Summary
מוצג כאן פרוטוקול למתודולוגיה הסטנדרטית של הכנת רקמת מכרסם לאחר ניסוי איסכמיה-רפרטפוזיה והנחיות להקמת הגדרות תאורה ומצלמה לרכישת תמונה ברזולוציה גבוהה. שיטה זו חלה על כל צילום איברים ניסיוני של בעלי חיים קטנים.
Abstract
צילום מאקרו ישים להדמיית דגימות רקמות שונות בהגדלה גבוהה לביצוע ניתוחים איכותיים וכמותיים. הכנת רקמות ולכידת תמונה עוקבת הם שלבים המבוצעים מיד לאחר ניסוי איסכמיה-ריפוזיה (IR) ויש לבצעם בזמן ובזהירות מתאימה. להערכת נזק שנגרם על ידי IR בלב ובמוח, מאמר זה מתאר 2,3,5-טריפניל-2H-טטרזוליום כלוריד (TTC) מבוסס כתמים ואחריו צילום מאקרו. צילום מאקרו מדעי דורש תאורה מבוקרת ומערך הדמיה מתאים. המתודולוגיה המתוקננת מבטיחה תמונות דיגיטליות איכותיות ומפורטות גם אם נעשה שימוש בשילוב של מצלמה דיגיטלית זולה ועדשת מאקרו עדכניות. טכניקות נכונות וטעויות פוטנציאליות בהכנה לדוגמה ורכישת תמונה נדונות, ודוגמאות להשפעת הגדרות נכונות ושגויות על איכות התמונה מסופקות. טיפים ספציפיים ניתנים כיצד להימנע מטעויות נפוצות, כגון הבעת יתר, אחסון מדגם לא תקין ותנאי תאורה תת-אופטימליים. מאמר זה מציג את המתודולוגיה המתאימה לחיתוך והכתמה של לב חולדה ורקמת מוח ומספק הנחיות להקמת תצורות תאורה ומצלמה וטכניקות צילום לרכישת תמונה ברזולוציה גבוהה.
Introduction
במשך עשרות שנים, צילום וניתוח של דגימות רקמת לב ומוח היו חלק חשוב מניסויים במדעי החיים. התקדמות המדע והחדשנות מניעה את הפיתוח של מיקרוסקופים יקרים המסוגלים לתסיסת-על. פוטומיקרוגרפים מתקבלים בסביבת אור מבוקרת היטב בעקבות הוראות מפורטות. לעומת זאת, צילום מאקרו (בהגדלה של 1:2 ומעלה) מבוצע לעתים קרובות בסביבת תאורה בלתי מבוקרת באמצעות הגדרות הדמיה לא הולמות. לעתים קרובות, הטכניקות של הכנת מדגם והתקנת מצלמה צריך להיות ממוטב באופן משמעותי. כתוצאה מכך, תצלומי מאקרו באיכות מוגבלת פורסמו בהרחבה בכתבי עת מדעיים. רזולוציית תמונה וניגודיות לא מספיקות מגבילות את האפשרויות לכימות תמונה מדויק במחקרי אינפרא-אדום.
הליכים ניסיוניים של שריר הלב1,2 ו brain3,4 אוטם תוארו בפירוט. מטרת המחקר היא לספק מדריך שלב אחר שלב כיצד להקים מערכת לצילום וניתוח סטנדרטי של דגימות לב מכרסמים ורקמת מוח לאחר ניסויי אוטם. זה כולל חיתוך רקמות, כתמים, וצילום מאקרו של דגימות לב ומוח. הכנת דגימות רקמות היא חלק חיוני מהניסוי, ותוצאות ניתוח התמונה הפלנימטרית תלויות מאוד באיכות התמונות המתקבלות5.
שיטות אלה שימושיות במיוחד לביצוע מדידות וניתוח פלנימטרי תמונה ברקמות מכרסמים ויכולות להיות בעלות ערך לצילום מאקרו מדעי כללי. בנוסף, האיכות הגבוהה והעקביות של תמונות מאפשרות לבצע ניתוח אוטומטי של תצלומים דיגיטליים, מה שעוזר לחסוך זמן, להימנע מכניסת משתמש ולמזער את הסיכון לשגיאות או הטיה במהלך ניתוח תמונה. זה יביא ליצירת נתונים חזקים ואמינים ולהגדיל את התרגום של תגליות פרה קליניות לטיפולים אנטיכימיים חדשניים במרפאות.
Protocol
ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם להנחיות הקהילה האירופית ולחוקים ולמדיניות המקומיים (הוראה 2010/63/EU), וכל ההליכים אושרו על ידי שירות המזון והווטרינריה, ריגה, לטביה.
1. כתמי לב וחתיכה
הערה: ניתן להשתמש בטכניקות המתוארות בפרוטוקול זה לאחר בדיקת פציעת עכבר או עכבר מבודדת של Langendorff או לב עכבר 6,7 והן בבדיקות פציעה של לב IR של חולדת vivo8,9,10,11. עבור כתמים לאחר בדיקת פציעה IR in vivo, ההנחה היא כי הלב הוא exced, רכוב על צינורית, לזמן קצר perfused במצב זלוף Langendorff.
- נתק את צינורית הלב מהמזרק המלא בתמיסת קרבס-הנסליט וחבר אותה למזרק מלא בתמיסה חמה (37 °C) של 0.1% מתילן כחול בתמיסת קרבס-הנסליט. השתמש מזרק 5 מ"ל עבור לבבות חולדה מזרק 1-2 מ"ל עבור לבבות עכבר.
הערה: חלופה היא למלא את המנגנון הנשלט בלחץ או בזרימה (למשל, לנגנדורף) בתמיסה כחולה המכילה צבע. במהלך הליך הניתוק וההרכבה, חיוני לא להשאיר בועות אוויר בצינורית ולא לשחרר את התפר המשמש לסגירת עורקים כליליים. - עוד יותר perfuse לבבות חולדה עם 4 מ"ל של פתרון כחול מתילן בקצב של ~ 4 מ"ל / דקה ו לבבות עכבר perfuse עם 1 מ"ל של פתרון כחול מתילן בקצב של ~ 0.5-1 מ"ל / דקה.
הערה: בהתבסס על ניסיון, שתי הטכניקות בטוחות ומספקות כתמים נאותים; עם זאת, באמצעות משאבה מבוקרת לחץ / מערכת לחץ הידרוסטטית היא אפשרות גוזלת זמן רב יותר אך בטוחה יותר נגד overstaining עבור מדענים טירון. - נתק את הצינורית מהמזרק והסר את הלב מהצינורית.
- הסר מתילן כחול עודף על ידי גלגול עדין של הלב על נייר טישו. לשחרר את הקשירה סביב העורק הכלילי על ידי פתיחת מלקחיים hemostatic והסרת צינורות פלסטיק מן התפר כירורגי רק לאחר הסרת עודף מתילן כחול.
הערה: בשלב זה, ניתן למקם את לב העכבר בשקית ניילון קטנה או microtube צנטריפוגה 5 מ"ל במקפיא (-20 °C (-20 °F) עד 5-10 דקות. זמן הקפאה מקסימלי צריך להיקבע באופן ניסיוני בכל מעבדה. הקפאה לטווח קצר של לב עכבר יכולה לעזור לנסיין טירון לחתוך אותו לפרוסות בעובי 1 מ"מ. הקפאת לבבות חולדות אינה מומלצת. יש להימנע מהקפאת יתר במשך יותר מ-10 דקות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. - הניחו את לב החולדה המוכתם במטריצה מפלדת אל-חלד (ראו טבלת החומרים) לחיתוך לב (איור 1A). לאחר מכן, לחתוך את החדרים של הלב לפרוסות בעובי 2 מ"מ (לכוון 6-7 פרוסות של לב חולדה בוגר). עבור לבבות עכבר, לחתוך את חדרי הלב לפרוסות בעובי 1.5 מ"מ (לשאוף לפחות 4 פרוסות של לב עכבר מבוגר).
הערה: יש להשתמש בסכיני גילוח תואמי מטריצה לחיתוך. באופן כללי, סכיני גילוח תואמים חד-קצה (לדוגמה, עובי של עד 0.01 אינץ' (0.254 מ"מ)) יכולים לשמש לחיתוך לבבות חולדה. סכיני גילוח דו-צדדיים משמשים בדרך כלל ללבבות עכבר ובדרך כלל הם בעובי של עד 0.004 אינץ' (0.1 מ"מ).
איור 1: מטריצות לחיתוך לב החולדה והמוח. (A) לב עכברוש, (ב) מוח עכברוש. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- לאחר החיתוך, מעבירים את הפרוסות לצינור פלסטיק של 15 מ"ל. מוסיפים 5 מ"ל של 1% טריפנילטטרזוליום כלוריד (TTC) מומסים מלוחים חוצצי פוספט (PBS) לצינור עם פרוסות הלב, ודגרו במשך 10 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר הדגירה בתמיסת TTC, שטפו את פרוסות הלב לפחות 2-3 פעמים עם PBS והתכוננו ללכידת תמונה.
2. כתמי מוח וחתיכה
- לאחר ניסוי חסימת העורק המוחי האמצעי3,12, הסר את המוח, כולל גזע המוח, מהגולגולת, ושטוף אותו ב- PBS קר כקרח.
- בחרו את הגודל הנכון של מטריצת נירוסטה במוח (ראו טבלת החומרים) בהתאם למשקל בעלי החיים (איור 1B). מניחים את המוח עם הצד הגחוני שלו למעלה במטריצת המוח.
הערה: כאשר יושבים במטריצה, פני השטח הגחוניים של המוח חייבים להיות מקבילים למשטח העליון של התבנית. - באמצעות להבים, להגביל את החלקים הקדמיים caudal (2 להבים משני הצדדים) של המוח.
הערה: יש להשתמש בסכיני גילוח תואמי מטריצה לחיתוך. באופן כללי, סכין גילוח תואם בעל קצה יחיד (עובי של עד 0.01 אינץ' (0.254 מ"מ)) יכול לשמש לחיתוך מוח חולדה. - שים את הלהבים חלקית (לא חיתוך מלא של המוח) לתוך הערוצים בין הלהבים הראשון והאחרון. כאשר כל הלהבים מוכנסים ומסודרים במקביל, לחץ על כל הלהבים למטה עם כף היד בו זמנית כדי לחתוך את המוח לפרוסות 2 מ"מ קורונל.
- תפוס את הלהבים בחוזקה לאורך הצדדים עם שתי אצבעות ולהסיר אותם יחד עם המוח פרוס מן המטריצה.
- מסדרים את פרוסות המוח אחת אחרי השנייה במגש (70 מ"ל, 72 x 72 מ"מ). בעת סידור הפרוסות, ודא שהמשטח הקדמי של כל פרוסה תמיד פונה כלפי מעלה.
- יוצקים חם (+37 °C)) 1% פתרון TTC ב- PBS על פרוסות המוח, ולדגור אותם במשך 8 דקות ב 37 °C (37 °F) בחושך.
הערה: פרוסות המוח חייבות להיות שקועות באופן מלא בתמיסת TTC במהלך הדגירה. - לאחר הדגירה בתמיסת TTC של 1%, העבירו את פרוסות המוח למגש הפלסטיק הכחול כדי לצלם תמונות. מסדרים את פרוסות המוח בסדר רציף מהחלק הקדמי לחלק הקודלי, ומשתמשים באזמל כדי להפריד את ההמיספרות במישור הקשת.
הערה: פני השטח של המגש צריכים להיות ניתנים לכביסה, מט וצבע המנוגד לפרוסות המוח (כלומר, לא אדום, לבן או ורוד חיוור).
3. צילום מאקרו
- צלם את פרוסות הרקמה מיד לאחר ההכתמה.
הערה: ניתן לאחסן פרוסות לב ב-PBS קר (בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס) או בפתרון פורמלין למשך עד 30 דקות. ניתן לאחסן פרוסות במוח בפורמלין לתקופה ממושכת (1-2 שבועות). - הגדר את המצלמה לפי בחירה באמצעות סוללה טעונה, כרטיס זיכרון ועדשה מחוברת על מעמד (איור 2)
הערה: הפעל את האורות לפחות 5-10 דקות לפני רכישת תמונה כדי לחמם את הציוד. נורות LED מגיעות לבהירות מלאה במיקרו-שניות.
איור 2: מצלמה ואורות מוגדרים לצילום מאקרו. המצלמה מאונכת למשטח ההדמיה כדי להבטיח שמישור המוקד של המצלמה מקביל לדגימות. קיצור: LED = דיודת פולטת אור. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- בהתאם למקורות האור הזמינים, בחר את הגדרות האיזון הלבן המתאימות או בצע כיול טמפרטורת צבע בהתאם להוראות במדריך המצלמה.
הערה: נורית LED לבנה (טמפרטורת צבע 6,500 K) היא מקור האור המועדף כדי למנוע הבהוב אור על ידי נורות פלורסנט. - העבר את המצלמה למצב ידני מלא, הגדר את ISO 100 ואת הצמצם ל- f/10 והתאם את מהירות התריס לחשיפה אופטימלית לתמונה. ודא שמישור מוקד המצלמה מקביל לפני השטח שבהם המדגם יוצב.
הערה: פונקציית ההיסטוגרמה שימושית כדי להבטיח שפרוסות רקמות לא ייחשפו יתר על המידה. - חבר או הפעל גורם מפעיל מרוחק קווי או אלחוטי כדי למנוע רעד מצלמה בעת שחרור התריס.
הערה: חלופה היא להפעיל פונקציית תריס מושהית, שתעכב את הגורם המפעיל למשך 2 או 10 שניות לאחר לחיצה על לחצן ההדק. - יש לטבול את פרוסות הלב לחלוטין במיכל עם PBS.
הערה: שקופיות שקועות נוטות לצוף הרחק ממיקומן. כדי למזער את הצפת הפרוסות, השתמשו במגש הקטן ביותר האפשרי שלתוכו כל הפרוסות יכולות להתאים ובכמות המינימלית של פתרון הטבילה, כדי להבטיח שהדגימה שקועה במלואה. שיטות חלופיות כוללות הצבת הפרוסות בין שקופיות זכוכית או שימוש במסנן קיטוב על העדשה. מסנן קיטוב מעגלי מחובר לעדשה ומסתובב עד שהשתקפויות בתצוגה חיה של המצלמה נעלמות. - מסדרים את פרוסות המוח במגש יבש ללא PBS או נוזלים אחרים.
הערה: מסנן מקוטב נוח מאוד ללכידת תמונות של פרוסות מוח. - מקם את הגורם המכיל עם פרוסות מתחת למצלמה עם עדשת המאקרו וודא שכל הפרוסות מתאימות באופן מלא לשדה הראייה. ודא שהפרוסות נמצאות באותו מישור, כלומר לא מעוקלות או מגולגלות.
- בדוק את החשיפה והתאם את הגדרות המצלמה במידת הצורך.
הערה: לאחר ההגדרה, אל תשנה את החשיפה והגדרות אחרות במהלך הניסוי כולו. - לכוד את המספר (או זיהוי אחר) של הדגימה וצלם את פרוסת הרקמה באמצעות גורם מפעיל מרוחק.
הערה: יש לכלול סמן גודל, כגון סרגל mm, בשדה הראייה כאשר יש צורך בכימות מוחלט של גודל הדגימה. - סובבו את הפרוסות ולכוד את התמונות שלהן מהצד השני.
Representative Results
איור 3A הוא תצלום של פרוסת לב מוכתמת במתילן כחול ו-TTC לאחר אוטם שריר הלב, המכילה מספיק פרטי פרטים ומידע צבע לניתוח פלנימטרי נוסף של גודל האוטם (איור 3B). בדקנו כיצד הקפאת הלב למשך 24 שעות משפיעה על שלמות רקמות הלב (איור 3C). הקפאה לתקופה ממושכת (>1 שעות, איור 3C) מפחיתה את תפקוד המיטוכונדריה; לפיכך, הכתמת TTC של הלב אינה אדומה אלא ורודה חיוורת, והגבול בין רקמות נמקיות לרקמות בנות קיימא מטושטש (איור 3C).
יתר על כן, שתי שיטות הושוו להפחתת השתקפויות בדגימות. טבילה היא השיטה היעילה ביותר ומייצרת תמונות מפורטות עם ניגודיות טובה (איור 4A). השיטה השנייה היא שימוש במסנן קיטוב המחובר לעדשה. מסנן הקיטוב גם יעיל; עם זאת, המסנן מפחית מעט את הרזולוציה ואת המיקרו-קונטרסט של התמונה (איור 4B). תמונה לדוגמה של פרוסת לב ללא טבילה או מסנן (איור 4C) מכילה השתקפויות רבות ואינה מתאימה לניתוח נוסף.
פרוסות המוח אינן שקועות בגלל בעיות ניהול פרוסות (צפות). בניתוח הפלנימטרי, חשוב להשוות את הצד הלא מושפע (הבריא) של המוח (איור 5A) לצד המושפע משבץ (איור 5B). קל יותר לנהל פרוסות מוח על צלחת או מגש יבשים, ומסנן קיטוב משמש להסרת השתקפויות. מגש עם רקע כחול משמש לצילום פרוסות מוח (בחירת רקע שתוארה קודם לכן5).
הגדרות מצלמה ידניות שימשו כדי להבטיח שליטה מלאה על החשיפה ואיזון לבן. יש לכוונן את הגדרות המצלמה לפני או בתחילת הניסוי בהתאם למקור האור הזמין. הדבר מבטיח חשיפה מיטבית ואיזון לבן של כל התמונות כדי לאפשר ניתוח אחיד (איור 6A). ההגדרות האוטומטיות של המצלמה אינן מושלמות ויכולות לגרום לפרמטרי מצלמה משתנים, מה שגורם לתוצאות בלתי הולמות ולהכנסת שונות בין תמונה לתמונה.
איור 6 מציג דוגמאות של חשיפת יתר (איור 6B) ותמונות עם חשיפת חסר (איור 6C) של פרוסות לב. יש להקדיש תשומת לב מספקת להגדרות האיזון הלבן הנכונות של המצלמה כדי להתאים למקור אור מסוים המשמש בהגדרת אור המצלמה. הגדרות איזון לבן שגויות עלולות לגרום למעבר לכחול או לצהוב (איור 6D) ולמגנטה או לירוק (איור 6E) בתמונה.
איור 3: תמונות של פרוסות לב חולדה. (A) פרוסת לב טרייה נותחה בתוכנת ImageProPlus 6.3 באמצעות פילוח צבעים (B). (ג) מכתים TTC מפלה לרעה בין רקמה בת קיימא ונמקית בפרוסת הלב הקפואה (קפוא במשך 24 שעות). קיצור: TTC = 2,3,5-טריפניל-2H-טטרזוליום כלוריד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: טכניקות להפחתת השתקפויות. תמונת פרוסת לב חולדה שנתפסה שקועה ב- PBS (A) ובאמצעות מסנן קיטוב (B). (ג) פרוסת לב עם השתקפויות כאשר לא נעשה שימוש בטבילה או במסנן. קיצור = PBS = תמיסת מלח חוצצת פוספט. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תמונות של פרוסות מוח חולדה. מוח חולדה נחתך לשבע פרוסות ומוכתם ב- TTC לאחר איסכמיה-רפרטפוזיה. שימוש במסנן קיטוב גורם לרכישת תמונה נטולת השתקפות. (א) פרוסות מחצי הכדור שלא ניזוקו ; (B) פרוסות מחצי הכדור המושפע משבץ. קיצור: TTC = 2,3,5-טריפניל-2H-טטרזוליום כלוריד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תמונות של פרוסת לב חולדה. נכון (A) ובאופן שגוי (B-E) שנתפסו תמונות פרוסות לב. הגדרות חשיפה שגויות גורמות לחשיפת יתר (B) ולתמונות עם חשיפת חסר (C). הגדרות איזון לבן שגויות גורמות ליציקה צהובה (D) או ירוקה בתמונה (E). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
הכנת הלב לאחר IR מתחילה עם שילוב מחדש של עורקי לב דם וזלוף של צבע כחול לאפליה של אזורים בסיכון מאזורים שאינם בסיכון מאזורים שאינם בסיכון. מתילן כחול או אוונס צבעים כחולים משמשים לעתים קרובות ביותר למטרה זו2. כמו לחץ גבוה מדי עלול לפגוע שסתומי לב, ולכן, חלקית או מלאה כתם באזורים בסיכון, עדיף perfuse הלב עם מערכת מבוקרת לחץ, כגון מנגנון Langendorff או גרסה פשוטה של מזרק או משאבה מערכת לחץ הידרוסטטית מצוידת. זלוף מבוקר יבטיח לחץ פיזיולוגי, והצבע בדרך כלל לא ייכנס לאזור הסגור של הלב. הן טכניקות מהירות הזרימה והן טכניקות מבוקרות הלחץ הן אמצעי הגנה מפני overstaining.
אחת הטעויות החמורות ביותר בעיבוד רקמות בר קיימא היא שמירה על רקמות במקפיא במשך זמן ממושך לפני ההכתמה. הקפאה משמשת בעיקר משום שחוקרים רוצים לבצע כתמי לב יום לאחר ניסוי האינפרא-אדום או מאוחר יותר. יתר על כן, הקפאה משמשת כדי להפוך את חיתוך הלב קל יותר. מצאנו כי הקפאה קצרת טווח של הלב עד 5-10 דקות משפיעה בזניחות על שלמות רקמות הלב ומאפשרת לחתוך את הרקמות (במיוחד עבור לבבות עכבר) לפרוסות דקות. עם זאת, הקפאה לתקופות ממושכות פוגעת בקרומים ומפחיתה את הכדאיות של התא ואת תפקוד המיטוכונדריה13. כתוצאה מכך, כתמי TTC של המיטוכונדריה המתפקדת מושפעים, והגבול בין רקמות נמקיות ובת קיימא מסומן בצורה גרועה (מטושטש). בסך הכל, יש להימנע מהקפאת לבבות חולדות, ורק הקפאה קצרת טווח של לבבות עכברים יכולה לשמש לחיתוך קל יותר.
השלב הבא הוא כתמי רקמות בתמיסת TTC של 1% בטמפרטורה של 37 °C14 °. יש להפעיל מראש את תמיסת ההכתמה – חשובה במיוחד להכתמת פרוסות המוח. בעת שימוש בתמיסה שלפני המלחמה, זמן ההכתמה האופטימלי לפרוסות לב הוא 10 דקות. דגירה ארוכה יותר או טמפרטורה גבוהה מ 37 °C (50 °F) תוצאות צבע חום של רקמות הלב. כתמים נכונים של דגימות ועוצמת צבע אדום עקבית חשובים לניתוח תמונה נוסף. בשלבים האחרונים לפני הצילום, פרוסות הרקמה נשטפות 2-3 פעמים עם PBS קר או חיץ דומה להסרת TTC ועודף מתילן כחול מהפתרון כדי למנוע יציקה כחולה בתמונה. יש לצלם פרוסות לב זמן קצר לאחר ההכתמה כדי לקבל את איכות התמונה הטובה ביותר. שרידי כתמי לב באיכות טובה אם מאוחסנים עד 60 דקות בקור (+4 מעלות צלזיוס) PBS. פרוסות מוח מוכתמות ורקמות אבי העורקים מאוחסנות בדרך כלל בתמיסת פורמלדהיד נייטרלית של 4% ושומרות על איכות טובה במשך שבוע. אחסון לילה של רקמות המוח בפורמלין (+4 °C (+4 °C)) אינו פוגע בעוצמת הצבע של רקמות רגילות ומקובל לרכישת תמונה. עם זאת, פורמלין גורם לנפיחות ו destaining של פרוסות הלב. לכן, אחסון של רקמות לב בפורמלין אינו מומלץ.
השלב הבא הוא רכישת תמונה. מעבדות רבות משתמשות בסורקים שטוחים ככלי לרכישת תמונה שצפוי להחליף מצלמה דיגיטלית ומערך תאורה. קבענו כי סריקת הפרוסות אינה מספקת רזולוציית תמונה והפרדת צבע מספקת ולכן אינה מתאימה להדמיית פרוסות לב. בפרט, רזולוציית סורק אינה מספיקה עבור לבבות עכבר, ושמנו לב לעיבוד לקוי של מתילן כחול. לעומת זאת, סורק עשוי להוות חלופה למצלמת צילום להדמיית פרוסות מוח המוכתמות רק ב- TTC או בצבעים בודדים אחרים. לסריקה של פרוסות רקמות, תוכנת סריקה המבטיחה הגדרות חשיפה קבועות היא חיונית. בסך הכל, סורק שטוח הוא פחות מסוגל ולא יכול להחליף מצלמה דיגיטלית עבור רוב יישומי ההדמיה.
הרקע מאחורי דגימות חשוב גם הוא. באופן אידיאלי, החלק התחתון של המגש צריך להיות בצבע שאינו קיים בדגימה המוכתמת. לדוגמה, כדי לכמת את האזור של מתילן כחול וכתם TTC (אדום) באופן אוטומטי או חצי אוטומטי, יש להימנע מרקע לבן, אדום, כחול, צהוב וחום. לכן, רקע ירוק יהיה עדיף. עם זאת, בחירת הצבעים תלויה בהעדפות של האופרטור, אשר מעבד את התמונה לאחר עיבוד התמונה. מדענים רבים מעדיפים רקע לבן מכיוון שניתן למחוק רקע לבן בתמונה לאחר עיבוד ולהמיר ללבן לחלוטין (קוד RGB לבן 255,255,255,255). לאחר מכן, יש להוציא לבן לחלוטין מרשימת הצבעים שנבחרו המשמשים לניתוח חצי-אוטומטי ולספור רק אזורים נמקיים חיוורים, שאינם לבנים לחלוטין אם לא נחשפים יתר על המידה. רקעים כחולים וירוקים מתאימים לצילום של פרוסות מוח ואבי העורקים.
כלי ההדמיה האופטימלי לצילום רקמות הוא רפלקס של עדשה אחת או מצלמה דיגיטלית עדשה הניתנת להחלפה ללא מראה עם עדשת מאקרו תואמת. לכידת עצמים קטנים מאוד עשויה לדרוש שילוב של מצלמה ומיקרוסקופ; עם זאת, לעדשת מאקרו יש בדרך כלל הגדלה מספקת (לפחות 1:2) כדי לקבל תמונות מפורטות של לב עכבר. יצרנים רבים מציעים מצלמות דיגיטליות במחירים סבירים ועדשות מאקרו כדי להשיג צילומים ברזולוציה גבוהה והגדלה גבוהה. לכל המצלמות הדיגיטליות העדכניות יש מאפיינים ופונקציות הדרושים לצילום מאקרו, כולל האפשרות לעלות על מעמד, מספר גבוה של פיקסלים (בדרך כלל >20 Mpx), תצוגה חיה, נעילת מראה, תכונות לשגות זמן, תריס מרחוק, והיכולת להגדיר באופן ידני פרמטרי מצלמה, ובכך להבטיח מהירות תריס קבועה, צמצם, איזון לבן והגדרת ISO. מצלמות קומפקטיות עם התכונות הנ"ל והגדלת העדשה של לפחות 1:2 יכולות לשמש גם לצילום מאקרו. בגלל מאפייני העדשה, כמה מצלמות קומפקטיות צריך להיות ממוקם בסמיכות האובייקט, ואת הנסיין חייב להבטיח כי גוף המצלמה אינו משפיע על התאורה של הדגימה.
לצילום מאקרו עם כל סוג של מצלמת עדשה הניתנת להחלפה, נדרשת עדשת מאקרו הגדלה גבוהה (1:1-1:2). אנו מציעים להשתמש בעדשות מאקרו עם אורך מוקד הנע בין 50 מ"מ ל 100 מ"מ (120) מ"מ או שווה ערך על חיישן מסגרת מלאה (24 מ"מ x 36 מ"מ). למצלמות חיישנים קטנות יותר יש גדלי חיישנים שונים, ויש לחשב מחדש את ההגדלה בהתאם. לצילום של פרוסות לב, מרחק ארגונומי של אלמנט קדמי של עדשת מאקרו 100 מ"מ לנושא הוא כ 150 מ"מ. הגדרה זו מאפשרת למפעילים לשמור את כל הציוד על שולחן, עם גישה נוחה לפקדי המצלמה. עדשת מאקרו 50 מ"מ עשויה להיחשב לצילום של עצמים גדולים יותר, כגון פרוסות מוח, מכיוון ששדה ראייה רחב יותר נחוץ כדי להשיג את כל הפרוסות בתמונה אחת.
כדי להשיג תמונות חדות ברזולוציה גבוהה, יש להתקין מצלמה על מעמד יציב, אשר, יחד עם הגדרת אור, נקרא עמדת צילום צילום. התקנת המצלמה על מעמד והפעלת שלט רחוק (קווית או אלחוטית) מבטלת את רעד המצלמה ומבטיחה מרחק קבוע מהיעד. מערך תאורת מצלמה עם שני מקורות אור קבוע משני הצדדים, בזווית של כ-30-60° ביחס למישור הנושא, מבטיח תאורה מספקת של דגימות ומסייע במניעת השתקפויות בו זמנית. יש להתקין את המצלמה בדיוק כך שהחיישן מקביל למישור הנושא. כדי להאיר באופן שווה את שדה התמונה, שתי המנורות צריכות להיות מכוונות באותה מידה וממוקמות באותו מרחק מהנושא. מקורות אור הממוקמים במרחקים שונים מהנושא גורמים להארה לא אחידה. בנוסף, מקורות אור מהבהבים הם סיבה לשינויים בחשיפה לתמונה. בסך הכל, חשוב למקם במדויק את המצלמה ואת מקורות האור כדי לרכוש במדויק תמונות של דגימות מוארות היטב.
דגימות רקמות משקפות אור (נוצץ), המופיעות ככתמים לבנים בתמונות. כתמי השתקפות אור אלה אינם מכילים מידע צבע שימושי, ובהתאם לכך, חלקים אלה של התמונות אינם יכולים לשמש לניתוח כמותי מדויק של תמונות. השתקפויות אור מפרוסות רקמות ניתן להסיר בשיטות שונות. היעיל ביותר הוא טבילה מלאה של דגימות רקמות במיכל עם תמיסת מלח או PBS. גישה דומה היא החדרת פרוסות רקמות מתחת (או בין) לוחות זכוכית. שיטה זו יעילה נגד השתקפויות; עם זאת, רזולוציית התמונה יכולה להיות נמוכה מזו של תצלומים של רקמות שקועות.
אפשר גם להשתמש במסנן קיטוב המותקן על עדשה כדי לחסל השתקפויות אור. מסנני קיטוב מעגליים זמינים באופן נרחב אך משתנים במידה ניכרת באיכותם בהתאם למחיר, ומסננים זולים יכולים להפחית באופן משמעותי את רזולוציית התמונה. ניתן לסנן אור משתקף על-ידי הפיכת החלק הנע של המסנן המקטב בזווית. היעילות של המסנן המקטב עשויה להיות מושפעת ממקורות אור מסוימים (לדוגמה, נורית LED חזקה). בסך הכל, לאחר הסרת נוזל נוסף, מסנן קיטוב יכול לחסל את כל ההשתקפויות מפרוסות המוח; עם זאת, טבילה לדוגמה בתמיסת המאגר היא הגישה הקלה והחסכונית ביותר עבור פרוסות לב.
הגדרות ידניות של מהירות התריס, הצמצם, ISO ואיזון לבן חשובות לשמירה על שליטה מלאה בתהליך ההדמיה. הדגימה, הרקע והמאפיינים של מקור האור משפיעים על מערכת מדידה של חשיפה למצלמה בהגדרות אוטומטיות; לכן, הגדרות ידניות נחוצות כדי לשמור על חשיפה מתמדת ואיזון לבן בין תצלומים מרובים במהלך הניסוי. עבור צילום מאקרו, הגדרת הצמצם המוצעת היא בין f/8 ל- f/16. על-ידי הקטנת הצמצם, עומק השדה גדל, וזה מועיל אם האובייקט אינו נמצא במישור אחד. עם זאת, עקיפה מגבילה את הרזולוציה הכוללת של הצילום במקרה של פתחים קטנים יותר. הצמצם האופטימלי עבור רוב העדשות הוא בדרך כלל f/10 מכיוון שבהגדרה זו, ירידה ברזולוציה היא זניחה, ועומק השדה מספיק. ערכי ISO הנעים בין 50 ל- 400 (נמוך יותר עדיף) הם בדרך כלל אופטימליים למזעור ממצאי תמונה (רעש). לאחר מכן נותר לשנות את מהירות התריס כדי לקבל חשיפה נכונה באמצעות הגדרות הצמצם וה- ISO שהוזכרו בתנאי האור הקיימים. הגדרות ידניות חשובות לניתוח תמונה עקבי. הדמיה מתוקננת מבטיחה שימוש באותן הגדרות סף צבע לאורך כל מחקר, מה שדורש ניתוח פילוח. לדוגמה, ניתוח חצי-אוטומטי על ידי תוכנת ImagePro המבוסס על קובץ פילוח עם צבעים מוגדרים מראש של כחול, אדום ולבן (+ורוד חיוור) יכול לשמש לאורך השנים אם לתמונות דגימה יש צבעים עקביים, איזון לבן וחשיפה.
יש להתאים את הגדרת האיזון הלבן בהתאם לטמפרטורת הצבע של מקור האור המשמש להארת מדגם. ניתן לבחור איזון לבן מתוך קביעות מוגדרות מראש מובנות של מצלמה או באמצעות כיול ידני של מטרה אפורה. היתרון של לכידת תמונה בפורמט RAW הוא שניתן להתאים איזון לבן במהלך עיבוד תוכנה לאחר עיבוד התמונה. כמו קבצי RAW מכילים הרבה יותר מידע מאשר קבצי JPEG, קובץ RAW לאחר עיבוד מספק הזדמנות מצוינת לתיקון של איזון צבע וחשיפה, כמו גם כדי לקבל רזולוציית תמונה טובה יותר. מכיוון שרוב המצלמות יכולות ללכוד קבצי JPEG ו- RAW בו-זמנית, אנו מציעים ללכוד את קובץ RAW ולשמור אותו כגיבוי.
בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה עבור הלב החולדה ורקמת המוח חיתוך והכתמה של רקמת המוח ומספק הנחיות להקמת תצורות תאורה ומצלמה וטכניקות צילום לרכישת תמונה ברזולוציה גבוהה לניתוח נוסף. שיטה זו חלה על כל צילום איברים ניסיוני של בעלי חיים קטנים.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחברים נתמכו על ידי תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענקים No 857394, Project FAT4BRAIN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 50 mL syringe | Terumo | N/A | |
| Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
| Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
| Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
| Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
| Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
| Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
| Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
| Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
| Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
| Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
| Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
| Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
| Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
| Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
| Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
| Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
| Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
| Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
| Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
| Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
| Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
| Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
| Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
| Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
| Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Research in Cardiology. 113 (5), 39 (2018).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e1978 (2011).
- Zvejniece, L., Svalbe, B., Liepinsh, E., Pulks, E., Dambrova, M. The sensorimotor and cognitive deficits in rats following 90- and 120-min transient occlusion of the middle cerebral artery. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 197-204 (2012).
- Liepinsh, E., Kuka, J., Dambrova, M. Troubleshooting digital macro photography for image acquisition and the analysis of biological samples. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 98-106 (2013).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52908 (2015).
- Liepinsh, E., et al. Inhibition of L-carnitine biosynthesis and transport by methyl-gamma-butyrobetaine decreases fatty acid oxidation and protects against myocardial infarction. British Journal of Pharmacology. 172 (5), 1319-1332 (2015).
- Nakamura, K., Al-Ruzzeh, S., Ilsley, C., Yacoub, M. H., Amrani, M. Acute effect of cerivastatin on cardiac regional ischemia in a rat model mimicking off-pump coronary surgery. Journal of Cardiac Surgery. 20 (6), 507-511 (2005).
- Li, Q., Morrison, M. S., Lim, H. W. Using a cardiac anchor to refine myocardial infarction surgery in the rat. Lab Animal. 39 (10), 313-317 (2010).
- Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K. Acute myocardial infarction in rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2464 (2011).
- Vavers, E., et al. The neuroprotective effects of R-phenibut after focal cerebral ischemia. Pharmacological Research. 113, Pt B 796-801 (2016).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Kloner, R. A., Darsee, J. R., DeBoer, L. W., Carlson, N. Early pathologic detection of acute myocardial infarction. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 105 (8), 403-406 (1981).
