجواني أو الأخضر (الشكل 6E) المصبوب في الصورة.
الشكل 3: صور شرائح قلب الفئران. (أ) تم تحليل شريحة القلب الطازجة في برنامج ImageProPlus 6.3 باستخدام تجزئة الألوان (B). (ج) تلطيخ TTC يميز بشكل سيئ بين الأنسجة القابلة للحياة والميتة في شريحة القلب المجمدة (المجمدة لمدة 24 ساعة). اختصار: TTC = 2,3,5-ثلاثي فينيل-2H-رباعي زوليوم كلوريد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تقنيات للحد من الانعكاسات. صورة شريحة قلب الفئران التي تم التقاطها مغمورة في PBS (A) وباستخدام مرشح الاستقطاب (B). (ج) شريحة القلب مع انعكاسات عند عدم استخدام الغمر أو المرشح. الاختصار = PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور لشرائح دماغ الفئران. تم تقطيع دماغ الفئران إلى سبع شرائح وتلطيخ ب TTC بعد نقص التروية - التروية. يؤدي استخدام مرشح الاستقطاب إلى الحصول على صورة خالية من الانعكاس. (أ) شرائح من نصف الكرة الأرضية غير التالف ؛ (ب) شرائح من نصف الكرة الأرضية المصاب بالسكتة الدماغية. اختصار: TTC = 2,3,5-ثلاثي فينيل-2H-رباعي زوليوم كلوريد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صور شريحة قلب الفئران. التقط (A) بشكل صحيح وغير صحيح (B-E) صور شريحة القلب. تؤدي إعدادات التعريض الضوئي غير الصحيحة إلى التعرض المفرط (B) والصور المكشوفة (C). تؤدي إعدادات توازن اللون الأبيض غير الصحيحة إلى ظهور اللون الأصفر (D) أو الأخضر في الصورة (E). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يبدأ تحضير القلب بعد الأشعة تحت الحمراء بإعادة انسداد شرايين القلب في الدم وإرواء الصبغة الزرقاء للتمييز بين المناطق المعرضة للخطر والمناطق غير المعرضة للخطر. تستخدم أصباغ الميثيلين الزرقاء أو أصباغ إيفانز الزرقاء بشكل متكرر لهذا الغرض2. نظرا لأن الضغط المرتفع بشكل مفرط قد يؤدي إلى تلف صمامات القلب ، وبالتالي ، جزئيا أو كليا ، تلطخ المناطق المعرضة للخطر ، فمن الأفضل أن تغلغل القلب بنظام يتم التحكم فيه بالضغط ، مثل جهاز Langendorff أو نسخة مبسطة من حقنة أو مضخة مجهزة بنظام الضغط الهيدروستاتيكي. سيضمن التروية التي يتم التحكم فيها الضغط الفسيولوجي ، ولن تدخل الصبغة عادة إلى المنطقة المسدودة من القلب. كل من سرعة التدفق والتقنيات التي يتم التحكم فيها بالضغط هي ضمانات ضد التلطيخ الزائد.
أحد أخطر الأخطاء في معالجة الأنسجة القابلة للحياة هو الاحتفاظ بالأنسجة في الثلاجة لفترة طويلة قبل تلطيخها. يستخدم التجميد بشكل أساسي لأن الباحثين يريدون إجراء تلطيخ القلب في اليوم التالي لتجربة الأشعة تحت الحمراء أو في وقت لاحق. علاوة على ذلك ، يتم استخدام التجميد لجعل قطع القلب أسهل. وجدنا أن تجميد القلب على المدى القصير لمدة تصل إلى 5-10 دقائق يؤثر بشكل ضئيل على سلامة أنسجة القلب ويسهل قطع الأنسجة (خاصة بالنسبة لقلوب الفئران) إلى شرائح رقيقة. ومع ذلك، فإن التجميد لفترات طويلة يضر بالأغشية ويقلل من صلاحية الخلية ووظيفة الميتوكوندريا13. نتيجة لذلك ، يتأثر تلطيخ TTC للميتوكوندريا العاملة ، ويتم تحديد الحدود بين الأنسجة الميتة والقابلة للحياة بشكل سيئ (ضبابية). بشكل عام ، يجب تجنب تجميد هارتس الفئران ، ويمكن استخدام التجميد قصير الأجل فقط لقلوب الفئران لتسهيل القطع.
الخطوة التالية هي تلطيخ الأنسجة في محلول TTC بنسبة 1٪ عند 37 درجة مئوية 14. يجب تسخين محلول التلطيخ مسبقا - وهو أمر مهم بشكل خاص لتلطيخ شرائح الدماغ. عند استخدام المحلول المسخن مسبقا ، فإن وقت التلطيخ الأمثل لشرائح القلب هو 10 دقائق. تؤدي الحضانة الأطول أو درجة الحرارة الأعلى من 37 درجة مئوية إلى تلوين بني لأنسجة القلب. يعد التلطيخ المناسب للعينات وكثافة اللون الأحمر المتسقة أمرا مهما لمزيد من تحليل الصور. في الخطوات الأخيرة قبل التصوير الفوتوغرافي ، يتم شطف شرائح الأنسجة 2-3 مرات باستخدام PBS البارد أو مخزن مؤقت مماثل لإزالة TTC وأزرق الميثيلين الزائد من المحلول لتجنب الصب الأزرق في الصورة. يجب تصوير شرائح القلب بعد فترة وجيزة من التلطيخ للحصول على أفضل جودة للصورة. يبقى تلطيخ القلب من نوعية جيدة إذا تم تخزينها لمدة تصل إلى 60 دقيقة في البرد (+4 درجة مئوية) PBS. عادة ما يتم تخزين شرائح الدماغ الملطخة وأنسجة الأبهر في محلول فورمالديهايد محايد بنسبة 4٪ وتحتفظ بنوعية جيدة لمدة أسبوع. التخزين بين عشية وضحاها من أنسجة المخ في الفورمالين (+4 درجة مئوية) لا يضعف كثافة اللون من الأنسجة الطبيعية ومقبول للحصول على الصورة. ومع ذلك ، فإن الفورمالين يحفز تورم وإزالة تلطيخ شرائح القلب. لذلك ، لا ينصح بتخزين أنسجة القلب في الفورمالين.
الخطوة التالية هي الحصول على الصور. تستخدم العديد من المختبرات الماسحات الضوئية المسطحة كأداة للحصول على الصور التي من المتوقع أن تحل محل الكاميرا الرقمية وإعداد الإضاءة. قررنا أن المسح الضوئي للشرائح لا يوفر دقة كافية للصورة وفصلا بين الألوان ، وبالتالي فهو غير مناسب لتصوير شرائح القلب. على وجه الخصوص ، دقة الماسح الضوئي غير كافية لقلوب الفئران ، ولاحظنا سوء تقديم الميثيلين الأزرق. في المقابل ، قد يكون الماسح الضوئي بديلا لكاميرا الصور لتصوير شرائح الدماغ الملطخة فقط ب TTC أو أصباغ مفردة أخرى. لمسح شرائح الأنسجة، يعد برنامج المسح الضوئي الذي يضمن إعدادات التعرض المستمر أمرا ضروريا. بشكل عام ، يكون الماسح الضوئي المسطح أقل قدرة ولا يمكنه استبدال الكاميرا الرقمية لمعظم تطبيقات التصوير.
الخلفية وراء العينات مهمة أيضا. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون الجزء السفلي من الدرج بلون غير موجود في العينة الملطخة. على سبيل المثال ، لتحديد مساحة تلطيخ الميثيلين الأزرق و TTC (الأحمر) بطريقة آلية أو شبه آلية ، يجب تجنب الخلفيات البيضاء والحمراء والزرقاء والصفراء والبنية. وبالتالي ، سيكون من الأفضل وجود خلفية خضراء. ومع ذلك ، يعتمد اختيار اللون على تفضيلات المشغل ، الذي يقوم بمعالجة الصورة. يفضل العديد من العلماء خلفية بيضاء لأنه يمكن حذف الخلفية البيضاء في المعالجة اللاحقة للصور وتحويلها إلى بيضاء تماما (الرمز الأبيض RGB 255,255,255). بعد ذلك ، يجب على المرء استبعاد اللون الأبيض تماما من قائمة الألوان المحددة المستخدمة في التحليل شبه الآلي وحساب المناطق الميتة الشاحبة فقط ، والتي ليست بيضاء تماما إن لم تكن مكشوفة بشكل مفرط. الخلفيات الزرقاء والخضراء مناسبة لتصوير شرائح الدماغ والشريان الأورطي.
أداة التصوير المثلى لتصوير الأنسجة هي كاميرا رقمية أحادية العدسة أو عدسة قابلة للتبديل بدون مرآة مع عدسة ماكرو متوافقة. قد يتطلب التقاط الأشياء الصغيرة جدا مزيجا من الكاميرا والمجهر. ومع ذلك ، عادة ما تحتوي عدسة الماكرو على تكبير كاف (1: 2 على الأقل) للحصول على صور مفصلة لقلب الماوس. تقدم العديد من الشركات المصنعة كاميرات رقمية وعدسات ماكرو بأسعار معقولة للحصول على صور عالية الدقة وعالية التكبير. تتميز جميع الكاميرات الرقمية المحدثة بالخصائص والوظائف اللازمة لتصوير الماكرو ، بما في ذلك إمكانية التركيب على حامل ، وعدد كبير من وحدات البكسل (عادة >20 ميجابكسل) ، والعرض المباشر ، وقفل المرآة ، وميزات الفاصل الزمني ، والغالق عن بعد ، والقدرة على ضبط معلمات الكاميرا يدويا ، وبالتالي ضمان سرعة غالق ثابتة ، وفتحة العدسة ، وتوازن اللون الأبيض ، وإعداد ISO. يمكن أيضا استخدام الكاميرات المدمجة ذات الميزات المذكورة أعلاه وتكبير العدسة بنسبة 1: 2 على الأقل لتصوير الماكرو. بسبب خصائص العدسة ، يجب وضع بعض الكاميرات المدمجة على مقربة من الكائن ، ويجب على المجرب التأكد من أن جسم الكاميرا لا يؤثر على إضاءة العينة.
بالنسبة لتصوير الماكرو باستخدام أي نوع من كاميرات العدسات القابلة للتبديل، يلزم وجود عدسة ماكرو عالية التكبير (1:1-1:2). نقترح استخدام عدسات ماكرو ذات بعد بؤري يتراوح من 50 مم إلى 100 (120) مم أو ما يعادلها على مستشعر كامل الإطار (24 مم × 36 مم). تحتوي كاميرات الاستشعار الأصغر حجما على أحجام مستشعر مختلفة ، ويجب إعادة حساب التكبير وفقا لذلك. بالنسبة لتصوير شرائح القلب، تبلغ المسافة المريحة للعنصر الأمامي لعدسة الماكرو مقاس 100 مم للهدف حوالي 150 مم. يسمح هذا الإعداد للمشغلين بالاحتفاظ بجميع المعدات على الطاولة ، مع سهولة الوصول إلى عناصر التحكم في الكاميرا. يمكن النظر في عدسة ماكرو مقاس 50 مم لتصوير الأجسام الأكبر حجما، مثل شرائح الدماغ، لأن مجال الرؤية الأوسع ضروري للحصول على جميع الشرائح في صورة واحدة.
للحصول على صور واضحة بدقة عالية ، يجب تركيب الكاميرا على حامل قوي ، والذي يسمى ، إلى جانب إعداد الضوء ، حامل نسخ التصوير الفوتوغرافي. يؤدي تركيب الكاميرا على حامل ومشغل جهاز تحكم عن بعد (سلكي أو لاسلكي) إلى التخلص من اهتزاز الكاميرا ويضمن مسافة ثابتة من الهدف. يضمن إعداد إضاءة الكاميرا مع مصدرين ثابتين للضوء من كلا الجانبين، بزاوية 30-60 درجة تقريبا بالنسبة لمستوى الهدف، إضاءة كافية للعينات ويساعد على تجنب الانعكاسات في نفس الوقت. يجب تركيب الكاميرا بدقة بحيث يكون المستشعر موازيا لمستوى الموضوع. لإلقاء الضوء بالتساوي على حقل الصورة ، يجب أن يكون كلا المصباحين موجهين بالتساوي ووضعهما على نفس المسافة من الهدف. مصادر الضوء الموضوعة على مسافات مختلفة من الهدف تسبب إضاءة غير متساوية. بالإضافة إلى ذلك ، تعد مصادر الضوء الوامض سببا للاختلافات في التعرض للصورة. بشكل عام ، من المهم وضع الكاميرا ومصادر الضوء بدقة للحصول على صور للعينات المضاءة جيدا بدقة.
تعكس عينات الأنسجة الضوء (اللمعان)، والتي تظهر كبقع بيضاء في الصور. لا تحتوي بقع انعكاس الضوء هذه على معلومات لونية مفيدة ، وبالتالي ، لا يمكن استخدام هذه الأجزاء من الصور للتحليل الكمي الدقيق للصور. يمكن إزالة انعكاسات الضوء من شرائح الأنسجة بطرق مختلفة. الأكثر كفاءة هو الغمر الكامل لعينات الأنسجة في حاوية مع محلول ملحي أو PBS. نهج مماثل هو إدخال شرائح الأنسجة أسفل (أو بين) الألواح الزجاجية. هذه الطريقة فعالة ضد الانعكاسات. ومع ذلك ، يمكن أن تكون دقة الصورة أقل من دقة الصور الفوتوغرافية للأنسجة المغمورة.
يمكن للمرء أيضا استخدام مرشح استقطاب مثبت على عدسة للقضاء على انعكاسات الضوء. تتوفر مرشحات الاستقطاب الدائرية على نطاق واسع ولكنها تختلف اختلافا كبيرا في الجودة اعتمادا على السعر ، ويمكن للمرشحات الرخيصة أن تقلل بشكل كبير من دقة الصورة. يمكن تصفية الضوء المنعكس عن طريق تشغيل الجزء المتحرك من مرشح الاستقطاب بزاوية. قد تتأثر فعالية مرشح الاستقطاب ببعض مصادر الضوء (على سبيل المثال، ضوء LED قوي). بشكل عام ، بعد إزالة السائل الزائد ، يمكن لمرشح الاستقطاب القضاء على جميع الانعكاسات من شرائح الدماغ. ومع ذلك ، فإن غمر العينات في محلول المخزن المؤقت هو النهج الأسهل والأكثر فعالية من حيث التكلفة لشرائح القلب.
تعد الإعدادات اليدوية لسرعة الغالق وفتحة العدسة وISO وتوازن اللون الأبيض مهمة للحفاظ على التحكم الكامل في عملية التصوير. تؤثر العينة والخلفية وخصائص مصدر الضوء على نظام قياس التعرض للكاميرا في الإعدادات التلقائية. لذلك ، تعد الإعدادات اليدوية ضرورية للحفاظ على التعرض المستمر وتوازن اللون الأبيض بين الصور المتعددة أثناء التجربة. بالنسبة لتصوير الماكرو، يتراوح إعداد فتحة العدسة المقترح بين f/8 وf/16. من خلال تقليل الفتحة ، يزداد عمق المجال ، وهو أمر مفيد إذا لم يكن الجسم في مستوى واحد. ومع ذلك ، فإن الحيود يحد من الدقة الإجمالية للتصوير الفوتوغرافي في حالة الفتحات الأصغر. عادة ما تكون الفتحة المثلى لمعظم العدسات f/10 لأنه في هذا الإعداد ، يكون انخفاض الدقة ضئيلا ، وعمق المجال كافيا. عادة ما تكون قيم ISO التي تتراوح من 50 إلى 400 (الأقل أفضل) مثالية لتقليل القطع الأثرية للصور (الضوضاء). ثم تظل سرعة الغالق بحاجة إلى التغيير للحصول على التعريض الضوئي الصحيح باستخدام إعدادات فتحة العدسة وISO المذكورة في ظروف الإضاءة الحالية. الإعدادات اليدوية مهمة لتحليل الصور بشكل متسق. يضمن التصوير الموحد استخدام نفس إعدادات عتبة اللون طوال أي دراسة، الأمر الذي يتطلب تحليل التجزئة. على سبيل المثال، يمكن استخدام التحليل شبه الآلي بواسطة برنامج ImagePro استنادا إلى ملف تجزئة بألوان محددة مسبقا من الأزرق والأحمر والأبيض (+وردي شاحب) على مر السنين إذا كانت صور العينات ذات ألوان متناسقة وتوازن أبيض وتعرض.
يجب ضبط إعداد توازن اللون الأبيض اعتمادا على درجة حرارة لون مصدر الضوء المستخدم لإضاءة عينة. يمكن تحديد توازن اللون الأبيض من الإعدادات المسبقة المضمنة في الكاميرا أو باستخدام المعايرة اليدوية لهدف رمادي. تتمثل فائدة التقاط الصور بتنسيق RAW في أنه يمكن ضبط توازن اللون الأبيض أثناء المعالجة اللاحقة للبرنامج للصورة. نظرا لأن ملفات RAW تحتوي على معلومات أكثر بكثير من ملفات JPEG ، فإن المعالجة اللاحقة لملف RAW توفر فرصة ممتازة لتصحيح توازن الألوان والتعرض ، وكذلك للحصول على دقة صورة أفضل. نظرا لأن معظم الكاميرات يمكنها التقاط ملفات JPEG و RAW في وقت واحد ، فإننا نقترح التقاط ملف RAW وحفظه كنسخة احتياطية.
بشكل عام ، يصف هذا البروتوكول منهجية لتقطيع وتلطيخ قلب الفئران وأنسجة المخ ويوفر إرشادات لإنشاء إعدادات الإضاءة والكاميرا وتقنيات التصوير الفوتوغرافي للحصول على صور عالية الدقة لمزيد من التحليل. تنطبق هذه الطريقة على جميع الصور التجريبية للأعضاء الحيوانية الصغيرة.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم المؤلفين من قبل برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 857394 ، مشروع FAT4BRAIN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 50 mL syringe | Terumo | N/A | |
| Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
| Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
| Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
| Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
| Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
| Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
| Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
| Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
| Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
| Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
| Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
| Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
| Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
| Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
| Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
| Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
| Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
| Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
| Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
| Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
| Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
| Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
| Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
| Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
| Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Research in Cardiology. 113 (5), 39 (2018).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e1978 (2011).
- Zvejniece, L., Svalbe, B., Liepinsh, E., Pulks, E., Dambrova, M. The sensorimotor and cognitive deficits in rats following 90- and 120-min transient occlusion of the middle cerebral artery. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 197-204 (2012).
- Liepinsh, E., Kuka, J., Dambrova, M. Troubleshooting digital macro photography for image acquisition and the analysis of biological samples. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 98-106 (2013).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52908 (2015).
- Liepinsh, E., et al. Inhibition of L-carnitine biosynthesis and transport by methyl-gamma-butyrobetaine decreases fatty acid oxidation and protects against myocardial infarction. British Journal of Pharmacology. 172 (5), 1319-1332 (2015).
- Nakamura, K., Al-Ruzzeh, S., Ilsley, C., Yacoub, M. H., Amrani, M. Acute effect of cerivastatin on cardiac regional ischemia in a rat model mimicking off-pump coronary surgery. Journal of Cardiac Surgery. 20 (6), 507-511 (2005).
- Li, Q., Morrison, M. S., Lim, H. W. Using a cardiac anchor to refine myocardial infarction surgery in the rat. Lab Animal. 39 (10), 313-317 (2010).
- Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K.
- Vavers, E., et al. The neuroprotective effects of R-phenibut after focal cerebral ischemia. Pharmacological Research. 113, Pt B 796-801 (2016).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Kloner, R. A., Darsee, J. R., DeBoer, L. W., Carlson, N. Early pathologic detection of acute myocardial infarction. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 105 (8), 403-406 (1981).
