Summary
Aquí se presenta un protocolo para la metodología estandarizada de preparación de tejido de roedores después del experimento de isquemia-reperfusión y pautas para establecer configuraciones de iluminación y cámara para la adquisición de imágenes de alta resolución. Este método es aplicable a todas las fotografías experimentales de órganos de animales pequeños.
Abstract
La fotografía macro es aplicable para obtener imágenes de varias muestras de tejido a gran aumento para realizar análisis cualitativos y cuantitativos. La preparación del tejido y la posterior captura de imágenes son pasos realizados inmediatamente después del experimento de isquemia-reperfusión (IR) y deben realizarse de manera oportuna y con el cuidado adecuado. Para la evaluación del daño inducido por IR en el corazón y el cerebro, este artículo describe la tinción basada en cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio (TTC) seguida de fotografía macro. La fotografía macro científica requiere una iluminación controlada y una configuración de imagen adecuada. La metodología estandarizada garantiza imágenes digitales detalladas y de alta calidad, incluso si se utiliza una combinación de una cámara digital actualizada y económica y una lente macro. Se discuten las técnicas adecuadas y los posibles errores en la preparación de muestras y la adquisición de imágenes, y se proporcionan ejemplos de la influencia de configuraciones correctas e incorrectas en la calidad de la imagen. Se proporcionan consejos específicos sobre cómo evitar errores comunes, como el exceso de manchas, el almacenamiento inadecuado de muestras y las condiciones de iluminación subóptimas. Este documento muestra la metodología adecuada para el corte y la tinción del corazón y el tejido cerebral de rata y proporciona pautas para establecer configuraciones de iluminación y cámara y técnicas de fotografía para la adquisición de imágenes de alta resolución.
Introduction
Durante décadas, la fotografía y el análisis de especímenes de tejido cardíaco y cerebral han sido una parte importante de los experimentos de ciencias de la vida. El progreso de la ciencia y la innovación impulsa el desarrollo de costosos microscopios capaces de superresolución. Las fotomicrografías se obtienen en un entorno de luz bien controlado siguiendo instrucciones detalladas. Por el contrario, la fotografía macro (con un aumento de 1:2 o mayor) se realiza con frecuencia en un entorno de luz no controlada utilizando configuraciones de imagen inapropiadas. A menudo, las técnicas de preparación de muestras y configuración de la cámara deben optimizarse sustancialmente. Como resultado, las fotografías macro de calidad limitada han sido ampliamente publicadas en revistas científicas. La resolución y el contraste insuficientes de la imagen limitan las posibilidades de cuantificación precisa de la imagen en los estudios de RI.
Se han descrito en detalle procedimientos experimentales de infartos de miocardio1,2 y cerebral3,4. El propósito de este estudio es proporcionar una guía paso a paso sobre cómo configurar un sistema para la fotografía y el análisis estandarizado de muestras de corazón y tejido cerebral de roedores después de experimentos de infarto. Esto incluye corte de tejido, tinción y fotografía macro de muestras de corazón y cerebro. La preparación de muestras de tejido es una parte esencial del experimento, y los resultados del análisis de imágenes planimétricas dependen en gran medida de la calidad de las imágenes obtenidas5.
Estos métodos son particularmente útiles para realizar mediciones y análisis planimétricos de imágenes en tejidos de roedores y podrían ser de valor para la fotografía macro científica general. Además, la alta calidad y consistencia de las imágenes permite realizar análisis automatizados de fotografías digitales, lo que ayuda a ahorrar tiempo, evitar la entrada del usuario y minimizar el riesgo de errores o sesgos durante el análisis de imágenes. Esto dará como resultado la generación de datos robustos y confiables y aumentará la traducción de los descubrimientos preclínicos en nuevos tratamientos antiisquémicos en las clínicas.
Protocol
Los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices de la Comunidad Europea y las leyes y políticas locales (Directiva 2010/63/UE), y todos los procedimientos fueron aprobados por el Servicio Alimentario y Veterinario, Riga, Letonia.
1. Tinción y corte del corazón
NOTA: Las técnicas descritas en este protocolo se pueden utilizar después de los ensayos aislados de corazón de rata o ratón perfundidos por Langendorff6,7 y ensayos in vivo de lesión IR cardíaca de rata8,9,10,11. Para la tinción después de un ensayo de lesión IR in vivo, se supone que el corazón se extirpa, se monta en una cánula y se perfunde brevemente en el modo de perfusión de Langendorff.
- Separe la cánula del corazón de la jeringa llena de solución de Krebs-Henseleit y conéctela a una jeringa llena de una solución tibia (37 °C) de azul de metileno al 0,1% en solución de Krebs-Henseleit. Use una jeringa de 5 ml para corazones de rata y una jeringa de 1-2 ml para corazones de ratón.
NOTA: Una alternativa es llenar el aparato controlado por presión o flujo (por ejemplo, Langendorff) con una solución que contenga colorante azul. Durante el procedimiento de desprendimiento y montaje, es esencial no dejar burbujas de aire en la cánula y no aflojar la sutura utilizada para la reoclusión de la arteria coronaria. - Perfunda aún más corazones de rata con 4 ml de la solución de azul de metileno a una velocidad de ~ 4 ml / min y perfunda corazones de ratón con 1 ml de solución de azul de metileno a una velocidad de ~ 0.5-1 ml / min.
NOTA: Según la experiencia, ambas técnicas son seguras y proporcionan una tinción adecuada; sin embargo, el uso de una bomba controlada por presión / sistema de presión hidrostática es una opción más lenta pero más segura contra la sobreintención para los científicos novatos. - Desconecte la cánula de la jeringa y retire el corazón de la cánula.
- Elimine el exceso de azul de metileno enrollando suavemente el corazón sobre papel de seda. Afloje la ligadura alrededor de la arteria coronaria abriendo las pinzas hemostáticas y retirando el tubo de plástico de la sutura quirúrgica solo después de eliminar el exceso de azul de metileno.
NOTA: En esta etapa, es posible colocar el corazón de ratón en una pequeña bolsa de plástico o un microtubo de centrífuga de 5 ml en el congelador (-20 ° C) durante un máximo de 5-10 min. El tiempo máximo de congelación debe determinarse experimentalmente en cada laboratorio. La congelación a corto plazo de un corazón de ratón puede ayudar a un experimentador novato a cortarlo en rodajas de 1 mm de grosor. No se recomienda la congelación de corazones de rata. Se debe evitar el sobrecongelamiento durante más de 10 min a -20 °C. - Coloque el corazón de rata teñido en una matriz de acero inoxidable (consulte la Tabla de materiales) para cortar el corazón (Figura 1A). Luego, corte los ventrículos del corazón en rodajas de 2 mm de grosor (apunte a 6-7 rebanadas de un corazón de rata adulto). Para los corazones de ratón, corte los ventrículos del corazón en rodajas de 1,5 mm de grosor (apunte a al menos 4 rebanadas de un corazón de ratón adulto).
NOTA: Se deben utilizar cuchillas de afeitar compatibles con la matriz de corte. En general, se pueden usar cuchillas de afeitar de un solo filo compatibles (por ejemplo, un grosor de hasta 0.01 pulgadas (0.254 mm)) para cortar corazones de rata. Las cuchillas de afeitar de doble filo se usan generalmente para corazones de ratón y generalmente tienen un grosor de hasta 0.004 pulgadas (0.1 mm).
Figura 1: Matrices para el corazón de rata y el corte cerebral. (A) Corazón de rata, (B) cerebro de rata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Después de cortar, transfiera las rodajas a un tubo de plástico de 15 ml. Agregue 5 ml de cloruro de trifeniltetrazolio al 1% (TTC) disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS) al tubo con las rodajas de corazón e incube durante 10 min en un baño de agua a 37 ° C.
- Después de la incubación en solución TTC, lave las rodajas de corazón al menos 2-3 veces con PBS y prepárese para la captura de imágenes.
2. Tinción cerebral y corte
- Después del experimento de oclusión de la arteria cerebral media3,12, extraiga el cerebro, incluido el tronco encefálico, del cráneo y lávelo en PBS helado.
- Elija el tamaño correcto de la matriz de acero inoxidable cerebral (consulte la Tabla de materiales) en función del peso de los animales (Figura 1B). Coloque el cerebro con su lado ventral hacia arriba en la matriz cerebral.
NOTA: Cuando está sentado en la matriz, la superficie ventral del cerebro debe ser paralela a la superficie superior del molde. - Usando cuchillas, restrinja las partes frontal y caudal (2 cuchillas de ambos lados) del cerebro.
NOTA: Se deben utilizar cuchillas de afeitar compatibles con la matriz de corte. En general, se puede usar una cuchilla de afeitar compatible de un solo filo (grosor de hasta 0.01 pulgadas (0.254 mm)) para cortar el cerebro de rata. - Coloque las cuchillas parcialmente (sin cortar completamente el cerebro) en los canales entre la primera y la última cuchilla. Cuando todas las cuchillas estén insertadas y dispuestas en paralelo, presione todas las cuchillas hacia abajo con la palma de la mano al mismo tiempo para cortar el cerebro en rodajas coronales de 2 mm.
- Agarre las cuchillas firmemente a lo largo de los lados con dos dedos y retírelas junto con el cerebro cortado de la matriz.
- Coloque las rodajas cerebrales una por una en una bandeja (70 ml, 72 x 72 mm). Al organizar las rebanadas, asegúrese de que la superficie anterior de cada rebanada esté siempre hacia arriba.
- Vierta una solución de TTC al 1% caliente (+37 °C) en PBS sobre las rodajas cerebrales e incube durante 8 min a 37 °C en la oscuridad.
NOTA: Las rodajas cerebrales deben estar completamente sumergidas en la solución de TTC durante la incubación. - Después de la incubación en una solución de TTC al 1%, transfiera las rodajas de cerebro a la bandeja de plástico azul para capturar imágenes. Organice las rodajas cerebrales en orden secuencial desde la parte frontal hasta la parte caudal, y use un bisturí para separar los hemisferios en el plano sagital.
NOTA: La superficie de la bandeja debe ser lavable, mate y de un color que contraste las rodajas cerebrales (es decir, no rojo, blanco o rosa pálido).
3. Fotografía macro
- Fotografíe las rodajas de tejido inmediatamente después de la tinción.
NOTA: Las rodajas de corazón se pueden almacenar en PBS frío (a +4 °C) o solución de formalina durante un máximo de 30 min. Las rebanadas de cerebro se pueden almacenar en formalina durante un período prolongado (1-2 semanas). - Configure la cámara de su elección con una batería cargada, una tarjeta de memoria y un objetivo conectado en un soporte (Figura 2)
NOTA: Encienda las luces al menos 5-10 minutos antes de la adquisición de la imagen para calentar el equipo. Las luces LED alcanzan el brillo total en microsegundos.
Figura 2: Cámara y luces configuradas para la fotografía macro. La cámara es perpendicular a la superficie de la imagen para garantizar que el plano focal de la cámara sea paralelo a las muestras. Abreviatura: LED = diodo emisor de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Dependiendo de las fuentes de luz disponibles, seleccione la configuración de balance de blancos adecuada o realice la calibración de la temperatura de color de acuerdo con las instrucciones del manual de la cámara.
NOTA: La luz LED blanca (temperatura de color 6,500 K) es la fuente de luz preferida para evitar el parpadeo de la luz por las bombillas fluorescentes. - Cambie la cámara al modo totalmente manual, ajuste el ISO 100 y la apertura a f/10, y ajuste la velocidad de obturación para una exposición óptima de la imagen. Asegúrese de que el plano focal de la cámara esté paralelo a la superficie donde se colocará la muestra.
NOTA: La función de histograma es útil para garantizar que las rodajas de tejido no estén sobreexpuestas. - Conecte o habilite un disparador remoto con cable o inalámbrico para evitar que la cámara se sacuda cuando se suelta el obturador.
NOTA: Una alternativa es habilitar una función de obturador retardado, que retrasará el disparador durante 2 o 10 s después de presionar el botón de disparo. - Sumerja las rodajas de corazón completamente en un recipiente con PBS.
NOTA: Las diapositivas sumergidas tienden a flotar lejos de su posición. Para minimizar la flotación de las rebanadas, use la bandeja más pequeña posible en la que puedan caber todas las rebanadas y la cantidad mínima de solución de inmersión, asegurándose de que la muestra esté completamente sumergida. Los métodos alternativos incluyen colocar las rodajas entre portaobjetos de vidrio o usar un filtro polarizador en la lente. Se conecta un filtro polarizador circular a la lente y se gira hasta que desaparecen los reflejos en una pantalla de visualización en vivo de la cámara. - Coloque las rebanadas de cerebro en una bandeja seca sin PBS u otros líquidos.
NOTA: Un filtro polarizador es muy conveniente para capturar imágenes de cortes cerebrales. - Coloque el recipiente con rebanadas debajo de la cámara con la lente macro y asegúrese de que todas las rebanadas encajen completamente en el campo de visión. Asegúrese de que las rodajas estén en el mismo plano, es decir, no curvadas o enrolladas.
- Compruebe la exposición y ajuste la configuración de la cámara si es necesario.
NOTA: Una vez configurado, no cambie la exposición y otros ajustes durante todo el experimento. - Capture el número (u otra identificación) de la muestra e imagine la rebanada de tejido utilizando un disparador remoto.
NOTA: Se debe incluir un marcador de tamaño, como una regla de mm, en el campo de visión cuando sea necesaria la cuantificación absoluta del tamaño de la muestra. - Gire las rodajas y capture sus imágenes desde el otro lado.
Representative Results
La Figura 3A es una fotografía de un corte de corazón teñido de azul de metileno y TTC después de un infarto de miocardio, que contiene suficiente información detallada y de color para un análisis planimétrico adicional del tamaño del infarto (Figura 3B). Probamos cómo la congelación del corazón durante 24 h afecta la integridad de los tejidos cardíacos (Figura 3C). La congelación durante un período prolongado (>1 h, Figura 3C) reduce la función mitocondrial; por lo tanto, la tinción TTC del corazón no es roja sino de color rosa pálido, y el borde entre los tejidos necróticos y viables es borroso (Figura 3C).
Además, se compararon dos métodos para la reducción de las reflexiones en los especímenes. La inmersión es el método más eficiente y produce imágenes detalladas con buen contraste (Figura 4A). El segundo método es el uso de un filtro polarizador conectado a la lente. El filtro polarizador también es efectivo; sin embargo, el filtro reduce ligeramente la resolución y el microcontraste de la imagen (Figura 4B). Una imagen de ejemplo de una rebanada de corazón sin inmersión o filtro (Figura 4C) contiene muchas reflexiones y no es adecuada para un análisis posterior.
Las rebanadas cerebrales no se sumergen debido a problemas de manejo de rebanadas (flotantes). En el análisis planimétrico, es importante comparar el lado no afectado (sano) del cerebro (Figura 5A) con el lado afectado por el accidente cerebrovascular (Figura 5B). Las rodajas cerebrales son más fáciles de manejar en una placa o bandeja seca, y se utiliza un filtro polarizador para eliminar los reflejos. Una bandeja con fondo azul se utiliza para la fotografía de corte de cerebro (selección de fondo descrita anteriormente5).
Se utilizaron ajustes manuales de la cámara para garantizar un control total de la exposición y el balance de blancos. La configuración de la cámara debe ajustarse antes o al comienzo del experimento de acuerdo con la fuente de luz disponible. Esto garantiza una exposición óptima y un balance de blancos de todas las imágenes para permitir un análisis uniforme (Figura 6A). Los ajustes automáticos de la cámara no son perfectos y pueden dar lugar a diferentes parámetros de la cámara, lo que provoca resultados inapropiados y la introducción de la variabilidad de imagen a imagen.
La Figura 6 muestra ejemplos de imágenes sobreexpuestas (Figura 6B) y subexpuestas (Figura 6C) de cortes de corazón. Se debe prestar suficiente atención a la configuración correcta del balance de blancos de la cámara para que coincida con una fuente de luz particular utilizada en la configuración de la cámara-luz. La configuración incorrecta del balance de blancos puede provocar un cambio a azul o amarillo (Figura 6D) y magenta o verde (Figura 6E) en la imagen.
Figura 3: Imágenes de cortes cardíacos de rata. (A) El corte de corazón fresco se analizó en el software ImageProPlus 6.3 utilizando la segmentación de color (B). (C) La tinción de TTC discrimina mal entre el tejido viable y necrótico en la rebanada de corazón congelado (congelado durante 24 h). Abreviatura: TTC = cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Técnicas para la reducción de reflexiones. Imagen de corte de corazón de rata capturada sumergida en PBS (A) y usando filtro polarizador (B). (C) Corte de corazón con reflejos cuando no se utiliza ni inmersión ni filtro. Abreviatura = PBS = solución salina tamponada con fosfato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes de cortes de cerebro de rata. El cerebro de la rata se cortó en siete rebanadas y se tiñó con TTC después de la isquemia-reperfusión. El uso del filtro polarizador da como resultado la adquisición de una imagen libre de reflexión. (A) Rebanadas del hemisferio no dañado; (B) Rebanadas del hemisferio afectado por el accidente cerebrovascular. Abreviatura: TTC = cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes de corte de corazón de rata. Correctamente (A) e incorrectamente (B-E) capturó imágenes de corte de corazón. Los ajustes de exposición incorrectos dan como resultado imágenes sobreexpuestas (B) y subexpuestas (C). La configuración incorrecta del balance de blancos da como resultado un tono amarillo (D) o verde en la imagen (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
La preparación del corazón después de la RI comienza con la reoclusión de las arterias cardíacas sanguíneas y la perfusión de tinte azul para la discriminación de áreas de riesgo de áreas no riesgosas. Los colorantes azul de metileno o azul de Evans se utilizan con mayor frecuencia para este propósito2. Como una presión excesivamente alta podría dañar las válvulas cardíacas y, por lo tanto, teñir parcial o completamente las áreas de riesgo, es mejor perfundir el corazón con un sistema controlado por presión, como el aparato Langendorff o una versión simplificada de una jeringa o bomba equipada con un sistema de presión hidrostática. La perfusión controlada asegurará la presión fisiológica, y el tinte generalmente no ingresará a la región ocluida del corazón. Tanto las técnicas de velocidad de flujo como las de control de presión son salvaguardas contra el exceso de tensión.
Uno de los errores más graves en el procesamiento de tejidos viables es mantener los tejidos en un congelador durante un tiempo prolongado antes de la tinción. La congelación se utiliza principalmente porque los investigadores quieren realizar la tinción del corazón el día después del experimento de IR o más tarde. Además, la congelación se utiliza para facilitar el corte del corazón. Se encontró que la congelación a corto plazo del corazón durante un máximo de 5-10 minutos afecta de manera insignificante la integridad de los tejidos cardíacos y facilita el corte de los tejidos (particularmente para los corazones de ratón) en rodajas delgadas. Sin embargo, la congelación durante períodos prolongados daña las membranas y disminuye la viabilidad celular y la función mitocondrial13. Como resultado, la tinción TTC de las mitocondrias funcionales se ve afectada, y la frontera entre los tejidos necróticos y viables está mal delineada (borrosa). En general, se debe evitar la congelación de los harts de rata, y solo se puede usar la congelación a corto plazo de los corazones de ratón para facilitar el corte.
El siguiente paso es la tinción de tejido en solución de TTC al 1% a 37 °C14. La solución de tinción debe estar precalentada, particularmente importante para la tinción de cortes cerebrales. Cuando se usa la solución precalentada, el tiempo óptimo de tinción para las rodajas de corazón es de 10 min. Una incubación más larga o una temperatura superior a 37 ° C da como resultado la coloración marrón de los tejidos del corazón. La tinción adecuada de los especímenes y la intensidad constante del color rojo son importantes para un mayor análisis de la imagen. En los pasos finales antes de la fotografía, las rodajas de tejido se enjuagan 2-3 veces con PBS frío o un tampón similar para eliminar el TTC y el exceso de azul de metileno de la solución para evitar la fundición azul en la fotografía. Las rodajas de corazón deben fotografiarse poco después de la tinción para obtener la mejor calidad de imagen. La tinción del corazón permanece de buena calidad si se almacena hasta 60 min en el frío (+4 °C) PBS. Las rebanadas de cerebro teñidas y los tejidos aórticos generalmente se almacenan en una solución de formaldehído neutro al 4% y conservan una buena calidad durante una semana. El almacenamiento nocturno de tejidos cerebrales en formalina (+4 °C) no afecta la intensidad del color del tejido normal y es aceptable para la adquisición de imágenes. Sin embargo, la formalina induce hinchazón y detención de las rebanadas de corazón. Por lo tanto, no se recomienda el almacenamiento de tejidos cardíacos en formalina.
El siguiente paso es la adquisición de imágenes. Muchos laboratorios utilizan escáneres de cama plana como una herramienta de adquisición de imágenes que se espera que reemplace una cámara digital y una configuración de iluminación. Determinamos que el escaneo de cortes no proporciona suficiente resolución de imagen y separación de color y, por lo tanto, no es adecuado para obtener imágenes de cortes de corazón. En particular, la resolución del escáner es insuficiente para los corazones de los ratones, y notamos una mala representación del azul de metileno. Por el contrario, un escáner podría ser una alternativa a una cámara fotográfica para obtener imágenes de cortes cerebrales teñidos solo con TTC u otros tintes individuales. Para el escaneo de cortes de tejido, el software de escaneo que garantiza la configuración de exposición constante es esencial. En general, un escáner de cama plana es menos capaz y no puede reemplazar una cámara digital para la mayoría de las aplicaciones de imágenes.
El fondo detrás de los especímenes también es importante. Idealmente, el fondo de la bandeja debe ser de un color que no esté presente en el espécimen teñido. Por ejemplo, para cuantificar el área de tinción de azul metileno y TTC (rojo) de manera automatizada o semiautomatizada, se deben evitar los fondos blancos, rojos, azules, amarillos y marrones. Por lo tanto, sería preferible un fondo verde. Sin embargo, la selección del color depende de las preferencias del operador, que postprocesa la imagen. Muchos científicos prefieren un fondo blanco porque un fondo blanco se puede eliminar en el postprocesamiento de imágenes y convertirse en completamente blanco (código blanco RGB 255,255,255). Luego, se debe excluir completamente el blanco de la lista de colores seleccionados utilizados para el análisis semiautomatizado y contar solo las áreas necróticas pálidas, que no son completamente blancas si no están sobreexpuestas. Los fondos azules y verdes son adecuados para la fotografía de rodajas cerebrales y aortas.
La herramienta de imagen óptima para la fotografía de tejidos es una cámara digital réflex de lente única o lente intercambiable sin espejo con una lente macro compatible. La captura de objetos muy pequeños puede requerir una combinación de una cámara y un microscopio; sin embargo, una lente macro generalmente tiene suficiente aumento (al menos 1: 2) para obtener imágenes detalladas de un corazón de ratón. Muchos fabricantes ofrecen cámaras digitales asequibles y lentes macro para obtener fotografías de alta resolución y gran aumento. Todas las cámaras digitales actualizadas tienen características y funciones necesarias para la fotografía macro, incluida la posibilidad de montar en un soporte, un alto número de píxeles (generalmente >20 Mpx), vista en vivo, bloqueo de espejo, funciones de lapso de tiempo, obturador remoto y la capacidad de configurar manualmente los parámetros de la cámara, lo que garantiza una velocidad de obturación constante, apertura, balance de blancos y ajuste ISO. Las cámaras compactas con las características mencionadas anteriormente y un aumento de lente de al menos 1: 2 también se pueden usar para fotografía macro. Debido a las características de la lente, algunas cámaras compactas deben colocarse muy cerca del objeto, y el experimentador debe asegurarse de que el cuerpo de la cámara no afecte la iluminación de la muestra.
Para la fotografía macro con cualquier tipo de cámara de lente intercambiable, se requiere una lente macro de alto aumento (1: 1-1: 2). Sugerimos utilizar lentes macro con una distancia focal que oscila entre 50 mm y 100 (120) mm o equivalente en el sensor de fotograma completo (24 mm x 36 mm). Las cámaras de sensor más pequeñas tienen diferentes tamaños de sensor, y la ampliación debe recalcularse en consecuencia. Para la fotografía de cortes de corazón, una distancia ergonómica del elemento frontal de la lente macro de 100 mm al sujeto es de aproximadamente 150 mm. Esta configuración permite a los operadores mantener todo el equipo sobre una mesa, con fácil acceso a los controles de la cámara. Se podría considerar un objetivo macro de 50 mm para la fotografía de objetos más grandes, como cortes de cerebro, porque se necesita un campo de visión más amplio para obtener todos los cortes en una sola fotografía.
Para obtener imágenes nítidas con alta resolución, una cámara debe montarse en un soporte resistente, que, junto con una configuración de luz, se denomina soporte de copia de fotografía. Montar la cámara en un soporte y un disparador remoto (con cable o inalámbrico) elimina el movimiento de la cámara y garantiza una distancia constante del objetivo. Una configuración de iluminación de cámara con dos fuentes de luz constante desde ambos lados, en ángulo de aproximadamente 30-60 ° en relación con el plano del sujeto, garantiza una iluminación suficiente de las muestras y ayuda a evitar reflejos al mismo tiempo. La cámara debe montarse con precisión para que el sensor esté paralelo al plano del sujeto. Para iluminar uniformemente el campo de la imagen, ambas lámparas deben estar igualmente orientadas y colocadas a la misma distancia del sujeto. Las fuentes de luz colocadas a varias distancias del sujeto causan una iluminación desigual. Además, las fuentes de luz parpadeantes son una razón para las variaciones en la exposición de la imagen. En general, es importante colocar con precisión la cámara y las fuentes de luz para adquirir con precisión imágenes de especímenes bien iluminados.
Las muestras de tejido reflejan la luz (brillo), que aparecen como manchas blancas en las imágenes. Estos puntos de reflexión de la luz no contienen información de color útil y, en consecuencia, estas partes de las imágenes no se pueden utilizar para un análisis cuantitativo preciso de las imágenes. Los reflejos de luz de las rodajas de tejido se pueden eliminar por varios métodos. La más eficiente es la inmersión completa de muestras de tejido en un recipiente con una solución salina o PBS. Un enfoque similar es la inserción de rodajas de tejido debajo (o entre) placas de vidrio. Este método es eficiente contra las reflexiones; sin embargo, la resolución de la imagen puede ser inferior a la de las fotografías de tejidos sumergidos.
También se puede usar un filtro polarizador montado en una lente para eliminar los reflejos de la luz. Los filtros polarizadores circulares están ampliamente disponibles, pero varían considerablemente en calidad dependiendo del precio, y los filtros baratos pueden reducir significativamente la resolución de la imagen. La luz reflejada se puede filtrar girando la parte móvil del filtro polarizador en ángulo. La eficacia del filtro polarizador puede verse afectada por algunas fuentes de luz (por ejemplo, luz LED fuerte). En general, después de la eliminación del líquido adicional, un filtro polarizador puede eliminar todos los reflejos de las rodajas cerebrales; sin embargo, la inmersión de la muestra en la solución tampón es el enfoque más fácil y rentable para los cortes de corazón.
La configuración manual de la velocidad de obturación, la apertura, el ISO y el balance de blancos son importantes para mantener el control total del proceso de obtención de imágenes. La muestra, el fondo y las características de la fuente de luz influyen en el sistema de medición de la exposición de la cámara en la configuración automática; por lo tanto, los ajustes manuales son necesarios para mantener la exposición constante y el balance de blancos entre múltiples fotografías durante el experimento. Para la fotografía macro, el ajuste de apertura sugerido está entre f/8 y f/16. Al disminuir la apertura, la profundidad de campo aumenta, lo cual es útil si el objeto no está en un solo plano. Sin embargo, la difracción limita la resolución total de la fotografía en el caso de aperturas más pequeñas. La apertura óptima para la mayoría de las lentes suele ser f / 10 porque en esta configuración, la caída de resolución es insignificante y la profundidad de campo es suficiente. Los valores ISO que oscilan entre 50 y 400 (más bajo es mejor) suelen ser óptimos para minimizar los artefactos de imagen (ruido). La velocidad de obturación queda por cambiar para obtener una exposición correcta utilizando la apertura mencionada y la configuración ISO en las condiciones de luz existentes. La configuración manual es importante para un análisis de imagen coherente. Las imágenes estandarizadas aseguran el uso de la misma configuración de umbral de color en cualquier estudio, lo que requiere un análisis de segmentación. Por ejemplo, el análisis semiautomatizado por el software ImagePro basado en un archivo de segmentación con colores predefinidos de azul, rojo y blanco (+ rosa pálido) se puede utilizar a lo largo de los años si las imágenes de muestra tienen colores consistentes, balance de blancos y exposición.
El ajuste del balance de blancos debe ajustarse en función de la temperatura de color de la fuente de luz que se utiliza para iluminar una muestra. El balance de blancos se puede seleccionar a partir de los ajustes preestablecidos integrados de la cámara o mediante la calibración manual de un objetivo gris. El beneficio de la captura de imágenes en formato RAW es que el balance de blancos se puede ajustar durante el postprocesamiento de la imagen por software. Como los archivos RAW contienen mucha más información que los archivos JPEG, el posprocesamiento de archivos RAW ofrece una excelente oportunidad para la corrección del equilibrio de color y la exposición, así como para obtener una mejor resolución de imagen. Debido a que la mayoría de las cámaras pueden capturar archivos JPEG y RAW simultáneamente, sugerimos capturar el archivo RAW y guardarlo como copia de seguridad.
En general, este protocolo describe una metodología para el corte y tinción de corazón de rata y tejido cerebral y proporciona pautas para establecer configuraciones de iluminación y cámara y técnicas de fotografía para la adquisición de imágenes de alta resolución para su posterior análisis. Este método es aplicable a todas las fotografías experimentales de órganos de animales pequeños.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores fueron apoyados por el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención No 857394, Proyecto FAT4BRAIN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
| 50 mL syringe | Terumo | N/A | |
| Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
| Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
| Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
| Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
| Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
| Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
| Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
| Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
| Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
| Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
| Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
| Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
| Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
| Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
| Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
| Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
| Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
| Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
| Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
| Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
| Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
| Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
| Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
| Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
| Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |
References
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