Summary
Questo articolo descrive l'incapsulamento di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) utilizzando un dispositivo di messa a fuoco del flusso coassiale. Dimostriamo che questa tecnologia di incapsulamento microfluidico consente una formazione efficiente di sferoidi hPSC.
Abstract
Le colture tridimensionali (3D) o sferoidi di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) offrono i vantaggi di migliori risultati di differenziazione e scalabilità. In questo articolo, descriviamo una strategia per la formazione robusta e riproducibile di sferoidi hPSC in cui un dispositivo di messa a fuoco del flusso coassiale viene utilizzato per intrappolare le hPSC all'interno di microcapsule core-shell. La soluzione principale conteneva sospensione monocellulare di hPSC ed è stata resa viscosa dall'incorporazione di poli(glicole etilenico) ad alto peso molecolare (PEG) e mezzi gradienti di densità. Il flusso di guscio comprendeva PEG-4 braccio-maleimmide o PEG-4-Mal e scorreva lungo il flusso centrale verso due giunzioni petrolifere consecutive. La formazione di goccioline si è verificata alla prima giunzione dell'olio con la soluzione del guscio che si avvolge attorno al nucleo. La reticolazione chimica del guscio si è verificata alla seconda giunzione dell'olio introducendo un reticolante di-tiolo (1,4-ditiotreitolo o DTT) a queste goccioline. Il reticolante reagisce con i gruppi funzionali della maleimmide tramite la chimica dei clic, con conseguente formazione di un guscio di idrogel attorno alle microcapsule. La nostra tecnologia di incapsulamento ha prodotto capsule da 400 μm di diametro ad una velocità di 10 capsule al secondo. Le capsule risultanti avevano un guscio di idrogel e un nucleo acquoso che permetteva alle singole cellule di assemblarsi rapidamente in aggregati e formare sferoidi. Il processo di incapsulamento non ha influenzato negativamente la vitalità delle hPSC, con una vitalità >95% osservata 3 giorni dopo l'incapsulamento. Per confronto, le hPSC incapsulate in microparticelle di gel solido (senza un nucleo acquoso) non formavano sferoidi e avevano una vitalità <50% 3 giorni dopo l'incapsulamento. La formazione sferoide di hPSC all'interno di microcapsule core-shell si è verificata entro 48 ore dall'incapsulamento, con il diametro sferoide in funzione della densità di inoculazione cellulare. Nel complesso, la tecnologia di incapsulamento microfluidico descritta in questo protocollo era adatta per l'incapsulamento delle hPSC e la formazione di sferoidi.
Introduction
C'è un notevole interesse per le colture 3D di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) a causa del miglioramento della pluripotenza e del potenziale di differenziazione offerti da questo formatodi coltura 1,2,3. Le hPSC sono tipicamente formate in sferoidi o altri formati di coltura 3D per mezzo di bioreattori, microwell, idrogel e scaffold polimerici 4,5,6. L'incapsulamento offre un altro mezzo per organizzare singole hPSC in sferoidi. Una volta incapsulati, gli sferoidi hPSC possono essere maneggiati con facilità e trasferiti in piastre di microtitolazione per la differenziazione, la modellazione della malattia o esperimenti di test antidroga. L'involucro di hPSC in uno strato di idrogel protegge anche le cellule dai danni da taglio e consente di coltivare sferoidi in un bioreattore ad alti tassi di agitazione7.
La nostra metodologia per l'incapsulamento delle cellule staminali si è evoluta nel tempo. In primo luogo, ci siamo concentrati sulle microparticelle di idrogel solido e abbiamo dimostrato successo nell'incapsulamento e nella coltivazione di cellule staminali embrionali di topo (mESC)8. Tuttavia, è stato notato che le cellule staminali embrionali umane (hESC) avevano una bassa vitalità quando incapsulate in tali microparticelle di idrogel, presumibilmente a causa della maggiore necessità per queste cellule di ristabilire i contatti cellula-cellula dopo l'incapsulamento. Abbiamo ragionato sul fatto che la microcapsula eterogenea, che possiede un nucleo acquoso, può essere più adatta per l'incapsulamento di cellule che si basano sul rapido ristabilimento dei contatti cellula-cellula. Il concetto di dispositivo microfluidico di focalizzazione del flusso coassiale per la produzione di microcapsule acquose a nucleo / guscio idrogel è stato adattato da He et al.9, ma invece dell'alginato impiegato nell'approccio originale, un idrogel a base di PEG è stato incorporato nel guscio. Abbiamo prima dimostrato il successo dell'incapsulamento e della formazione sferoide di epatociti primari in microcapsule10 del guscio centrale e più recentemente descritto incapsulamento di cellule hES e iPS7. Come delineato nella Figura 1A, le capsule sono fabbricate in un dispositivo di messa a fuoco del flusso in cui i flussi di flusso del guscio e del nucleo passano da un lato all'altro al flusso coassiale prima dell'espulsione nella fase dell'olio. Il flusso del nucleo contiene cellule e additivi che aumentano la viscosità della soluzione (PEG MW 35kD non reattivo e iodixanolo - nome commerciale OptiPrep) mentre il flusso del guscio contiene molecole reattive (PEG-4-Mal). Il flusso continuo coassiale viene discretizzato in goccioline che mantengono l'architettura core-shell. La struttura del guscio centrale è resa permanente dall'esposizione al reticolante di-tiolo (DTT), che reagisce con PEG-4-Mal tramite la chimica del clic e provoca la formazione di una pelle o di un guscio di idrogel sottile (~ 10 μm). Dopo che l'emulsione è stata rotta e le capsule sono state trasferite in una fase acquosa, le molecole di PEG si diffondono dal nucleo e vengono sostituite da molecole d'acqua. Ciò si traduce in microcapsule a nucleo acquoso e guscio idrogel.
Di seguito sono fornite istruzioni dettagliate su come realizzare dispositivi microfluidici, come preparare le cellule e come eseguire l'incapsulamento delle hPSC.
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Protocol
1. Fabbricazione del dispositivo
- Realizza i progetti per il dispositivo di microincapsulazione e il dispositivo di dissociazione utilizzando il software CAD10,11.
- Spin-coat i tre strati di SU-8 fotoresistono sequenzialmente su un wafer di silicio (Figura 2A) per ottenere strutture con le altezze desiderate: 60, 100 e 150 μm.
NOTA: il processo per gli stampi superiore e inferiore è identico.- Spin coat un wafer di silicio pulito da 10 cm con fotoresiste negativo SU-8 2025 a 1.100 rpm per creare il primo strato da 60 μm. Dopo una cottura morbida a 65 °C per 3 min e 95 °C per 10 min su una piastra calda, esporre lo stampo utilizzando un allineatore senza maschera caricando il file di progettazione del pattern del canale centrale sul PC μPG 101. Quindi, procedere con la cottura post-esposizione a 65 °C per 3 min e a 95 °C per 10 min.
- Ruotare il secondo strato SU-8 2025 (40 μm) a 1.500 rpm ed esporre caricando il file CAD appropriato per il modello di canale della shell.
NOTA: le cotture morbide e post-esposizione erano simili al passaggio precedente. - Ruotare il terzo strato su SU-8 2025 a 1.400 giri / min per raggiungere un'altezza di 50 μm e ripetere il processo di cui sopra ma esporre le strutture per la fase dell'olio.
- Sviluppa lo stampo con tutti e tre gli strati in un unico passaggio immergendolo nello sviluppatore SU-8 fino a quando non viene rimosso tutto il fotoresist non esposto.
- Cuocere duramente lo stampo su una piastra calda a 160 °C per 10 minuti per migliorare l'adesione e sigillare piccole crepe che potrebbero apparire dopo lo sviluppo.
- Esporre lo stampo al clorotrimetilsilano per evitare il legame con l'elastomero nella fase successiva e posizionarlo in piastre di Petri da 15 cm fino all'uso.
- Preparare lo stampo del dispositivo di dissociazione nello stesso modo, come descritto nella Figura 1D e nella Figura 2B. Rivestire uno strato di fotoresiste SU-8 su un wafer di silicio, come descritto in precedenza nel passaggio 1.2.3, per ottenere strutture con l'altezza desiderata: 50 μm. Condurre la cottura morbida e post-esposizione, lo sviluppo e la cottura dura in modo simile al passaggio precedente.
NOTA: una serie di montanti di forma triangolare copriva l'intera camera, con la spaziatura tra i montanti che diminuiva man mano che la larghezza della camera diminuiva verso l'uscita. I montanti triangolari erano 200 μm per lato con un passo che andava da 400 μm (all'ingresso) a 30 μm (all'uscita). - Preparare gli stampi mediante litografia morbida utilizzando polidimetilsilossano (PDMS).
- Mescolare la base di elastomero PDMS e l'agente polimerizzante dell'elastomero in un rapporto 10:1 w/w in una centrifuga planetaria. Versare la miscela su entrambi gli stampi master di microincapsulazione e sullo stampo master di dissociazione per creare uno strato di 3-4 mm.
NOTA: Una miscela di 50 g di base di elastomero con 5 g di agente polimerizzante è sufficiente per coprire uno stampo principale con spessore di 3 mm. - Posizionare le piastre di Petri contenenti gli stampi in un essiccatore sottovuoto per 15 minuti per degassare il PDMS non polimerizzato.
- Spostare le piastre di Petri in forno e cuocere a 80 °C per un minimo di 60 min.
- Togliere gli stampi master dal forno e lasciarli raffreddare. Usando un coltello di precisione, tagliare con cura il PDMS seguendo la forma del wafer e staccare i pezzi PDMS dallo stampo master.
- Ritagliare le lastre PDMS tagliando i bordi di ciascun dispositivo con un bisturi, quindi perforare le porte fluidiche di ingresso / uscita nel dispositivo di dissociazione e solo nel dispositivo microfluidico superiore utilizzando aghi in acciaio inossidabile. Coprire i dispositivi con nastro adesivo per evitare contaminazioni.
NOTA: il calibro dell'ago è di 14 G e 15 G rispettivamente per le porte di ingresso e di uscita. - Per l'incollaggio, trattare i lati modellati dei pezzi PDMS superiore e inferiore con plasma O2 su un'incisore al plasma per 2 minuti.
- Allineare entrambe le parti PDMS sotto uno stereoscopio dopo aver aggiunto un sottile strato separatore di acqua distillata direttamente nei microcanali (2 μL).
- Posizionare il dispositivo PDMS allineato nel forno a 80 °C durante la notte per completare l'incollaggio e ripristinare il PDMS al suo stato idrofobo originale. Conservare i dispositivi fino a nuovo utilizzo.
NOTA: ciò si traduce in un dispositivo di messa a fuoco del flusso coassiale con tre diverse altezze di 120 μm per il nucleo, 200 μm per il guscio e 300 μm per i canali dell'olio. - Per utilizzare il dispositivo subito dopo il legame al plasma, iniettare con cura ma con fermezza 30 μL di soluzione di rivestimento idrofobo nei canali fluidici per ottenere un rivestimento idrofobo. Quindi, spurgare immediatamente l'aria nei canali fino a quando non si osservano residui della soluzione di rivestimento idrofobo nel dispositivo.
- Legare il dispositivo di dissociazione trattando prima il lato modellato del dispositivo e un vetro scorrevole pulito con plasma O2 per 2 minuti, quindi assemblarli per un'ulteriore polimerizzazione nel forno a 80 ° C durante la notte.
NOTA: i dispositivi possono essere conservati fino a nuovo utilizzo.
- Mescolare la base di elastomero PDMS e l'agente polimerizzante dell'elastomero in un rapporto 10:1 w/w in una centrifuga planetaria. Versare la miscela su entrambi gli stampi master di microincapsulazione e sullo stampo master di dissociazione per creare uno strato di 3-4 mm.
2. Preparazione delle soluzioni
- Soluzioni stock. In primo luogo, preparare soluzioni stock (soluzioni concentrate) che saranno diluite a concentrazioni più basse per l'uso effettivo.
NOTA: le soluzioni stock vengono utilizzate per risparmiare tempo di preparazione, conservare i materiali, ridurre lo spazio di stoccaggio e migliorare l'accuratezza durante la preparazione di una soluzione di lavoro in concentrazioni inferiori.- Preparare 30 mL di soluzione 2x core (16% PEG e 34% density gradient media): mescolare 4,8 g di 35 kDa PEG, 10,2 mL di density gradient media e 19,8 mL di DMEM/F12 media. Filtrare questa soluzione di base utilizzando un filtro a siringa da 0,22 μm.
- Preparare 50 ml di olio minerale con tensioattivo al 3%: mescolare 48,5 ml di olio minerale e 1,5 ml di tensioattivo. Conservare in condizioni sterili dopo la filtrazione attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm.
- Preparare 50 ml di olio minerale con tensioattivo allo 0,5%: mescolare 49,75 ml di olio minerale e 0,25 ml di tensioattivo. Mantenere in condizioni sterili.
- Preparare 1 M ditioteritolo (DTT): sciogliere 1,5425 g di DTT in 10 ml di acqua distillata. Mantenere in condizioni sterili.
- Preparare 1 M di trietanolamina (TEA): aggiungere 66,4 μL di TEA in 433,6 μL di acqua distillata. Mantenere in condizioni sterili.
- Preparare 1% Pluronic F127 (PF127): sciogliere 100 mg di PF127 in 10 ml di acqua distillata. Mantenere in condizioni sterili.
- Soluzioni di lavoro
- Preparare un'emulsione reticolante mescolando 4,5 mL di olio minerale con tensioattivo al 3% e 300 μL di 1 M DTT (rapporto 1:15). Vortice la soluzione per 2 min e sonicare per 45-60 min in un bagno ad ultrasuoni a 20 °C. Caricare questa soluzione su una siringa da 5 ml con un ago da 27 G.
NOTA: L'emulsione è generata dalla miscela sonicante olio/acqua. - Preparare la soluzione di olio schermante caricando l'olio minerale con tensioattivo allo 0,5% su una siringa da 5 ml con un ago da 27 G.
- Preparare la soluzione di guscio (8% p/v PEG-4-Mal e 15 mM TEA) aggiungendo 32 mg di PEG-4-Mal in 400 μL di 1x DPBS per formare una soluzione all'8% p/v e vorticare la soluzione per 2 min. Quindi, aggiungere 6 μL di 1 M TEA (concentrazione finale 15 mM TEA). Infine, centrifugare a 13.000 x g per 5 minuti attraverso un filtro di rotazione e tenerlo al buio sul bilanciere per 30 minuti. Quindi, caricare questa soluzione su una siringa da 1 mL con un ago da 27 G.
NOTA: Lasciare riposare il contenitore PEG-4-Mal a temperatura ambiente per 10 minuti prima di aprire il coperchio e soffiare il gas N2 per sostituire L'O2 con N2 prima di chiudere il coperchio. Vortex TEA prima di aggiungere alla soluzione.
- Preparare un'emulsione reticolante mescolando 4,5 mL di olio minerale con tensioattivo al 3% e 300 μL di 1 M DTT (rapporto 1:15). Vortice la soluzione per 2 min e sonicare per 45-60 min in un bagno ad ultrasuoni a 20 °C. Caricare questa soluzione su una siringa da 5 ml con un ago da 27 G.
- Preparare la sospensione cellulare in soluzione di base
- Trattare le hPSC con tripsina per 5-10 minuti a 37 °C. Quindi, raccoglili dai piatti. Spegnere la tripsina con il mezzo dopo il distacco cellulare, quindi trasferire le cellule in un tubo conico da 15 ml.
- Centrifugare la sospensione di celle sfuse (400 x g, 5 min). Aspirare accuratamente il surnatante e quindi risospesare il pellet cellulare utilizzando un volume minimo di terreno di crescita. Contare le celle utilizzando un contatore di celle automatizzato.
NOTA: le aliquote cellulari tipiche contengono 12-20 x 106 celle e sono sufficienti per produrre 400 μL della soluzione del nucleo. - Prelevare 12-20 x 106 celle dalla sospensione di massa cellulare e centrifugare la sospensione cella/media (400 x g, 5 min).
- Aspirare accuratamente il mezzo dal pellet cellulare. Quindi, aggiungere 200 μL di mezzi e 200 μL di 2x soluzione PEG (concentrazione finale 30-50 x 106 celle/mL) e mescolare delicatamente.
NOTA: Basse concentrazioni cellulari (meno di 20 x 106 cellule/ml) hanno provocato molte capsule vuote. - Aggiungere 30 μL di PF127 all'1% alla soluzione.
- Inserire una micro barra agitatrice (2 mm x 7 mm) in una siringa da 1 mL, quindi caricare la soluzione del nucleo contenente la cella sulla siringa con un ago da 27 G. Mantenere la soluzione fredda con ghiaccio durante l'intero processo di incapsulamento.
3. Configurazione sperimentale
- Posizionare il dispositivo a goccia PDMS incollato, quattro pezzi di microtubi di ingresso lunghi 20 cm e un pezzo di microtubi di ingresso lunghi 5 cm (0,38 mm ID x 1,1 mm O.D.), un pezzo di tubo di uscita da 10 cm (0,5 mm ID x 1,5 mm O.D.) e sei pezzi di tubi di raccordo da 0,5 cm (1 mm ID x 1,8 mm O.D.) sotto una sorgente luminosa germicida (tipicamente integrata negli armadi di sicurezza biologica) e sterilizzare per 30 Min.
- Utilizzare una pinza per inserire il tubo nelle porte di ingresso fluidiche e nelle porte di dissociazione.
- Utilizzare i tre pezzi di microtubi di ingresso lunghi 20 cm per il guscio, l'olio, gli ingressi di emulsione reticolante e un pezzo per l'ingresso del dispositivo di dissociazione. Quindi, inserire l'estremità opposta dei tubi all'ago della siringa con la soluzione corrispondente. Nel frattempo, collegare l'ingresso principale del dispositivo microfluidico e l'uscita del dispositivo di dissociazione con un microtubo di 5 cm (Figura 1C).
NOTA: i microtubi di ingresso devono essere fissati saldamente all'interno dei tubi di raccordo, che sono stati inseriti nell'ultimo passaggio. - Inserire un tubo di uscita nella porta di uscita fluidica e posizionare l'estremità opposta in un serbatoio di raccolta.
- Posizionare il dispositivo su uno stadio del microscopio e collegare il tubo per evitare di muoversi. Allineare e focalizzare il microscopio sull'ugello del dispositivo per l'ispezione del flusso.
- Posizionare ogni siringa su diverse pompe a siringa e fissarla correttamente (Figura 1B). Programmare ogni pompa secondo i protocolli del produttore alle seguenti portate: nucleo (3-5 μL/min), guscio (3-5 μL/min), olio schermante (20-80 μL/min) e olio reticolante (40-60 μL/min). Avviare il flusso in tutte le pompe.
- Attendere che ogni fluido entri nel dispositivo e riempire i canali mentre si spinge fuori l'aria rimanente.
NOTA: se c'è una grande quantità di aria nel tubo di ingresso, aumentare temporaneamente ogni portata fino a quando l'aria non viene completamente rimossa. Tieni presente che una portata eccessiva potrebbe portare al fallimento del legame PDMS-PDMS. - Quando la formazione della capsula è stabilizzata (Figura 3), posizionare l'estremità opposta del tubo di raccolta su un nuovo tubo conico con 5 mL di mezzo mTeSR.
NOTA: Il mezzo contiene 10 μM di inibitore ROCK, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina. - Dopo aver raccolto un numero sufficiente di capsule, incubare a 37 °C con il 5% di CO2 per 10 minuti. Le capsule che risiedono nella fase oleosa saranno nella parte superiore del tubo (vedere Figura 4A). Picchiettando delicatamente sul tubo le capsule si sedimentano sul fondo. Dopo questo, la maggior parte dell'olio e dei mezzi può essere aspirata.
- Raccogliere le capsule dal fondo del tubo conico, posizionarle su un colino cellulare (dimensione dei pori di 100 μm) e lavare con abbondanti quantità di mezzi. Quindi, raccogliere le microcapsule utilizzando 2 mL di terreno in una piastra di coltura a 6 pozzetti facendo scorrere il fluido attraverso il filtro mentre viene invertito sopra la piastra del pozzo (vedere la Figura 4A).
4. Coltura e analisi di hPSC in microcapsule
- Cultura di base
- Incubare le capsule di cellule staminali in un piatto di coltura a 6 pozzetti a 37 °C con il 5% di CO2.
- Cambiare i supporti a giorni alterni raccogliendo le capsule su un filtro filtrante cellulare, lavandole con mezzi in eccesso e riutilizzandole in un nuovo pozzo in piastre a 6 pozzetti con 2 mL di supporto come è stato fatto nel passaggio 3.10.
- Coltivare le capsule per almeno 10 giorni.
- Eseguire il test vivo/morto per determinare la vitalità delle cellule staminali incapsulate.
- Scongelare soluzioni di saggio vivo/morto (ethidium homodimer-1 e calcein AM).
- Aggiungere 4 μL dell'omodimero-1 all'etidio da 2 μM e 1 μL delle soluzioni di calceina AM da 4 μM a 2 ml di DPBS sterile. Vortice per garantire la miscelazione completa.
- Raccogliere circa 100 microcapsule su un filtro cellulare e risciacquarle con DPBS sterile per consentire la diffusione del mezzo dalle capsule.
- Raccoglierli nuovamente in una piastra di coltura a 12 pozzetti utilizzando 1 mL della soluzione preparata al punto 4.2.2. Incubare a 37 °C per 20 min.
- Visualizza le cellule al microscopio a fluorescenza.
NOTA: la vitalità cellulare viene quantificata calcolando la percentuale di cellule vive, che vengono visualizzate come verdi, tra il numero totale di cellule.
- Caratterizzazione delle dimensioni sferoidi.
- Quando lo si desidera, posizionare la piastra del pozzo con microcapsule al microscopio e misurare il diametro degli sferoidi mostrati sul relativo software con apposite barre di scala.
- Misurare e analizzare la dimensione dello sferoide.
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Representative Results
Seguendo il protocollo sopra menzionato, il lettore sarà in grado di fabbricare dispositivi microfluidici e produrre microcapsule portatrici di cellule. La Figura 3A mostra esempi di microcapsule ottimali e non ottimali fabbricate utilizzando la generazione di goccioline microfluidiche. Diverse formulazioni di PEG-4-Mal hanno portato a capsule di morfologia variabile: le capsule rugose erano associate a scarsa gelificazione, bassa integrità meccanica e non resistevano alla coltivazione in un bioreattore agitato. Le capsule lisce osservate con un contenuto di PEG di >6% rappresentavano la morfologia della capsula desiderata ed erano abbastanza robuste per la coltivazione cellulare. La struttura del guscio del nucleo è stata confermata dall'incorporazione di microsfere nel nucleo e porzioni fluorescenti nel guscio delle microcapsule. L'aggregazione di perline al centro delle capsule, come si vede nella Figura 3B , è stata usata come indicazione che il nucleo era acquoso e che le perline erano libere di muoversi. L'anulus fluorescente osservato nella Figura 3C ha indicato la presenza di un guscio di idrogel ed è stato utilizzato per determinare lo spessore del guscio. Raccomandiamo agli utenti di utilizzare l'incorporazione di microsfere e l'etichettatura fluorescente nelle prime fasi dello stabilire il processo di incapsulamento.
Una volta stabilito il processo di incapsulamento, si può passare all'incapsulamento delle hPSC. Mentre questo protocollo descrive l'incapsulamento delle cellule H9, abbiamo usato una strategia simile per incapsulare un'altra linea hESC (HUES-8) e una linea iPSC (1016). 7
Mentre l'incapsulamento può essere effettuato utilizzando solo il dispositivo di incapsulamento, abbiamo notato che le hPSC tendevano a raggrupparsi nel sistema con conseguente incapsulamento non uniforme o occupazione della capsula. Per affrontare questa sfida, abbiamo progettato un dispositivo di dissociazione o filtrazione e lo abbiamo posizionato a monte del dispositivo di incapsulamento. Questo dispositivo di dissociazione comprendeva un canale di flusso con una serie di montanti a forma di triangolo misurati 200 μm per lato e con passo compreso tra 400 μm all'ingresso e 30 μm all'uscita in modo tale che i grumi siano trattenuti o spezzati prima di entrare nel dispositivo di incapsulamento (cfr. figura 1D)7. L'uso del dispositivo di dissociazione consente di migliorare significativamente l'uniformità degli sferoidi e aumentare l'occupazione cellulare delle capsule dal 57% al >90%7.
La Figura 4B,C descrive i risultati rappresentativi di un'esecuzione di incapsulamento. Come si può vedere da queste immagini, le cellule H9 hanno un'elevata vitalità con >95% di vitalità raggiunta di routine durante le corse di incapsulamento. La Corte ha confrontato il tasso di crescita (cfr. Figura 4B,C) e il potenziale di differenziazione degli sferoidi incapsulati rispetto a quelli non incapsulati7 e ha determinato che il processo di incapsulamento non ha effetti negativi sulle hPSC. D'altra parte, ci sono diversi vantaggi nell'incapsulare le hPSC. Gli sferoidi incapsulati sono facili da maneggiare e possono essere erogati/distribuiti in piastre di microtitolazione per lo sviluppo di protocolli di differenziazione o terapie di test. Il nostro laboratorio è interessato a utilizzare microcapsule come vettori di cellule staminali per la coltivazione in sospensione in bioreattori agitati e ha dimostrato che il guscio di idrogel offre protezione contro i danni da taglio in talicolture 7. Questa è un'ulteriore strada che stiamo perseguendo da noi è nella creazione di microcapsule bioattive in cui il guscio di idrogel può essere caricato con fattori di crescita per la consegna locale e continua di segnali induttivi durante la differenziazione.
Figura 1: Fabbricazione di microcapsule nucleo-guscio. (A) Il dispositivo microfluidico per la generazione di capsule è costituito da quattro canali di ingresso (nucleo, guscio, olio e olio reticolante) e un canale serpentino che conduce a un tubo di raccolta. Il dispositivo è fabbricato in modo tale che il nucleo, il guscio e i canali dell'olio siano rispettivamentealti 120 μm (H 1),200 μm (H 2) e300 μm (H 3). L'inserto rappresenta una vista della sezione trasversale all'ugello - la giunzione tra flussi acquosi e oleosi. Questa vista della sezione trasversale è inclinata di 90° per offrire al lettore una migliore visione dei canali di flusso coassiali. Una rappresentazione 3D del processo di fabbricazione della microcapsula nucleo-guscio illustra come il flusso coassiale viene generato a monte della giunzione di messa a fuoco del flusso per produrre la struttura della microcapsula nucleo-guscio. L'emulsione si ottiene esponendo goccioline acquose a due flussi di olio, il primo dei quali è progettato per stabilizzare le goccioline e il secondo per fornire il reticolante DTT, che reagisce con PEG-4-Mal. Questa cifra è stata modificata dal riferimento12. Diritto d'autore 2019, American Chemical Society. (B) Configurazione sperimentale del sistema di incapsulamento che mostra le posizioni delle pompe a siringa, dei tubi, dei dispositivi microfluidici e del tubo di raccolta delle capsule. (C) Un'immagine del sistema di incapsulamento, che consiste in dispositivi di dissociazione e incapsulamento in una sequenza. (D) Progettazione del dispositivo di dissociazione microfluidica utilizzato per evitare che aggregati cellulari di grandi dimensioni penetrino nel dispositivo di microincapsulazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fabbricazione di dispositivi microfluidici utilizzati per l'incapsulamento. (A) Fabbricazione del dispositivo di incapsulamento. Tre strati di fotoresist SU-8 sono stati rivestiti e foto-modellati per generare canali di nucleo, guscio e olio con altezze diverse. I canali principali hanno una larghezza di 220 μm che si restringe alla giunzione della capsula a 135 μm. I canali per tutte le fasi seguono lo stesso principio: i canali del guscio e dell'olio iniziano con una larghezza di 500 μm, restringendosi alla giunzione a 220 μm e l'olio di schermatura inizia a 500 μm restringendosi a 270 μm. La serpentina di uscita ha una larghezza di 1,5 mm e una lunghezza di ~ 55 mm. I pezzi PDMS superiore e inferiore sono stati quindi allineati e legati al plasma. (B) Fabbricazione del dispositivo di dissociazione. Uno strato di fotoresist SU-8 è stato rivestito di spin e foto modellato per generare canali di dissociazione. Il pezzo PDMS è stato quindi legato al plasma con vetrino. Il dispositivo di dissociazione è costituito da una piccola camera con un'altezza di 30 μm, una lunghezza di 16,5 mm e una larghezza di 5 mm all'ingresso e 1,7 mm all'uscita. Ha strutture a forma di triangolo (200 μm, equilatere) che sono separate l'una dall'altra da 420 μm dell'ingresso e si avvicinano sulla strada per l'uscita, con una separazione di 50 μm nell'ultima fila. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Caratterizzazione di microcapsule. (A) Differenze nella morfologia della capsula in funzione del contenuto di PEG-4-Mal nel guscio. Le capsule lisce con bordi luminosi sono associate all'integrità meccanica desiderata. (B) Conferma del nucleo acquoso delle microcapsule. Le microsfere intrappolate sono libere di muoversi nel nucleo acquoso e aggregarsi al centro delle microcapsule. (C) Conferma della struttura del guscio centrale incorporando il PEG marcato con Rhodamine B nel guscio delle microcapsule. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Incapsulamento delle hPSC. (A) Le microcapsule nella fase oleosa sono raccolte in un tubo conico riempito con mezzi. Dopo che le microcapsule sono state fatte depositare sul fondo del tubo, l'olio e il fluido vengono aspirati, le microcapsule vengono lavate e quindi trasferite in una piastra a 6 pozzetti per la coltivazione. (B) Colorazione viva/morta 6 ore dopo l'incapsulamento delle cellule H9. L'immagine superiore è stata scattata a 10x e l'immagine inferiore a 20x. (C) Immagini che confrontano le dimensioni degli sferoidi che cambiano nel tempo per le cellule H9 in capsule e in piastre di coltura 3D commerciali (immagini in basso). (D) Quantificazione del diametro dello sferoide che aumenta per le hPSC nelle microcapsule e nelle piastre di coltura 3D standard durante 7 giorni nei supporti H9. Analisi statistica -t-test, p < 0,05, n = 20. Barra della scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il processo di incapsulamento qui descritto si traduce nella formazione riproducibile di sferoidi hPSC. Il formato a microcapsula facilita l'erogazione di sferoidi nei pozzetti di una piastra di microtitolazione per esperimenti volti a migliorare/ottimizzare i protocolli di differenziazione o testare terapie. Gli sferoidi a cellule staminali incapsulati possono anche essere utilizzati in colture di sospensioni in cui il guscio di idrogel protegge le cellule dai danni indotti dal taglio7.
Ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo. È importante mantenere le portate dei flussi di nucleo, guscio e olio entro l'intervallo descritto nella sezione Protocollo. Se la portata del guscio è troppo bassa, il flusso diventa instabile, con conseguente capsule distorte e meccanicamente instabili. Un incapsulamento cellulare di successo dovrebbe essere simile alle microcapsule mostrate nella Figura 4C. Le microcapsule dovrebbero avere un diametro simile e avere un numero comparabile di cellule intrappolate nel nucleo. L'aggregazione di singole cellule in sferoidi avviene tipicamente entro 48 ore e la mancanza di formazione di sferoidi a 72 ore è un segnale di avvertimento. Una ragione per la mancanza di formazione di sferoidi potrebbe essere che le molecole viscose nel nucleo non si sciacquano abbastanza rapidamente attraverso il guscio dell'idrogel. Abbiamo riscontrato questo scenario durante la regolazione della viscosità della soluzione del nucleo utilizzando polimeri ad alto peso molecolare come la carbossimetilcellulosa (MW 250 kD). Si possono incapsulare microsfere (vedi Figura 3B) per verificare se questi oggetti delle dimensioni di una cellula sono liberi di muoversi intorno al nucleo e quanto rapidamente i componenti del nucleo fuoriescono. La mancanza di formazione di sferoidi è stata riscontrata anche da noi quando abbiamo usato concentrazioni di PEG-4-Mal di >8% p / v. In questo scenario, la porosità e la diffusività del guscio di idrogel sono diminuite e gli elementi ad alta viscosità nel nucleo non fuoriescono abbastanza rapidamente da consentire alle cellule di formarsi in aggregati. È concepibile che la qualità di PEG-4-Mal possa variare da lotto a lotto o produttore. Pertanto, potrebbe essere necessario un certo aggiustamento della concentrazione del polimero nel guscio. Ancora una volta, il metodo di incorporazione delle perline dovrebbe rivelare quanto rapidamente i componenti viscosi nel nucleo vengono spostati dalle molecole d'acqua. Nella nostra esperienza, questo dovrebbe avvenire entro 3 ore dal trasferimento delle microcapsule nell'ambiente acquoso.
Il protocollo di incapsulamento qui descritto ha funzionato bene per diverse linee hPSC7, epatociti primari10 e più linee cellulari tumorali (risultati non pubblicati). Tuttavia, abbiamo incontrato difficoltà a formare sferoidi dopo l'incapsulamento di epatociti derivati da cellule staminali (sc) e cellule sc-β. La risoluzione dei problemi con microsfere incapsulate ha rivelato che i componenti viscosi sono stati rapidamente eluiti dal nucleo e che le cellule erano libere di muoversi e formare contatti cellula-cellula. Un'ulteriore risoluzione dei problemi ha comportato la titolazione della concentrazione del reticolante di-tiolo DTT (presente nella fase oleosa) da 66 mM a 10 mM. La formazione di sferoidi per sc-epatociti e cellule β si è verificata a questa concentrazione inferiore di DTT. Pertanto, l'utente potrebbe prendere in considerazione l'ottimizzazione della concentrazione del reticolante, ma solo se altri passaggi per la risoluzione dei problemi sopra elencati non hanno avuto successo. Troviamo che la concentrazione di DTT è fondamentale per mantenere l'integrità meccanica delle microcapsule con DTT 66 mM, con conseguente microcapsule meccanicamente robuste e non tossiche per la stragrande maggioranza dei tipi di cellule utilizzati fino ad oggi.
Un certo numero di strategie per la creazione di costrutti di cellule staminali 3D sono state descritte in letteratura. I vantaggi della formazione di costrutti di cellule staminali all'interno di microcapsule core-shell sono molteplici. Una volta incapsulati, gli sferoidi possono essere maneggiati con facilità con capsule di idrogel che forniscono protezione contro i danni da taglio. Gli sferoidi incapsulati possono essere coltivati in sospensione con agitazione vigorosa senza danneggiare le cellule staminali.
Esistono diverse strade per espandere le capacità delle microcapsule. Il nostro team ha precedentemente descritto l'uso di idrogel contenenti eparina per l'incapsulamento di epatociti e cellule staminali 8,12 e sta attualmente sviluppando microcapsule bioattive core-shell contenenti eparina che fungono da depositi per lo stoccaggio e il rilascio locale di segnali induttivi (GF) alle cellule staminali. Tali microcapsule possono aiutare a ridurre l'uso di GF costosi migliorando al contempo i risultati della differenziazione. Le microcapsule possono essere ulteriormente migliorate incorporando proteine ECM nel nucleo modulando così il microambiente delle cellule staminali. Le microcapsule core-shell possono essere rese degradabili per facilitare il recupero degli sferoidi hPSC13,14. Nel complesso, le microcapsule core-shell rappresentano una tecnologia di piattaforma che può essere modificata e migliorata per soddisfare le esigenze di uno specifico protocollo di differenziazione delle cellule staminali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato in parte dalle sovvenzioni del Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) e NIH (DK107255).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
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