Summary
यहाँ प्रस्तुत ischemia-reperfusion प्रयोग और उच्च संकल्प छवि अधिग्रहण के लिए प्रकाश व्यवस्था और कैमरा setups की स्थापना के लिए दिशानिर्देशों के बाद कृंतक ऊतक की तैयारी के मानकीकृत पद्धति के लिए एक प्रोटोकॉल है. यह विधि सभी प्रयोगात्मक छोटे-पशु अंग फोटोग्राफी पर लागू होती है।
Abstract
मैक्रो फोटोग्राफी गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए उच्च आवर्धन पर विभिन्न ऊतक नमूनों की इमेजिंग के लिए लागू होती है। ऊतक तैयारी और बाद की छवि पर कब्जा ischemia-reperfusion (आईआर) प्रयोग के तुरंत बाद प्रदर्शन किए गए कदम हैं और समय पर तरीके से और उचित देखभाल के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए। दिल और मस्तिष्क में आईआर-प्रेरित क्षति के मूल्यांकन के लिए, यह पेपर 2,3,5-ट्राइफिनाइल-2एच-टेट्राज़ोलियम क्लोराइड (टीटीसी) -आधारित धुंधला होने का वर्णन करता है, जिसके बाद मैक्रो फोटोग्राफी होती है। वैज्ञानिक मैक्रो फोटोग्राफी के लिए नियंत्रित प्रकाश व्यवस्था और एक उपयुक्त इमेजिंग सेटअप की आवश्यकता होती है। मानकीकृत पद्धति उच्च गुणवत्ता, विस्तृत डिजिटल छवियों को सुनिश्चित करती है, भले ही एक सस्ती अप-टू-डेट डिजिटल कैमरा और मैक्रो लेंस के संयोजन का उपयोग किया जाता है। नमूना तैयारी और छवि अधिग्रहण में उचित तकनीकों और संभावित गलतियों पर चर्चा की जाती है, और छवि गुणवत्ता पर सही और गलत सेटअप के प्रभाव के उदाहरण प्रदान किए जाते हैं। सामान्य गलतियों से बचने के तरीके के बारे में विशिष्ट सुझाव प्रदान किए जाते हैं, जैसे कि ओवरस्टेनिंग, अनुचित नमूना भंडारण, और सबऑप्टिमल लाइटिंग की स्थिति। यह पेपर चूहे के दिल और मस्तिष्क के ऊतकों को टुकड़ा करने की क्रिया और धुंधला करने के लिए उपयुक्त पद्धति दिखाता है और उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि अधिग्रहण के लिए प्रकाश और कैमरा सेटअप और फोटोग्राफी तकनीकों की स्थापना के लिए दिशानिर्देश प्रदान करता है।
Introduction
दशकों से, हृदय और मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों की फोटोग्राफी और विश्लेषण जीवन विज्ञान प्रयोगों का एक महत्वपूर्ण हिस्सा रहा है। विज्ञान और नवाचार की प्रगति महंगे माइक्रोस्कोप के विकास को संचालित करती है जो सुपररिज़ॉल्यूशन में सक्षम है। फोटोमाइक्रोग्राफ़ विस्तृत निर्देशों का पालन करते हुए एक अच्छी तरह से नियंत्रित प्रकाश वातावरण में प्राप्त किए जाते हैं। इसके विपरीत, मैक्रो फोटोग्राफी (1: 2 या अधिक आवर्धन पर) अक्सर अनुचित इमेजिंग सेटअप का उपयोग करके अनियंत्रित प्रकाश वातावरण में किया जाता है। अक्सर, नमूना तैयारी और कैमरा सेटअप की तकनीकों को काफी हद तक अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। नतीजतन, सीमित गुणवत्ता की मैक्रो तस्वीरें व्यापक रूप से वैज्ञानिक पत्रिकाओं में प्रकाशित की गई हैं। अपर्याप्त छवि संकल्प और इसके विपरीत आईआर अध्ययनों में सटीक छवि परिमाणीकरण की संभावनाओं को सीमित करते हैं।
myocardial1,2 और brain3,4 infarctions की प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का विस्तार से वर्णन किया गया है। इस अध्ययन का उद्देश्य रोधगलन प्रयोगों के बाद कृंतक हृदय और मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों की फोटोग्राफी और मानकीकृत विश्लेषण के लिए एक प्रणाली स्थापित करने के तरीके पर एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करना है। इसमें ऊतक स्लाइसिंग, धुंधला, और हृदय और मस्तिष्क के नमूनों की मैक्रो फोटोग्राफी शामिल है। ऊतक नमूनों की तैयारी प्रयोग का एक अनिवार्य हिस्सा है, और प्लानिमेट्रिक छवि विश्लेषण परिणाम प्राप्त छवियों की गुणवत्ता पर अत्यधिक निर्भर करते हैं5।
ये विधियां कृंतक ऊतकों में माप और छवि प्लानिमेट्रिक विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं और सामान्य वैज्ञानिक मैक्रो फोटोग्राफी के लिए मूल्य की हो सकती हैं। इसके अलावा, छवियों की उच्च गुणवत्ता और स्थिरता डिजिटल तस्वीरों के स्वचालित विश्लेषण को निष्पादित करने की अनुमति देती है, जो समय बचाने, उपयोगकर्ता इनपुट से बचने और छवि विश्लेषण के दौरान त्रुटियों या पूर्वाग्रह के जोखिम को कम करने में मदद करती है। इसके परिणामस्वरूप मजबूत और विश्वसनीय डेटा की पीढ़ी होगी और क्लीनिकों में उपन्यास एंटीइस्केमिक उपचारों में प्रीक्लिनिकल खोजों के अनुवाद में वृद्धि होगी।
Protocol
प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को यूरोपीय समुदाय और स्थानीय कानूनों और नीतियों (निर्देश 2010/63 / यूरोपीय संघ) के दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था, और सभी प्रक्रियाओं को खाद्य और पशु चिकित्सा सेवा, रीगा, लातविया द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. दिल धुंधला और टुकड़ा करने की क्रिया
नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीकों का उपयोग लैंगेनडॉर्फ-परफ्यूज्ड अलग चूहे या माउस हार्ट 6,7 और विवो चूहा दिल आईआर चोट assays8,9,10,11 दोनों के बाद किया जा सकता है। एक विवो आईआर चोट परख में के बाद धुंधला करने के लिए, यह माना जाता है कि दिल excised है, एक cannula पर घुड़सवार है, और संक्षेप में Langendorff परफ्यूजन मोड में perfused.
- क्रेब्स-हेन्सेलेट समाधान से भरे सिरिंज से दिल की कैनुला को अलग करें और इसे क्रेब्स-हेनेसेलिट समाधान में 0.1% मेथिलीन नीले रंग के गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) समाधान से भरे सिरिंज से कनेक्ट करें। चूहे के दिल के लिए 5 मिलीलीटर सिरिंज और माउस दिल के लिए 1-2 एमएल सिरिंज का उपयोग करें।
नोट: एक विकल्प दबाव- या प्रवाह-नियंत्रित (जैसे, Langendorff) उपकरण को नीले रंग की डाई युक्त समाधान के साथ भरना है। टुकड़ी और बढ़ते प्रक्रिया के दौरान, प्रवेशनी में किसी भी हवा के बुलबुले को नहीं छोड़ना और कोरोनरी धमनी reocclusion के लिए इस्तेमाल किया सीवन ढीला नहीं करने के लिए आवश्यक है। - आगे ~ 4 mL / मिनट की दर से मेथिलीन नीले समाधान के 4 मिलीलीटर के साथ चूहे के दिल को पार करना और ~ 0.5-1 मिलीलीटर / मिनट की दर से मेथिलीन नीले समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ माउस दिल को परफ्यूज करना।
नोट: अनुभव के आधार पर, दोनों तकनीकें सुरक्षित हैं और पर्याप्त धुंधला प्रदान करती हैं; हालांकि, एक दबाव-नियंत्रित पंप / हाइड्रोस्टेटिक दबाव प्रणाली का उपयोग करना नौसिखिए वैज्ञानिकों के लिए ओवरस्टेनिंग के खिलाफ एक अधिक समय लेने वाला लेकिन सुरक्षित विकल्प है। - सिरिंज से कैनुला डिस्कनेक्ट करें और प्रवेशनी से दिल को हटा दें।
- टिशू पेपर पर दिल के कोमल रोलिंग द्वारा अतिरिक्त मेथिलीन नीले रंग को हटा दें। हेमोस्टेटिक संदंश को खोलकर और अतिरिक्त मेथिलीन नीले रंग को हटाने के बाद ही सर्जिकल टांके से प्लास्टिक टयूबिंग को हटाकर कोरोनरी धमनी के चारों ओर लिगेचर को ढीला करें।
नोट: इस स्तर पर, माउस दिल को एक छोटे प्लास्टिक बैग या फ्रीजर (-20 डिग्री सेल्सियस) में 5-10 मिनट तक के लिए 5 एमएल सेंट्रीफ्यूज माइक्रोट्यूब में रखना संभव है। प्रत्येक प्रयोगशाला में प्रयोगात्मक रूप से अधिकतम ठंड का समय निर्धारित किया जाना चाहिए। एक माउस दिल की अल्पकालिक ठंड एक नौसिखिया प्रयोगकर्ता को इसे 1-मिमी-मोटी स्लाइस में काटने में मदद कर सकती है। चूहे के दिल की ठंड की सिफारिश नहीं की जाती है। -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट से अधिक समय के लिए ओवरफ्रीजिंग से बचा जाना चाहिए। - दिल की टुकड़ा करने की क्रिया के लिए एक स्टेनलेस स्टील मैट्रिक्स ( सामग्री की तालिका देखें) में दाग चूहे के दिल जगह (चित्रा 1 ए). फिर, दिल के वेंट्रिकल्स को 2-मिमी-मोटी स्लाइस में काट लें (एक वयस्क चूहे के दिल के 6-7 स्लाइस का लक्ष्य रखें)। माउस के दिल के लिए, दिल के वेंट्रिकल्स को 1.5-मिमी-मोटी स्लाइस में काटें (एक वयस्क माउस दिल के कम से कम 4 स्लाइस का लक्ष्य रखें)।
नोट: स्लाइसिंग मैट्रिक्स-संगत रेजर ब्लेड का उपयोग किया जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, संगत एकल-किनारे रेजर ब्लेड (उदाहरण के लिए, 0.01 इंच (0.254 मिमी) तक की मोटाई) का उपयोग चूहे के दिल को टुकड़ा करने के लिए किया जा सकता है। डबल-एज रेजर ब्लेड आमतौर पर माउस के दिल के लिए उपयोग किए जाते हैं और आमतौर पर मोटाई में 0.004 इंच (0.1 मिमी) तक होते हैं।
चित्रा 1: चूहे के दिल और मस्तिष्क की टुकड़ा करने की क्रिया के लिए आव्यूह ( ए) चूहा दिल, (बी) चूहा मस्तिष्क। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
- काटने के बाद, स्लाइस को 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में स्थानांतरित करें। दिल के स्लाइस के साथ ट्यूब में फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) में भंग 1% ट्राइफेनिलटेट्राज़ोलियम क्लोराइड (टीटीसी) के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- टीटीसी समाधान में इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस के साथ कम से कम 2-3 बार दिल के स्लाइस को धोएं और छवि कैप्चर के लिए तैयार रहें।
2. मस्तिष्क धुंधला और टुकड़ा करने की क्रिया
- मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा प्रयोग 3,12 के बाद, मस्तिष्क को खोपड़ी से ब्रेनस्टेम सहित हटा दें, और इसे बर्फ-ठंडे पीबीएस में धो लें।
- जानवरों के वजन के आधार पर मस्तिष्क स्टेनलेस-स्टील मैट्रिक्स का सही आकार चुनें ( सामग्री की तालिका देखें) (चित्रा 1 बी)। मस्तिष्क मैट्रिक्स में अपने वेंट्रल पक्ष के साथ मस्तिष्क को रखें।
नोट: जब मैट्रिक्स में बैठे होते हैं, तो मस्तिष्क की वेंट्रल सतह मोल्ड की शीर्ष सतह के समानांतर होनी चाहिए। - ब्लेड का उपयोग करके, मस्तिष्क के ललाट और पुच्छल भागों (दोनों तरफ से 2 ब्लेड) को प्रतिबंधित करें।
नोट: स्लाइसिंग मैट्रिक्स-संगत रेजर ब्लेड का उपयोग किया जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, एक संगत, एकल-किनारे रेजर ब्लेड (0.01 इंच (0.254 मिमी) तक की मोटाई) का उपयोग चूहे के मस्तिष्क के टुकड़ा करने के लिए किया जा सकता है। - ब्लेड को आंशिक रूप से (मस्तिष्क को पूरी तरह से नहीं काटने) को पहले और अंतिम ब्लेड के बीच चैनलों में रखें। जब सभी ब्लेड डाले जाते हैं और समानांतर में व्यवस्थित होते हैं, तो मस्तिष्क को 2 मिमी कोरोनल स्लाइस में काटने के लिए एक ही समय में हथेली के साथ सभी ब्लेड दबाएं।
- दो उंगलियों के साथ पक्षों के साथ दृढ़ता से ब्लेड को समझें और उन्हें मैट्रिक्स से कटा हुआ मस्तिष्क के साथ एक साथ हटा दें।
- मस्तिष्क स्लाइस को एक ट्रे (70 मिलीलीटर, 72 x 72 मिमी) में एक-एक करके व्यवस्थित करें। स्लाइस की व्यवस्था करते समय, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक स्लाइस की पूर्वकाल सतह हमेशा ऊपर का सामना कर रही है।
- मस्तिष्क स्लाइस पर पीबीएस में गर्म (+ 37 डिग्री सेल्सियस) 1% टीटीसी समाधान डालें, और उन्हें अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: मस्तिष्क स्लाइस पूरी तरह से इनक्यूबेशन के दौरान TTC समाधान में विसर्जित किया जाना चाहिए। - 1% टीटीसी समाधान में इनक्यूबेशन के बाद, छवियों को कैप्चर करने के लिए मस्तिष्क स्लाइस को नीले प्लास्टिक ट्रे में स्थानांतरित करें। ललाट से पुच्छल भाग तक अनुक्रमिक क्रम में मस्तिष्क स्लाइस को व्यवस्थित करें, और सैगिटल विमान में गोलार्धों को अलग करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
नोट: ट्रे की सतह धोने योग्य, मैट, और एक रंग की होनी चाहिए जो मस्तिष्क स्लाइस के विपरीत है (यानी, लाल, सफेद या पीला गुलाबी नहीं)।
3. मैक्रो फोटोग्राफी
- धुंधला होने के तुरंत बाद ऊतक स्लाइस की तस्वीर लें।
नोट: दिल के स्लाइस को ठंडे पीबीएस (+4 डिग्री सेल्सियस पर) या फॉर्मेलिन समाधान में 30 मिनट तक संग्रहीत किया जा सकता है। मस्तिष्क स्लाइस को लंबे समय तक (1-2 सप्ताह) के लिए फॉर्मेलिन में संग्रहीत किया जा सकता है। - एक स्टैंड पर एक चार्ज बैटरी, मेमोरी कार्ड और संलग्न लेंस के साथ पसंद का कैमरा सेट करें (चित्रा 2)
नोट: उपकरण को गर्म करने के लिए छवि अधिग्रहण से पहले कम से कम 5-10 मिनट पर रोशनी चालू करें। एलईडी रोशनी माइक्रोसेकंड में पूर्ण चमक तक पहुंचती है।
चित्रा 2: कैमरा और लाइट्स मैक्रो फोटोग्राफी के लिए स्थापित किया गया है। कैमरा इमेजिंग सतह पर लंबवत है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कैमरे का फोकल प्लेन नमूनों के समानांतर है। संक्षिप्त नाम: एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
- उपलब्ध प्रकाश स्रोतों के आधार पर, उपयुक्त सफेद संतुलन सेटिंग्स का चयन करें या कैमरा मैनुअल में दिए गए निर्देशों के अनुसार रंग तापमान अंशांकन करें।
नोट: सफेद एलईडी प्रकाश (रंग तापमान 6,500 K) फ्लोरोसेंट प्रकाश बल्बों द्वारा झिलमिलाहट प्रकाश से बचने के लिए पसंदीदा प्रकाश स्रोत है। - कैमरे को पूरी तरह से मैन्युअल मोड पर स्विच करें, आईएसओ 100 और एपर्चर को एफ / 10 पर सेट करें, और इष्टतम छवि जोखिम के लिए शटर गति को समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि कैमरा फोकल प्लेन उस सतह के समानांतर है जहां नमूना रखा जाएगा।
नोट: हिस्टोग्राम फ़ंक्शन यह सुनिश्चित करने के लिए उपयोगी है कि ऊतक स्लाइस ओवरएक्सपोज्ड नहीं हैं। - शटर जारी होने पर कैमरा शेक को रोकने के लिए वायर्ड या वायरलेस रिमोट ट्रिगर अनुलग्न या सक्षम करें.
नोट:: एक विकल्प एक विलंबित शटर फ़ंक्शन को सक्षम करने के लिए है, जो ट्रिगर बटन दबाने के बाद 2 या 10 सेकंड के लिए ट्रिगर में देरी करेगा। - पीबीएस के साथ एक कंटेनर में दिल के स्लाइस को पूरी तरह से विसर्जित करें।
नोट: विसर्जित स्लाइड्स अपनी स्थिति से दूर तैरने के लिए करते हैं। स्लाइस के फ्लोटिंग को कम करने के लिए, सबसे छोटी संभव ट्रे का उपयोग करें जिसमें सभी स्लाइस फिट हो सकते हैं और विसर्जन समाधान की न्यूनतम मात्रा, यह सुनिश्चित करते हुए कि नमूना पूरी तरह से डूबा हुआ है। वैकल्पिक विधियों में ग्लास स्लाइड के बीच स्लाइस रखना या लेंस पर ध्रुवीकरण फ़िल्टर का उपयोग करना शामिल है। एक परिपत्र ध्रुवीकरण फ़िल्टर लेंस से जुड़ा होता है और तब तक घुमाया जाता है जब तक कि कैमरे के लाइव-व्यू डिस्प्ले में प्रतिबिंब गायब नहीं हो जाते। - पीबीएस या अन्य तरल पदार्थों के बिना एक सूखी ट्रे में मस्तिष्क स्लाइस की व्यवस्था करें।
नोट: एक polarizing फिल्टर मस्तिष्क स्लाइस की छवियों को कैप्चर करने के लिए बहुत सुविधाजनक है। - मैक्रो लेंस के साथ कैमरे के नीचे स्लाइस के साथ कंटेनर रखें और सुनिश्चित करें कि सभी स्लाइस दृश्य के क्षेत्र में पूरी तरह से फिट हों। सुनिश्चित करें कि स्लाइस एक ही विमान पर हैं, यानी, घुमावदार या लुढ़का हुआ नहीं है।
- एक्सपोजर की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो कैमरा सेटिंग्स को समायोजित करें।
नोट:: एक बार सेट करने के बाद, पूरे प्रयोग के दौरान एक्सपोज़र और अन्य सेटिंग्स परिवर्तित न करें। - नमूने की संख्या (या अन्य पहचान) को कैप्चर करें और एक दूरस्थ ट्रिगर का उपयोग करके ऊतक स्लाइस की छवि बनाएं।
नोट: एक आकार मार्कर, जैसे कि एक मिमी शासक, को दृश्य के क्षेत्र में शामिल किया जाना चाहिए जब नमूना आकार का पूर्ण परिमाणीकरण आवश्यक हो। - स्लाइस घुमाएं और दूसरी तरफ से उनकी छवियों को कैप्चर करें।
Representative Results
चित्रा 3 ए मायोकार्डियल रोधगलन के बाद एक मेथिलीन नीले और टीटीसी-दाग वाले दिल के टुकड़े की एक तस्वीर है, जिसमें इंफार्क्ट आकार (चित्रा 3 बी) के आगे के प्लानिमेट्रिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त विवरण और रंग की जानकारी शामिल है। हमने परीक्षण किया कि 24 घंटे के लिए दिल की ठंड दिल के ऊतकों की अखंडता को कैसे प्रभावित करती है (चित्रा 3 सी)। लंबे समय तक ठंड (>1 ज, चित्रा 3 सी) माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को कम करता है; इस प्रकार, दिल का टीटीसी धुंधला लाल नहीं है, लेकिन पीला गुलाबी है, और परिगलित और व्यवहार्य ऊतकों के बीच की सीमा धुंधली है (चित्रा 3 सी)।
इसके अलावा, नमूनों में प्रतिबिंबों की कमी के लिए दो तरीकों की तुलना की गई थी। विसर्जन सबसे कुशल विधि है और अच्छे विपरीत (चित्रा 4 ए) के साथ विस्तृत छवियों का उत्पादन करती है। दूसरी विधि लेंस से जुड़े ध्रुवीकरण फिल्टर का उपयोग है। ध्रुवीकरण फ़िल्टर भी प्रभावी है; हालांकि, फ़िल्टर थोड़ा संकल्प और छवि के microcontrast (चित्रा 4B) को कम कर देता है। विसर्जन या फ़िल्टर के बिना दिल के टुकड़े की एक उदाहरण छवि (चित्रा 4 सी) में कई प्रतिबिंब होते हैं और आगे के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है।
स्लाइस प्रबंधन (फ्लोटिंग) समस्याओं के कारण मस्तिष्क स्लाइस विसर्जित नहीं होते हैं। प्लानमेट्रिक विश्लेषण में, मस्तिष्क के अप्रभावित (स्वस्थ) पक्ष (चित्रा 5 ए) की तुलना स्ट्रोक-प्रभावित पक्ष (चित्रा 5 बी) के साथ करना महत्वपूर्ण है। मस्तिष्क स्लाइस एक सूखी प्लेट या ट्रे पर प्रबंधित करना आसान होता है, और प्रतिबिंब को हटाने के लिए एक ध्रुवीकरण फ़िल्टर का उपयोग किया जाता है। नीली पृष्ठभूमि के साथ एक ट्रे का उपयोग मस्तिष्क स्लाइस फोटोग्राफी के लिए किया जाता है (पृष्ठभूमि चयन पहले वर्णित 5)।
मैन्युअल कैमरा सेटिंग्स का उपयोग एक्सपोज़र और सफेद संतुलन के पूर्ण नियंत्रण को सुनिश्चित करने के लिए किया गया था। कैमरा सेटिंग्स को उपलब्ध प्रकाश स्रोत के अनुसार प्रयोग से पहले या शुरुआत में समायोजित किया जाना चाहिए। यह समान विश्लेषण (चित्रा 6 ए) की अनुमति देने के लिए सभी छवियों के इष्टतम जोखिम और सफेद संतुलन को सुनिश्चित करता है। कैमरे की स्वचालित सेटिंग्स सही नहीं हैं और इसके परिणामस्वरूप अलग-अलग कैमरा पैरामीटर हो सकते हैं, जिससे अनुचित परिणाम और छवि-से-छवि परिवर्तनशीलता की शुरुआत हो सकती है।
चित्रा 6 overexposed (चित्रा 6B) और underexposed छवियों (चित्रा 6C) दिल स्लाइस के उदाहरण से पता चलता है. कैमरा-लाइट सेटअप में उपयोग किए जाने वाले एक विशेष प्रकाश स्रोत से मेल खाने के लिए कैमरे की सही सफेद संतुलन सेटिंग्स पर पर्याप्त ध्यान दिया जाना चाहिए। गलत सफेद संतुलन सेटिंग्स के परिणामस्वरूप छवि में नीले या पीले (चित्रा 6 डी) और मैजेंटा या हरे (चित्रा 6 ई) में बदलाव हो सकता है।
चित्रा 3: चूहे कार्डियक स्लाइस की छवियां( A) ताजा दिल के स्लाइस का विश्लेषण ImageProPlus 6.3 सॉफ़्टवेयर में रंग विभाजन (B) का उपयोग करके किया गया था। (सी) टीटीसी धुंधला खराब जमे हुए दिल के टुकड़े में व्यवहार्य और परिगलित ऊतक के बीच भेदभाव करता है (24 घंटे के लिए जमे हुए)। संक्षिप्त रूप: TTC = 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium क्लोराइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: प्रतिबिंबों की कमी के लिए तकनीक। चूहा दिल टुकड़ा छवि PBS (ए) में विसर्जित पर कब्जा कर लिया और polarizing फिल्टर (बी) का उपयोग कर. (सी) प्रतिबिंब के साथ दिल टुकड़ा जब न तो विसर्जन और न ही फिल्टर का उपयोग किया जाता है। संक्षिप्त नाम = PBS = फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: चूहे के मस्तिष्क स्लाइस की छवियां। चूहे के मस्तिष्क को सात स्लाइस में काट दिया गया था और इस्केमिया-reperfusion के बाद टीटीसी के साथ दाग दिया गया था। ध्रुवीकरण फ़िल्टर का उपयोग करने से प्रतिबिंब-मुक्त छवि के अधिग्रहण में परिणाम होता है। (ए) अक्षतिग्रस्त गोलार्ध से स्लाइस; (बी) स्ट्रोक से प्रभावित गोलार्ध से स्लाइस। संक्षिप्त रूप: TTC = 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium क्लोराइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: चूहा दिल टुकड़ा छवियों. सही ढंग से (ए) और गलत तरीके से (बी-ई) ने दिल की स्लाइस छवियों पर कब्जा कर लिया। गलत एक्सपोज़र सेटिंग्स के परिणामस्वरूप overexposed (B) और underexposed images (C) होते हैं। गलत सफ़ेद संतुलन सेटिंग्स के परिणामस्वरूप छवि (E) में पीला (D) या हरा कास्ट होता है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
आईआर के बाद दिल की तैयारी रक्त कार्डियक धमनियों के पुनर्संचरण और गैर-जोखिम वाले क्षेत्रों से जोखिम वाले क्षेत्रों के भेदभाव के लिए नीले डाई के छिड़काव के साथ शुरू होती है। मेथिलीन ब्लू या इवांस नीले रंग के रंगों का उपयोग इस उद्देश्य के लिए सबसे अधिक बार किया जाता है2। जैसा कि अत्यधिक उच्च दबाव दिल के वाल्व को नुकसान पहुंचा सकता है और इस प्रकार, आंशिक रूप से या पूरी तरह से दाग-जोखिम वाले क्षेत्रों में, दिल को दबाव-नियंत्रित प्रणाली के साथ पारफ्यूज करना बेहतर होता है, जैसे कि लैंगेनडॉर्फ उपकरण या हाइड्रोस्टेटिक दबाव प्रणाली से सुसज्जित सिरिंज या पंप का एक सरलीकृत संस्करण। नियंत्रित परफ्यूजन शारीरिक दबाव सुनिश्चित करेगा, और डाई आमतौर पर दिल के occluded क्षेत्र में प्रवेश नहीं करेगा। प्रवाह की गति और दबाव-नियंत्रित दोनों तकनीकें ओवरस्टेनिंग के खिलाफ सुरक्षा उपाय हैं।
व्यवहार्य ऊतक प्रसंस्करण में सबसे गंभीर गलतियों में से एक ऊतकों को धुंधला होने से पहले लंबे समय तक फ्रीजर में रखना है। ठंड का उपयोग मुख्य रूप से किया जाता है क्योंकि शोधकर्ता आईआर प्रयोग के अगले दिन या बाद में दिल को धुंधला करना चाहते हैं। इसके अलावा, ठंड का उपयोग दिल की कटाई को आसान बनाने के लिए किया जाता है। हमने पाया कि 5-10 मिनट तक दिल की अल्पकालिक ठंड नगण्य रूप से हृदय के ऊतकों की अखंडता को प्रभावित करती है और ऊतकों (विशेष रूप से माउस के दिल के लिए) को पतले स्लाइस में काटने की सुविधा प्रदान करती है। हालांकि, लंबे समय तक ठंड झिल्ली को नुकसान पहुंचाती है और सेल व्यवहार्यता और माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को कम करती है। नतीजतन, कामकाजी माइटोकॉन्ड्रिया के टीटीसी धुंधला प्रभावित होता है, और परिगलित और व्यवहार्य ऊतकों के बीच की सीमा खराब रूप से चित्रित (धुंधली) होती है। कुल मिलाकर, चूहे के हार्ट्स की ठंड से बचा जाना चाहिए, और माउस के दिलों की केवल अल्पकालिक ठंड का उपयोग आसान काटने के लिए किया जा सकता है।
अगला कदम 37 डिग्री सेल्सियस 14 पर 1% टीटीसी समाधान में ऊतक धुंधला है। धुंधला समाधान prewarmed होना चाहिए- विशेष रूप से मस्तिष्क स्लाइस के दाग के लिए महत्वपूर्ण है। Prewarmed समाधान का उपयोग करते समय, दिल के स्लाइस के लिए इष्टतम धुंधला समय 10 मिनट है। लंबे इनक्यूबेशन या 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान के परिणामस्वरूप हृदय के ऊतकों का भूरा रंग होता है। नमूनों के उचित धुंधला और लगातार लाल रंग की तीव्रता आगे की छवि विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण हैं। फोटोग्राफी से पहले अंतिम चरणों में, ऊतक स्लाइस को ठंडे पीबीएस या एक समान बफर के साथ 2-3 बार कुल्ला जाता है ताकि टीटीसी को हटाने के लिए और तस्वीर में नीले रंग की कास्टिंग से बचने के लिए समाधान से अतिरिक्त मेथिलीन नीले रंग को हटा दिया जा सके। सबसे अच्छी छवि गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए धुंधला होने के तुरंत बाद दिल के स्लाइस की तस्वीर ली जानी चाहिए। दिल का धुंधला होना अच्छी गुणवत्ता का रहता है यदि ठंड (+ 4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस में 60 मिनट तक संग्रहीत किया जाता है। सना हुआ मस्तिष्क स्लाइस और महाधमनी ऊतकआमतौर पर 4% तटस्थ फॉर्मेल्डिहाइड समाधान में संग्रहीत होते हैं और एक सप्ताह के लिए अच्छी गुणवत्ता बनाए रखते हैं। फॉर्मेलिन (+4 डिग्री सेल्सियस) में मस्तिष्क के ऊतकों का रातोंरात भंडारण सामान्य ऊतक की रंग तीव्रता को खराब नहीं करता है और छवि अधिग्रहण के लिए स्वीकार्य है। हालांकि, फॉर्मेलिन दिल के स्लाइस की सूजन और destaining को प्रेरित करता है। इसलिए, फॉर्मेलिन में हृदय के ऊतकों के भंडारण की सिफारिश नहीं की जाती है।
अगला कदम छवि अधिग्रहण है। कई प्रयोगशालाएं एक छवि अधिग्रहण उपकरण के रूप में फ्लैटबेड स्कैनर का उपयोग करती हैं जो डिजिटल कैमरा और प्रकाश व्यवस्था सेटअप को बदलने की उम्मीद है। हमने निर्धारित किया कि स्लाइस की स्कैनिंग पर्याप्त छवि रिज़ॉल्यूशन और रंग पृथक्करण प्रदान नहीं करती है और इसलिए इमेजिंग दिल के स्लाइस के लिए उपयुक्त नहीं है। विशेष रूप से, माउस दिल के लिए स्कैनर रिज़ॉल्यूशन अपर्याप्त है, और हमने मेथिलीन नीले रंग के खराब प्रतिपादन को देखा। इसके विपरीत, एक स्कैनर इमेजिंग मस्तिष्क स्लाइस के लिए एक फोटो कैमरे का विकल्प हो सकता है जो केवल टीटीसी या अन्य एकल रंजक के साथ सना हुआ है। ऊतक स्लाइस की स्कैनिंग के लिए, स्कैनिंग सॉफ़्टवेयर जो निरंतर एक्सपोज़र सेटिंग्स सुनिश्चित करता है, आवश्यक है। कुल मिलाकर, एक फ्लैटबेड स्कैनर कम सक्षम है और अधिकांश इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए डिजिटल कैमरे को प्रतिस्थापित नहीं कर सकता है।
नमूनों के पीछे की पृष्ठभूमि भी महत्वपूर्ण है। आदर्श रूप से, ट्रे का निचला हिस्सा एक रंग का होना चाहिए जो दाग वाले नमूने में मौजूद नहीं है। उदाहरण के लिए, मेथिलीन नीले और टीटीसी (लाल) के क्षेत्र को स्वचालित या अर्ध-स्वचालित तरीके से धुंधला करने के लिए, सफेद, लाल, नीले, पीले और भूरे रंग की पृष्ठभूमि से बचा जाना चाहिए। इस प्रकार, एक हरे रंग की पृष्ठभूमि बेहतर होगी। फिर भी, रंग चयन ऑपरेटर की प्राथमिकताओं पर निर्भर करता है, जो छवि को पोस्टप्रोसेस करता है। कई वैज्ञानिक एक सफेद पृष्ठभूमि पसंद करते हैं क्योंकि एक सफेद पृष्ठभूमि को छवि पोस्टप्रोसेसिंग में हटाया जा सकता है और पूरी तरह से सफेद (आरजीबी सफेद कोड 255,255,255) में परिवर्तित किया जा सकता है। फिर, किसी को अर्ध-स्वचालित विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले चयनित रंगों की सूची से पूरी तरह से सफेद को बाहर करना चाहिए और केवल पीले नेक्रोटिक क्षेत्रों की गिनती करनी चाहिए, जो पूरी तरह से सफेद नहीं हैं यदि अतिरंजित नहीं हैं। नीले और हरे रंग की पृष्ठभूमि मस्तिष्क स्लाइस और महाधमनी की फोटोग्राफी के लिए उपयुक्त हैं।
ऊतक फोटोग्राफी के लिए इष्टतम इमेजिंग उपकरण एक संगत मैक्रो लेंस के साथ एक एकल लेंस पलटा या मिररलेस विनिमेय लेंस डिजिटल कैमरा है। बहुत छोटी वस्तुओं को कैप्चर करने के लिए एक कैमरे और माइक्रोस्कोप के संयोजन की आवश्यकता हो सकती है; फिर भी, एक मैक्रो लेंस में आमतौर पर माउस दिल की विस्तृत छवियों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त (कम से कम 1: 2) आवर्धन होता है। कई निर्माता उच्च-रिज़ॉल्यूशन और उच्च-आवर्धन तस्वीरों को प्राप्त करने के लिए सस्ती डिजिटल कैमरे और मैक्रो लेंस प्रदान करते हैं। सभी अप-टू-डेट डिजिटल कैमरों में मैक्रो फोटोग्राफी के लिए आवश्यक विशेषताएं और कार्य होते हैं, जिसमें स्टैंड पर माउंट करने की संभावना, पिक्सेल की एक उच्च संख्या (आमतौर पर >20 एमपीएक्स), लाइव व्यू, मिरर लॉक-अप, टाइम-लैप्स विशेषताएं, रिमोट शटर, और मैन्युअल रूप से कैमरा पैरामीटर सेट करने की क्षमता शामिल है, इस प्रकार एक निरंतर शटर गति, एपर्चर, सफेद संतुलन और आईएसओ सेटिंग सुनिश्चित करना। उपर्युक्त सुविधाओं और कम से कम 1: 2 के लेंस आवर्धन के साथ कॉम्पैक्ट कैमरों का उपयोग मैक्रो फोटोग्राफी के लिए भी किया जा सकता है। लेंस विशेषताओं के कारण, कुछ कॉम्पैक्ट कैमरों को वस्तु के करीब निकटता में रखा जाना चाहिए, और प्रयोगकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि कैमरा बॉडी नमूने की रोशनी को प्रभावित न करे।
किसी भी प्रकार के विनिमेय लेंस कैमरे के साथ मैक्रो फोटोग्राफी के लिए, एक उच्च आवर्धन (1: 1-1: 2) मैक्रो लेंस की आवश्यकता होती है। हम पूर्ण फ्रेम (24 मिमी x 36 मिमी) सेंसर पर 50 मिमी से 100 (120) मिमी या समकक्ष तक की फोकल लंबाई के साथ मैक्रो लेंस का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। छोटे सेंसर कैमरों में अलग-अलग सेंसर आकार होते हैं, और आवर्धन को तदनुसार पुनर्गणना की जानी चाहिए। दिल के स्लाइस की फोटोग्राफी के लिए, विषय के लिए 100 मिमी मैक्रो लेंस फ्रंट तत्व की एक एर्गोनोमिक दूरी लगभग 150 मिमी है। यह सेटिंग ऑपरेटरों को कैमरा नियंत्रण तक आसान पहुंच के साथ, एक मेज पर सभी उपकरणों को रखने की अनुमति देती है। मस्तिष्क स्लाइस जैसी बड़ी वस्तुओं की फोटोग्राफी के लिए 50 मिमी मैक्रो लेंस पर विचार किया जा सकता है, क्योंकि एक ही तस्वीर में सभी स्लाइस प्राप्त करने के लिए दृश्य का एक व्यापक क्षेत्र आवश्यक है।
उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ तेज छवियों को प्राप्त करने के लिए, एक कैमरे को एक मजबूत स्टैंड पर लगाया जाना चाहिए, जिसे एक प्रकाश सेटअप के साथ, एक फोटोग्राफी कॉपी स्टैंड कहा जाता है। एक स्टैंड और एक रिमोट (वायर्ड या वायरलेस) ट्रिगर पर कैमरे को माउंट करना कैमरा शेक को खत्म कर देता है और लक्ष्य से निरंतर दूरी सुनिश्चित करता है। दोनों तरफ से दो निरंतर-प्रकाश स्रोतों के साथ एक कैमरा-लाइटिंग सेटअप, विषय विमान के सापेक्ष लगभग 30-60 डिग्री को कोण करता है, नमूनों की पर्याप्त रोशनी सुनिश्चित करता है और एक ही समय में प्रतिबिंब से बचने में मदद करता है। कैमरे को ठीक से माउंट किया जाना चाहिए ताकि सेंसर विषय विमान के समानांतर हो। छवि क्षेत्र को समान रूप से रोशन करने के लिए, दोनों लैंप को समान रूप से उन्मुख किया जाना चाहिए और विषय से समान दूरी पर रखा जाना चाहिए। विषय से विभिन्न दूरी पर रखे गए प्रकाश स्रोत असमान रोशनी का कारण बनते हैं। इसके अतिरिक्त, प्रकाश स्रोतों को झपकाना छवि जोखिम में भिन्नताओं का एक कारण है। कुल मिलाकर, अच्छी तरह से प्रकाशित नमूनों की छवियों को ठीक से प्राप्त करने के लिए कैमरे और प्रकाश स्रोतों को सटीक रूप से रखना महत्वपूर्ण है।
ऊतक के नमूने प्रकाश (चमक) को प्रतिबिंबित करते हैं, जो छवियों में सफेद धब्बे के रूप में दिखाई देते हैं। इन प्रकाश प्रतिबिंब धब्बों में उपयोगी रंग जानकारी नहीं होती है, और तदनुसार, छवियों के इन हिस्सों का उपयोग छवियों के सटीक मात्रात्मक विश्लेषण के लिए नहीं किया जा सकता है। ऊतक स्लाइस से प्रकाश प्रतिबिंब को विभिन्न तरीकों से हटाया जा सकता है। सबसे कुशल एक खारा या पीबीएस समाधान के साथ एक कंटेनर में ऊतक के नमूनों का पूर्ण विसर्जन है। एक समान दृष्टिकोण कांच की प्लेटों के नीचे (या बीच में) ऊतक स्लाइस का सम्मिलन है। यह विधि प्रतिबिंबों के खिलाफ कुशल है; हालांकि, छवि संकल्प विसर्जित ऊतकों की तस्वीरों की तुलना में कम हो सकता है।
कोई भी प्रकाश प्रतिबिंब को खत्म करने के लिए एक लेंस पर घुड़सवार ध्रुवीकरण फिल्टर का उपयोग कर सकता है। परिपत्र polarizing फिल्टर व्यापक रूप से उपलब्ध हैं, लेकिन कीमत के आधार पर गुणवत्ता में काफी भिन्न होते हैं, और सस्ते फिल्टर छवि संकल्प को काफी कम कर सकते हैं। परावर्तित प्रकाश को एक कोण पर ध्रुवीकरण फ़िल्टर के चलती भाग को मोड़कर फ़िल्टर किया जा सकता है। ध्रुवीकरण फ़िल्टर की प्रभावकारिता कुछ प्रकाश स्रोतों (उदाहरण के लिए, मजबूत एलईडी प्रकाश) से प्रभावित हो सकती है। कुल मिलाकर, अतिरिक्त तरल को हटाने के बाद, एक ध्रुवीकरण फ़िल्टर मस्तिष्क स्लाइस से सभी प्रतिबिंबों को समाप्त कर सकता है; हालांकि, बफर समाधान में नमूना विसर्जन दिल के स्लाइस के लिए सबसे आसान और सबसे अधिक लागत-कुशल दृष्टिकोण है।
इमेजिंग प्रक्रिया के पूर्ण नियंत्रण को बनाए रखने के लिए शटर गति, एपर्चर, आईएसओ और सफेद संतुलन की मैनुअल सेटिंग्स महत्वपूर्ण हैं। प्रकाश स्रोत का नमूना, पृष्ठभूमि और विशेषताएं स्वचालित सेटिंग्स में कैमरा एक्सपोजर पैमाइश प्रणाली को प्रभावित करती हैं; इसलिए, मैन्युअल सेटिंग्स प्रयोग के दौरान कई तस्वीरों के बीच निरंतर जोखिम और सफेद संतुलन बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। मैक्रो फोटोग्राफी के लिए, सुझाई गई एपर्चर सेटिंग f/8 और f/16 के बीच है। एपर्चर को कम करने से, क्षेत्र की गहराई बढ़ जाती है, जो सहायक होती है यदि वस्तु एक ही विमान में नहीं है। हालांकि, विवर्तन छोटे एपर्चर के मामले में फोटोग्राफी के कुल रिज़ॉल्यूशन को सीमित करता है। अधिकांश लेंसों के लिए इष्टतम एपर्चर आमतौर पर एफ /10 होता है क्योंकि इस सेटिंग में, रिज़ॉल्यूशन ड्रॉप नगण्य है, और क्षेत्र की गहराई पर्याप्त है। आईएसओ मान जो 50 से 400 तक होते हैं (कम बेहतर होता है) आमतौर पर छवि कलाकृतियों (शोर) को कम करने के लिए इष्टतम होते हैं। शटर गति तब मौजूदा प्रकाश स्थितियों में उल्लिखित एपर्चर और आईएसओ सेटिंग्स का उपयोग करके सही जोखिम प्राप्त करने के लिए बदली जानी बाकी है। लगातार छवि विश्लेषण के लिए मैन्युअल सेटिंग्स महत्वपूर्ण हैं। मानकीकृत इमेजिंग किसी भी अध्ययन में एक ही रंग थ्रेशोल्डिंग सेटिंग्स का उपयोग सुनिश्चित करती है, जिसके लिए विभाजन विश्लेषण की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, ImagePro सॉफ़्टवेयर द्वारा अर्ध-स्वचालित विश्लेषण नीले, लाल और सफेद (+ पीला गुलाबी) के पूर्वनिर्धारित रंगों के साथ एक विभाजन फ़ाइल के आधार पर वर्षों से उपयोग किया जा सकता है यदि नमूना छवियों में लगातार रंग, सफेद संतुलन और एक्सपोजर हैं।
सफेद संतुलन सेटिंग को प्रकाश स्रोत के रंग के तापमान के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए जिसका उपयोग एक नमूने को रोशन करने के लिए किया जाता है। सफेद संतुलन कैमरा अंतर्निहित प्रीसेट से या ग्रे लक्ष्य के मैनुअल अंशांकन का उपयोग करके चुना जा सकता है। रॉ प्रारूप में छवि कैप्चरिंग का लाभ यह है कि छवि के सॉफ़्टवेयर पोस्टप्रोसेसिंग के दौरान सफेद संतुलन को समायोजित किया जा सकता है। चूंकि रॉ फ़ाइलों में जेपीईजी फ़ाइलों की तुलना में बहुत अधिक जानकारी होती है, रॉ फ़ाइल पोस्टप्रोसेसिंग रंग संतुलन और एक्सपोजर के सुधार के साथ-साथ बेहतर छवि रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रदान करती है। क्योंकि अधिकांश कैमरे जेपीईजी और रॉ फ़ाइलों को एक साथ कैप्चर कर सकते हैं, हम रॉ फ़ाइल को कैप्चर करने और इसे बैकअप के रूप में सहेजने का सुझाव देते हैं।
कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल चूहे के दिल और मस्तिष्क के ऊतकों को टुकड़ा करने की क्रिया और धुंधला करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है और आगे के विश्लेषण के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि अधिग्रहण के लिए प्रकाश और कैमरा सेटअप और फोटोग्राफी तकनीकों की स्थापना के लिए दिशानिर्देश प्रदान करता है। यह विधि सभी प्रयोगात्मक छोटे-पशु अंग फोटोग्राफी पर लागू होती है।
Disclosures
लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई संघर्ष नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों को अनुदान समझौते के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, कोई 857394 नहीं, प्रोजेक्ट FAT4BRAIN।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 50 mL syringe | Terumo | N/A | |
| Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
| Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
| Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
| Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
| Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
| Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
| Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
| Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
| Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
| Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
| Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
| Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
| Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
| Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
| Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
| Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
| Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
| Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
| Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
| Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
| Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
| Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
| Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
| Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
| Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |
References
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