Summary
이 기사는 동축 유동 초점 장치를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 캡슐화를 설명합니다. 우리는이 미세 유체 캡슐화 기술이 hPSC 구상체의 효율적인 형성을 가능하게한다는 것을 보여줍니다.
Abstract
인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 3차원 (3D) 또는 스페로이드 배양은 향상된 분화 결과 및 확장성의 이점을 제공한다. 이 논문에서는 동축 흐름 초점 장치를 사용하여 코어 쉘 마이크로 캡슐 내부에 hPSC를 포획하는 hPSC 구상체의 견고하고 재현 가능한 형성을위한 전략을 설명합니다. 코어 용액은 hPSCs의 단일 세포 현탁액을 함유하고, 고분자량 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 밀도 구배 매질의 혼입에 의해 점성으로 만들어졌다. 쉘 스트림은 PEG-4 암-말레이미드 또는 PEG-4-Mal로 구성되고, 코어 스트림과 함께 두 개의 연속적인 오일 접합부를 향해 흘렀다. 액적 형성은 첫 번째 오일 접합부에서 발생했으며 쉘 용액은 코어 주위를 감싸고 있습니다. 쉘의 화학적 가교결합은 이들 액적에 디티올 가교결합제(1,4-디티오트레이톨 또는 DTT)를 도입함으로써 제2 오일 접합부에서 발생하였다. 가교제는 클릭 화학을 통해 말레이미드 작용기와 반응하여 마이크로 캡슐 주위에 하이드로겔 쉘을 형성합니다. 당사의 캡슐화 기술은 초당 10 캡슐의 속도로 직경 400 μm 캡슐을 생산했습니다. 결과 캡슐에는 하이드로겔 쉘과 수성 코어가있어 단일 세포가 응집체로 빠르게 조립되어 구상체를 형성 할 수있었습니다. 캡슐화 과정은 hPSCs의 생존력에 악영향을 미치지 않았으며, 캡슐화 후 3 일 동안 관찰 된 >95 %의 생존력으로 나타났습니다. 비교를 위해, (수성 코어 없이) 고체 겔 미세입자로 캡슐화된 hPSCs는 구상체를 형성하지 않았고, 캡슐화 3일 후에 <50%의 생존력을 가졌다. 코어-쉘 마이크로캡슐 내부의 hPSCs의 스페로이드 형성은 캡슐화 후 48시간 이내에 발생했으며, 스페로이드 직경은 세포 접종 밀도의 함수이다. 전반적으로, 이 프로토콜에 기술된 미세유체 캡슐화 기술은 hPSCs 캡슐화 및 스페로이드 형성에 매우 적합하였다.
Introduction
인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 3D 배양에는 이러한 배양 형식 1,2,3에 의해 제공되는 향상된 다능성 및 분화 잠재력으로 인해 상당한 관심이 있다. hPSC는 전형적으로 생물반응기, 마이크로웰, 하이드로겔 및 중합체성 스캐폴드 4,5,6을 통해 구상체 또는 다른 3D 배양 포맷으로 형성된다. 캡슐화는 단일 hPSC를 구상체로 조직하는 또 다른 방법을 제공합니다. 일단 캡슐화된 hPSC 구상체는 용이하게 처리되고 분화, 질병 모델링, 또는 약물 시험 실험을 위해 마이크로타이터 플레이트로 옮겨질 수 있다. 하이드로겔 층에 hPSC를 포위하는 것은 또한 전단 손상으로부터 세포를 보호하고, 높은 교반 속도로 생물반응기에서 구상체를 배양할 수 있게한다(7).
줄기 세포 캡슐화에 대한 우리의 방법론은 시간이 지남에 따라 진화했습니다. 첫째, 우리는 고체 하이드로겔 미세입자에 초점을 맞추고 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)의 성공적인 캡슐화 및 배양을 입증했습니다8. 그러나, 인간 배아줄기세포(hESCs)는 이러한 하이드로겔 마이크로입자에 캡슐화될 때 생존율이 낮으며, 아마도 캡슐화 후 세포-세포 접촉을 재확립하기 위해 이들 세포가 더 많이 필요하기 때문인 것으로 추정된다. 우리는 수성 코어를 소유하고있는 이종 마이크로 캡슐이 세포 - 세포 접촉의 신속한 재 확립에 의존하는 세포의 캡슐화에 더 적합 할 수 있다고 추론했다. 수성 코어/하이드로겔 쉘 마이크로캡슐을 제조하기 위한 동축 유동 포커싱 마이크로유체 장치의 개념은 He et al.9에서 채택되었지만, 원래의 접근법에 사용된 알지네이트 대신에, PEG 기반 하이드로겔이 쉘에 통합되었다. 우리는 먼저 코어-쉘 마이크로캡슐(10 )에서 원발성 간세포의 성공적인 캡슐화 및 스페로이드 형성을 입증하였고, 가장 최근에 hES 및 iPS 세포(7)의 캡슐화를 기술하였다. 도 1A에 요약된 바와 같이, 캡슐은 오일 페이즈로 토출되기 전에 쉘 및 코어 유동 스트림이 좌우에서 동축 흐름으로 전환되는 흐름 집속 장치로 제조된다. 코어 흐름에는 용액의 점도를 증가시키는 세포 및 첨가제 (비 반응성 PEG MW 35kD 및 iodixanol - 상업명 OptiPrep)가 포함되어 있으며 쉘 스트림에는 반응성 분자 (PEG-4-Mal)가 포함되어 있습니다. 연속 동축 흐름 스트림은 코어 쉘 아키텍처를 유지하는 물방울로 이산화됩니다. 코어-쉘 구조는 디티올 가교제(DTT)에 노출됨으로써 영구적으로 만들어지며, 이는 클릭 화학을 통해 PEG-4-Mal과 반응하여 얇은(~10 μm) 하이드로겔 피부 또는 쉘의 형성을 초래한다. 에멀젼이 깨지고 캡슐이 수성상으로 옮겨지면 PEG 분자가 코어에서 확산되어 물 분자로 대체됩니다. 이로 인해 수성 코어 및 하이드로겔 쉘 마이크로캡슐이 생성됩니다.
아래에는 미세 유체 장치를 만드는 방법, 세포를 준비하는 방법 및 hPSC의 캡슐화를 수행하는 방법에 대한 단계별 지침이 제공됩니다.
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Protocol
1. 장치 제작
- CAD 소프트웨어10,11을 사용하여 마이크로 캡슐화 장치 및 해리 장치에 대한 설계를 수행합니다.
- SU-8 포토레지스트의 세 층을 실리콘 웨이퍼 상에 순차적으로 스핀 코팅하여(도 2A) 원하는 높이의 구조를 달성한다: 60, 100 및 150 μm.
참고: 상단 및 하단 금형의 공정은 동일합니다.- 깨끗한 10 cm 실리콘 웨이퍼를 SU-8 2025 네거티브 포토레지스트를 1,100 rpm으로 스핀 코팅하여 첫 번째 60 μm 층을 만들었다. 핫플레이트 상에서 3분 동안 및 95°C에서 10분 동안 65°C에서 소프트 베이킹한 후, 코어 채널 패턴의 설계 파일을 μPG 101 PC에 업로드하여 마스크리스 얼라이너를 사용하여 몰드를 노출시킨다. 이어서, 노광 후 베이크를 65°C에서 3분 동안 및 95°C에서 10분 동안 진행한다.
- 두 번째 SU-8 2025 레이어(40μm)를 1,500rpm으로 회전시키고 셸 채널 패턴에 적합한 CAD 파일을 업로드하여 노출합니다.
참고: 소프트 베이크와 노출 후 베이크는 이전 단계와 비슷했습니다. - 세 번째 SU-8 2025 층을 1,400rpm으로 스핀 코팅하여 50 μm 높이를 달성하고 위의 과정을 반복하되 유상에 대한 구조를 노출시킵니다.
- 모든 미노광 포토레지스트가 제거될 때까지 SU-8 현상액에 침수하여 한 번에 세 층 모두를 가진 몰드를 개발한다.
- 몰드를 160°C의 핫플레이트 상에 10분 동안 하드 베이킹하여 접착력을 향상시키고 현상 후에 나타날 수 있는 작은 균열을 밀봉한다.
- 다음 단계에서 엘라스토머 결합을 피하기 위해 몰드를 클로로트리메틸실란에 노출시키고 사용할 때까지 15cm 페트리 접시에 넣으십시오.
- 해리 장치 몰드를 도 1D 및 도 2B에 설명된 바와 같은 방식으로 준비한다. 단계 1.2.3에서 앞서 설명된 바와 같이, 실리콘 웨이퍼 상에 SU-8 포토레지스트의 1층을 스핀 코팅하여, 원하는 높이를 갖는 구조를 달성한다: 50 μm. 이전 단계와 유사하게 소프트 및 노출 후 베이크, 개발 및 하드 베이크를 수행하십시오.
참고 : 삼각형 모양의 기둥 배열이 챔버 전체를 덮었으며 챔버 너비가 출구쪽으로 감소함에 따라 포스트 사이의 간격이 줄어 들었습니다. 삼각형 포스트는 측면 당 200 μm이고 피치는 400 μm (입구에서)에서 30 μm (출구에서)에 이르는 피치였다. - 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 소프트 리소그래피로 주형을 제조하였다.
- PDMS 엘라스토머 염기와 엘라스토머 경화제를 유성 원심분리기에 10:1 w/w 비율로 혼합하십시오. 혼합물을 마이크로 캡슐화 마스터 몰드와 해리 마스터 몰드 모두에 붓고 3-4mm 층을 만듭니다.
참고: 엘라스토머 베이스 50g과 경화제 5g의 혼합물은 마스터 몰드를 3mm 두께로 덮기에 충분합니다. - 몰드가 들어있는 페트리 접시를 진공 데시케이터에 15분 동안 놓고 경화되지 않은 PDMS를 탈가스화시킨다.
- 페트리 접시를 오븐으로 옮기고 최소 60 분 동안 80 °C에서 굽습니다.
- 오븐에서 마스터 몰드를 제거하고 식히십시오. 정밀 나이프를 사용하여 웨이퍼의 모양에 따라 PDMS를 조심스럽게 자르고 마스터 몰드에서 PDMS 조각을 벗겨냅니다.
- 메스로 각 장치의 가장자리를 트리밍하여 PDMS 슬래브를 잘라낸 다음 해리 장치의 입구 / 출구 유체 포트를 펀치하고 스테인레스 스틸 바늘을 사용하여 상단 미세 유체 장치에서만 펀치하십시오. 오염을 피하기 위해 매직 테이프로 장치를 덮으십시오.
참고: 바늘 게이지는 입구 및 출구 포트의 경우 각각 14G 및 15G입니다. - 접합을 위해, 상부 및 하부 PDMS 조각의 패턴화된 측면을 플라즈마 에칭기 상에서O2 플라즈마로 2분 동안 처리한다.
- 두 PDMS 부분을 마이크로채널(2 μL)에 직접 증류수의 얇은 분리층을 첨가한 후 스테레오스코프 아래에 정렬한다.
- 정렬된 PDMS 장치를 하룻밤 동안 80°C의 오븐에 두어 접합을 완료하고 PDMS를 원래의 소수성 상태로 복원한다. 나중에 사용할 때까지 장치를 보관하십시오.
참고: 이로 인해 코어의 경우 120μm, 셸의 경우 200μm, 오일 채널의 경우 300μm의 세 가지 높이를 가진 동축 흐름 집속 장치가 생성됩니다. - 플라즈마 결합 직후에 장치를 사용하려면 소수성 코팅 용액 30μL를 유체 채널에 주의 깊게 그러나 단단히 주입하여 소수성 코팅을 달성하십시오. 그런 다음, 장치에서 소수성 코팅 용액의 잔류물이 관찰되지 않을 때까지 즉시 채널 내로 공기를 정화한다.
- 해리 장치를 먼저 패턴화된 측면의 장치 및 세척된 슬라이드 글라스를O2 플라즈마로 2분 동안 처리하고, 이어서 하룻밤 동안 80°C의 오븐에서 추가 경화를 위해 이들을 조립함으로써 해리 장치를 접합시킨다.
참고: 장치는 추가로 사용할 때까지 저장할 수 있습니다.
- PDMS 엘라스토머 염기와 엘라스토머 경화제를 유성 원심분리기에 10:1 w/w 비율로 혼합하십시오. 혼합물을 마이크로 캡슐화 마스터 몰드와 해리 마스터 몰드 모두에 붓고 3-4mm 층을 만듭니다.
2. 용액의 제조
- 스톡 솔루션. 첫째, 실제 사용을 위해 더 낮은 농도로 희석 될 원액 (농축 용액)을 준비하십시오.
참고: 스톡 솔루션은 준비 시간을 절약하고, 재료를 보존하고, 저장 공간을 줄이고, 낮은 농도로 작업 솔루션을 준비할 때 정확도를 향상시키는 데 사용됩니다.- 30mL의 2x 코어 용액(16% PEG 및 34% 밀도 구배 배지)을 준비합니다: 4.8g의 35kDa PEG, 10.2mL의 밀도 구배 배지 및 19.8mL의 DMEM/F12 배지를 혼합합니다. 이 코어 용액을 0.22 μm 시린지 필터를 사용하여 필터링한다.
- 미네랄 오일 50 mL를 3% 계면활성제로 준비하십시오: 미네랄 오일 48.5 mL와 계면활성제 1.5 mL를 섞는다. 0.22 μm 시린지 필터를 통해 여과한 후 멸균 상태로 유지한다.
- 미네랄 오일 50 mL를 0.5% 계면활성제로 준비하십시오: 미네랄 오일 49.75 mL와 계면활성제 0.25 mL를 섞는다. 멸균 상태로 유지하십시오.
- 1 M 디티오테리톨(DTT)을 준비한다: 1.5425 g의 DTT를 10 mL 증류수에 녹인다. 멸균 상태로 유지하십시오.
- 1 M 트리에탄올아민 (TEA)을 준비하십시오 : 433.6 μL의 증류수에 66.4 μL의 TEA를 첨가하십시오. 멸균 상태로 유지하십시오.
- 1% 플루로닉 F127(PF127)을 준비합니다: 100mg의 PF127을 증류수 10mL에 녹입니다. 멸균 상태로 유지하십시오.
- 작업 솔루션
- 광유 4.5 mL와 3% 계면활성제 및 300 μL의 1 M DTT (1:15 비율)를 혼합하여 가교제 에멀젼을 제조하였다. 용액을 2분 동안 볼텍스하고, 20°C의 초음파 욕조에서 45-60분 동안 초음파 처리한다. 이 용액을 27 G 바늘로 5 mL 주사기에 적재하십시오.
참고 : 에멀젼은 초음파 처리 오일 / 물 혼합물에 의해 생성됩니다. - 광유를 0.5% 계면활성제로 27 G 바늘이 있는 5 mL 주사기에 로딩하여 차폐유 용액을 제조하였다.
- 1x DPBS의 400 μL에 32 mg의 PEG-4-Mal을 첨가하여 쉘 (8 % w/v PEG-4-Mal 및 15 mM TEA) 용액을 준비하여 8 % w / v 용액을 형성하고 용액을 2 분 동안 와류하십시오. 이어서, 6 μL의 1 M TEA (최종 농도 15 mM TEA)를 첨가하였다. 마지막으로, 스핀 필터를 통해 5분 동안 13,000 x g 에서 원심분리하고 30분 동안 로커 상의 어둠 속에 보관한다. 이어서, 이 용액을 27 G 바늘이 있는 1 mL 주사기에 로딩한다.
주: 뚜껑을 열기 전에 PEG-4-Mal 용기를 실온에서 10분 동안 그대로 두고 뚜껑을 닫기 전에 N2 가스를 불어 O2를N2로 교체하십시오. 솔루션에 추가하기 전에 VORTEX TEA를 사용하십시오.
- 광유 4.5 mL와 3% 계면활성제 및 300 μL의 1 M DTT (1:15 비율)를 혼합하여 가교제 에멀젼을 제조하였다. 용액을 2분 동안 볼텍스하고, 20°C의 초음파 욕조에서 45-60분 동안 초음파 처리한다. 이 용액을 27 G 바늘로 5 mL 주사기에 적재하십시오.
- 코어 용액에서 세포 현탁액을 준비하십시오.
- hPSCs를 37°C에서 5 내지 10분 동안 트립신으로 처리하였다. 그런 다음 접시에서 수집하십시오. 세포 분리 후 배지로 트립신을 켄칭하고, 이어서 세포를 15 mL 원뿔형 튜브로 옮긴다.
- 벌크 세포 현탁액을 원심분리한다(400 x g, 5분). 상청액을 조심스럽게 흡인한 다음, 최소 부피의 성장 배지를 사용하여 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산합니다.
참고: 일반적인 세포 분취량은 12-20 x 106 세포를 함유하고 있으며 코어 용액 400 μL를 만들기에 충분합니다. - 벌크 세포 현탁액에서 12-20 x 106 세포를 취하여 세포 / 배지 현탁액 (400 x g, 5 분)을 원심분리하십시오.
- 세포 펠릿으로부터 배지를 조심스럽게 흡인시킨다. 그런 다음 200 μL 배지와 200 μL의 2x PEG 용액 (최종 농도 30-50 x 106 cell/mL)을 넣고 부드럽게 혼합하십시오.
참고: 낮은 세포 농도(20 x 106 cells/mL 미만)로 인해 많은 빈 캡슐이 생성되었습니다. - 30 μL의 1% PF127을 용액에 첨가한다.
- 마이크로 교반기 막대 (2 mm x 7 mm)를 1 mL 주사기에 넣은 다음, 코어 용액을 함유하는 세포를 27 G 바늘로 주사기에 로딩한다. 전체 캡슐화 과정에서 용액을 얼음으로 차갑게 유지하십시오.
3. 실험 설정
- 접합된 PDMS 액적 장치, 길이 20cm 및 길이 5cm 입구 마이크로 튜브 1개(0.38mm I.D. x 1.1mm O.D.) 1장, 10cm 출구 튜브 1개(0.5mm I.D. x 1.5mm O.D.) 및 0.5cm 피팅 튜브 6개(1mm I.D. x 1.8mm O.D.)를 살균 광원(일반적으로 생물학적 안전 캐비닛에 내장) 아래에 놓고 30개씩 살균합니다. 분.
- 포셉을 사용하여 튜브를 유체 입구 포트와 해리 포트에 맞춥니다.
- 쉘, 오일, 가교제 에멀젼 유입구 및 해리 장치의 입구에 대해 20cm 길이의 입구 마이크로 튜브의 세 조각을 사용하십시오. 그런 다음 튜브의 반대쪽 끝을 해당 용액으로 주사기의 바늘에 삽입하십시오. 한편, 미세 유체 장치의 코어 입구와 해리 장치의 출구를 하나의 5cm 마이크로 튜브로 연결하십시오 (그림 1C).
참고: 입구 마이크로튜브는 마지막 단계에서 삽입된 피팅 튜브 내에 단단히 고정되어야 합니다. - 하나의 출구 튜브를 유체 출구 포트에 삽입하고 반대쪽 끝을 수집 저장소에 넣으십시오.
- 장치를 현미경 스테이지에 놓고 튜브를 부착하여 움직이지 않도록하십시오. 유량 검사를 위해 현미경을 장치 노즐에 맞추고 초점을 맞춥니다.
- 각 주사기를 다른 주사기 펌프에 놓고 제대로 고정하십시오(그림 1B). 제조업체의 프로토콜에 따라 각 펌프를 코어(3-5μL/분), 셸(3-5μL/분), 차폐 오일(20-80μL/분) 및 가교 오일(40-60μL/분)의 유량으로 프로그래밍합니다. 모든 펌프에서 흐름을 시작하십시오.
- 각 유체가 장치에 들어갈 때까지 기다렸다가 나머지 공기를 밀어내는 동안 채널을 채 웁니다.
주: 입구 튜브에 많은 양의 공기가 있는 경우 공기가 완전히 제거될 때까지 일시적으로 각 유량을 늘리십시오. 과도한 유량은 PDMS-PDMS 결합 실패로 이어질 수 있음을 명심하십시오. - 캡슐 형성이 안정화되면(그림 3), 수집 튜브의 반대쪽 끝을 5mL의 mTeSR 배지가 있는 새로운 원뿔형 튜브에 놓습니다.
참고: 배지에는 10 μM ROCK 억제제, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함되어 있습니다. - 충분한 수의 캡슐이 수집된 후, 37°C에서 10분 동안 5%CO2 와 함께 인큐베이션한다. 유상에 상주하는 캡슐은 튜브의 상단에 있을 것이다( 도 4A 참조). 튜브를 부드럽게 두드리면 캡슐이 바닥에 침전됩니다. 그 후, 대부분의 오일과 매체가 흡인 될 수 있습니다.
- 원뿔형 튜브의 바닥에서 캡슐을 수집하여 세포 스트레이너 (100 μm 기공 크기) 위에 놓고 풍부한 양의 배지로 씻으십시오. 이어서, 웰 플레이트의 상부에 반전되는 바와 같이 필터를 통해 배지를 실행하여 6-웰 배양 플레이트에서 2 mL 배지를 사용하여 마이크로캡슐을 수집한다( 도 4A 참조).
4. 마이크로캡슐에서의 hPSC 배양 및 분석
- 기본 문화
- 줄기 세포 캡슐을 5%CO2와 함께 37°C의 6-웰 플레이트 배양 접시에서 인큐베이션한다.
- 세포 스트레이너 필터 상에서 캡슐을 수집하고, 과량의 배지로 세척하고, 단계 3.10에서 행해진 바와 같이 2 mL 배지를 갖는 6-웰 플레이트에서 새로운 웰로 재현탁시킴으로써 격일로 배지를 변경한다.
- 캡슐을 적어도 10 일 동안 배양하십시오.
- 살아있는 / 죽은 분석을 수행하여 캡슐화 된 줄기 세포의 생존 가능성을 결정하십시오.
- 해동 살아있는 / 죽은 분석 용액 (에티듐 호모 다이머 -1 및 칼세인 AM).
- 4 μL의 2 μM 에티듐 호모다이머-1 및 1 μL의 4 μM 칼세인 AM 용액을 2 mL의 멸균 DPBS에 첨가한다. 완벽한 혼합을 보장하는 소용돌이.
- 세포 스트레이너에 약 100 개의 마이크로 캡슐을 모으고 멸균 DPBS로 헹구어 캡슐에서 배지가 확산 될 수 있도록하십시오.
- 이들을 단계 4.2.2에서 제조된 용액 1 mL를 사용하여 12 웰 배양 플레이트에 다시 수집한다. 37°C에서 20분 동안 인큐베이션한다.
- 세포를 형광 현미경으로 시각화합니다.
참고 : 세포 생존력은 총 세포 수 중 녹색으로 시각화되는 살아있는 세포의 백분율을 계산하여 정량화됩니다.
- 스페로이드 크기 특성화.
- 원하는 경우 마이크로 캡슐이있는 웰 플레이트를 현미경 아래에 놓고 적절한 스케일 막대로 관련 소프트웨어에 표시된 구상체의 직경을 측정하십시오.
- 스페로이드 크기를 측정하고 분석합니다.
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Representative Results
상기 언급된 프로토콜에 따라, 리더는 미세유체 장치를 제조하고 세포 운반 마이크로캡슐을 생산할 수 있을 것이다. 도 3A는 마이크로유체 액적 생성을 사용하여 제조된 최적 및 차선책의 마이크로캡슐의 예를 도시한다. PEG-4-Mal의 상이한 제형은 다양한 형태의 캡슐을 초래하였다 - 주름진 캡슐은 불량한 겔화, 낮은 기계적 완전성과 관련되었고, 교반된 생물반응기에서의 배양을 견디지 못했다. >6%의 PEG 함량에서 관찰된 매끄러운 캡슐은 원하는 캡슐 형태를 나타내었고, 세포 배양을 위해 충분히 견고하였다. 코어-쉘 구조는 마이크로비드를 코어에 혼입시키고 형광 모이어티를 마이크로캡슐의 쉘 내로 혼입함으로써 확인하였다. 도 3B 에서 볼 수 있는 바와 같이 캡슐의 중앙에 비드의 응집은 코어가 수성이고 비드가 자유롭게 움직일 수 있다는 표시로서 사용되었다. 도 3C 에서 관찰된 형광 환부는 하이드로겔 쉘의 존재를 나타내고 쉘 두께를 결정하기 위해 사용되었다. 우리는 사용자가 캡슐화 프로세스를 확립의 초기 단계에서 마이크로 비드 혼입 및 형광 표지를 사용하는 것이 좋습니다.
캡슐화 프로세스가 설정되면 hPSC의 캡슐화로 이동할 수 있습니다. 이 프로토콜은 H9 세포의 캡슐화를 설명하지만, 우리는 다른 hESC 라인 (HUES-8) 및 iPSC 라인 (1016)을 캡슐화하기 위해 유사한 전략을 사용했습니다. 7
캡슐화는 캡슐화 장치만을 사용하여 수행 될 수 있지만, 우리는 hPSC가 시스템에 덩어리가 생겨 불균일 한 캡슐화 또는 캡슐 점유를 초래하는 경향이 있음을 주목했습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 해리 또는 여과 장치를 설계하고 캡슐화 장치의 상류에 배치했습니다. 이 해리 장치는 측면 당 200μm로 측정된 삼각형 모양의 포스트 어레이와 입구에서 400μm에서 출구에서 30μm 범위의 피치를 갖는 유동 채널을 구성하여 캡슐화 장치에 들어가기 전에 덩어리가 유지되거나 분해되도록 했습니다( 그림 1D 참조)7. 해리 장치의 사용은 구상체의 균일 성을 크게 향상시키고 캡슐의 세포 점유율을 57 %에서 >90 % 7로 증가시킬 수 있습니다.
도 4B,C는 캡슐화 실행으로부터의 대표적인 결과를 기술한다. 이들 이미지로부터 알 수 있는 바와 같이, H9 세포는 캡슐화 실행 동안 일상적으로 달성되는 >95% 생존력으로 높은 생존력을 갖는다. 우리는 캡슐화 된 구상체 7과 캡슐화되지 않은 구상체7의 성장 속도 (도 4B, C 참조)와 분화 가능성을 비교하고, 캡슐화 과정이 hPSC에 악영향을 미치지 않는다는 것을 결정하였다. 반면에 hPSC를 캡슐화하면 몇 가지 이점이 있습니다. 캡슐화된 구상체는 취급하기 쉬우며, 분화 프로토콜 개발 또는 시험 요법을 위해 마이크로타이터 플레이트에 분배/분배될 수 있다. 우리 실험실은 교반 생물반응기에서 현탁액 배양을위한 줄기 세포 운반체로 마이크로 캡슐을 사용하는 데 관심이 있으며 하이드로 겔 쉘이 그러한 배양물에서 전단 손상으로부터 보호한다는 것을 입증했습니다7. 이것은 하이드로겔 쉘이 분화 동안 유도성 단서의 국부적이고 지속적인 전달을 위한 성장 인자로 로딩될 수 있는 생체활성 마이크로캡슐을 만드는 것에 있어서 우리가 추구하는 추가적인 길이다.
그림 1: 코어-쉘 마이크로캡슐의 제조 . (A) 캡슐 생성을 위한 미세유체 장치는 네 개의 유입 채널(코어, 쉘, 오일 및 가교기 오일)과 수집 튜브로 연결되는 뱀 채널로 구성됩니다. 이 장치는 코어, 쉘 및 오일 채널이 각각 높이가 120μm(H1), 200μm(H2) 및 300μm(H3)가 되도록 제작됩니다. 인셋은 노즐에서의 단면도 - 수성과 오일 스트림 사이의 접합부를 나타냅니다. 이 단면도는 90°씩 기울어져 있어 독자가 동축 유동 채널을 더 잘 볼 수 있습니다. 코어-쉘 마이크로캡슐 제조 공정의 3D 표현은 코어-쉘 마이크로캡슐 구조를 생성하기 위해 유동 집속 접합부의 상류에서 동축 유동이 어떻게 생성되는지를 묘사한다. 유화는 수성 액적을 두 개의 오일 스트림에 노출시킴으로써 이루어지며, 그 중 첫 번째는 액적을 안정화하도록 설계되고, 두 번째는 PEG-4-Mal과 반응하는 가교제 DTT를 제공한다. 이 도면은 참조12에서 수정되었습니다. 저작권 2019, 미국 화학 협회. (B) 주사기 펌프, 튜빙, 미세유체 장치 및 캡슐 수집 튜브의 위치를 보여주는 캡슐화 시스템의 실험적 설정. (C) 해리 및 캡슐화 장치로 구성된 캡슐화 시스템의 이미지. (d) 마이크로캡슐화 장치에 들어가는 큰 세포 응집체를 피하기 위해 사용되는 미세유체 해리 장치의 설계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 캡슐화에 사용되는 미세유체 장치의 제작. (A) 캡슐화 장치의 제작. SU-8 포토레지스트의 세 층이 스핀 코팅되었고, 사진은 높이가 다른 코어, 쉘 및 오일 채널을 생성하기 위해 패턴화되었습니다. 코어 채널의 폭은 220μm로 캡슐 접합부에서 135μm까지 좁아집니다. 모든 위상에 대한 채널은 동일한 원칙을 따릅니다: 쉘과 오일 채널은 폭 500μm로 시작하여 접합부에서 220μm로 좁아지고, 차폐 오일은 500μm에서 시작하여 270μm로 좁아집니다. 출구 뱀은 폭이 1.5mm이고 길이가 ~ 55mm입니다. 이어서, 상부 및 하부 PDMS 조각들을 정렬하고, 플라즈마 접합시켰다. (B) 해리 장치의 제작. SU-8 포토레지스트의 한 층은 스핀 코팅되었고, 사진은 해리 채널을 생성하기 위해 패터닝되었다. 이어서, PDMS 조각을 유리 슬라이드로 플라즈마 접합시켰다. 해리 장치는 높이 30μm, 길이 16.5mm, 입구에서 폭 5mm, 출구에서 1.7mm의 작은 챔버로 구성됩니다. 그것은 입구의 420 μm에 의해 서로 분리되고 출구로가는 도중에 더 가까워지는 삼각형 모양의 구조 (200 μm, 등변)를 가지고 있으며, 마지막 행에서 50 μm의 분리와 함께. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 마이크로캡슐의 특성화. (A) 쉘 내의 PEG-4-Mal 함량의 함수로서 캡슐 형태학의 차이. 밝은 가장자리를 가진 부드러운 캡슐은 원하는 기계적 무결성과 관련이 있습니다. (b) 마이크로캡슐의 수성 코어의 확인. 포획된 마이크로비드는 마이크로캡슐의 중심에서 수성 코어 및 응집체 내에서 자유롭게 이동할 수 있다. (c) 로다민 B 표지된 PEG를 마이크로캡슐의 쉘에 혼입시켜 코어-쉘 구조의 확인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: hPSCs의 캡슐화 . (A) 유상의 마이크로캡슐은 매질로 채워진 원뿔형 튜브에 수집된다. 마이크로 캡슐이 튜브의 바닥에 침전되도록 만들어진 후, 오일 및 배지가 흡인되고, 마이크로 캡슐을 세척 한 다음 재배를 위해 6-웰 플레이트로 옮깁니다. (b) H9 세포를 캡슐화한 후 6시간 동안 생/사신 염색. 상부 이미지는 10x에서, 하부 이미지는 20x에서 촬영되었다. (C) 캡슐 및 상업용 3D 배양 플레이트에서 H9 세포에 대해 시간에 따라 변하는 스페로이드 크기를 비교하는 이미지(하단 이미지). (d) H9 배지에서 7일 동안 마이크로캡슐 및 표준 3D 배양 플레이트에서 hPSCs에 대해 증가하는 스페로이드 직경의 정량화. 통계적 분석 -t-검정, p< 0.05, n=20. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 캡슐화 과정은 hPSC 구상체의 재현 가능한 형성을 초래한다. 마이크로 캡슐 형식을 사용하면 분화 프로토콜 개선 / 최적화 또는 치료법 테스트를 목표로하는 실험을 위해 구상체를 마이크로 타이터 플레이트의 웰에 쉽게 분배 할 수 있습니다. 캡슐화된 줄기 세포 구상체는 또한 하이드로겔 쉘이 전단-유도된 손상으로부터 세포를 보호하는 현탁 배양물에서 사용될 수 있다7.
프로토콜 내에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 코어, 쉘 및 오일 스트림의 유속을 프로토콜 섹션에 설명된 범위 내에서 유지하는 것이 중요합니다. 쉘 유량이 너무 낮 으면 흐름이 불안정 해져서 왜곡되고 기계적으로 불안정한 캡슐이 발생합니다. 성공적인 세포 캡슐화는 도 4C에 도시된 마이크로캡슐과 유사하게 보일 것이다. 마이크로캡슐은 직경이 비슷해야 하며 코어에 갇힌 유사한 수의 세포를 가져야 한다. 단일 세포를 구상체로 응집시키는 것은 일반적으로 48 h 이내에 발생하며 72 h에서 스페로이드 형성의 부족은 경고 신호입니다. 스페로이드 형성이 부족한 한 가지 이유는 코어의 점성 분자가 하이드로겔 쉘을 통해 충분히 빠르게 침출되지 않기 때문일 수 있습니다. 우리는 카르복시메틸 셀룰로스 (MW 250 kD)와 같은 고분자량 중합체를 사용하여 코어 용액의 점도를 조정할 때이 시나리오에 직면했다. 마이크로비드를 캡슐화하여( 도 3B 참조) 이러한 세포 크기의 물체가 코어 주위로 자유롭게 움직일 수 있는지, 그리고 코어의 성분이 얼마나 빨리 침출되는지를 테스트할 수 있다. 스페로이드 형성의 부족은 또한 >8 % w / v의 PEG-4-Mal 농도를 사용할 때 우리에 의해 발생했습니다. 이 시나리오에서, 하이드로겔 쉘의 다공도 및 확산성이 감소되고 코어의 고점도 원소는 세포가 응집체로 형성될 수 있을 정도로 빠르게 침출되지 않는다. PEG-4-Mal의 품질은 배치마다 다를 수 있으며 배치 또는 제조업체마다 다를 수 있습니다. 따라서, 쉘 내의 중합체 농도의 약간의 조정이 필요할 수 있다. 다시 한번, 비드 혼입 방법은 코어 내의 점성 성분이 물 분자에 의해 얼마나 빨리 변위되는지를 밝혀야 한다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 이것은 마이크로 캡슐을 수성 환경으로 옮긴 후 3 시간 이내에 발생해야합니다.
여기에 기재된 캡슐화 프로토콜은 몇몇 hPSC 라인7, 원발성 간세포10, 및 다수의 암 세포주 (미공개 결과)에 대해 잘 작동하였다. 그러나, 줄기세포 유래(sc)-간세포 및 sc-β-세포의 캡슐화 후 구상체 형성에 어려움을 겪었다. 캡슐화 된 마이크로 비드를 사용한 문제 해결은 점성 성분이 코어에서 빠르게 용출되었으며 세포가 자유롭게 움직이고 세포 - 세포 접촉을 형성한다는 것을 보여주었습니다. 추가적인 트러블슈팅은 디티올 가교결합제 DTT(유상에 존재함)의 적정 농도를 66mM에서 10mM로 낮추는 것을 포함했다. sc-간세포 및 β-세포에 대한 스페로이드 형성은 이러한 낮은 DTT 농도에서 발생하였다. 따라서 사용자는 가교구 농도 최적화를 고려할 수 있지만 위에 나열된 다른 문제 해결 단계가 성공하지 못한 경우에만 가능합니다. 우리는 DTT 농도가 66 mM DTT로 마이크로 캡슐의 기계적 무결성을 유지하는 데 중요하며 기계적으로 견고한 마이크로 캡슐을 생성하고 현재까지 사용 된 대부분의 세포 유형에 무독성이라는 것을 알게되었습니다.
3D 줄기 세포 구축물을 만들기 위한 다수의 전략이 문헌에 기술되어 있다. 코어-쉘 마이크로캡슐 내에서 줄기 세포 구축물을 형성하는 것의 이점은 다중이다. 일단 캡슐화되면, 구상체는 전단 손상으로부터 보호를 제공하는 하이드로겔 캡슐로 쉽게 취급될 수 있다. 캡슐화된 구상체는 줄기 세포를 손상시키지 않으면서 격렬한 교반으로 현탁액 중에서 배양될 수 있다.
마이크로 캡슐의 기능을 확장하기위한 여러 가지 방법이 있습니다. 우리 팀은 이전에 간세포 및 줄기 세포 8,12의 캡슐화를 위해 헤파린 함유 하이드로 젤의 사용을 설명했으며, 현재 줄기 세포에 유도 단서 (GF)의 저장 및 국소 방출을위한 창고 역할을하는 헤파린 함유 생리 활성 코어 쉘 마이크로 캡슐을 개발 중입니다. 이러한 마이크로 캡슐은 분화 결과를 개선하면서 값 비싼 GF의 사용을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 마이크로캡슐은 ECM 단백질을 코어 내로 혼입시킴으로써 줄기 세포 미세환경을 조절함으로써 더욱 강화될 수 있다. 코어-쉘 마이크로캡슐은 hPSC 구상체(13,14)를 더 쉽게 회수할 수 있도록 분해가능하게 만들어질 수 있다. 전반적으로, 코어-쉘 마이크로캡슐은 특정 줄기 세포 분화 프로토콜의 요구를 해결하기 위해 변형되고 향상될 수 있는 플랫폼 기술을 나타낸다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) 및 NIH (DK107255)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
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