Summary
В этой статье описывается инкапсуляция плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) с использованием коаксиального устройства фокусировки потока. Мы демонстрируем, что эта технология микрофлюидной инкапсуляции позволяет эффективно формировать сфероиды hPSC.
Abstract
Трехмерные (3D) или сфероидные культуры плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) предлагают преимущества улучшения результатов дифференцировки и масштабируемости. В этой статье мы описываем стратегию надежного и воспроизводимого образования сфероидов hPSC, где коаксиальное устройство фокусировки потока используется для захвата hPSC внутри микрокапсул ядра-оболочки. Основной раствор содержал одноклеточную суспензию гПСК и становился вязким путем включения высокомолекулярного поли(этиленгликоля) (ПЭГ) и среды градиента плотности. Поток оболочки состоял из ПЭГ-4 арм-малеимида или ПЭГ-4-Мал и протекал вдоль основного потока к двум последовательным нефтяным соединениям. Образование капель происходило при первом масляном соединении с раствором оболочки, обернутым вокруг ядра. Химическое сшивание оболочки происходило на втором масляном переходе путем введения в эти капли ди-тиолового сшивки (1,4-дитиотрейтола или ДТТ). Сшиватель реагирует с функциональными группами малеймидов посредством щелковой химии, в результате чего вокруг микрокапсул образуется гидрогелевая оболочка. Наша технология инкапсуляции производила капсулы диаметром 400 мкм со скоростью 10 капсул в секунду. Полученные капсулы имели гидрогелевую оболочку и водное ядро, которое позволяло отдельным клеткам быстро собираться в агрегаты и образовывать сфероиды. Процесс инкапсуляции не оказывал негативного влияния на жизнеспособность гПСК, при этом >95% жизнеспособность наблюдалась через 3 дня после инкапсуляции. Для сравнения, hPSCs, инкапсулированные в твердые гелевые микрочастицы (без водного ядра), не образовывали сфероидов и имели <50% жизнеспособность через 3 дня после инкапсуляции. Сфероидное образование hPSCs внутри микрокапсул ядра-оболочки происходило в течение 48 ч после инкапсуляции, причем диаметр сфероида был функцией плотности прививки клеток. В целом, технология микрофлюидной инкапсуляции, описанная в этом протоколе, хорошо подходила для инкапсуляции hPSCs и формирования сфероидов.
Introduction
Существует значительный интерес к 3D-культурам человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) из-за улучшенной плюрипотентности и дифференцировочного потенциала, обеспечиваемого этим форматом культуры 1,2,3. hPSCs обычно формируются в сфероиды или другие форматы 3D-культур с помощью биореакторов, микроэлементов, гидрогелей и полимерных каркасов 4,5,6. Инкапсуляция предлагает еще одно средство для организации отдельных HPSC в сфероиды. После инкапсулирования сфероиды hPSC могут быть легко обработаны и перенесены в микротитрные пластины для дифференцировки, моделирования заболеваний или экспериментов по тестированию лекарств. Пленение гПСК в гидрогелевом слое также защищает клетки от повреждения сдвигом и позволяет культивировать сфероиды в биореакторе при высоких скоростях перемешивания7.
Наша методология инкапсуляции стволовых клеток развивалась с течением времени. Во-первых, мы сосредоточились на твердых микрочастицах гидрогеля и продемонстрировали успешную инкапсуляцию и культивирование эмбриональных стволовых клеток мышей (mESCs)8. Однако было отмечено, что эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) имеют низкую жизнеспособность при инкапсуляции в таких микрочастицах гидрогеля, по-видимому, из-за большей необходимости для этих клеток восстанавливать контакты между клетками после инкапсуляции. Мы рассуждали, что гетерогенная микрокапсула, обладающая водным ядром, может лучше подходить для инкапсуляции клеток, которые полагаются на быстрое восстановление клеточных контактов. Концепция коаксиального потока, фокусирующего микрофлюидное устройство для получения микрокапсул водного ядра / гидрогелевой оболочки, была адаптирована из He et al.9, но вместо альгината, используемого в первоначальном подходе, в оболочку был включен гидрогель на основе ПЭГ. Впервые мы продемонстрировали успешную инкапсуляцию и сфероидное образование первичного гепатоцита в микрокапсулахядра-оболочки 10 и совсем недавно описали инкапсуляцию hES и iPS-клеток7. Как показано на фиг.1А, капсулы изготавливаются в устройстве фокусировки потока, где потоки потока оболочки и ядра переходят из стороны в сторону в коаксиальный поток перед выбросом в масляную фазу. Основной поток содержит клетки и добавки, которые увеличивают вязкость раствора (нереакционноспособный ПЭГ MW 35кД и йодиксанол - коммерческое название OptiPrep), в то время как оболочка потока содержит реакционноспособные молекулы (ПЭГ-4-Мал). Непрерывный поток коаксиального потока дискретизируется на капли, которые сохраняют архитектуру ядра-оболочки. Структура ядра-оболочки становится постоянной путем воздействия ди-тиолового сшивателя (DTT), который реагирует с PEG-4-Mal через химию щелчка и приводит к образованию тонкой (~ 10 мкм) гидрогелевой кожи или оболочки. После того, как эмульсия нарушается и капсулы переводятся в водную фазу, молекулы ПЭГ диффундируют из ядра и заменяются молекулами воды. Это приводит к образованию микрокапсул водного ядра и гидрогелевой оболочки.
Ниже приведены пошаговые инструкции о том, как создавать микрофлюидные устройства, как подготовить клетки и как проводить инкапсуляцию гПСК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление устройств
- Составьте конструкции устройства микроинкапсулирования и устройства диссоциации с помощью программного обеспечения CAD10,11.
- Раскрутите три слоя фоторезиста СУ-8 последовательно на кремниевой пластине (рисунок 2А) для достижения структур с желаемой высотой: 60, 100 и 150 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс для верхней и нижней форм идентичен.- Отжимное покрытие чистой кремниевой пластиной 10 см с отрицательным фоторезистом SU-8 2025 со скоростью вращения 1 100 об/мин для создания первого слоя 60 мкм. После мягкой выпечки при 65 °C в течение 3 мин и 95 °C в течение 10 мин на конфорке подвергайте форму с помощью безмаскочного элайнера, загрузив файл конструкции шаблона основного канала на ПК μPG 101. Затем продолжайте выпекать после воздействия при 65 °C в течение 3 мин и при 95 °C в течение 10 мин.
- Спиновое покрытие второго слоя SU-8 2025 (40 мкм) при 1 500 об/мин и экспонирование путем загрузки соответствующего файла CAD для шаблона канала оболочки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкая и постэкспозиционная выпечка были аналогичны предыдущему шагу. - Спиновое покрытие третьего слоя СУ-8 2025 при 1 400 об/мин для достижения высоты 50 мкм и повторения вышеуказанного процесса, но обнажения структур для масляной фазы.
- Разработайте форму со всеми тремя слоями за один шаг путем погружения в СУ-8 разработчика до тех пор, пока не будет удален весь неэкспонированный фоторезист.
- Жестко запекайте форму на конфорке при 160 °C в течение 10 мин, чтобы улучшить адгезию и заделать незначительные трещины, которые могут появиться после разработки.
- Подвергайте форму воздействию хлортриметилсилана, чтобы избежать склеивания эластомеров на следующем этапе, и поместите его в чашку Петри по 15 см до использования.
- Подготовьте форму устройства диссоциации таким же образом, как описано на рисунках 1D и 2B. Спиновое покрытие одним слоем фоторезиста СУ-8 на кремниевой пластине, как описано ранее на этапе 1.2.3, для достижения структур с желаемой высотой: 50 мкм. Проводите мягкую и постэкспозиционную выпечку, развитие и твердую выпечку аналогично предыдущему этапу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Массив столбов треугольной формы покрывал всю камеру, причем расстояние между стойками уменьшалось по мере уменьшения ширины камеры к выходу. Треугольные стойки были по 200 мкм на сторону с шагом от 400 мкм (на входе) до 30 мкм (на выходе). - Подготовьте формы методом мягкой литографии с использованием полидиметилсилоксана (PDMS).
- Смешайте основание эластомера PDMS и эластомерный отверждающий агент в соотношении 10:1 w/w в планетарной центрифуге. Вылейте смесь как на мастер-формы микрокапсулирования, так и на форму диссоциации, чтобы создать слой 3-4 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смеси 50 г эластомерной основы с 5 г отверждающего агента достаточно для покрытия основной формы толщиной 3 мм. - Поместите чашки Петри, содержащие формы, в вакуумный осушитель на 15 минут, чтобы дегазировать неотвержденную PDMS.
- Переместите чашку Петри в духовку и выпекайте при 80 °C в течение минимум 60 минут.
- Снимите мастер-формы из духовки и дайте им остыть. С помощью прецизионного ножа аккуратно вырежьте PDMS по форме пластины и вырежьте кусочки PDMS из основной формы.
- Вырежьте плиты PDMS, обрезав края каждого устройства скальпелем, затем выбивайте впускные/выпускные жидкостные порты в диссоциационном устройстве и только в верхнем микрофлюидном устройстве с помощью игл из нержавеющей стали. Накройте устройства волшебной лентой, чтобы избежать загрязнения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Игольчатый калибр составляет 14 G и 15 G для входных и выходных отверстий соответственно. - Для склеивания обрабатывают узорчатые стороны верхней и нижней частей PDMS плазмой O2 на плазменном травиле в течение 2 мин.
- Выровняйте обе части PDMS под стереоскопом после добавления тонкого разделительного слоя дистиллированной воды непосредственно в микроканалы (2 мкл).
- Поместите выровненное устройство PDMS в печь при температуре 80 °C на ночь, чтобы завершить склеивание и восстановить PDMS до исходного гидрофобного состояния. Храните устройства до дальнейшего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В результате получается коаксиальное устройство фокусировки потока с тремя различными высотами 120 мкм для сердечника, 200 мкм для оболочки и 300 мкм для масляных каналов. - Чтобы использовать устройство сразу после плазменного склеивания, осторожно, но твердо вводят 30 мкл раствора гидрофобного покрытия в псевдоожиженные каналы для достижения гидрофобного покрытия. Затем немедленно продуть воздух в каналы до тех пор, пока в устройстве не будут наблюдаться остатки раствора гидрофобного покрытия.
- Свяжите диссоциационное устройство, сначала обработав узорчатую сторону устройства и очищенное скользящее стекло плазмой O2 в течение 2 мин, а затем соберите их для дальнейшего отверждения в печи при 80 °C в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройства можно хранить до дальнейшего использования.
- Смешайте основание эластомера PDMS и эластомерный отверждающий агент в соотношении 10:1 w/w в планетарной центрифуге. Вылейте смесь как на мастер-формы микрокапсулирования, так и на форму диссоциации, чтобы создать слой 3-4 мм.
2. Приготовление растворов
- Складские решения. Во-первых, готовят исходные растворы (концентрированные растворы), которые будут разбавлены до более низких концентраций для фактического использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Складские растворы используются для экономии времени приготовления, экономии материалов, уменьшения пространства для хранения и повышения точности при приготовлении рабочего раствора в более низких концентрациях.- Приготовьте 30 мл 2-кратного основного раствора (16% ПЭГ и 34% среды с градиентом плотности): смешайте 4,8 г ПЭГ 35 кДа, 10,2 мл среды с градиентом плотности и 19,8 мл среды DMEM/F12. Отфильтруйте этот основной раствор с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм.
- Приготовить 50 мл минерального масла с 3% поверхностно-активным веществом: смешать 48,5 мл минерального масла и 1,5 мл поверхностно-активного вещества. Хранить в стерильном состоянии после фильтрации через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
- Приготовить 50 мл минерального масла с 0,5% поверхностно-активным веществом: смешать 49,75 мл минерального масла и 0,25 мл поверхностно-активного вещества. Хранить в стерильном состоянии.
- Приготовить 1 М дитиотеритол (ДТТ): растворить 1,5425 г ДТТ в 10 мл дистиллированной воды. Хранить в стерильном состоянии.
- Приготовьте 1 М триэтаноламина (TEA): добавьте 66,4 мкл TEA в 433,6 мкл дистиллированной воды. Хранить в стерильном состоянии.
- Приготовьте 1% Pluronic F127 (PF127): растворите 100 мг PF127 в 10 мл дистиллированной воды. Хранить в стерильном состоянии.
- Рабочие решения
- Приготовьте сшивающую эмульсию, смешав 4,5 мл минерального масла с 3% поверхностно-активным веществом и 300 мкл 1 М DTT (соотношение 1:15). Вихрь раствора в течение 2 мин и ультразвуком в течение 45-60 мин в ультразвуковой ванне при 20 °C. Загрузите этот раствор в шприц объемом 5 мл с иглой 27 г.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмульсия образуется путем обработки ультразвуком смеси масла и воды. - Приготовьте раствор защитного масла, загрузив минеральное масло 0,5% поверхностно-активным веществом в шприц объемом 5 мл с иглой 27 г.
- Готовят скорлупный (8% мас./об.ПЭГ-4-Маль и 15 мМ ТЭА) раствор, добавляя 32 мг ПЭГ-4-Маль в 400 мкл 1x DPBS с образованием 8% мас./об.раствора, и вихря раствор в течение 2 мин. Затем добавляют 6 мкл 1 М ЧАЙ (конечная концентрация 15 мМ ЧАЙ). Наконец, центрифугу при 13 000 х г в течение 5 мин через спин-фильтр и держите ее в темноте на коромысле в течение 30 мин. Затем загрузите этот раствор в шприц объемом 1 мл с иглой 27 г.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте контейнер PEG-4-Mal сидеть при комнатной температуре в течение 10 мин перед открытием крышки и выдуйте газN2 , чтобы заменить O2 на N2 перед закрытием крышки. Вихрь TEA перед добавлением в раствор.
- Приготовьте сшивающую эмульсию, смешав 4,5 мл минерального масла с 3% поверхностно-активным веществом и 300 мкл 1 М DTT (соотношение 1:15). Вихрь раствора в течение 2 мин и ультразвуком в течение 45-60 мин в ультразвуковой ванне при 20 °C. Загрузите этот раствор в шприц объемом 5 мл с иглой 27 г.
- Приготовьте клеточную суспензию в основном растворе
- Обрабатывайте гПСК трипсином в течение 5-10 мин при 37 °C. Затем соберите их с тарелок. Гасить трипсин средой после отслоения клеток, а затем перенести клетки в коническую трубку объемом 15 мл.
- Центрифуга объемной клеточной суспензии (400 х г, 5 мин). Осторожно аспирируйте супернатант, а затем повторно суспендируйте клеточную гранулу, используя минимальный объем питательной среды. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные клеточные аликвоты содержат 12-20 х 106 клеток и достаточны для получения 400 мкл основного раствора. - Взять 12-20 х 106 ячеек из суспензии объемной ячейки и центрифугировать суспензию ячейки/среды (400 х г, 5 мин).
- Осторожно аспирировать среду из ячейки гранулы. Затем добавляют 200 мкл среды и 200 мкл 2-кратного раствора ПЭГ (конечная концентрация 30-50 х 106 клеток/мл) и аккуратно перемешивают.
ПРИМЕЧАНИЕ: Низкие концентрации в клетках (менее 20 х 106 клеток/мл) приводили к образованию многих пустых капсул. - Добавьте в раствор 30 мкл 1% PF127.
- Вставьте микромешалку (2 мм х 7 мм) в шприц объемом 1 мл, а затем загрузите ячейку, содержащую основной раствор, в шприц иглой 27 G. Держите раствор холодным со льдом в течение всего процесса инкапсуляции.
3. Экспериментальная установка
- Поместите связанное капельное устройство PDMS, четыре куска длиной 20 см и один кусок впускных микротрубок длиной 5 см (0,38 мм I.D. x 1,1 мм O.D.), один кусок выходной трубки 10 см (0,5 мм I.D. x 1,5 мм O.D.) и шесть частей 0,5 см фитинговых трубок (1 мм I.D. x 1,8 мм O.D.) под бактерицидным источником света (обычно встроенным в шкафы биологической безопасности) и стерилизуйте в течение 30 Мин.
- Используйте щипцы для установки трубки в жидкостные входные отверстия и диссоциационные отверстия.
- Используйте три куска впускных микротрубок длиной 20 см для оболочки, масла, сшивающих эмульсийных входов и один кусок для входного отверстия устройства диссоциации. Затем вставьте противоположный конец трубок к игле шприца с соответствующим раствором. Между тем, соедините входное отверстие микрофлюидного устройства и выходное отверстие устройства диссоциации с одной микропробиркой 5 см (рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Входные микротрубки должны быть плотно закреплены внутри фитинговых трубок, которые были вставлены на последнем этапе. - Вставьте одну выпускную трубку в выходное отверстие для жидкости и поместите противоположный конец в резервуар для сбора.
- Поместите устройство на ступень микроскопа и прикрепите трубку, чтобы избежать движения. Выровняйте и сфокусируйте микроскоп на сопле прибора для контроля потока.
- Поместите каждый шприц на разные шприцевые насосы и закрепите их должным образом (рисунок 1B). Программируйте каждый насос в соответствии с протоколами производителя на следующие скорости потока: ядро (3-5 мкл/мин), оболочка (3-5 мкл/мин), защитное масло (20-80 мкл/мин) и сшивающее масло (40-60 мкл/мин). Запустите поток во всех насосах.
- Подождите, пока каждая жидкость войдет в устройство, и заполните каналы, выталкивая оставшийся воздух.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если во входной трубке находится большое количество воздуха, временно увеличьте каждый расход до тех пор, пока воздух не будет полностью удален. Имейте в виду, что чрезмерный расход может привести к отказу связи PDMS-to-PDMS. - Когда образование капсулы стабилизируется (рисунок 3), поместите противоположный конец коллекторной трубки в новую коническую трубку с 5 мл среды mTeSR.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда содержит 10 мкМ ингибитора ROCK, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. - После сбора достаточного количества капсул инкубируют при 37 °C с 5% CO2 в течение 10 мин. Капсулы, находящиеся в масляной фазе, будут находиться в верхней части трубки (см. Рисунок 4А). Осторожно постукивание по трубке приводит к тому, что капсулы оседают на дно. После этого большая часть масла и среды может быть аспирирована.
- Соберите капсулы со дна конической трубки, поместите их на клеточный ситечко (размер пор 100 мкм) и промыть обильным количеством среды. Затем соберите микрокапсулы, используя среду 2 мл в 6-луночной культуральной пластине, проведя среду через фильтр, поскольку она перевернута поверх пластины скважины (см. Рисунок 4A).
4. Культура и анализ hPSC в микрокапсулах
- Базовая культура
- Инкубируйте капсулы стволовых клеток в 6-луночной чашке для культивирования при 37 °C с 5% CO2.
- Меняйте среду через день, собирая капсулы на фильтре клеточного сетчатого фильтра, промывая их избыточной средой и повторно помещая их в новую скважину в 6-луночных пластинах со средой 2 мл, как это было сделано на этапе 3.10.
- Культивируйте капсулы не менее 10 дней.
- Выполните анализ живых/мертвых, чтобы определить жизнеспособность инкапсулированных стволовых клеток.
- Разморозить живые/мертвые растворы анализа (гомодимер этидия-1 и кальцеин АМ).
- Добавьте 4 мкл гомодимера этидия-1 и 1 мкл 4 мкМ растворов кальциина AM к 2 мл стерильного DPBS. Вихрь для обеспечения полного перемешивания.
- Соберите приблизительно 100 микрокапсул на клеточном ситечке и промойте их стерильным DPBS, чтобы обеспечить диффузию среды из капсул.
- Снова соберите их на 12-луночную культуральную пластину, используя 1 мл раствора, приготовленного на этапе 4.2.2. Инкубировать при 37 °C в течение 20 мин.
- Визуализируйте клетки под флуоресцентным микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток количественно определяется путем расчета процента живых клеток, которые визуализируются как зеленые, среди общего числа клеток.
- Характеристика размера сфероида.
- При желании поместите пластину скважины с микрокапсулами под микроскоп и измерьте диаметр сфероидов, показанный на соответствующем программном обеспечении, с соответствующими шкалами стержней.
- Измерьте и проанализируйте размер сфероида.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следуя вышеупомянутому протоколу, считыватель сможет изготавливать микрофлюидные устройства и производить микрокапсулы, несущие клетки. На рисунке 3А показаны примеры оптимальных и субоптимальных микрокапсул, изготовленных с использованием микрофлюидной генерации капель. Различные составы ПЭГ-4-Мал приводили к образованию капсул различной морфологии – морщинистые капсулы были связаны с плохим гелеобразованием, низкой механической целостностью и не выдерживали культивирования в перемешиваемом биореакторе. Гладкие капсулы, наблюдаемые при содержании ПЭГ >6%, представляли желаемую морфологию капсул и были достаточно надежными для культивирования клеток. Структура ядра-оболочки была подтверждена включением микрошариков в ядро и флуоресцентных фрагментов в оболочку микрокапсул. Агрегация бусин в центре капсул, как показано на рисунке 3B , использовалась как указание на то, что ядро было водным, и бусины могли свободно перемещаться. Флуоресцентное кольцо, наблюдаемое на фиг.3С , указывало на наличие гидрогелевой оболочки и использовалось для определения толщины оболочки. Мы рекомендуем пользователям использовать включение микрогранул и флуоресцентную маркировку на ранних стадиях установления процесса инкапсуляции.
Как только процесс инкапсуляции установлен, можно переходить к инкапсуляции hPSCs. Хотя этот протокол описывает инкапсуляцию клеток H9, мы использовали аналогичную стратегию для инкапсуляции другой линии hESC (HUES-8) и линии iPSC (1016). 7 См.
Хотя инкапсуляция может осуществляться с использованием только устройства инкапсуляции, мы отметили, что hPSC имеют тенденцию сгущаться в системе, что приводит к неравномерной инкапсуляции или заполняемости капсул. Чтобы решить эту проблему, мы разработали устройство диссоциации или фильтрации и расположили его перед устройством инкапсуляции. Это диссоциационное устройство содержало проточный канал с массивом треугольных столбов, измеренных 200 мкм на сторону, и с шагом в диапазоне от 400 мкм на входе до 30 мкм на выходе, так что сгустки либо сохраняются, либо разбиваются перед входом в устройство инкапсуляции (см. Фиг.1D)7. Использование диссоциационного устройства позволяет значительно улучшить однородность сфероидов и увеличить заполненность клеток капсул с 57% до >90%7.
На рисунке 4B,C описаны репрезентативные результаты выполнения инкапсуляции. Как видно из этих изображений, клетки H9 обладают высокой жизнеспособностью с >95% жизнеспособностью, достигаемой регулярно во время инкапсуляции. Мы сравнили скорость роста (см. Рисунок 4B,C) и дифференциационный потенциал инкапсулированных инкапсулированных сфероидов7 и определили, что процесс инкапсуляции не оказывает неблагоприятного воздействия на hPSCs. С другой стороны, есть несколько преимуществ инкапсуляции HPSC. Инкапсулированные сфероиды просты в обращении и могут быть распределены в микротитрные пластины для разработки протоколов дифференцировки или тестирования методов лечения. Наша лаборатория заинтересована в использовании микрокапсул в качестве носителей стволовых клеток для выращивания суспензии в перемешанных биореакторах и продемонстрировала, что гидрогелевая оболочка обеспечивает защиту от повреждения сдвигом в таких культурах7. Это дополнительный путь, который мы преследуем, заключается в создании биологически активных микрокапсул, где гидрогелевая оболочка может быть загружена факторами роста для локальной и непрерывной доставки индуктивных сигналов во время дифференциации.
Рисунок 1: Изготовление микрокапсул сердечника-оболочки. (A) Микрофлюидное устройство для генерации капсул состоит из четырех входных каналов (ядро, оболочка, масло и сшитое масло) и змеевидного канала, который ведет к коллекторной трубке. Устройство изготовлено таким образом, что сердечник, оболочка и масляные каналы имеют высоту 120 мкм (H1),200 мкм (H 2) и 300 мкм (H3) соответственно. Вставка представляет собой вид поперечного сечения на сопле - стыке водных и масляных потоков. Этот вид поперечного сечения наклонен на 90°, чтобы дать читателю лучшее представление о коаксиальных каналах потока. 3D-представление процесса изготовления микрокапсул сердечника-оболочки показывает, как коаксиальный поток генерируется перед переходом, фокусирующим поток, для создания структуры микрокапсулы ядро-оболочка. Эмульгирование достигается путем воздействия водных капель на два масляных потока, первый из которых предназначен для стабилизации капель, а второй для обеспечения сшивки DTT, который реагирует с PEG-4-Mal. Этот показатель был изменен по сравнению со ссылкой12. Авторское право 2019, Американское химическое общество. (B) Экспериментальная установка системы инкапсуляции с указанием местоположения шприцевых насосов, трубок, микрофлюидных устройств и капсульной коллекторной трубки. (C) Изображение системы инкапсуляции, которая состоит из диссоциационных и инкапсуляционных устройств в последовательности. (D) Конструкция устройства микрофлюидной диссоциации, используемого для предотвращения попадания крупных клеточных агрегатов в устройство микрокапсулирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изготовление микрофлюидных устройств, используемых для инкапсуляции. (A) Изготовление инкапсуляционного устройства. Три слоя фоторезиста Су-8 были покрыты спин-покрытием и фотоструктурированы для создания керна, оболочки и масляных каналов с разной высотой. Основные каналы имеют ширину 220 мкм, которая сужается на стыке капсул до 135 мкм. Каналы для всех фаз следуют одному и тому же принципу: оболочка и масляный каналы начинаются с ширины 500 мкм, сужаясь на стыке до 220 мкм, а экранирующее масло начинается при 500 мкм, сужаясь до 270 мкм. Выходной серпантин имеет ширину 1,5 мм и длину ~55 мм. Верхняя и нижняя части PDMS затем выравнивались и склеивались плазмой. (B) Изготовление устройства для диссоциации. Один слой фоторезиста СУ-8 был покрыт спин-покрытием, а фотография узорчатой для создания каналов диссоциации. Затем кусок PDMS был склеен плазмой со стеклянным затвором. Диссоциационное устройство состоит из небольшой камеры высотой 30 мкм, длиной 16,5 мм и шириной 5 мм на входе и 1,7 мм на выходе. Он имеет треугольные структуры (200 мкм, равносторонние), которые отделены друг от друга 420 мкм входного отверстия и становятся ближе на пути к выходу, с разделением 50 мкм в последнем ряду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Характеристика микрокапсул. (A) Различия в морфологии капсул в зависимости от содержания ПЭГ-4-Mal в оболочке. Гладкие капсулы с яркими краями связаны с желаемой механической целостностью. (B) Подтверждение водного ядра микрокапсул. Захваченные микрошарики свободно перемещаются в водном ядре и агрегируются в центре микрокапсул. (C) Подтверждение структуры сердечника-оболочки путем включения ПЭГ, меченного родамином B, в оболочку микрокапсул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Инкапсуляция гПСК. (А) Микрокапсулы в масляной фазе собирают в коническую трубку, заполненную средой. После того, как микрокапсулы оседают на дно трубки, масло и среда аспирируют, микрокапсулы промывают и затем переносят на 6-луночную пластину для культивирования. (B) Живое/мертвое окрашивание через 6 ч после инкапсуляции клеток H9. Верхнее изображение было получено в 10x, а нижнее изображение в 20x. (C) Изображения, сравнивающие размеры сфероидов, которые меняются со временем для клеток H9 в капсулах и в коммерческих 3D-культурах (нижние изображения). (D) Количественная оценка диаметра сфероида, который увеличивается для hPSCs в микрокапсулах и в стандартных 3D-пластинах культуры в течение 7 дней в среде H9. Статистический анализ -t-тест, p < 0,05, n = 20. Шкала: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь процесс инкапсуляции приводит к воспроизводимому образованию сфероидов hPSC. Формат микрокапсул позволяет легко дозировать сфероиды в колодцы микротитровой пластины для экспериментов, направленных на улучшение/оптимизацию протоколов дифференциации или тестирование методов лечения. Инкапсулированные сфероиды стволовых клеток могут также использоваться в культурах суспензий, где гидрогелевая оболочка защищает клетки от повреждений, вызванныхсдвигом7.
В рамках протокола есть несколько критических шагов. Важно поддерживать скорость потока керна, оболочки и нефтяных потоков в пределах диапазона, описанного в разделе «Протокол». Если скорость потока оболочки слишком низкая, поток становится нестабильным, в результате чего образуются искаженные и механически нестабильные капсулы. Успешная инкапсуляция клеток должна выглядеть аналогично микрокапсулам, показанным на рисунке 4C. Микрокапсулы должны быть одинакового диаметра и иметь сопоставимое количество клеток, захваченных в ядре. Агрегация отдельных клеток в сфероиды обычно происходит в течение 48 ч, а отсутствие образования сфероидов через 72 ч является предупреждающим знаком. Одной из причин отсутствия сфероидного образования может быть то, что вязкие молекулы в ядре недостаточно быстро выщелачиваются через гидрогелевую оболочку. Мы столкнулись с этим сценарием при регулировке вязкости основного раствора с использованием высокомолекулярных полимеров, таких как карбоксиметилцеллюлоза (MW 250 kD). Можно инкапсулировать микрошарики (см. Рисунок 3B), чтобы проверить, могут ли эти объекты размером с клетку свободно перемещаться по ядру и насколько быстро компоненты ядра выщелачиваются. Отсутствие сфероидного образования также встречалось нами при использовании ПЭГ-4-Маль концентраций >8% мас./об. В этом сценарии пористость и диффузионная способность гидрогелевой оболочки уменьшаются, а элементы с высокой вязкостью в ядре не выщелачиваются достаточно быстро, чтобы позволить клеткам образоваться в агрегаты. Вполне возможно, что качество ПЭГ-4-Мал может варьироваться от партии к партии или производителю. Поэтому может потребоваться некоторая корректировка концентрации полимера в оболочке. Еще раз, метод включения шариков должен показать, как быстро вязкие компоненты в ядре вытесняются молекулами воды. По нашему опыту, это должно произойти в течение 3 ч после переноса микрокапсул в водную среду.
Протокол инкапсуляции, описанный здесь, хорошо работал для нескольких линий hPSC7, первичных гепатоцитов10 и нескольких линий раковых клеток (неопубликованные результаты). Тем не менее, мы столкнулись с трудностями в формировании сфероидов после инкапсуляции стволовых клеток (sc)-гепатоцитов и sc-β-клеток. Устранение неполадок с инкапсулированными микрошариками показало, что вязкие компоненты быстро элюируются из ядра и что клетки могут свободно перемещаться и образовывать клеточные контакты. Дополнительное устранение неисправностей включало титрование концентрации ди-тиолового поперечного DTT (присутствующего в масляной фазе) с 66 мМ до 10 мМ. Образование сфероидов для sc-гепатоцитов и β-клеток происходило при этой более низкой концентрации DTT. Поэтому пользователь может захотеть рассмотреть возможность оптимизации концентрации кросслинкера, но только в том случае, если другие шаги по устранению неполадок, перечисленные выше, не увенчались успехом. Мы обнаружили, что концентрация DTT имеет решающее значение для поддержания механической целостности микрокапсул с 66 мМ DTT, что приводит к механически прочным микрокапсулам и нетоксична для подавляющего большинства типов клеток, используемых на сегодняшний день.
В литературе описан ряд стратегий создания 3D-конструкций стволовых клеток. Преимущества формирования конструкций стволовых клеток в микрокапсулах ядра-оболочки многочисленны. После инкапсулирования сфероиды могут легко обрабатываться с помощью гидрогелевых капсул, обеспечивающих защиту от повреждения сдвигом. Инкапсулированные сфероиды можно культивировать в суспензии с энергичным перемешиванием без повреждения стволовых клеток.
Существует множество возможностей для расширения возможностей микрокапсул. Наша команда ранее описала использование гепаринсодержащих гидрогелей для инкапсуляции гепатоцитов и стволовых клеток 8,12 и в настоящее время разрабатывает гепаринсодержащие биологически активные микрокапсулы ядра-оболочки, которые служат депо для хранения и локального высвобождения индуктивных сигналов (ГФ) к стволовым клеткам. Такие микрокапсулы могут помочь уменьшить использование дорогостоящих ГФ при одновременном улучшении результатов дифференциации. Микрокапсулы могут быть дополнительно усилены путем включения белков ECM в ядро, тем самым модулируя микроокружение стволовых клеток. Микрокапсулы оболочки ядра могут быть разлагаемыми, чтобы облегчить извлечение сфероидов hPSC13,14. В целом, микрокапсулы core-shell представляют собой платформенную технологию, которая может быть модифицирована и улучшена для удовлетворения потребностей конкретного протокола дифференцировки стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было частично поддержано грантами Центра регенеративной медицины клиники Майо, Фонда J. W. Kieckhefer, Фонда Аль Нахайяна, Регенеративной медицины Миннесоты (RMM 101617 TR 004) и NIH (DK107255).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
