Summary
Denne artikkelen beskriver innkapsling av humane pluripotente stamceller (hPSCer) ved hjelp av en koaksial strømningsfokuseringsenhet. Vi viser at denne mikrofluidiske innkapslingsteknologien muliggjør effektiv dannelse av hPSC-sfæroider.
Abstract
Tredimensjonale (3D) eller sfæroidkulturer av humane pluripotente stamceller (hPSCer) gir fordelene med forbedrede differensieringsresultater og skalerbarhet. I dette dokumentet beskriver vi en strategi for robust og reproduserbar dannelse av hPSC-sfæroider der en koaksial strømningsfokuseringsenhet brukes til å fange hPSCer inne i mikrokapsler av kjerneskall. Kjerneløsningen inneholdt encellet suspensjon av hPSCer og ble gjort viskøst ved inkorporering av høymolekylær poly (etylenglykol) (PEG) og tetthet gradient media. Skallstrømmen består av PEG-4 arm-maleimid eller PEG-4-Mal og strømmet sammen med kjernestrømmen mot to påfølgende oljekryss. Dråpeformasjonen skjedde ved det første oljekrysset med skallløsning som pakket seg rundt kjernen. Kjemisk krysskobling av skallet skjedde ved det andre oljekrysset ved å introdusere en di-tiol crosslinker (1,4-dithiothreitol eller DTT) til disse dråpene. Crosslinker reagerer med maleimid funksjonelle grupper via klikkkjemi, noe som resulterer i dannelsen av et hydrogelskall rundt mikrokapsler. Vår innkapslingsteknologi produserte kapsler med 400 μm diameter med en hastighet på 10 kapsler per sekund. De resulterende kapslene hadde et hydrogelskall og en vandig kjerne som gjorde det mulig for enkeltceller å raskt montere seg i aggregater og danne sfæroider. Innkapslingsprosessen påvirket ikke levedyktigheten til hPSCer negativt, med >95% levedyktighet observert 3 dager etter innkapsling. Til sammenligning dannet hPSCs innkapslet i faste gelmikropartikler (uten en vandig kjerne) ikke sfæroider og hadde <50% levedyktighet 3 dager etter innkapsling. Sfæroiddannelse av hPSCer inne i mikrokapsler av kjerneskall oppstod innen 48 timer etter innkapsling, med sfæroiddiameteren som en funksjon av celleinokuleringstetthet. Samlet sett var den mikrofluidiske innkapslingsteknologien beskrevet i denne protokollen godt egnet for hPSCs innkapsling og sfæroiddannelse.
Introduction
Det er stor interesse for 3D-kulturer av menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) på grunn av forbedret pluripotens og differensieringspotensial gitt av dette kulturformatet 1,2,3. hPSCer dannes vanligvis til sfæroider eller andre 3D-kulturformater ved hjelp av bioreaktorer, mikrowells, hydrogeler og polymere stillaser 4,5,6. Innkapsling tilbyr et annet middel for å organisere enkle hPSCer i sfæroider. Når innkapslede hPSC sfæroider kan håndteres med letthett og overføres til mikrotiterplater for differensiering, sykdomsmodellering eller narkotikatesting eksperimenter. Innkapslet hPSCs i et hydrogellag beskytter også celler mot skjærskader og gjør det mulig å dyrke sfæroider i en bioreaktor ved høye omrøringshastigheter7.
Vår metodikk for stamcelleinnkapsling utviklet seg over tid. For det første fokuserte vi på faste hydrogelmikropartikler og demonstrerte vellykket innkapsling og dyrking av museembrenne stamceller (mESCs)8. Det ble imidlertid bemerket at humane embryonale stamceller (hESCs) hadde lav levedyktighet når de ble innkapslet i slike hydrogelmikropartikler, antagelig på grunn av større behov for at disse cellene gjenoppretter cellecellekontakter etter innkapslingen. Vi begrunnet det med at heterogen mikrokapsel, som har en vandig kjerne, kan være bedre egnet for innkapsling av celler som er avhengige av rask reetablering av cellecellekontakter. Konseptet med koaksial strømningsfokusering av mikrofluidisk enhet for å lage vandige mikrokapsler av kjerne/hydrogelskall ble tilpasset fra He et al.9, men i stedet for alginat ansatt i den opprinnelige tilnærmingen, ble en PEG-basert hydrogel innlemmet i skallet. Vi viste først vellykket innkapsling og sfæroiddannelse av primær hepatocytt i kjerneskallmikrokapsler10 og sist beskrevet innkapsling av hES- og iPS-celler7. Som beskrevet i figur 1A, fremstilles kapsler i en strømningsfokuseringsenhet der skall- og kjernestrømstrømmene går fra side til side til koaksial strømning før utkast til oljefasen. Kjernestrømmen inneholder celler og tilsetningsstoffer som øker viskositeten til løsningen (ikke-reaktiv PEG MW 35kD og iodixanol - kommersielt navn OptiPrep) mens skallstrømmen inneholder reaktive molekyler (PEG-4-Mal). Kontinuerlig koaksial strømningsstrøm er atskilt i dråper som beholder kjerneskallarkitektur. Kjerneskallstrukturen gjøres permanent ved eksponering for di-tiol crosslinker (DTT), som reagerer med PEG-4-Mal via klikkkjemi og resulterer i dannelse av en tynn (~ 10 μm) hydrogelhud eller skall. Etter at emulsjonen er brutt og kapsler overføres til en vandig fase, diffuse molekyler av PEG fra kjernen og erstattes av vannmolekyler. Dette resulterer i vandig kjerne og hydrogel skall mikrokapsler.
Nedenfor finner du trinnvise instruksjoner om hvordan du lager mikrofluidiske enheter, hvordan du klargjør celler og hvordan du utfører innkapsling av hPSCer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabrikasjon av enheter
- Lag designene for mikroinnkapslingsenheten og dissosiasjonsenheten ved hjelp av CAD-programvare10,11.
- Spin-coat de tre lagene av SU-8 fotoresist sekvensielt på en silisiumskive (figur 2A) for å oppnå strukturer med ønsket høyde: 60, 100 og 150 μm.
MERK: Prosessen for topp- og bunnformer er identisk.- Spinn frakk en ren 10 cm silisiumskive med SU-8 2025 negativ fotoresist ved 1100 rpm for å lage det første 60 μm-laget. Etter en myk bake ved 65 °C i 3 minutter og 95 °C i 10 minutter på en varm plate, eksponer formen ved hjelp av en maskeløs justering ved å laste opp designfilen til kjernekanalmønsteret til μPG 101 PC. Fortsett deretter med ettereksponeringsbaken ved 65 °C i 3 minutter og ved 95 °C i 10 minutter.
- Snurr det andre SU-8 2025-laget (40 μm) ved 1500 o/min og eksponer ved å laste opp riktig CAD-fil for skallkanalmønsteret.
MERK: Myke og posteksponeringsbakstene lignet på forrige trinn. - Spinn kappen det tredje SU-8 2025-laget ved 1400 o/min for å oppnå 50 μm høyde og gjenta prosessen ovenfor, men eksponer strukturene for oljefasen.
- Utvikle formen med alle tre lagene i ett enkelt trinn ved nedsenking i SU-8 utvikler til all den ueksponerte fotoresisten er fjernet.
- Hard bake formen på en varm plate ved 160 °C i 10 minutter for å forbedre vedheft og forsegle mindre sprekker som kan oppstå etter utviklingen.
- Utsett formen på klorotrimetylsilane for å unngå elastomerbinding i neste trinn og legg den i 15 cm Petri-retter til bruk.
- Klargjør dissosiasjonsenhetens form på samme måte, som beskrevet i figur 1D og figur 2B. Spinn frakk ett lag SU-8 fotoresist på en silisiumskive, som beskrevet tidligere i trinn 1.2.3, for å oppnå strukturer med ønsket høyde: 50 μm. Utfør den myke og posteksponeringsbake, utvikling og hard bake på samme måte som forrige trinn.
MERK: En rekke trekantede stolper dekket hele kammeret, med mellomrom mellom stolper som avtar etter hvert som kammerbredden reduseres mot utløpet. Trekantstolper var 200 μm per side med en tonehøyde fra 400 μm (ved innløpet) til 30 μm (ved utløpet). - Forbered formene ved myk litografi ved hjelp av polydimetylsiloksan (PDMS).
- Bland PDMS elastomerbase og elastomer herdemiddel i et forhold på 10:1 m/w i en planetarisk sentrifuge. Hell blandingen på både mikroinnkapslingsmesterformer og dissosiasjonsmesterform for å skape et 3-4 mm lag.
MERK: En blanding av 50 g elastomerbase med 5 g herdemiddel er tilstrekkelig til å dekke en masterform med 3 mm tykkelse. - Legg Petri-rettene som inneholder formene i en vakuumdesiccator i 15 minutter for å avgasse den usikrede PDMS.
- Flytt Petri-rettene til en ovn og stek ved 80 °C i minst 60 minutter.
- Fjern masterformene fra ovnen og la dem avkjøles. Bruk en presisjonskniv til å kutte PDMS forsiktig etter formen på skiven og skrell ut PDMS-brikkene fra masterformen.
- Klipp ut PDMS-platene ved å trimme kantene på hver enhet med en skalpell, og slå deretter ut innløps-/utløpsvæskeporter i dissosiasjonsenheten og bare i den øverste mikrofluidiske enheten ved hjelp av nåler i rustfritt stål. Dekk enhetene med magisk tape for å unngå forurensning.
MERK: Nålemåleren er henholdsvis 14 G og 15 G for innløps- og utløpsporter. - For binding, behandle de mønstrede sidene av de øverste og nederste PDMS-delene med O2 plasma på en plasmaeter i 2 min.
- Juster begge PDMS-delene under et stereoskop etter at du har lagt til et tynt separasjonslag med destillert vann direkte i mikrokanalene (2 μL).
- Plasser den justerte PDMS-enheten i ovnen ved 80 °C over natten for å fullføre bindingen og gjenopprette PDMS til sin opprinnelige hydrofobe tilstand. Oppbevar enhetene inntil videre bruk.
MERK: Dette resulterer i en koaksial strømningsfokuseringsenhet med tre forskjellige høyder på 120 μm for kjerne, 200 μm for skall og 300 μm for oljekanaler. - For å bruke enheten rett etter plasmabindingen, injiser forsiktig, men fast 30 μL hydrofob beleggløsning i de fluidiske kanalene for å oppnå hydrofobt belegg. Deretter renses luft umiddelbart inn i kanalene til det ikke observeres rester av den hydrofobe beleggløsningen i enheten.
- Koble dissosiasjonsanordningen ved først å behandle den mønstrede siden av enheten og et renset glideglass med O2 plasma i 2 min, og monter dem deretter for videre herding i ovnen ved 80 °C over natten.
MERK: Enheter kan lagres inntil videre bruk.
- Bland PDMS elastomerbase og elastomer herdemiddel i et forhold på 10:1 m/w i en planetarisk sentrifuge. Hell blandingen på både mikroinnkapslingsmesterformer og dissosiasjonsmesterform for å skape et 3-4 mm lag.
2. Utarbeidelse av løsninger
- Lagerløsninger. For det første utarbeide lagerløsninger (konsentrerte løsninger) som vil bli fortynnet til lavere konsentrasjoner for faktisk bruk.
MERK: Lagerløsninger brukes til å spare tilberedningstid, spare materialer, redusere lagringsplass og forbedre nøyaktigheten når du forbereder en arbeidsløsning i lavere konsentrasjoner.- Forbered 30 ml 2x kjerneløsning (16 % PEG og 34 % tetthetsgradientmedier): Bland 4,8 g 35 kDa PEG, 10,2 ml tetthetsgradientmedier og 19,8 ml DMEM/F12-medier. Filtrer denne kjerneløsningen ved hjelp av et 0,22 μm sprøytefilter.
- Forbered 50 ml mineralolje med 3% overflateaktivt middel: bland 48,5 ml mineralolje og 1,5 ml overflateaktivt middel. Oppbevares i steril tilstand etter filtrering gjennom et 0,22 μm sprøytefilter.
- Forbered 50 ml mineralolje med 0,5% overflateaktivt middel: bland 49,75 ml mineralolje og 0,25 ml overflateaktivt middel. Holdes i steril tilstand.
- Forbered 1 M Dithiotheritol (DTT): løs opp 1,5425 g DTT i 10 ml destillert vann. Holdes i steril tilstand.
- Forbered 1 M trietanolamin (TE): Tilsett 66,4 μL TE i 433,6 μL destillert vann. Holdes i steril tilstand.
- Forbered 1% Pluronic F127 (PF127): oppløs 100 mg PF127 i 10 ml destillert vann. Holdes i steril tilstand.
- Arbeidsløsninger
- Forbered en krysskoblingsemulsjon ved å blande 4,5 ml mineralolje med 3% overflateaktivt middel og 300 μL 1 M DTT (1:15-forhold). Vortex løsningen i 2 min og sonikere i 45-60 min i et ultralydbad ved 20 °C. Legg denne oppløsningen på en 5 ml sprøyte med en 27 G kanyle.
MERK: Emulsjon genereres ved sonikering av olje/vannblanding. - Forbered dekkoljeløsningen ved å laste mineraloljen med 0,5% overflateaktivt middel til en 5 ml sprøyte med en 27 G nål.
- Forbered skall (8% m/ v PEG-4-Mal og 15 mM TEA) løsning ved å tilsette 32 mg PEG-4-Mal i 400 μL 1x DPBS for å danne 8% m / v løsning, og virvel løsningen i 2 min. Tilsett deretter 6 μL 1 M TEA (sluttkonsentrasjon 15 mM TE). Til slutt sentrifugerer du på 13 000 x g i 5 minutter gjennom et spinnfilter og holder det i mørket på rockeren i 30 minutter. Last deretter denne løsningen til en 1 ml sprøyte med en 27 G nål.
MERK: La PEG-4-Mal-beholderen sitte ved romtemperatur i 10 minutter før du åpner lokket, og blås N2-gassen for å skifte ut O2 med N2 før du lukker lokket. Vortex TEA før du legger til løsningen.
- Forbered en krysskoblingsemulsjon ved å blande 4,5 ml mineralolje med 3% overflateaktivt middel og 300 μL 1 M DTT (1:15-forhold). Vortex løsningen i 2 min og sonikere i 45-60 min i et ultralydbad ved 20 °C. Legg denne oppløsningen på en 5 ml sprøyte med en 27 G kanyle.
- Forbered celleopphenget i kjerneløsningen
- Behandle hPSCene med trypsin i 5 til 10 min ved 37 °C. Deretter samler du dem fra plater. Slukk trypsin med mediet etter celleavløsning, og overfør deretter cellene til et 15 ml konisk rør.
- Sentrifuger bulkcellefjæringen (400 x g, 5 min). Aspirer forsiktig supernatanten og resuspender deretter cellepellet ved hjelp av et minimalt volum vekstmedium. Tell cellene ved hjelp av en automatisert celleteller.
MERK: Typiske celle aliquots inneholder 12-20 x 106 celler og er nok til å lage 400 μL av kjerneløsningen. - Ta 12-20 x 106 celler fra bulkcelle suspensjon og sentrifuger cellen / media suspensjon (400 x g, 5 min).
- Forsiktig aspirerer medier fra cellepellet. Tilsett deretter 200 μL medier og 200 μL 2x PEG-oppløsning (sluttkonsentrasjon 30-50 x 106 celle / ml) og bland forsiktig.
MERK: Lave cellekonsentrasjoner (mindre enn 20 x 106 celler/ml) resulterte i mange tomme kapsler. - Tilsett 30 μL 1% PF127 til løsningen.
- Sett inn en mikrorørerstang (2 mm x 7 mm) i en 1 ml sprøyte, og last deretter cellen som inneholder kjerneoppløsningen til sprøyten med en 27 G nål. Hold løsningen kald med is under hele innkapslingsprosessen.
3. Eksperimentelt oppsett
- Plasser limt PDMS-dråpeenhet, fire stykker 20 cm lange og ett stykke 5 cm lange mikrorør (0,38 mm I.D. x 1,1 mm O.D.), ett stykke 10 cm utløpsrør (0,5 mm I.D. x 1,5 mm O.D.), og seks stykker 0,5 cm monteringsrør (1 mm I.D. x 1,8 mm O.D.) under en bakteriedrepende lyskilde (vanligvis innebygd i biologiske sikkerhetsskap) og steriliseres for 30 min.
- Bruk tang til å montere slangen i de fluidiske innløpsportene og dissosiasjonsportene.
- Bruk de tre delene av 20 cm lange innløpsmikrorør til skallet, oljen, krysskoblingsemulsjonsinntakene og ett stykke for innløpet til dissosiasjonsenheten. Sett deretter motsatt ende av rørene til sprøytens nål med den tilsvarende løsningen. I mellomtiden kobler du kjerneinntaket til den mikrofluidiske enheten og utløpet av dissosiasjonsenheten med ett 5 cm mikrorør (figur 1C).
MERK: Innløpsmikrorørene skal være tett festet i monteringsrørene, som ble satt inn i det siste trinnet. - Sett det ene utløpsrøret inn i den fluidiske utløpsporten og plasser den motsatte enden i et oppsamlingsreservoar.
- Plasser enheten på et mikroskopstadium og fest slangen for å unngå å bevege deg. Juster og fokuser mikroskopet på enhetsdysen for strømningsinspeksjon.
- Plasser hver sprøyte på forskjellige sprøytepumper og fest den ordentlig (figur 1B). Programmer hver pumpe i henhold til produsentens protokoller til følgende strømningshastigheter: kjerne (3-5 μL/min), skall (3-5 μL/min), dekkolje (20-80 μL/min) og krysskoblingsolje (40-60 μL/min). Start strømmen i alle pumper.
- Vent til hver væske kommer inn i enheten og fyll opp kanalene mens du skyver ut gjenværende luft.
MERK: Hvis det er mye luft i innløpsslangen, må du midlertidig øke hver strømningshastighet til luften er helt fjernet. Vær oppmerksom på at overdreven strømningshastighet kan føre til feil i PDMS-til-PDMS-bindingen. - Når kapselformasjonen er stabilisert (figur 3), plasser den motsatte enden av oppsamlingsrøret til et nytt konisk rør med 5 ml mTeSR-medier.
MERK: Mediet inneholder 10 μM ROCK-hemmer, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. - Etter at et tilstrekkelig antall kapsler er samlet inn, inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2 i 10 minutter. Kapsler som befinner seg i oljefasen vil være på toppen av røret (se figur 4A). Forsiktig tapping på røret får kapsler til å sedimentere til bunnen. Etter dette kan det meste av oljen og mediene aspireres.
- Samle kapslene fra bunnen av det koniske røret, legg dem på en cellesil (100 μm porestørrelse), og vask med store mengder medier. Samle deretter mikrokapsler ved hjelp av 2 ml medier i en 6-brønns kulturplate ved å kjøre mediet gjennom filteret, da det er invertert på toppen av brønnplaten (se figur 4A).
4. hPSC kultur og analyse i mikrokapsler
- Grunnleggende kultur
- Inkuber stamcellekapsler i en 6-brønns tallerkenkulturrett ved 37 °C med 5 % CO2.
- Bytt media annenhver dag ved å samle kapslene på et cellesilfilter, vaske dem med overflødige medier og gjenbruke dem til en ny brønn i 6-brønnsplater med 2 ml medier som ble gjort i trinn 3.10.
- Kultur kapslene i minst 10 dager.
- Utfør den levende/døde analysen for å bestemme levedyktigheten til innkapslede stamceller.
- Tine levende/døde analyseløsninger (ethidium homodimer-1 og calcein AM).
- Tilsett 4 μL av 2 μM ethidium homodimer-1 og 1 μL av 4 μM calcein AM-løsningene til 2 ml steril DPBS. Virvel for å sikre fullstendig blanding.
- Samle ca. 100 mikrokapsler på en cellesil og skyll dem med steril DPBS for å tillate diffusjon av medium ut fra kapslene.
- Samle dem igjen til en 12 brønnkulturplate ved å bruke 1 ml av løsningen som er utarbeidet i trinn 4.2.2. Inkuber ved 37 °C i 20 minutter.
- Visualiser cellene under et fluorescensmikroskop.
MERK: Celle levedyktighet kvantifiseres ved å beregne prosentandelen av levende celler, som visualiseres som grønn, blant det totale antall celler.
- Sfæroid størrelse karakterisering.
- Plasser eventuelt brønnplaten med mikrokapsler under mikroskopet og mål diameteren på sfæroidene som vises på den relaterte programvaren med riktige skalastenger.
- Mål og analyser sfæroidstørrelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å følge ovennevnte protokoll vil leseren kunne fremstille mikrofluidiske enheter og produsere cellebærende mikrokapsler. Figur 3A viser eksempler på optimale og suboptimale mikrokapsler fremstilt ved hjelp av mikrofluid dråpegenerering. Ulike formuleringer av PEG-4-Mal resulterte i kapsler med varierende morfologier - rynkete kapsler var forbundet med dårlig gelering, lav mekanisk integritet, og motsto ikke dyrking i en rørt bioreaktor. Glatte kapsler observert ved PEG-innhold av >6% representerte ønsket kapselmorfologi og var robuste nok til celledyrking. Kjerneskallstrukturen ble bekreftet ved inkorporering av mikrober i kjernen og fluorescerende moieties i skallet av mikrokapsler. Aggregering av perler i midten av kapslene sett i figur 3B ble brukt som indikasjon på at kjernen var vandig, og perlene var frie til å bevege seg rundt. Fluorescerende annulus observert i figur 3C indikerte tilstedeværelsen av et hydrogelskall og ble brukt til å bestemme skalltykkelsen. Vi anbefaler at brukere bruker mikrobeadinkorporering og fluorescerende merking i de tidlige stadiene av å etablere innkapslingsprosessen.
Når innkapslingsprosessen er etablert, kan man gå over til innkapsling av hPSCer. Mens denne protokollen beskriver innkapsling av H9-celler, har vi brukt en lignende strategi for å innkapsle en annen hESC-linje (HUES-8) og en iPSC-linje (1016). 7
Selv om innkapsling bare kan utføres ved hjelp av innkapslingsenheten, bemerket vi at hPSCer hadde en tendens til å klumpe seg i systemet, noe som resulterte i ikke-ensartet innkapsling eller kapselbelegg. For å løse denne utfordringen designet vi en dissosiasjons- eller filtreringsenhet og plasserte den oppstrøms for innkapslingsenheten. Denne dissosiasjonsenheten besto av en strømningskanal med en rekke trekantformede stolper målt 200 μm per side og med tonehøyde fra 400 μm ved innløpet til 30 μm ved utløpet, slik at klumper enten beholdes eller brytes opp før de går inn i innkapslingsenheten (se figur 1D)7. Bruken av dissosiasjonsenheten gjør det mulig å forbedre ensartetheten av sfæroider betydelig og øke cellebelegget til kapsler fra 57% til >90%7.
Figur 4B,C beskriver representative resultater fra en innkapslingskjøring. Som det fremgår av disse bildene, har H9-celler høy levedyktighet med >95% levedyktighet oppnådd rutinemessig under innkapslingskjøringene. Vi sammenlignet vekstraten (se figur 4B,C) og differensieringspotensialet til innkapslet vs. uinnkapslede sfæroider7, og fastslo at innkapslingsprosessen ikke har noen bivirkninger på hPSCer. På den annen side er det flere fordeler med å innkapsle hPSCer. Innkapslede sfæroider er enkle å håndtere og kan dispenseres/distribueres til mikrotiterplater for å utvikle differensieringsprotokoller eller testbehandlinger. Laboratoriet vårt er interessert i å bruke mikrokapsler som stamcellebærere for suspensjonsdyrking i rørte bioreaktorer og har vist at hydrogelskall gir beskyttelse mot skjærskader i slike kulturer7. Dette er en ekstra vei som forfølges av oss er å skape bioaktive mikrokapsler der hydrogelskall kan lastes med vekstfaktorer for lokal og kontinuerlig levering av induktive signaler under differensiering.
Figur 1: Fabrikasjon av mikrokapsler av kjerneskall. (A) Den mikrofluidiske enheten for kapselgenerering består av fire innløpskanaler (kjerne-, skall-, olje- og krysskoblingsolje) og en serpentinkanal som fører til et oppsamlingsrør. Enheten er fremstilt slik at kjerne-, skall- og oljekanaler er henholdsvis 120 μm (H1), 200 μm (H2) og 300 μm (H3) i høyden. Innsettet representerer en tverrsnittsvisning på dysen - krysset mellom vandige og oljestrømmer. Denne tverrsnittsvisningen vippes med 90° for å gi leseren en bedre visning av koaksiale strømningskanaler. En 3D-representasjon av kjerneskallmikrokapselfabrikasjonsprosessen viser hvordan koaksialstrømmen genereres oppstrøms for strømningsfokuseringskrysset for å produsere mikrokapselstruktur av kjerneskall. Emulgering oppnås ved å eksponere vandige dråper til to oljestrømmer, hvorav den første er designet for å stabilisere dråpene, og den andre for å gi crosslinker DTT, som reagerer med PEG-4-Mal. Dette tallet er endret fra referanse12. Opphavsrett 2019, American Chemical Society. (B) Eksperimentelt oppsett av innkapslingssystemet som viser plassering av sprøytepumper, rør, mikrofluidiske enheter og kapseloppsamlingsrør. (C) Et bilde av innkapslingssystemet, som består av dissosiasjons- og innkapslingsenheter i en sekvens. (D) Utformingen av den mikrofluidiske dissosiasjonsenheten som brukes til å unngå at store celleaggregater kommer inn i mikroinnkapslingsenheten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fabrikasjon av mikrofluidiske enheter som brukes til innkapsling. (A) Fabrikasjon av innkapslingsanordningen. Tre lag med SU-8 fotoresist var spin-coated, og foto mønstret for å generere kjerne-, skall- og oljekanaler med forskjellige høyder. Kjernekanaler har en bredde på 220 μm som smalner ved kapselkrysset til 135 μm. Kanaler for alle faser følger samme prinsipp: skall- og oljekanaler starter med en bredde på 500 μm, innsnevring i krysset til 220 μm, og dekkolje starter på 500 μm innsnevring til 270 μm. Utløpsservant har en bredde på 1,5 mm og en lengde på ~ 55 mm. Topp- og bunn-PDMS-deler ble deretter justert, og plasmabundet. (B) Fabrikasjon av dissosiasjonsanordningen. Ett lag su-8 fotoresist var spin-belagt, og foto mønstret for å generere dissosiasjonskanaler. PDMS-stykket ble deretter plasmabundet med glasssklie. Dissosiasjonsanordningen består av et lite kammer med en høyde på 30 μm, lengde på 16,5 mm og bredde på 5 mm ved innløpet og 1,7 mm ved utløpet. Den har trekantformede strukturer (200 μm, likesidet) som er skilt fra hverandre med 420 μm av innløpet og kommer nærmere på vei til utløpet, med en separasjon på 50 μm i siste rad. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av mikrokapsler. (A) Forskjeller i kapselmorfologi som funksjon av PEG-4-Mal innhold i skallet. Glatte kapsler med lyse kanter er forbundet med ønsket mekanisk integritet. (B) Bekreftelse av vandig kjerne av mikrokapsler. Fanget mikrober står fritt til å bevege seg i vandig kjerne og aggregeres i midten av mikrokapsler. (C) Bekreftelse av kjerneskallstruktur ved å inkorporere Rhodamine B-merket PEG i skallet av mikrokapsler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Innkapsling av hPSCer ( A) Mikrokapsler i oljefasen samles inn i et konisk rør fylt med medier. Etter at mikrokapsler er laget for å bosette seg til bunnen av røret, blir olje og media aspirert, mikrokapsler vaskes og overføres deretter til en 6-brønns plate for dyrking. (B) Levende/døde flekker 6 timer etter innkapsling av H9-celler. Øvre bilde ble tatt ved 10x, og lavere bilde ved 20x. (C) Bilder som sammenligner sfæroidstørrelser som endres over tid for H9-celler i kapsler og i kommersielle 3D-kulturplater (bunnbilder). (D) Kvantifisering av sfæroid diameter som øker for hPSCer i mikrokapsler og i standard 3D-kulturplater i løpet av 7 dager i H9-medier. Statistisk analyse -t-test, p < 0,05, n = 20. Skalalinje: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Innkapslingsprosessen som er beskrevet her, resulterer i reproduserbar dannelse av hPSC-sfæroider. Mikrokapselformatet gjør det enkelt å dispensere sfæroider i brønner på en mikrotiterplate for eksperimenter som tar sikte på å forbedre / optimalisere differensieringsprotokoller eller testterapier. Innkapslede stamcellesfæroider kan også brukes i suspensjonskulturer der hydrogelskall beskytter celler mot skjærindusert skade7.
Det er flere kritiske trinn i protokollen. Det er viktig å holde strømningshastigheten til kjerne-, skall- og oljestrømmer innenfor området som er beskrevet i Protokoll-delen. Hvis skallstrømningshastigheten er for lav, blir strømmen ustabil, noe som resulterer i forvrengte og mekanisk ustabile kapsler. En vellykket celleinnkapsling skal se ut som mikrokapsler vist i figur 4C. Mikrokapsler skal ha lignende diameter og ha et sammenlignbart antall celler fanget i kjernen. Aggregering av enkeltceller i sfæroider oppstår vanligvis innen 48 timer, og mangel på sfæroiddannelse ved 72 timer er et advarselstegn. En grunn til mangel på sfæroiddannelse kan være at viskøse molekyler i kjernen ikke lekker ut raskt nok gjennom hydrogelskallet. Vi opplevde dette scenariet ved justering av viskositeten til kjerneløsningen ved hjelp av polymerer med høy molekylvekt som karboksymetylcellulose (MW 250 kD). Man kan innkapsle mikrober (se figur 3B) for å teste om disse cellestore objektene står fritt til å bevege seg rundt kjernen og hvor raskt komponenter i kjerneutvaskingen ut. Mangel på sfæroiddannelse ble også påtruffet av oss ved bruk av PEG-4-Mal konsentrasjoner på >8% m / v. I dette scenariet reduseres porøsiteten og diffusiteten til hydrogelskallet, og elementer med høy viskositet i kjernen lekker ikke ut raskt nok til at celler kan danne seg i aggregater. Det kan tenkes at kvaliteten på PEG-4-Mal kan variere fra batch til batch eller produsent. Derfor kan det være nødvendig med en viss justering av polymerkonsentrasjonen i skallet. Nok en gang bør bead inkorporeringsmetode avsløre hvor raskt viskøse komponenter i kjernen er forskjøvet av vannmolekyler. Vår erfaring er at dette bør skje innen 3 timer etter overføring av mikrokapsler til vandig miljø.
Innkapslingsprotokollen som er beskrevet her, har fungert bra for flere hPSC-linje7, primære hepatocytter10 og flere kreftcellelinjer (upubliserte resultater). Vi fikk imidlertid problemer med å danne sfæroider etter innkapsling av stamcelleavledede (sc)-hepatocytter og sc-β-celler. Feilsøking med innkapslede mikrober viste at viskøse komponenter raskt ble unngått fra kjernen, og at cellene var frie til å flytte og danne cellecellekontakter. Ytterligere feilsøking innebar titreringskonsentrasjon av di-tiol crosslinker DTT (til stede i oljefasen) ned fra 66 mM til 10 mM. Sfæroiddannelse for sc-hepatocytter og β-celler oppstod ved denne lavere konsentrasjonen av DTT. Det kan derfor være lurt å vurdere å optimalisere krysskoblingskonsentrasjonen, men bare hvis andre feilsøkingstrinn som er oppført ovenfor, ikke har vært vellykkede. Vi finner at DTT-konsentrasjon er avgjørende for å opprettholde mekanisk integritet av mikrokapsler med 66 mM DTT, noe som resulterer i mekanisk robuste mikrokapsler og er giftfri for de aller fleste celletyper som brukes til dags dato.
En rekke strategier for å lage 3D stamcellekonstruksjoner er beskrevet i litteraturen. Fordelene med å danne stamcellekonstruksjoner i mikrokapsler med kjerneskall er flere. Når de er innkapslet, kan sfæroider håndteres enkelt med hydrogelkapsler som gir beskyttelse mot skjærskader. Innkapslede sfæroider kan dyrkes i suspensjon med kraftig agitasjon uten å skade stamceller.
Det er flere veier for å utvide mulighetene til mikrokapsler. Vårt team har tidligere beskrevet bruken av heparinholdige hydrogeler for innkapsling av hepatocytter og stamceller 8,12, og utvikler for tiden heparinholdige bioaktive kjerneskallmikrokapsler som fungerer som depoter for lagring og lokal frigjøring av induktive signaler (GFs) til stamceller. Slike mikrokapsler kan bidra til å redusere bruken av dyre GFs samtidig som differensieringsresultatene forbedres. Mikrokapsler kan forbedres ytterligere ved å inkorporere ECM-proteiner i kjernen og dermed modulere stamcellemikromiljøet. Mikrokapsler i kjerneskall kan gjøres nedbrytbare for å gjøre det enklere å hente hPSC-sfæroider13,14. Totalt sett representerer mikrokapsler av kjerneskall en plattformteknologi som kan endres og forbedres for å møte behovene til en bestemt stamcelledifferensieringsprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble delvis støttet av tilskuddene fra Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) og NIH (DK107255).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
