Summary
Burada, iskemi-reperfüzyon deneyinden sonra kemirgen dokusu hazırlığının standartlaştırılmış metodolojisi için bir protokol ve yüksek çözünürlüklü görüntü elde etmek için aydınlatma ve kamera kurulumları oluşturma kılavuzları sunulmaktadır. Bu yöntem tüm deneysel küçük hayvan organ fotoğrafçılığına uygulanabilir.
Abstract
Makro fotoğrafçılık, kalitatif ve kantitatif analizler yapmak için çeşitli doku örneklerini yüksek büyütmede görüntülemek için uygulanabilir. Doku hazırlama ve ardından görüntü yakalama, iskemi-reperfüzyon (IR) deneyinden hemen sonra gerçekleştirilen adımlardır ve zamanında ve uygun özenle yapılmalıdır. Kalp ve beyindeki IR kaynaklı hasarın değerlendirilmesi için, bu makalede 2,3,5-triphenil-2H-tetrazolyum klorür (TTC) bazlı boyama ve ardından makro fotoğrafçılık açıklanmaktadır. Bilimsel makro fotoğrafçılık, kontrollü aydınlatma ve uygun bir görüntüleme kurulumu gerektirir. Standartlaştırılmış metodoloji, ucuz bir güncel dijital kamera ve makro lensin bir kombinasyonu kullanılsa bile yüksek kaliteli, ayrıntılı dijital görüntüler sağlar. Numune hazırlama ve görüntü elde etmede uygun teknikler ve olası hatalar tartışılmakta, doğru ve yanlış kurulumların görüntü kalitesi üzerindeki etkisine dair örnekler verilmektedir. Aşırı boyama, yanlış numune depolama ve yetersiz aydınlatma koşulları gibi yaygın hataların nasıl önleneceğine dair özel ipuçları verilmiştir. Bu makale, sıçan kalbi ve beyin dokusu dilimleme ve boyama için uygun metodolojiyi göstermekte ve yüksek çözünürlüklü görüntü elde etmek için aydınlatma ve kamera kurulumları ve fotoğrafçılık teknikleri oluşturmak için kılavuzlar sunmaktadır.
Introduction
Onlarca yıldır, kalp ve beyin dokusu örneklerinin fotoğraflanması ve analizi, yaşam bilimleri deneylerinin önemli bir parçası olmuştur. Bilim ve inovasyon ilerlemesi, süper çözünürlük yeteneğine sahip pahalı mikroskopların geliştirilmesini teşvik etmektedir. Fotomikrograflar, ayrıntılı talimatları izleyerek iyi kontrol edilen bir ışık ortamında elde edilir. Buna karşılık, makro fotoğrafçılık (1: 2 veya daha büyük büyütmede) genellikle uygunsuz görüntüleme kurulumları kullanılarak kontrolsüz bir ışık ortamında gerçekleştirilir. Çoğu zaman, numune hazırlama ve kamera kurulum tekniklerinin önemli ölçüde optimize edilmesi gerekir. Sonuç olarak, sınırlı kalitede makro fotoğraflar bilimsel dergilerde yaygın olarak yayınlanmıştır. Yetersiz görüntü çözünürlüğü ve kontrast, IR çalışmalarında hassas görüntü niceliği olanaklarını sınırlar.
Miyokardial1,2 ve beyin3,4 enfarktüslerinin deneysel prosedürleri ayrıntılı olarak tanımlanmıştır. Bu çalışmanın amacı, enfarktüs deneylerinden sonra kemirgen kalp ve beyin dokusu örneklerinin fotoğraflanması ve standartlaştırılmış analizi için bir sistemin nasıl kurulacağına dair adım adım bir rehber sağlamaktır. Bu, doku dilimleme, boyama ve kalp ve beyin örneklerinin makro fotoğrafçılığını içerir. Doku örneklerinin hazırlanması deneyin önemli bir parçasıdır ve planimetrik görüntü analizi sonuçları büyük ölçüde elde edilen görüntülerin kalitesine bağlıdır5.
Bu yöntemler özellikle kemirgen dokularında ölçümler ve görüntü planimetrik analizi yapmak için kullanışlıdır ve genel bilimsel makro fotoğrafçılık için değerli olabilir. Ek olarak, görüntülerin yüksek kalitesi ve tutarlılığı, dijital fotoğrafların otomatik analizinin yapılmasına izin verir, bu da zamandan tasarruf etmeye, kullanıcı girişinden kaçınmaya ve görüntü analizi sırasında hata veya önyargı riskini en aza indirmeye yardımcı olur. Bu, sağlam ve güvenilir verilerin üretilmesine neden olacak ve klinik öncesi keşiflerin kliniklerde yeni antiiskemik tedavilere çevrilmesini artıracaktır.
Protocol
Deneysel prosedürler, Avrupa Topluluğu'nun kılavuzlarına ve yerel yasa ve politikalara (Direktif 2010/63/EU) uygun olarak gerçekleştirilmiş ve tüm prosedürler Gıda ve Veterinerlik Servisi, Riga, Letonya tarafından onaylanmıştır.
1. Kalp boyama ve dilimleme
NOT: Bu protokolde açıklanan teknikler hem Langendorff perfüze izole sıçan veya fare kalbi6,7 hem de in vivo sıçan kalp IR yaralanma tahlilleri8,9,10,11'den sonra kullanılabilir. Bir in vivo IR yaralanma testinden sonra boyama için, kalbin eksize edildiği, bir kanül üzerine monte edildiği ve Langendorff perfüzyon modunda kısaca perfüze edildiği varsayılmaktadır.
- Kalp kanülünü Krebs-Henseleit çözeltisi ile doldurulmuş şırıngadan ayırın ve Krebs-Henseleit çözeltisinde% 0.1 metilen mavisi ılık (37 ° C) çözeltisi ile doldurulmuş bir şırıngaya bağlayın. Sıçan kalpleri için 5 mL'lik bir şırınga ve fare kalpleri için 1-2 mL'lik bir şırınga kullanın.
NOT: Bir alternatif, basınç veya akış kontrollü (örneğin, Langendorff) aparatı mavi boya içeren bir çözelti ile doldurmaktır. Ayrılma ve montaj işlemi sırasında kanül içinde hava kabarcığı bırakmamak ve koroner arter reoklüzyonu için kullanılan dikişin gevşetilmemesi esastır. - Daha fazla perfüze sıçan kalpleri ~ 4 mL / dak hızında metilen mavisi çözeltisi ile sıçan kalpleri ve ~ 0.5-1 mL / dak hızında 1 mL metilen mavisi çözeltisi ile fare kalplerini perfüze edin.
NOT: Deneyimlere dayanarak, her iki teknik de güvenlidir ve yeterli boyama sağlar; Bununla birlikte, basınç kontrollü bir pompa / hidrostatik basınç sistemi kullanmak, acemi bilim adamları için aşırı boyamaya karşı daha zaman alıcı ancak daha güvenli bir seçenektir. - Kanülü şırıngadan ayırın ve kalbi kanülden çıkarın.
- Kalbin doku kağıdı üzerinde hafifçe yuvarlanmasıyla fazla metilen mavisini çıkarın. Hemostatik forsepsleri açarak ve plastik boruyu cerrahi dikişten çıkararak koroner arter etrafındaki bağı gevşetin, ancak fazla metilen mavisini çıkardıktan sonra.
NOT: Bu aşamada, fare kalbini küçük bir plastik torbaya veya 5 mL'lik bir santrifüj mikrotüpüne dondurucuda (-20 ° C) 5-10 dakikaya kadar yerleştirmek mümkündür. Maksimum donma süresi her laboratuvarda deneysel olarak belirlenmelidir. Bir fare kalbinin kısa süreli donması, acemi bir deneycinin onu 1 mm kalınlığında dilimler halinde kesmesine yardımcı olabilir. Sıçan kalplerinin dondurulması önerilmez. -20 °C'de 10 dakikadan fazla aşırı donma önlenmelidir. - Lekeli sıçan kalbini, kalp dilimleme için paslanmaz çelik bir matrise yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 1A). Daha sonra, kalbin ventriküllerini 2 mm kalınlığında dilimler halinde kesin (yetişkin bir sıçan kalbinin 6-7 dilimini hedefleyin). Fare kalpleri için, kalbin ventriküllerini 1,5 mm kalınlığında dilimler halinde kesin (yetişkin bir fare kalbinin en az 4 dilimini hedefleyin).
NOT: Dilimleme matrisi uyumlu tıraş bıçakları kullanılmalıdır. Genel olarak, sıçan kalplerini dilimlemek için uyumlu tek kenarlı tıraş bıçakları (örneğin, 0,01 inç'e (0,254 mm) kadar kalınlık) kullanılabilir. Çift kenarlı tıraş bıçakları genellikle fare kalpleri için kullanılır ve genellikle 0,1 mm (0,004 inç) kalınlığa kadardır.
Resim 1: Sıçan kalbi ve beyin dilimlemesi için matrisler . (A) Sıçan kalbi, (B) sıçan beyni. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Kestikten sonra, dilimleri 15 mL'lik bir plastik tüpe aktarın. Kalp dilimleri ile tüpe fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözünmüş 5 mL% 1 trifeniltetrazolyum klorür (TTC) ekleyin ve 37 ° C'de bir su banyosunda 10 dakika boyunca inkübe edin.
- TTC çözeltisinde inkübasyondan sonra, kalp dilimlerini PBS ile en az 2-3 kez yıkayın ve görüntü yakalamaya hazırlanın.
2. Beyin boyama ve dilimleme
- Orta serebral arter tıkanıklığı deneyinden3,12 sonra, beyin sapı da dahil olmak üzere beyni kafatasından çıkarın ve buz gibi soğuk PBS'de yıkayın.
- Hayvanların ağırlığına bağlı olarak beynin paslanmaz çelik matrisinin doğru boyutunu seçin ( Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 1B). Beyni ventral tarafı yukarı doğru beyin matrisine yerleştirin.
NOT: Matrikse oturduğunda, beynin ventral yüzeyi kalıbın üst yüzeyine paralel olmalıdır. - Bıçakları kullanarak, beynin ön ve kaudal kısımlarını (her iki taraftan 2 bıçak) kısıtlayın.
NOT: Dilimleme matrisi uyumlu tıraş bıçakları kullanılmalıdır. Genel olarak, sıçan beyni dilimlemesi için uyumlu, tek kenarlı bir tıraş bıçağı (0,01 inç'e (0,254 mm) kadar kalınlık) kullanılabilir. - Bıçakları kısmen (beyni tamamen kesmeden) ilk ve son bıçaklar arasındaki kanallara yerleştirin. Tüm bıçaklar paralel olarak yerleştirildiğinde ve düzenlendiğinde, beyni 2 mm'lik koronal dilimler halinde kesmek için tüm bıçakları avuç içi ile aynı anda bastırın.
- Bıçakları iki parmağınızla yanlar boyunca sıkıca tutun ve dilimlenmiş beyinle birlikte matristen çıkarın.
- Beyin dilimlerini birer birer tepsiye yerleştirin (70 mL, 72 x 72 mm). Dilimleri düzenlerken, her dilimin ön yüzeyinin her zaman yukarı bakacak şekilde olduğundan emin olun.
- PBS'de ılık (+37 °C)% 1 TTC çözeltisini beyin dilimlerine dökün ve karanlıkta 37 ° C'de 8 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: Beyin dilimleri, inkübasyon sırasında TTC çözeltisine tamamen daldırılmalıdır. - % 1 TTC çözeltisinde inkübasyondan sonra, görüntüleri yakalamak için beyin dilimlerini mavi plastik tepsiye aktarın. Beyin dilimlerini frontalden kaudal kısma kadar sıralı sırayla düzenleyin ve sagital düzlemdeki yarımküreleri ayırmak için bir neşter kullanın.
NOT: Tepsinin yüzeyi yıkanabilir, mat ve beyin dilimlerine zıt bir renkte olmalıdır (yani kırmızı, beyaz veya soluk pembe değil).
3. Makro fotoğrafçılık
- Boyama işleminden hemen sonra doku dilimlerini fotoğraflayın.
NOT: Kalp dilimleri soğuk PBS'de (+4 °C'de) veya formalin çözeltisinde 30 dakikaya kadar saklanabilir. Beyin dilimleri formalinde uzun süre (1-2 hafta) saklanabilir. - İstediğiniz fotoğraf makinesini şarj edilmiş bir pil, hafıza kartı ve standa takılı lensle ayarlayın (Şekil 2)
NOT: Ekipmanı ısıtmak için görüntü almadan en az 5-10 dakika önce ışıkları açın. LED ışıklar mikrosaniyeler içinde tam parlaklığa ulaşır.
Resim 2: Makro fotoğrafçılık için ayarlanmış kamera ve ışıklar. Kamera, kameranın odak düzleminin örneklere paralel olmasını sağlamak için görüntüleme yüzeyine diktir. Kısaltma: LED = ışık yayan diyot. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Mevcut ışık kaynaklarına bağlı olarak, uygun beyaz dengesi ayarlarını seçin veya fotoğraf makinesi kılavuzundaki talimatlara göre renk sıcaklığı kalibrasyonu gerçekleştirin.
NOT: Beyaz LED ışık (renk sıcaklığı 6.500 K), floresan ampuller tarafından ışığın titreşmesini önlemek için tercih edilen ışık kaynağıdır. - Fotoğraf makinesini tamamen manuel moda geçirin, ISO 100'ü ve diyafram açıklığını f / 10 olarak ayarlayın ve optimum görüntü pozlaması için deklanşör hızını ayarlayın. Fotoğraf makinesi odak düzleminin, numunenin yerleştirileceği yüzeye paralel olduğundan emin olun.
NOT: Histogram işlevi, doku dilimlerinin aşırı pozlanmamasını sağlamak için kullanışlıdır. - Deklanşör serbest bırakıldığında kameranın titremesini önlemek için kablolu veya kablosuz bir uzaktan kumanda tetiği takın veya etkinleştirin.
NOT: Alternatif olarak, tetikleyici düğmeye bastıktan sonra tetiği 2 veya 10 s geciktirecek gecikmeli bir deklanşör işlevini etkinleştirmektir. - Kalp dilimlerini PBS ile tamamen bir kaba batırın.
NOT: Daldırılmış slaytlar konumlarından uzaklaşma eğilimindedir. Dilimlerin yüzmesini en aza indirmek için, tüm dilimlerin sığabileceği mümkün olan en küçük tepsiyi ve minimum miktarda daldırma çözeltisini kullanarak numunenin tamamen daldırılmasını sağlayın. Alternatif yöntemler, dilimleri cam slaytlar arasına yerleştirmeyi veya lens üzerinde polarize edici bir filtre kullanmayı içerir. Objektife dairesel polarize bir filtre takılır ve kameranın canlı görüntü ekranındaki yansımalar kaybolana kadar döndürülür. - Beyin dilimlerini PBS veya diğer sıvılar olmadan kuru bir tepsiye yerleştirin.
NOT: Polarize filtre, beyin dilimlerinin görüntülerini yakalamak için çok uygundur. - Makro lensle kameranın altına dilimler içeren kabı yerleştirin ve tüm dilimlerin görüş alanına tam olarak sığdığından emin olun. Dilimlerin aynı düzlemde olduğundan, yani kavisli veya yuvarlanmamış olduğundan emin olun.
- Pozlamayı kontrol edin ve gerekirse fotoğraf makinesi ayarlarını yapın.
NOT: Ayarlandıktan sonra, tüm deneme boyunca pozlamayı ve diğer ayarları değiştirmeyin. - Numunenin numarasını (veya başka bir tanımlamayı) yakalayın ve uzak bir tetikleyici kullanarak doku dilimini görüntüleyin.
NOT: Numune boyutunun mutlak niceliğinin belirlenmesi gerektiğinde, mm cetveli gibi bir boyut işaretleyicisi görüş alanına dahil edilmelidir. - Dilimleri döndürün ve görüntülerini diğer taraftan yakalayın.
Representative Results
Şekil 3A , enfarktüs boyutunun daha ileri planimetrik analizi için yeterli ayrıntı ve renk bilgisi içeren miyokard enfarktüsü sonrası metilen mavisi ve TTC lekeli bir kalp diliminin fotoğrafıdır (Şekil 3B). Kalbin 24 saat boyunca donmasının kalp dokularının bütünlüğünü nasıl etkilediğini test ettik (Şekil 3C). Uzun süre dondurma (>1 saat, Şekil 3C) mitokondriyal fonksiyonu azaltır; Bu nedenle, kalbin TTC boyaması kırmızı değil, soluk pembedir ve nekrotik ve canlı dokular arasındaki sınır bulanıklaşır (Şekil 3C).
Ayrıca, örneklerdeki yansımaların azaltılması için iki yöntem karşılaştırılmıştır. Daldırma en etkili yöntemdir ve iyi kontrasta sahip ayrıntılı görüntüler üretir (Şekil 4A). İkinci yöntem, lense bağlı polarize edici bir filtrenin kullanılmasıdır. Polarize filtre de etkilidir; ancak, filtre görüntünün çözünürlüğünü ve mikro kontrastını biraz azaltır (Şekil 4B). Daldırma veya filtre içermeyen bir kalp diliminin örnek bir görüntüsü (Şekil 4C) birçok yansıma içerir ve daha fazla analiz için uygun değildir.
Beyin dilimleri, dilim yönetimi (yüzen) problemleri nedeniyle daldırılmaz. Planimetrik analizde, beynin etkilenmemiş (sağlıklı) tarafını (Şekil 5A) inmeden etkilenen tarafla (Şekil 5B) karşılaştırmak önemlidir. Beyin dilimlerinin kuru bir plaka veya tepside yönetilmesi daha kolaydır ve yansımaları gidermek için polarize edici bir filtre kullanılır. Beyin dilimi fotoğrafçılığı için mavi arka plana sahip bir tepsi kullanılır (daha önce açıklanan arka plan seçimi5).
Pozlama ve beyaz dengesinin tam kontrolünü sağlamak için manuel kamera ayarları kullanıldı. Kamera ayarları, deneyden önce veya denemenin başlangıcında mevcut ışık kaynağına göre ayarlanmalıdır. Bu, tek tip analize izin vermek için tüm görüntülerin optimum pozlamasını ve beyaz dengesini sağlar (Şekil 6A). Kameranın otomatik ayarları mükemmel değildir ve değişen kamera parametrelerine neden olarak uygunsuz sonuçlara ve görüntüden görüntüye değişkenliğin ortaya çıkmasına neden olabilir.
Şekil 6, kalp dilimlerinin aşırı pozlanmış (Şekil 6B) ve az pozlanmış görüntülerinin (Şekil 6C) örneklerini göstermektedir. Fotoğraf makinesi-ışık ayarında kullanılan belirli bir ışık kaynağıyla eşleşmesi için kameranın doğru beyaz dengesi ayarlarına yeterince dikkat edilmelidir. Yanlış beyaz dengesi ayarları, görüntüde mavi veya sarıya (Şekil 6D) ve macenta veya yeşile (Şekil 6E) kaymasına neden olabilir.
Şekil 3: Sıçan kalp dilimlerinin görüntüleri. (A) Taze kalp dilimi, renk segmentasyonu (B) kullanılarak ImageProPlus 6.3 yazılımında analiz edildi. (C) TTC boyaması, donmuş kalp dilimindeki canlı ve nekrotik doku arasında zayıf ayrım yapar (24 saat boyunca dondurulur). Kısaltma: TTC = 2,3,5-triphenil-2H-tetrazolyum klorür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yansımaların azaltılması için teknikler. PBS'ye (A) batırılmış ve polarize filtre (B) kullanılarak yakalanan sıçan kalp dilimi görüntüsü. (C) Daldırma veya filtre kullanılmadığında yansımalı kalp dilimi. Kısaltma = PBS = fosfat tamponlu salin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sıçan beyin dilimlerinin görüntüleri. Sıçan beyni yedi dilim halinde kesildi ve iskemi-reperfüzyon sonrası TTC ile boyandı. Polarize filtrenin kullanılması, yansımasız görüntü elde edilmesini sağlar. (A) Hasarsız yarımküreden dilimler; (B) İnmeden etkilenen yarımküreden dilimler. Kısaltma: TTC = 2,3,5-triphenil-2H-tetrazolyum klorür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Sıçan kalbi dilimi görüntüleri. Doğru (A) ve yanlış (B-E) kalp dilimi görüntüleri yakaladı. Yanlış pozlama ayarları aşırı pozlama (B) ve az pozlanmış görüntülere (C) neden olur. Yanlış beyaz dengesi ayarları, görüntüde sarı (D) veya yeşilin (E) oluşmasına neden olur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
IR sonrası kalbin hazırlanması, kan kardiyak arterlerinin yeniden tıkanması ve risk altındaki alanların risk altındaki bölgelerden ayrılması için mavi boyanın perfüzyonu ile başlar. Metilen mavisi veya Evans mavisi boyalar bu amaçla en sık kullanılır2. Aşırı yüksek bir basınç kalp kapakçıklarına zarar verebileceğinden ve dolayısıyla risk altındaki alanları kısmen veya tamamen lekeleyebileceğinden, kalbi Langendorff aparatı veya hidrostatik basınç sistemi donanımlı bir şırınga veya pompanın basitleştirilmiş bir versiyonu gibi basınç kontrollü bir sistemle delmek daha iyidir. Kontrollü perfüzyon fizyolojik basıncı sağlayacak ve boya genellikle kalbin tıkalı bölgesine girmeyecektir. Hem akış hızı hem de basınç kontrollü teknikler aşırı boyanmaya karşı koruma sağlar.
Canlı doku işlemedeki en ciddi hatalardan biri, dokuları lekelemeden önce uzun süre dondurucuda tutmaktır. Donma esas olarak kullanılır çünkü araştırmacılar IR deneyinden sonraki gün veya daha sonra kalp boyama yapmak isterler. Ayrıca, kalbin kesilmesini kolaylaştırmak için dondurma kullanılır. Kalbin 5-10 dakikaya kadar kısa süreli donmasının ihmalkar bir şekilde kalp dokularının bütünlüğünü etkilediğini ve dokuların (özellikle fare kalpleri için) ince dilimler halinde kesilmesini kolaylaştırdığını bulduk. Bununla birlikte, uzun süre dondurma membranlara zarar verir ve hücre canlılığını ve mitokondriyal fonksiyonu azaltır13. Sonuç olarak, işleyen mitokondrinin TTC boyaması etkilenir ve nekrotik ve canlı dokular arasındaki sınır zayıf bir şekilde tanımlanmıştır (bulanık). Genel olarak, sıçan osuruklarının dondurulmasından kaçınılmalıdır ve daha kolay kesim için fare kalplerinin sadece kısa süreli dondurulması kullanılabilir.
Bir sonraki adım, 37 ° C14'te% 1 TTC çözeltisinde doku boyamasıdır. Boyama çözeltisi önceden ısıtılmalıdır – özellikle beyin dilimlerinin boyanması için önemlidir. Önceden ısıtılmış çözeltiyi kullanırken, kalp dilimleri için en uygun boyama süresi 10 dakikadır. Daha uzun bir inkübasyon veya 37 ° C'den daha yüksek bir sıcaklık, kalp dokularının kahverengi renklenmesine neden olur. Numunelerin uygun şekilde boyanması ve tutarlı kırmızı renk yoğunluğu, daha ileri görüntü analizi için önemlidir. Fotoğraftan önceki son adımlarda, doku dilimleri soğuk PBS veya benzeri bir tamponla 2-3 kez durulanarak TTC ve fazla metilen mavisini çözeltiden uzaklaştırarak fotoğrafta mavi dökümü önler. En iyi görüntü kalitesini elde etmek için kalp dilimleri lekelenmeden kısa bir süre sonra fotoğraflanmalıdır. Kalp boyaması, soğukta (+4 ° C) PBS'de 60 dakikaya kadar saklanırsa iyi kalitede kalır. Lekeli beyin dilimleri ve aort dokuları genellikle% 4'lük nötr bir formaldehit çözeltisinde depolanır ve bir hafta boyunca iyi kaliteyi korur. Beyin dokularının formalin (+4 °C) içinde gece boyunca depolanması, normal dokunun renk yoğunluğunu bozmaz ve görüntü elde etmek için kabul edilebilir. Bununla birlikte, formalin kalp dilimlerinin şişmesine ve lekelenmesine neden olur. Bu nedenle, kalp dokularının formalinde depolanması önerilmez.
Bir sonraki adım görüntü yakalamadır. Birçok laboratuvar, düz yataklı tarayıcıları, dijital kamera ve aydınlatma kurulumunun yerini alması beklenen bir görüntü yakalama aracı olarak kullanır. Dilimlerin taranmasının yeterli görüntü çözünürlüğü ve renk ayrımı sağlamadığını ve bu nedenle kalp dilimlerinin görüntülenmesi için uygun olmadığını belirledik. Özellikle, tarayıcı çözünürlüğü fare kalpleri için yetersizdir ve metilen mavisinin zayıf bir şekilde oluşturulduğunu fark ettik. Buna karşılık, bir tarayıcı, yalnızca TTC veya diğer tek boyalarla boyanmış beyin dilimlerini görüntülemek için bir fotoğraf kamerasına alternatif olabilir. Doku dilimlerinin taranması için, sürekli pozlama ayarlarını sağlayan tarama yazılımı gereklidir. Genel olarak, düz yataklı bir tarayıcı daha az yeteneklidir ve çoğu görüntüleme uygulaması için dijital kameranın yerini alamaz.
Örneklerin arkasındaki arka plan da önemlidir. İdeal olarak, tepsinin tabanı lekeli numunede bulunmayan bir renkte olmalıdır. Örneğin, metilen mavisi ve TTC (kırmızı) boyama alanını otomatik veya yarı otomatik bir şekilde ölçmek için beyaz, kırmızı, mavi, sarı ve kahverengi arka planlardan kaçınılmalıdır. Bu nedenle, yeşil bir arka plan tercih edilir. Bununla birlikte, renk seçimi, görüntüyü sonradan işleyen operatörün tercihlerine bağlıdır. Birçok bilim adamı beyaz bir arka planı tercih eder, çünkü beyaz bir arka plan görüntü son işlemede silinebilir ve tamamen beyaza dönüştürülebilir (RGB beyaz kodu 255.255.255). Daha sonra, yarı otomatik analiz için kullanılan seçilen renkler listesinden tamamen beyaz hariç tutulmalı ve aşırı pozlanmamışsa tamamen beyaz olmayan soluk nekrotik alanlar sayılmalıdır. Mavi ve yeşil arka planlar beyin dilimlerinin ve aortların fotoğrafçılığı için uygundur.
Doku fotoğrafçılığı için en uygun görüntüleme aracı, uyumlu bir makro lense sahip tek lensli refleks veya aynasız değiştirilebilir lensli dijital fotoğraf makinesidir. Çok küçük nesneleri yakalamak için kamera ve mikroskop kombinasyonu gerekebilir; Bununla birlikte, bir makro lens genellikle fare kalbinin ayrıntılı görüntülerini elde etmek için yeterli (en az 1: 2) büyütmeye sahiptir. Birçok üretici, yüksek çözünürlüklü ve yüksek büyütmeli fotoğraflar elde etmek için uygun fiyatlı dijital kameralar ve makro lensler sunmaktadır. Tüm güncel dijital fotoğraf makineleri, bir standa monte etme imkanı, çok sayıda piksel (genellikle >20 Mpx), canlı görüntü, ayna kilitleme, hızlandırılmış özellikler, uzaktan deklanşör ve kamera parametrelerini manuel olarak ayarlama yeteneği de dahil olmak üzere makro fotoğrafçılık için gerekli özelliklere ve işlevlere sahiptir, böylece sabit bir enstantane hızı, diyafram, beyaz dengesi ve ISO ayarı sağlar. Yukarıda belirtilen özelliklere ve en az 1:2 lens büyütme oranına sahip kompakt fotoğraf makineleri makro fotoğrafçılık için de kullanılabilir. Lens özellikleri nedeniyle, bazı kompakt kameralar nesneye yakın bir yere yerleştirilmeli ve deneyci, kamera gövdesinin numunenin aydınlatmasını etkilemediğinden emin olmalıdır.
Her türlü değiştirilebilir lensli fotoğraf makinesi ile makro fotoğrafçılık için, yüksek büyütmeli (1:1-1:2) makro lens gereklidir. Tam çerçeve (24 mm x 36 mm) sensörde 50 mm ile 100 (120) mm arasında veya eşdeğeri odak uzaklığına sahip makro lensler kullanmanızı öneririz. Daha küçük sensörlü kameralar farklı sensör boyutlarına sahiptir ve büyütme buna göre yeniden hesaplanmalıdır. Kalp dilimlerinin fotoğraflanması için, 100 mm makro lens ön elemanının nesneye ergonomik mesafesi yaklaşık 150 mm'dir. Bu ayar, operatörlerin kamera kontrollerine kolay erişim ile tüm ekipmanı bir masada tutmasına olanak tanır. Beyin dilimleri gibi daha büyük nesnelerin fotoğraflanması için 50 mm'lik bir makro lens düşünülebilir, çünkü tek bir fotoğraftaki tüm dilimleri elde etmek için daha geniş bir görüş alanı gereklidir.
Yüksek çözünürlükte keskin görüntüler elde etmek için, bir kamera, ışık kurulumuyla birlikte fotoğraf kopyası standı olarak adlandırılan sağlam bir standa monte edilmelidir. Fotoğraf makinesini bir standa ve uzaktan kumandalı (kablolu veya kablosuz) bir tetiğe monte etmek, fotoğraf makinesinin titremesini ortadan kaldırır ve hedeften sabit bir mesafe sağlar. Her iki taraftan iki sabit ışık kaynağına sahip, konu düzlemine göre yaklaşık 30-60° açılı bir kamera aydınlatma kurulumu, numunelerin yeterli şekilde aydınlatılmasını sağlar ve aynı zamanda yansımaları önlemeye yardımcı olur. Kamera, sensörün konu düzlemine paralel olması için hassas bir şekilde monte edilmelidir. Görüntü alanını eşit şekilde aydınlatmak için, her iki lamba da eşit şekilde yönlendirilmeli ve nesneden aynı mesafeye yerleştirilmelidir. Nesneden çeşitli mesafelere yerleştirilen ışık kaynakları eşit olmayan aydınlatmaya neden olur. Ek olarak, yanıp sönen ışık kaynakları, görüntü pozlamadaki farklılıkların bir nedenidir. Genel olarak, iyi aydınlatılmış örneklerin görüntülerini hassas bir şekilde elde etmek için kamerayı ve ışık kaynaklarını doğru bir şekilde yerleştirmek önemlidir.
Doku örnekleri, görüntülerde beyaz lekeler olarak görünen ışığı (parıltı) yansıtır. Bu ışık yansıma noktaları yararlı renk bilgileri içermez ve buna bağlı olarak, görüntülerin bu kısımları görüntülerin doğru nicel analizi için kullanılamaz. Doku dilimlerinden gelen ışık yansımaları çeşitli yöntemlerle giderilebilir. En verimli olanı, doku örneklerinin tuzlu su veya PBS çözeltisi içeren bir kaba tam olarak daldırılmasıdır. Benzer bir yaklaşım, cam plakaların altına (veya arasına) doku dilimlerinin yerleştirilmesidir. Bu yöntem yansımalara karşı etkilidir; ancak, görüntü çözünürlüğü daldırılmış dokuların fotoğraflarından daha düşük olabilir.
Işık yansımalarını ortadan kaldırmak için bir lense monte edilmiş polarize edici bir filtre de kullanılabilir. Dairesel polarize filtreler yaygın olarak bulunur, ancak fiyata bağlı olarak kalite açısından önemli ölçüde değişir ve ucuz filtreler görüntü çözünürlüğünü önemli ölçüde azaltabilir. Yansıyan ışık, polarize filtrenin hareketli kısmı bir açıyla döndürülerek filtrelenebilir. Polarize filtrenin etkinliği bazı ışık kaynaklarından (örneğin, güçlü LED ışığı) etkilenebilir. Genel olarak, ekstra sıvının çıkarılmasından sonra, polarize edici bir filtre beyin dilimlerinden gelen tüm yansımaları ortadan kaldırabilir; Bununla birlikte, numunenin tampon çözeltisine daldırılması, kalp dilimleri için en kolay ve en uygun maliyetli yaklaşımdır.
Deklanşör hızı, diyafram açıklığı, ISO ve beyaz dengesinin manuel ayarları, görüntüleme işleminin tam kontrolünü sağlamak için önemlidir. Işık kaynağının örneği, arka planı ve özellikleri, otomatik ayarlarda kamera pozlama ölçüm sistemini etkiler; bu nedenle, deney sırasında birden fazla fotoğraf arasında sabit pozlama ve beyaz dengesini korumak için manuel ayarlar gereklidir. Makro fotoğrafçılık için önerilen diyafram açıklığı ayarı f/8 ile f/16 arasındadır. Diyafram açıklığını azaltarak, alan derinliği artar, bu da nesne tek bir düzlemde değilse yararlıdır. Bununla birlikte, kırınım, daha küçük diyafram açıklıkları durumunda fotoğrafın toplam çözünürlüğünü sınırlar. Çoğu objektif için en uygun diyafram açıklığı genellikle f / 10'dur, çünkü bu ayarda çözünürlük düşüşü ihmal edilebilir ve alan derinliği yeterlidir. 50 ila 400 (daha düşük daha iyidir) arasında değişen ISO değerleri, görüntü yapıtlarını (parazit) en aza indirmek için genellikle en uygunudur. Deklanşör hızı daha sonra mevcut ışık koşullarında belirtilen diyafram açıklığı ve ISO ayarları kullanılarak doğru pozlama elde etmek için değiştirilmeye devam ediyor. Manuel ayarlar, tutarlı görüntü analizi için önemlidir. Standartlaştırılmış görüntüleme, segmentasyon analizi gerektiren herhangi bir etüt boyunca aynı renk eşik ayarlarının kullanılmasını sağlar. Örneğin, ImagePro yazılımı tarafından önceden tanımlanmış mavi, kırmızı ve beyaz (+soluk pembe) renklere sahip bir segmentasyon dosyasına dayalı yarı otomatik analiz, örnek görüntülerin tutarlı renklere, beyaz dengesine ve pozlamaya sahip olması durumunda yıllar içinde kullanılabilir.
Beyaz dengesi ayarı, bir numuneyi aydınlatmak için kullanılan ışık kaynağının renk sıcaklığına bağlı olarak ayarlanmalıdır. Beyaz dengesi, fotoğraf makinesinin yerleşik ön ayarlarından veya gri bir hedefin manuel kalibrasyonu kullanılarak seçilebilir. RAW formatında görüntü yakalamanın yararı, beyaz dengesinin görüntünün yazılım tarafından işlenmesi sırasında ayarlanabilmesidir. RAW dosyaları JPEG dosyalarından çok daha fazla bilgi içerdiğinden, RAW dosya son işleme, renk dengesi ve pozlamanın düzeltilmesi ve daha iyi görüntü çözünürlüğü elde edilmesi için mükemmel bir fırsat sunar. Çoğu fotoğraf makinesi JPEG ve RAW dosyalarını aynı anda yakalayabildiğinden, RAW dosyasını yakalamanızı ve yedek olarak kaydetmenizi öneririz.
Genel olarak, bu protokol sıçan kalbi ve beyin dokusu dilimleme ve boyama için bir metodolojiyi tanımlar ve daha fazla analiz için yüksek çözünürlüklü görüntü elde etmek için aydınlatma ve kamera kurulumları ve fotoğrafçılık teknikleri oluşturmak için kılavuzlar sağlar. Bu yöntem tüm deneysel küçük hayvan organ fotoğrafçılığına uygulanabilir.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı tarafından 857394 No'lu hibe anlaşması kapsamında FAT4BRAIN Projesi kapsamında desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 50 mL syringe | Terumo | N/A | |
| Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
| Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
| Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
| Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
| Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
| Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
| Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
| Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
| Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
| Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
| Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
| Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
| Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
| Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
| Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
| Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
| Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
| Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
| Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
| Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
| Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
| Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
| Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
| Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
| Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Research in Cardiology. 113 (5), 39 (2018).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e1978 (2011).
- Zvejniece, L., Svalbe, B., Liepinsh, E., Pulks, E., Dambrova, M. The sensorimotor and cognitive deficits in rats following 90- and 120-min transient occlusion of the middle cerebral artery. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 197-204 (2012).
- Liepinsh, E., Kuka, J., Dambrova, M. Troubleshooting digital macro photography for image acquisition and the analysis of biological samples. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 98-106 (2013).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52908 (2015).
- Liepinsh, E., et al. Inhibition of L-carnitine biosynthesis and transport by methyl-gamma-butyrobetaine decreases fatty acid oxidation and protects against myocardial infarction. British Journal of Pharmacology. 172 (5), 1319-1332 (2015).
- Nakamura, K., Al-Ruzzeh, S., Ilsley, C., Yacoub, M. H., Amrani, M. Acute effect of cerivastatin on cardiac regional ischemia in a rat model mimicking off-pump coronary surgery. Journal of Cardiac Surgery. 20 (6), 507-511 (2005).
- Li, Q., Morrison, M. S., Lim, H. W. Using a cardiac anchor to refine myocardial infarction surgery in the rat. Lab Animal. 39 (10), 313-317 (2010).
- Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K.
- Vavers, E., et al. The neuroprotective effects of R-phenibut after focal cerebral ischemia. Pharmacological Research. 113, Pt B 796-801 (2016).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Kloner, R. A., Darsee, J. R., DeBoer, L. W., Carlson, N. Early pathologic detection of acute myocardial infarction. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 105 (8), 403-406 (1981).
