Summary
Este artículo describe la encapsulación de células madre pluripotentes humanas (hPSC) utilizando un dispositivo de enfoque de flujo coaxial. Demostramos que esta tecnología de encapsulación microfluídica permite la formación eficiente de esferoides hPSC.
Abstract
Los cultivos tridimensionales (3D) o esferoides de células madre pluripotentes humanas (hPSC) ofrecen los beneficios de mejorar los resultados de diferenciación y escalabilidad. En este artículo, describimos una estrategia para la formación robusta y reproducible de esferoides hPSC donde se utiliza un dispositivo de enfoque de flujo coaxial para atrapar hPSC dentro de microcápsulas de núcleo-caparazón. La solución central contenía suspensión unicelular de hPSCs y se hizo viscosa mediante la incorporación de poli(etilenglicol) de alto peso molecular (PEG) y medios de gradiente de densidad. La corriente de concha comprendía PEG-4 brazo-maleimida o PEG-4-Mal y fluía a lo largo de la corriente central hacia dos uniones de petróleo consecutivas. La formación de gotas ocurrió en la primera unión de aceite con una solución de cáscara que se envuelve alrededor del núcleo. La reticulación química de la cáscara se produjo en la segunda unión de aceite mediante la introducción de un reticulador de di-tiol (1,4-ditiotreitol o TDT) a estas gotas. El reticulante reacciona con los grupos funcionales maleimida a través de la química del clic, lo que resulta en la formación de una capa de hidrogel alrededor de las microcápsulas. Nuestra tecnología de encapsulación produjo cápsulas de 400 μm de diámetro a una velocidad de 10 cápsulas por segundo. Las cápsulas resultantes tenían una cubierta de hidrogel y un núcleo acuoso que permitía a las células individuales ensamblarse rápidamente en agregados y formar esferoides. El proceso de encapsulación no afectó negativamente la viabilidad de las hPSC, observándose una viabilidad del >95% 3 días después de la encapsulación. A modo de comparación, las hPSC encapsuladas en micropartículas de gel sólido (sin un núcleo acuoso) no formaron esferoides y tuvieron una viabilidad del <50% 3 días después de la encapsulación. La formación de esferoides de hPSC dentro de las microcápsulas de la cáscara del núcleo ocurrió dentro de las 48 h posteriores a la encapsulación, siendo el diámetro del esferoide una función de la densidad de inoculación celular. En general, la tecnología de encapsulación microfluídica descrita en este protocolo era adecuada para la encapsulación de hPSC y la formación de esferoides.
Introduction
Existe un interés considerable en los cultivos 3D de células madre pluripotentes humanas (hPSC) debido a la mejora de la pluripotencia y el potencial de diferenciación que ofrece este formato de cultivo 1,2,3. Las hPSC se forman típicamente en esferoides u otros formatos de cultivo 3D por medio de biorreactores, micropocillos, hidrogeles y andamios poliméricos 4,5,6. La encapsulación ofrece otro medio para organizar hPSC individuales en esferoides. Una vez encapsulados, los esferoides hPSC se pueden manejar con facilidad y transferirse a placas de microtitulación para diferenciación, modelado de enfermedades o experimentos de prueba de drogas. El recubrimiento de hPSCs en una capa de hidrogel también protege las células contra el daño por cizallamiento y permite cultivar esferoides en un biorreactor a altas tasas de agitación7.
Nuestra metodología para la encapsulación de células madre evolucionó con el tiempo. En primer lugar, nos centramos en micropartículas sólidas de hidrogel y demostramos la encapsulación y el cultivo exitosos de células madre embrionarias de ratón (mESCs)8. Sin embargo, se observó que las células madre embrionarias humanas (hESC) tenían baja viabilidad cuando se encapsulaban en tales micropartículas de hidrogel, presumiblemente debido a la mayor necesidad de que estas células restablecieran los contactos célula-célula después de la encapsulación. Razonamos que la microcápsula heterogénea, que posee un núcleo acuoso, puede ser más adecuada para la encapsulación de células que dependen del rápido restablecimiento de los contactos célula-célula. El concepto de dispositivo microfluídico de enfoque de flujo coaxial para hacer microcápsulas de núcleo acuoso / cubierta de hidrogel se adaptó de He et al.9, pero en lugar de alginato empleado en el enfoque original, se incorporó un hidrogel basado en PEG en la cáscara. Primero demostramos la encapsulación exitosa y la formación de esferoides de hepatocitos primarios en microcápsulas núcleo-cáscara10 y, más recientemente, describimos la encapsulación de células hES e iPS7. Como se describe en la Figura 1A, las cápsulas se fabrican en un dispositivo de enfoque de flujo donde las corrientes de flujo de la cáscara y el núcleo pasan de lado a lado al flujo coaxial antes de la eyección a la fase de aceite. El flujo central contiene células y aditivos que aumentan la viscosidad de la solución (PEG MW 35kD no reactivo e iodixanol - nombre comercial OptiPrep) mientras que el flujo de la cáscara contiene moléculas reactivas (PEG-4-Mal). El flujo de flujo coaxial continuo se discretiza en gotas que conservan la arquitectura core-shell. La estructura núcleo-cáscara se hace permanente por la exposición al reticulador de di-tiol (TDT), que reacciona con PEG-4-Mal a través de la química del clic y da como resultado la formación de una piel o cáscara de hidrogel delgada (~ 10 μm). Después de que la emulsión se rompe y las cápsulas se transfieren a una fase acuosa, las moléculas de PEG se difunden desde el núcleo y son reemplazadas por moléculas de agua. Esto da como resultado microcápsulas de núcleo acuoso y cáscara de hidrogel.
A continuación se proporcionan instrucciones paso a paso sobre cómo hacer dispositivos microfluídicos, cómo preparar células y cómo llevar a cabo la encapsulación de hPSC.
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Protocol
1. Fabricación del dispositivo
- Realice los diseños para el dispositivo de microencapsulación y el dispositivo de disociación utilizando el software CAD10,11.
- Spin-coat las tres capas de fotorresisten SU-8 secuencialmente sobre una oblea de silicio (Figura 2A) para lograr estructuras con las alturas deseadas: 60, 100 y 150 μm.
NOTA: El proceso para los moldes superior e inferior es idéntico.- Recubre una oblea de silicio limpia de 10 cm con fotorresistencia negativa SU-8 2025 a 1.100 rpm para crear la primera capa de 60 μm. Después de hornear suavemente a 65 °C durante 3 min y 95 °C durante 10 min en una placa caliente, exponga el molde usando un alineador sin máscara cargando el archivo de diseño del patrón de canal central en el PC μPG 101. Luego, proceda con el horneado posterior a la exposición a 65 ° C durante 3 min y a 95 ° C durante 10 min.
- Cubra la segunda capa SU-8 2025 (40 μm) a 1.500 rpm y expóngala cargando el archivo CAD apropiado para el patrón de canal de shell.
NOTA: Los horneados suaves y posteriores a la exposición fueron similares al paso anterior. - Recubrimiento de centrifugado de la tercera capa SU-8 2025 a 1.400 rpm para alcanzar una altura de 50 μm y repetir el proceso anterior pero exponer las estructuras para la fase de aceite.
- Desarrolle el molde con las tres capas en un solo paso por inmersión en el revelador SU-8 hasta que se elimine toda la fotorresistente no expuesta.
- Hornea duro el molde en una placa caliente a 160 °C durante 10 min para mejorar la adherencia y sellar las grietas menores que podrían aparecer después del desarrollo.
- Exponga el molde al clorotrimetilsilano para evitar la unión del elastómero en el siguiente paso y colóquelo en placas de Petri de 15 cm hasta su uso.
- Prepare el molde del dispositivo de disociación de la misma manera, como se describe en la Figura 1D y la Figura 2B. Haga girar una capa de fotorresistencia SU-8 sobre una oblea de silicio, como se describió anteriormente en el paso 1.2.3, para lograr estructuras con la altura deseada: 50 μm. Realice el horneado suave y posterior a la exposición, el desarrollo y el horneado duro de manera similar al paso anterior.
NOTA: Una serie de postes de forma triangular cubría toda la cámara, con un espaciado entre los postes que disminuía a medida que el ancho de la cámara disminuía hacia la salida. Los postes triangulares eran de 200 μm por lado con un paso que oscilaba entre 400 μm (en la entrada) y 30 μm (en la salida). - Preparar los moldes mediante litografía blanda utilizando polidimetilsiloxano (PDMS).
- Mezcle la base de elastómero PDMS y el agente de curado de elastómero en una proporción de 10:1 w/w en una centrífuga planetaria. Vierta la mezcla tanto en moldes maestros de microencapsulación como en moldes maestros de disociación para crear una capa de 3-4 mm.
NOTA: Una mezcla de 50 g de base de elastómero con 5 g de agente de curado es suficiente para cubrir un molde maestro con 3 mm de espesor. - Coloque las placas de Petri que contienen los moldes en un desecador al vacío durante 15 minutos para desgasificar el PDMS sin curar.
- Mueva las placas de Petri a un horno y hornee a 80 °C durante un mínimo de 60 min.
- Retire los moldes maestros del horno y deje que se enfríen. Con un cuchillo de precisión, corte cuidadosamente el PDMS siguiendo la forma de la oblea y despegue las piezas pdmS del molde maestro.
- Recorte las losas PDMS recortando los bordes de cada dispositivo con un bisturí, luego perfore los puertos fluídicos de entrada / salida en el dispositivo de disociación y solo en el dispositivo microfluídico superior con agujas de acero inoxidable. Cubra los dispositivos con cinta adhesiva mágica para evitar la contaminación.
NOTA: El medidor de aguja es de 14 G y 15 G para los puertos de entrada y salida, respectivamente. - Para la unión, trate los lados estampados de las piezas PDMS superior e inferior con plasma O2 en un grabador de plasma durante 2 minutos.
- Alinee ambas partes de PDMS bajo un estereoscopio después de agregar una capa de separación delgada de agua destilada directamente en los microcanales (2 μL).
- Coloque el dispositivo PDMS alineado en el horno a 80 °C durante la noche para completar la unión y restaurar el PDMS a su estado hidrófobo original. Guarde los dispositivos hasta su uso posterior.
NOTA: Esto da como resultado un dispositivo de enfoque de flujo coaxial con tres alturas diferentes de 120 μm para el núcleo, 200 μm para la carcasa y 300 μm para los canales de aceite. - Para usar el dispositivo justo después de la unión de plasma, inyecte cuidadosa pero firmemente 30 μL de solución de recubrimiento hidrófobo en los canales fluídicos para lograr un recubrimiento hidrófobo. Luego, purgue inmediatamente el aire en los canales hasta que no se observen residuos de la solución de recubrimiento hidrófobo en el dispositivo.
- Unir el dispositivo de disociación tratando primero el lado estampado del dispositivo y un vaso de diapositiva limpiado con plasma O2 durante 2 minutos, y luego ensamblándolos para su posterior curado en el horno a 80 ° C durante la noche.
NOTA: Los dispositivos se pueden almacenar hasta su uso posterior.
- Mezcle la base de elastómero PDMS y el agente de curado de elastómero en una proporción de 10:1 w/w en una centrífuga planetaria. Vierta la mezcla tanto en moldes maestros de microencapsulación como en moldes maestros de disociación para crear una capa de 3-4 mm.
2. Preparación de soluciones
- Soluciones de stock. Primero, prepare soluciones madre (soluciones concentradas) que se diluirán a concentraciones más bajas para su uso real.
NOTA: Las soluciones de stock se utilizan para ahorrar tiempo de preparación, conservar materiales, reducir el espacio de almacenamiento y mejorar la precisión al preparar una solución de trabajo en concentraciones más bajas.- Preparar 30 mL de solución de núcleo 2x (16% PEG y 34% de medios de gradiente de densidad): mezclar 4,8 g de 35 kDa DE PEG, 10,2 mL de medios de gradiente de densidad y 19,8 mL de medios DMEM/F12. Filtre esta solución central con un filtro de jeringa de 0,22 μm.
- Preparar 50 mL de aceite mineral con 3% de surfactante: mezclar 48,5 mL de aceite mineral y 1,5 mL de surfactante. Mantener en estado estéril después de la filtración a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm.
- Preparar 50 mL de aceite mineral con 0.5% de surfactante: mezclar 49.75 mL de aceite mineral y 0.25 mL de surfactante. Mantener en condición estéril.
- Preparar 1 M de Ditiotheritol (TDT): disolver 1,5425 g de TDT en 10 mL de agua destilada. Mantener en condición estéril.
- Preparar 1 M de trietanolamina (TEA): añadir 66,4 μL de TEA en 433,6 μL de agua destilada. Mantener en condición estéril.
- Preparar 1% Pluronic F127 (PF127): disolver 100 mg de PF127 en 10 mL de agua destilada. Mantener en condición estéril.
- Soluciones de trabajo
- Preparar una emulsión reticulante mezclando 4,5 mL de aceite mineral con 3% de surfactante y 300 μL de 1 M de TDT (proporción 1:15). Vórtice la solución durante 2 min y sonicate durante 45-60 min en un baño ultrasónico a 20 °C. Cargue esta solución en una jeringa de 5 ml con una aguja de 27 G.
NOTA: La emulsión se genera al sonicar la mezcla de aceite / agua. - Prepare la solución de aceite de protección cargando el aceite mineral con surfactante al 0,5% en una jeringa de 5 ml con una aguja de 27 G.
- Preparar la solución de cáscara (8% p/v PEG-4-Mal y 15 mM TEA) añadiendo 32 mg de PEG-4-Mal en 400 μL de 1x DPBS para formar 8% p/v solución, y vórtice la solución durante 2 min. A continuación, añadir 6 μL de 1 M TEA (concentración final 15 mM TEA). Finalmente, centrifuga a 13.000 x g durante 5 min a través de un filtro de centrifugado y manténgalo en la oscuridad en el balancín durante 30 min. Luego, cargue esta solución en una jeringa de 1 ml con una aguja de 27 G.
NOTA: Deje que el recipiente PEG-4-Mal permanezca a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de abrir la tapa, y sople el gas N2 para reemplazar el O2 con N2 antes de cerrar la tapa. Vortex TEA antes de añadir a la solución.
- Preparar una emulsión reticulante mezclando 4,5 mL de aceite mineral con 3% de surfactante y 300 μL de 1 M de TDT (proporción 1:15). Vórtice la solución durante 2 min y sonicate durante 45-60 min en un baño ultrasónico a 20 °C. Cargue esta solución en una jeringa de 5 ml con una aguja de 27 G.
- Preparar la suspensión celular en la solución central
- Trate las hPSC con tripsina durante 5 a 10 min a 37 °C. Luego, recógelos de los platos. Apague la tripsina con el medio después del desprendimiento celular y luego transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar la suspensión de células a granel (400 x g, 5 min). Aspire cuidadosamente el sobrenadante y luego resuspenda el pellet celular utilizando un volumen mínimo de medio de crecimiento. Cuente las celdas mediante un contador de celdas automatizado.
NOTA: Las alícuotas celulares típicas contienen 12-20 x 106 células y son suficientes para producir 400 μL de la solución central. - Tome 12-20 x 106 células de la suspensión de células a granel y centrifugue la suspensión de células / medios (400 x g, 5 min).
- Aspire cuidadosamente los medios de la bolita celular. Luego, agregue 200 μL de medio y 200 μL de 2x solución de PEG (concentración final 30-50 x 106 celdas / ml) y mezcle suavemente.
NOTA: Las bajas concentraciones celulares (menos de 20 x 106 células/ml) dieron lugar a muchas cápsulas vacías. - Añadir 30 μL de PF127 al 1% a la solución.
- Inserte una barra de micro agitador (2 mm x 7 mm) en una jeringa de 1 ml y luego cargue la celda que contiene la solución central a la jeringa con una aguja de 27 G. Mantenga la solución fría con hielo durante todo el proceso de encapsulación.
3. Configuración experimental
- Coloque el dispositivo de gotas PDMS adherido, cuatro piezas de 20 cm de largo y una pieza de microtubos de entrada de 5 cm de largo (0,38 mm I.D. x 1,1 mm O.D.), una pieza de tubo de salida de 10 cm (0,5 mm I.D. x 1,5 mm O.D.) y seis piezas de tubos de conexión de 0,5 cm (1 mm I.D. x 1,8 mm O.D.) debajo de una fuente de luz germicida (normalmente integrada en gabinetes de seguridad biológica) y esterilice durante 30 min.
- Use fórceps para colocar el tubo en los puertos de entrada fluídicos y los puertos de disociación.
- Utilice las tres piezas de microtubos de entrada de 20 cm de largo para la carcasa, el aceite, las entradas de emulsión de reticulación y una pieza para la entrada del dispositivo de disociación. Luego, inserte el extremo opuesto de los tubos a la aguja de la jeringa con la solución correspondiente. Mientras tanto, conecte la entrada central del dispositivo microfluídico y la salida del dispositivo de disociación con un microtubo de 5 cm (Figura 1C).
NOTA: Los microtubos de entrada deben estar bien asegurados dentro de los tubos de conexión, que se insertaron en el último paso. - Inserte un tubo de salida en el puerto de salida fluídico y coloque el extremo opuesto en un depósito de recolección.
- Coloque el dispositivo en un escenario de microscopio y conecte el tubo para evitar que se mueva. Alinee y enfoque el microscopio en la boquilla del dispositivo para la inspección de flujo.
- Coloque cada jeringa en diferentes bombas de jeringa y asegúrela correctamente (Figura 1B). Programe cada bomba de acuerdo con los protocolos del fabricante a los siguientes caudales: núcleo (3-5 μL/min), carcasa (3-5 μL/min), aceite de blindaje (20-80 μL/min) y aceite de reticulación (40-60 μL/min). Inicie el flujo en todas las bombas.
- Espere a que cada fluido ingrese al dispositivo y llene los canales mientras expulsa el aire restante.
NOTA: Si hay una gran cantidad de aire en el tubo de entrada, aumente temporalmente cada caudal hasta que el aire se elimine por completo. Tenga en cuenta que el caudal excesivo podría provocar la falla del enlace de PDMS a PDMS. - Cuando la formación de la cápsula se estabilice (Figura 3), coloque el extremo opuesto del tubo de recolección en un nuevo tubo cónico con 5 ml de medios mTeSR.
NOTA: El medio contiene 10 μM de inhibidor de ROCK, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. - Después de recolectar un número suficiente de cápsulas, incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 10 min. Las cápsulas que residen en la fase de aceite estarán en la parte superior del tubo (ver Figura 4A). Golpear suavemente el tubo hace que las cápsulas se sedimenten en el fondo. Después de esto, la mayor parte del aceite y los medios pueden ser aspirados.
- Recoja las cápsulas de la parte inferior del tubo cónico, colóquelas en un colador celular (tamaño de poro de 100 μm) y lávelas con grandes cantidades de medios. Luego, recolecte microcápsulas usando medios de 2 ml en una placa de cultivo de 6 pocillos pasando el medio a través del filtro a medida que se invierte en la parte superior de la placa del pozo (consulte la Figura 4A).
4. Cultivo y análisis de hPSC en microcápsulas
- Cultura básica
- Incubar las cápsulas de células madre en una placa de cultivo de 6 pocillos a 37 °C con un 5% de CO2.
- Cambie los medios cada dos días recolectando las cápsulas en un filtro colador celular, lavándolas con exceso de medios y resuspiéndolas a un nuevo pozo en placas de 6 pocillos con medios de 2 ml como se hizo en el paso 3.10.
- Cultive las cápsulas durante al menos 10 días.
- Realizar el ensayo vivo/muerto para determinar la viabilidad de las células madre encapsuladas.
- Descongelar soluciones de ensayo vivas/muertas (homodímero de etidio-1 y calceína AM).
- Añadir 4 μL de las soluciones de 2 μM de etidio homodímero-1 y 1 μL de las soluciones de calceína AM de 4 μM a 2 ml de DPBS estéril. Vórtice para asegurar una mezcla completa.
- Recolecte aproximadamente 100 microcápsulas en un colador celular y enjuáguelas con DPBS estériles para permitir la difusión del medio fuera de las cápsulas.
- Recójalos de nuevo en una placa de cultivo de 12 pocillos utilizando 1 ml de la solución preparada en el paso 4.2.2. Incubar a 37 °C durante 20 min.
- Visualice las células bajo un microscopio de fluorescencia.
NOTA: La viabilidad celular se cuantifica calculando el porcentaje de células vivas, que se visualizan como verdes, entre el número total de células.
- Caracterización del tamaño de los esferoides.
- Cuando lo desee, coloque la placa del pozo con microcápsulas bajo el microscopio y mida el diámetro de los esferoides que se muestran en el software relacionado con barras de escala adecuadas.
- Medir y analizar el tamaño de los esferoides.
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Representative Results
Al seguir el protocolo mencionado anteriormente, el lector podrá fabricar dispositivos microfluídicos y producir microcápsulas portadoras de células. La Figura 3A muestra ejemplos de microcápsulas óptimas y subóptimas fabricadas mediante la generación de gotas microfluídicas. Diferentes formulaciones de PEG-4-Mal dieron como resultado cápsulas de diferentes morfologías: las cápsulas arrugadas se asociaron con una gelificación deficiente, baja integridad mecánica y no resistieron el cultivo en un biorreactor agitado. Las cápsulas lisas observadas con un contenido de PEG de >6% representaban la morfología de la cápsula deseada y eran lo suficientemente robustas para el cultivo celular. La estructura núcleo-cáscara se confirmó mediante la incorporación de microperlas en el núcleo y partes fluorescentes en la capa de microcápsulas. La agregación de cuentas en el centro de las cápsulas como se ve en la Figura 3B se utilizó como indicación de que el núcleo era acuoso y que las cuentas eran libres de moverse. El anillo fluorescente observado en la Figura 3C indicó la presencia de una cáscara de hidrogel y se utilizó para determinar el grosor de la cáscara. Recomendamos que los usuarios empleen la incorporación de microperlas y el etiquetado fluorescente en las primeras etapas del establecimiento del proceso de encapsulación.
Una vez que se establece el proceso de encapsulación, se puede pasar a la encapsulación de hPSC. Si bien este protocolo describe la encapsulación de células H9, hemos utilizado una estrategia similar para encapsular otra línea hESC (HUES-8) y una línea iPSC (1016). 7
Si bien la encapsulación puede llevarse a cabo utilizando solo el dispositivo de encapsulación, observamos que las hPSC tendían a agruparse en el sistema, lo que resultaba en una encapsulación no uniforme o una ocupación de la cápsula. Para abordar este desafío, diseñamos un dispositivo de disociación o filtración y lo colocamos aguas arriba del dispositivo de encapsulación. Este dispositivo de disociación comprendía un canal de flujo con una matriz de postes en forma de triángulo medidos 200 μm por lado y con un paso que oscilaba entre 400 μm en la entrada y 30 μm en la salida, de modo que los grupos se retienen o se rompen antes de entrar en el dispositivo de encapsulación (véase la Figura 1D)7. El uso del dispositivo de disociación permite mejorar significativamente la uniformidad de los esferoides y aumentar la ocupación celular de las cápsulas del 57% al >90%7.
La Figura 4B,C describe los resultados representativos de una ejecución de encapsulación. Como se puede ver en estas imágenes, las células H9 tienen una alta viabilidad con una viabilidad del >95% lograda rutinariamente durante las ejecuciones de encapsulación. Comparamos la tasa de crecimiento (ver Figura 4B,C) y el potencial de diferenciación de los esferoides encapsulados frente a los no encapsulados7, y determinamos que el proceso de encapsulación no tiene efectos adversos sobre las hPSC. Por otro lado, hay varios beneficios de encapsular hPSCs. Los esferoides encapsulados son fáciles de manejar y pueden dispensarse / distribuirse en placas de microtitulación para desarrollar protocolos de diferenciación o probar terapias. Nuestro laboratorio está interesado en el uso de microcápsulas como portadores de células madre para el cultivo en suspensión en biorreactores agitados y ha demostrado que la cáscara de hidrogel ofrece protección contra el daño por cizallamiento en tales cultivos7. Esta es una vía adicional que perseguimos en la creación de microcápsulas bioactivas donde la cáscara de hidrogel puede estar cargada con factores de crecimiento para la entrega local y continua de señales inductivas durante la diferenciación.
Figura 1: Fabricación de microcápsulas núcleo-cáscara. (A) El dispositivo microfluídico para la generación de cápsulas consta de cuatro canales de entrada (núcleo, cáscara, aceite y aceite de reticulador) y un canal de serpentina que conduce a un tubo de recolección. El dispositivo está fabricado de tal manera que los canales de núcleo, carcasa y aceite tienen una altura de120 μm (H 1), 200 μm (H2) y 300 μm (H3), respectivamente. El recuadro representa una vista transversal en la boquilla, la unión entre las corrientes acuosa y de aceite. Esta vista de sección transversal está inclinada 90° para dar al lector una mejor visión de los canales de flujo coaxial. Una representación 3D del proceso de fabricación de microcápsulas núcleo-cáscara representa cómo se genera el flujo coaxial aguas arriba de la unión de enfoque de flujo para producir la estructura de microcápsula núcleo-capa. La emulsificación se logra exponiendo gotas acuosas a dos corrientes de aceite, la primera de las cuales está diseñada para estabilizar las gotas, y la segunda para proporcionar el reticulante reticulante, que reacciona con PEG-4-Mal. Esta cifra ha sido modificada a partir de la referencia12. Derechos de autor 2019, American Chemical Society. (B) Configuración experimental del sistema de encapsulación que muestra la ubicación de las bombas de jeringa, tubos, dispositivos microfluídicos y del tubo de recolección de cápsulas. (C) Una imagen del sistema de encapsulación, que consiste en dispositivos de disociación y encapsulación en una secuencia. (D) Diseño del dispositivo de disociación microfluídica utilizado para evitar que los agregados celulares grandes entren en el dispositivo de microencapsulación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fabricación de dispositivos microfluídicos utilizados para la encapsulación. (A) Fabricación del dispositivo de encapsulación. Tres capas de fotorresistente SU-8 fueron recubiertas de espín y fotoestumbradas para generar canales de núcleo, cáscara y aceite con diferentes alturas. Los canales centrales tienen un ancho de 220 μm que se estrecha en la unión de la cápsula a 135 μm. Los canales para todas las fases siguen el mismo principio: los canales de carcasa y aceite comienzan con un ancho de 500 μm, se estrechan en la unión a 220 μm y el aceite de blindaje comienza a 500 μm estrechándose a 270 μm. La serpentina de salida tiene un ancho de 1,5 mm y una longitud de ~ 55 mm. Las piezas PDMS superiores e inferiores se alinearon y se unieron al plasma. (B) Fabricación del dispositivo de disociación. Una capa de fotorresistente SU-8 fue recubierta de espín y fotoestuada para generar canales de disociación. La pieza PDMS se unió entonces con plasma con un portaobjetos de vidrio. El dispositivo de disociación consiste en una pequeña cámara con una altura de 30 μm, una longitud de 16,5 mm y un ancho de 5 mm en la entrada y 1,7 mm en la salida. Tiene estructuras en forma de triángulo (200 μm, equilátero) que están separadas entre sí por 420 μm de la entrada y se acercan en el camino a la salida, con una separación de 50 μm en la última fila. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Caracterización de microcápsulas. (A) Diferencias en la morfología de la cápsula en función del contenido de PEG-4-Mal en la cáscara. Las cápsulas lisas con bordes brillantes se asocian con la integridad mecánica deseada. (B) Confirmación del núcleo acuoso de las microcápsulas. Las microperlas atrapadas son libres de moverse en el núcleo acuoso y agregarse en el centro de las microcápsulas. (C) Confirmación de la estructura núcleo-cáscara mediante la incorporación de PEG marcado con Rhodamine B en la cáscara de las microcápsulas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Encapsulación de hPSCs. (A) Las microcápsulas en la fase de aceite se recogen en un tubo cónico lleno de medios. Después de que las microcápsulas se hacen para asentarse en el fondo del tubo, se aspira el aceite y los medios, las microcápsulas se lavan y luego se transfieren a una placa de 6 pocillos para el cultivo. (B) Tinción viva/muerta 6 h después de encapsular las células H9. La imagen superior se tomó a 10x, y la imagen inferior a 20x. (C) Imágenes que comparan los tamaños de los esferoides que cambian con el tiempo para las células H9 en cápsulas y en placas de cultivo 3D comerciales (imágenes inferiores). (D) Cuantificación del diámetro de los esferoides que aumenta para hPSCs en microcápsulas y en placas de cultivo 3D estándar durante 7 días en medios H9. Análisis estadístico -t-test, p < 0,05, n = 20. Barra de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El proceso de encapsulación descrito aquí da como resultado la formación reproducible de esferoides hPSC. El formato de microcápsula facilita la dispensación de esferoides en pozos de una placa de microtitulación para experimentos destinados a mejorar / optimizar los protocolos de diferenciación o probar terapias. Los esferoides de células madre encapsuladas también se pueden usar en cultivos en suspensiones donde la cubierta de hidrogel protege las células contra el daño inducido por el cizallamiento7.
Hay varios pasos críticos dentro del protocolo. Es importante mantener los caudales de las corrientes de núcleo, cáscara y petróleo dentro del rango descrito en la sección Protocolo. Si el caudal de la cáscara es demasiado bajo, el flujo se vuelve inestable, lo que resulta en cápsulas distorsionadas y mecánicamente inestables. Una encapsulación celular exitosa debe tener un aspecto similar a las microcápsulas que se muestran en la Figura 4C. Las microcápsulas deben ser de diámetro similar y tener un número comparable de células atrapadas en el núcleo. La agregación de células individuales en esferoides generalmente ocurre dentro de las 48 h y la falta de formación de esferoides a las 72 h es una señal de advertencia. Una razón para la falta de formación de esferoides puede ser que las moléculas viscosas en el núcleo no se filtran lo suficientemente rápido a través de la capa de hidrogel. Nos encontramos con este escenario al ajustar la viscosidad de la solución central utilizando polímeros de alto peso molecular como la carboximetilcelulosa (MW 250 kD). Uno puede encapsular microperlas (ver Figura 3B) para probar si estos objetos del tamaño de una célula son libres de moverse por el núcleo y qué tan rápido se filtran los componentes del núcleo. La falta de formación de esferoides también fue encontrada por nosotros cuando usamos concentraciones de PEG-4-Mal de >8% p/v. En este escenario, la porosidad y la difusividad de la cubierta del hidrogel disminuyen y los elementos de alta viscosidad en el núcleo no se filtran lo suficientemente rápido como para permitir que las células se formen en agregados. Es concebible que la calidad de PEG-4-Mal pueda variar de un lote a otro o fabricante. Por lo tanto, puede ser necesario algún ajuste de la concentración de polímero en la cáscara. Una vez más, el método de incorporación de perlas debería revelar qué tan rápido los componentes viscosos en el núcleo son desplazados por las moléculas de agua. En nuestra experiencia, esto debería ocurrir dentro de las 3 h posteriores a la transferencia de microcápsulas al entorno acuoso.
El protocolo de encapsulación descrito aquí ha funcionado bien para varias líneashPSC 7, hepatocitos primarios10 y múltiples líneas celulares de cáncer (resultados no publicados). Sin embargo, encontramos dificultades para formar esferoides después de la encapsulación de hepatocitos derivados de células madre (sc) y células sc-β. La solución de problemas con microperlas encapsuladas reveló que los componentes viscosos se eluían rápidamente del núcleo y que las células eran libres de moverse y formar contactos célula-célula. La solución de problemas adicional incluyó la titulación de la concentración de TDT de reticulación de di-tiol (presente en la fase de aceite) de 66 mM a 10 mM. La formación de esferoides para los hepatocitos sc y las células β ocurrió a esta menor concentración de TDT. Por lo tanto, es posible que el usuario desee considerar la optimización de la concentración de enlaces cruzados, pero solo si otros pasos de solución de problemas enumerados anteriormente no se han realizado correctamente. Encontramos que la concentración de TDT es crítica para mantener la integridad mecánica de las microcápsulas con TDT de 66 mM, lo que resulta en microcápsulas mecánicamente robustas y no es tóxica para la gran mayoría de los tipos de células utilizadas hasta la fecha.
Una serie de estrategias para crear construcciones de células madre 3D se han descrito en la literatura. Los beneficios de formar construcciones de células madre dentro de microcápsulas de núcleo-cáscara son múltiples. Una vez encapsulados, los esferoides se pueden manejar con facilidad con cápsulas de hidrogel que brindan protección contra el daño por cizallamiento. Los esferoides encapsulados se pueden cultivar en suspensión con agitación vigorosa sin dañar las células madre.
Existen múltiples vías para ampliar las capacidades de las microcápsulas. Nuestro equipo ha descrito previamente el uso de hidrogeles que contienen heparina para la encapsulación de hepatocitos y células madre 8,12, y actualmente está desarrollando microcápsulas bioactivas de núcleo y cáscara que contienen heparina que sirven como depósitos para el almacenamiento y la liberación local de señales inductivas (GF) a las células madre. Tales microcápsulas pueden ayudar a disminuir el uso de GF costosos al tiempo que mejoran los resultados de diferenciación. Las microcápsulas pueden mejorarse aún más mediante la incorporación de proteínas ECM en el núcleo, modulando así el microambiente de las células madre. Las microcápsulas core-shell pueden hacerse degradables para facilitar la recuperación de los esferoides hPSC13,14. En general, las microcápsulas de núcleo-cáscara representan una tecnología de plataforma que se puede modificar y mejorar para abordar las necesidades de un protocolo específico de diferenciación de células madre.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado en parte por las subvenciones del Centro de Medicina Regenerativa de Mayo Clinic, la Fundación J. W. Kieckhefer, la Fundación Al Nahyan, Medicina Regenerativa de Minnesota (RMM 101617 TR 004) y los NIH (DK107255).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
