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Bioengineering

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल गोलाकार ले जाने वाले कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल का माइक्रोफ्लुइडिक फैब्रिकेशन

Published: October 13, 2021 doi: 10.3791/62944
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic
* These authors contributed equally

Summary

यह आलेख एक सह-अक्षीय प्रवाह फोकसिंग डिवाइस का उपयोग करके मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (hPSCs) के encapsulation का वर्णन करता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह माइक्रोफ्लुइडिक एनकैप्सुलेशन तकनीक एचपीएससी गोलाकार के कुशल गठन को सक्षम बनाती है।

Abstract

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) की त्रि-आयामी (3 डी) या गोलाकार संस्कृतियां बेहतर भेदभाव परिणामों और स्केलेबिलिटी के लाभ प्रदान करती हैं। इस पेपर में, हम एचपीएससी गोलाकार के मजबूत और पुनरुत्पादक गठन के लिए एक रणनीति का वर्णन करते हैं जहां एक सह-अक्षीय प्रवाह फोकसिंग डिवाइस का उपयोग कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल के अंदर एचपीएससी को फंसाने के लिए किया जाता है। कोर समाधान में एचपीएससी का एकल सेल निलंबन शामिल था और उच्च आणविक भार पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) (पीईजी) और घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया को शामिल करके चिपचिपा बनाया गया था। शेल स्ट्रीम में PEG-4 आर्म-मैलिमाइड या PEG-4-Mal शामिल थे और दो लगातार तेल जंक्शनों की ओर कोर स्ट्रीम के साथ बहते थे। ड्रॉपलेट गठन पहले तेल जंक्शन पर शेल समाधान के साथ कोर के चारों ओर खुद को लपेटने के साथ हुआ। इन बूंदों के लिए एक di-thiol crosslinker (1,4-dithiothreitol या DTT) पेश करके दूसरे तेल जंक्शन पर शेल का रासायनिक क्रॉसलिंकिंग हुआ। क्रॉसलिंकर क्लिक रसायन विज्ञान के माध्यम से मैलिमाइड कार्यात्मक समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता है, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोकैप्सूल के चारों ओर एक हाइड्रोजेल खोल का गठन होता है। हमारी encapsulation प्रौद्योगिकी प्रति सेकंड 10 कैप्सूल की दर से 400 μm व्यास कैप्सूल का उत्पादन किया। परिणामी कैप्सूल में एक हाइड्रोजेल खोल और एक जलीय कोर था जिसने एकल कोशिकाओं को तेजी से समुच्चय में इकट्ठा करने और गोलाकार बनाने की अनुमति दी थी। एनकैप्सुलेशन की प्रक्रिया ने एचपीएससी की व्यवहार्यता को प्रतिकूल रूप से प्रभावित नहीं किया, जिसमें >95% व्यवहार्यता 3 दिनों के बाद एनकैप्सुलेशन देखी गई। तुलना के लिए, ठोस जेल सूक्ष्म कणों (एक जलीय कोर के बिना) में encapsulated hPSCs गोलाकार नहीं बनाते थे और encapsulation के 3 दिन बाद <50% व्यवहार्यता थी। कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल के अंदर एचपीएससी का गोलाकार गठन एनकैप्सुलेशन के बाद 48 घंटे के भीतर हुआ, जिसमें गोलाकार व्यास सेल इनोक्यूलेशन घनत्व का एक कार्य था। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल में वर्णित माइक्रोफ्लुइडिक एनकैप्सुलेशन तकनीक एचपीएससी एनकैप्सुलेशन और गोलाकार गठन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल थी।

Introduction

इस संस्कृति प्रारूप 1,2,3 द्वारा प्रदान की गई बेहतर प्लूरिबिलिटी और भेदभाव क्षमता के कारण मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी)की 3 डी संस्कृतियों में काफी रुचि है। hPSCs आमतौर पर बायोरिएक्टर, microwells, hydrogels, और बहुलक scaffolds 4,5,6 के माध्यम से गोलाकार या अन्य 3 डी संस्कृति प्रारूपों में गठित कर रहे हैं। Encapsulation गोलाकार में एकल hPSCs के आयोजन के लिए एक और साधन प्रदान करता है। एक बार encapsulated hPSC गोलाकार आसानी से संभाला जा सकता है और भेदभाव, रोग मॉडलिंग, या दवा परीक्षण प्रयोगों के लिए माइक्रोटिटर प्लेटों में स्थानांतरित किया जा सकता है। एक हाइड्रोजेल परत में hPSCs encasing भी कतरनी क्षति के खिलाफ कोशिकाओं की रक्षा करता है और सरगर्मी 7 की उच्च दर पर एक बायोरिएक्टर में गोलाकार संस्कृति की अनुमति देताहै।

स्टेम सेल encapsulation के लिए हमारी पद्धति समय के साथ विकसित हुई। सबसे पहले, हमने ठोस हाइड्रोजेल सूक्ष्म कणों पर ध्यान केंद्रित किया और माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (mESCs) 8 की सफल encapsulation और खेती का प्रदर्शन किया। हालांकि, यह ध्यान दिया गया था कि मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) में कम व्यवहार्यता थी जब इस तरह के हाइड्रोजेल सूक्ष्म कणों में समझाया गया था, संभवतः इन कोशिकाओं को एनकैप्सुलेशन के बाद सेल-सेल संपर्कों को फिर से स्थापित करने की अधिक आवश्यकता के कारण। हमने तर्क दिया कि विषम माइक्रोकैप्सूल, एक जलीय कोर रखने वाले, कोशिकाओं के encapsulation के लिए बेहतर अनुकूल हो सकते हैं जो सेल-सेल संपर्कों की तेजी से पुन: स्थापना पर भरोसा करते हैं। जलीय कोर / हाइड्रोजेल शेल माइक्रोकैप्सूल बनाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस पर ध्यान केंद्रित करने वाले सह-अक्षीय प्रवाह की अवधारणा को He et al.9 से अनुकूलित किया गया था, लेकिन मूल दृष्टिकोण में नियोजित एल्गिनेट के बजाय, एक पीईजी-आधारित हाइड्रोजेल को खोल में शामिल किया गया था। हमने पहली बार कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल्स10 में प्राथमिक हेपेटोसाइट के सफल एनकैप्सुलेशन और गोलाकार गठन का प्रदर्शन किया और हाल ही में एचईएस और आईपीएस कोशिकाओं केएनकैप्सुलेशन का वर्णन किया। जैसा कि चित्रा 1 ए में उल्लिखित है, कैप्सूल को एक प्रवाह फोकसिंग डिवाइस में गढ़ा जाता है जहां शेल और कोर प्रवाह धाराएं तेल चरण में इजेक्शन से पहले साइड-टू-साइड से सह-अक्षीय प्रवाह में संक्रमण करती हैं। कोर प्रवाह में कोशिकाएं और एडिटिव्स होते हैं जो समाधान की चिपचिपाहट को बढ़ाते हैं (गैर-प्रतिक्रियाशील PEG MW 35kD और iodixanol - वाणिज्यिक नाम OptiPrep) जबकि शेल स्ट्रीम में प्रतिक्रियाशील अणु (PEG-4-Mal) होते हैं। निरंतर सह-अक्षीय प्रवाह धारा को बूंदों में विभाजित किया जाता है जो कोर-शेल आर्किटेक्चर को बनाए रखते हैं। कोर-शेल संरचना को डी-थिओल क्रॉसलिंकर (डीटीटी) के संपर्क में आने से स्थायी बनाया जाता है, जो क्लिक रसायन विज्ञान के माध्यम से PEG-4-Mal के साथ प्रतिक्रिया करता है और परिणामस्वरूप एक पतली (~ 10 μm) हाइड्रोजेल त्वचा या खोल का गठन होता है। इमल्शन टूटने के बाद और कैप्सूल को एक जलीय चरण में स्थानांतरित कर दिया जाता है, पीईजी के अणु कोर से फैलते हैं और पानी के अणुओं द्वारा प्रतिस्थापित किए जाते हैं। इसके परिणामस्वरूप जलीय कोर और हाइड्रोजेल शेल माइक्रोकैप्सूल होते हैं।

नीचे दिए गए चरण-दर-चरण निर्देश हैं कि माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण कैसे बनाएं, कोशिकाओं को कैसे तैयार किया जाए, और एचपीएससी के एनकैप्सुलेशन को कैसे पूरा किया जाए।

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Protocol

1. डिवाइस निर्माण

  1. CAD सॉफ़्टवेयर10,11 का उपयोग करके माइक्रोएनकैप्सुलेशन डिवाइस और पृथक्करण डिवाइस के लिए डिज़ाइन बनाएं।
  2. स्पिन-कोट एक सिलिकॉन वेफर (चित्रा 2 ए) पर एसयू -8 फोटोरेसिस्ट की तीन परतों को अनुक्रमिक रूप से वांछित ऊंचाइयों के साथ संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए: 60, 100, और 150 μm।
    नोट:: ऊपर और नीचे molds के लिए प्रक्रिया समान है।
    1. स्पिन कोट पहले 60 μm परत बनाने के लिए 1,100 rpm पर SU-8 2025 नकारात्मक photoresist के साथ एक साफ 10 सेमी सिलिकॉन वेफर। एक गर्म प्लेट पर 3 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक नरम सेंकना के बाद, μPG 101 पीसी पर कोर चैनल पैटर्न की डिजाइन फ़ाइल अपलोड करके एक मुखौटा रहित संरेखक का उपयोग करके मोल्ड को बेनकाब करें। फिर, 3 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर और 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर पोस्ट-एक्सपोजर बेक के साथ आगे बढ़ें।
    2. स्पिन कोट दूसरी SU-8 2025 परत (40 μm) 1,500 rpm पर और शेल चैनल पैटर्न के लिए उपयुक्त सीएडी फ़ाइल अपलोड करके बेनकाब।
      नोट: नरम और पोस्ट-एक्सपोज़र बेक पिछले चरण के समान थे।
    3. स्पिन कोट 50 μm ऊंचाई प्राप्त करने के लिए 1,400 आरपीएम पर तीसरी SU-8 2025 परत और उपरोक्त प्रक्रिया को दोहराने के लिए लेकिन तेल चरण के लिए संरचनाओं को उजागर करते हैं।
    4. SU-8 डेवलपर में पनडुब्बी द्वारा एक ही चरण में सभी तीन परतों के साथ मोल्ड विकसित करें जब तक कि सभी अप्रकाशित फोटोरेसिस्ट को हटा नहीं दिया जाता है।
    5. आसंजन में सुधार करने और विकास के बाद दिखाई देने वाली मामूली दरारों को सील करने के लिए 10 मिनट के लिए 160 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर मोल्ड को हार्ड बेक करें।
    6. अगले चरण में इलास्टोमर बंधन से बचने के लिए क्लोरोट्रिमिथाइलसिलेन के लिए मोल्ड को उजागर करें और उपयोग करने तक इसे 15 सेमी पेट्री व्यंजनों में रखें।
  3. पृथक्करण डिवाइस मोल्ड को उसी तरह से तैयार करें, जैसा कि चित्र 1D और चित्र2B में वर्णित है। स्पिन कोट एक सिलिकॉन वेफर पर SU-8 photoresist की एक परत, जैसा कि पहले चरण 1.2.3 में वर्णित है, वांछित ऊंचाई के साथ संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए: 50 μm। नरम और पोस्ट-एक्सपोज़र बेक, विकास, और पिछले चरण के समान हार्ड बेक का संचालन करें।
    नोट: त्रिकोणीय आकार के पदों की एक सरणी ने पूरे कक्ष को कवर किया, जिसमें कक्ष की चौड़ाई आउटलेट की ओर कम होने के साथ-साथ पदों के बीच की रिक्ति कम हो गई। त्रिभुज पोस्ट 400 μm (इनलेट पर) से 30 μm (आउटलेट पर) तक की पिच के साथ प्रति पक्ष 200 μm थे।
  4. polydimethylsiloxane (PDMS) का उपयोग कर नरम लिथोग्राफी द्वारा molds तैयार करें।
    1. एक ग्रह सेंट्रीफ्यूज में 10: 1 डब्ल्यू / डब्ल्यू अनुपात में पीडीएमएस इलास्टोमर बेस और इलास्टोमर इलाज एजेंट को मिलाएं। दोनों microencapsulation मास्टर molds और पृथक्करण मास्टर मोल्ड पर मिश्रण डालो एक 3-4 मिमी परत बनाने के लिए.
      नोट: इलाज एजेंट के 5 ग्राम के साथ elastomer आधार के 50 ग्राम का एक मिश्रण 3 मिमी मोटाई के साथ एक मास्टर मोल्ड को कवर करने के लिए पर्याप्त है।
    2. 15 मिनट के लिए एक वैक्यूम desiccator में molds युक्त पेट्री व्यंजन जगह-गैस uncured PDMS डी गैस.
    3. पेट्री व्यंजनों को एक ओवन में ले जाएं और कम से कम 60 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना।
    4. ओवन से मास्टर मोल्ड्स को हटा दें और उन्हें ठंडा करने की अनुमति दें। एक परिशुद्धता चाकू का उपयोग करते हुए, वेफर के आकार के बाद पीडीएमएस को सावधानीपूर्वक काटें और मास्टर मोल्ड से पीडीएमएस टुकड़ों को छील लें।
    5. एक स्केलपेल के साथ प्रत्येक डिवाइस के किनारों को ट्रिम करके पीडीएमएस स्लैब को काट लें, फिर पृथक्करण डिवाइस में इनलेट / आउटलेट फ्लुइडिक पोर्ट को पंच करें और केवल स्टेनलेस स्टील सुइयों का उपयोग करके शीर्ष माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में। संदूषण से बचने के लिए जादू टेप के साथ उपकरणों को कवर करें।
      नोट: सुई गेज क्रमशः इनलेट और आउटलेट पोर्ट के लिए 14 जी और 15 जी है।
    6. बंधन के लिए, 2 मिनट के लिए प्लाज्मा etcher पर O2 प्लाज्मा के साथ ऊपर और नीचे PDMS टुकड़ों के पैटर्न वाले पक्षों का इलाज करें।
    7. माइक्रोचैनल (2 μL) में सीधे आसुत पानी की एक पतली अलग परत जोड़ने के बाद दोनों पीडीएमएस भागों को स्टीरियोस्कोप के तहत संरेखित करें।
    8. बॉन्डिंग को पूरा करने और पीडीएमएस को अपने मूल हाइड्रोफोबिक राज्य में बहाल करने के लिए ओवन में रातभर 80 डिग्री सेल्सियस पर संरेखित पीडीएमएस डिवाइस रखें। उपकरणों को आगे के उपयोग तक संग्रहीत करें।
      नोट: यह कोर के लिए 120 μm, खोल के लिए 200 μm, और तेल चैनलों के लिए 300 μm की तीन अलग-अलग ऊंचाइयों के साथ एक समाक्षीय प्रवाह-फोकसिंग डिवाइस में परिणाम है।
    9. प्लाज्मा बॉन्डिंग के ठीक बाद डिवाइस का उपयोग करने के लिए, हाइड्रोफोबिक कोटिंग को प्राप्त करने के लिए हाइड्रोफोबिक कोटिंग समाधान के 30 μL को तरल चैनलों में सावधानीपूर्वक लेकिन दृढ़ता से इंजेक्ट करें। फिर, तुरंत चैनलों में हवा को शुद्ध करें जब तक कि डिवाइस में हाइड्रोफोबिक कोटिंग समाधान का कोई अवशेष नहीं देखा जाता है।
    10. पहले डिवाइस के पैटर्न वाले पक्ष और 2 मिनट के लिए ओ2 प्लाज्मा के साथ एक साफ स्लाइड ग्लास का इलाज करके पृथक्करण डिवाइस को बॉन्ड करें, और फिर उन्हें रात भर 80 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में आगे के इलाज के लिए इकट्ठा करें।
      नोट: उपकरणों को आगे के उपयोग तक संग्रहीत किया जा सकता है।

2. समाधान की तैयारी

  1. स्टॉक समाधान. सबसे पहले, स्टॉक समाधान (केंद्रित समाधान) तैयार करें जो वास्तविक उपयोग के लिए कम सांद्रता में पतला हो जाएगा।
    नोट: स्टॉक समाधान का उपयोग तैयारी के समय को बचाने, सामग्री को संरक्षित करने, भंडारण स्थान को कम करने और कम सांद्रता में एक कामकाजी समाधान तैयार करते समय सटीकता में सुधार करने के लिए किया जाता है।
    1. 2x कोर समाधान (16% PEG और 34% घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया) के 30 mL तैयार करें: 35 kDa PEG के 4.8 g, घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया के 10.2 mL, और DMEM / F12 मीडिया के 19.8 mL मिश्रण। एक 0.22 μm सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग कर इस कोर समाधान फ़िल्टर।
    2. 3% surfactant के साथ खनिज तेल के 50 मिलीलीटर तैयार करें: खनिज तेल के 48.5 मिलीलीटर और surfactant के 1.5 मिलीलीटर मिश्रण। एक 0.22 μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन के बाद एक बाँझ स्थिति में रखें।
    3. 0.5% surfactant के साथ खनिज तेल के 50 mL तैयार करें: 49.75 mL खनिज तेल और surfactant के 0.25 mL मिश्रण। बाँझ स्थिति में रखें।
    4. 1 M Dithiotheritol (DTT) तैयार करें: 10 mL आसुत पानी में DTT के 1.5425 ग्राम को भंग करें। बाँझ स्थिति में रखें।
    5. 1 M Triethanolamine (TEA) तैयार करें: आसुत पानी के 433.6 μL में TEA के 66.4 μL जोड़ें। बाँझ स्थिति में रखें।
    6. 1% Pluronic F127 (PF127) तैयार करें: आसुत पानी के 10 मिलीलीटर में 100 मिलीग्राम PF127 को भंग करें। बाँझ स्थिति में रखें।
  2. कार्य समाधान
    1. 3% surfactant और 1 M DTT (1: 15 अनुपात) के 300 μL के साथ खनिज तेल के 4.5 मिलीलीटर मिश्रण द्वारा एक क्रॉसलिंकर इमल्शन तैयार करें। भंवर 2 मिनट के लिए समाधान और 20 डिग्री सेल्सियस पर एक अल्ट्रासोनिक स्नान में 45-60 मिनट के लिए sonicate। इस समाधान को 27 जी सुई के साथ 5 एमएल सिरिंज पर लोड करें।
      नोट: इमल्शन तेल / पानी के मिश्रण को sonicating द्वारा उत्पन्न किया जाता है।
    2. एक 27 जी सुई के साथ एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के लिए 0.5% surfactant के साथ खनिज तेल लोड करके परिरक्षण तेल समाधान तैयार करें।
    3. 8% w/ v समाधान बनाने के लिए 1x DPBS के 400 μL में PEG-4-Mal के 32 मिलीग्राम को जोड़कर शेल (8% w/ v PEG-4-Mal और 15 mM TEA) समाधान तैयार करें, और 2 मिनट के लिए समाधान को भंवर करें। फिर, 1 M TEA (अंतिम एकाग्रता 15 mM TEA) के 6 μL जोड़ें। अंत में, एक स्पिन-फिल्टर के माध्यम से 5 मिनट के लिए 13,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और इसे 30 मिनट के लिए रॉकर पर अंधेरे में रखें। फिर, इस समाधान को 27 जी सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज पर लोड करें।
      नोट: ढक्कन खोलने से पहले 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने के लिए PEG-4-Mal कंटेनर को छोड़ दें, और ढक्कन को बंद करने से पहले O2 को N2 के साथ बदलने के लिए N2 गैस को उड़ा दें। समाधान में जोड़ने से पहले भंवर टीईए।
  3. कोर समाधान में सेल निलंबन तैयार करें
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 से 10 मिनट के लिए ट्रिप्सिन के साथ एचपीएससी का इलाज करें। फिर, उन्हें प्लेटों से इकट्ठा करें। सेल टुकड़ी के बाद माध्यम के साथ ट्रिप्सिन को बुझाएं, और फिर कोशिकाओं को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. बल्क सेल निलंबन (400 x g, 5 मिनट) को सेंट्रीफ्यूज करें। सावधानी से supernatant aspirate और फिर विकास माध्यम की एक न्यूनतम मात्रा का उपयोग कर सेल गोली resuspend. स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की गणना करें.
      नोट: विशिष्ट सेल ऐलीकोट में 12-20 x 106 कोशिकाएं होती हैं और कोर समाधान के 400 μL बनाने के लिए पर्याप्त हैं।
    3. थोक सेल निलंबन से 12-20 x 106 कोशिकाओं को लें और सेल / मीडिया निलंबन (400 x g, 5 मिनट) को सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. ध्यान से सेल गोली से aspirate मीडिया. फिर, 200 μL मीडिया और 2x PEG समाधान के 200 μL जोड़ें (अंतिम एकाग्रता 30-50 x 106 सेल / एमएल) और धीरे से मिश्रण।
      नोट: कम सेल सांद्रता (20 x 106 कोशिकाओं / एमएल से कम) के परिणामस्वरूप कई खाली कैप्सूल होते हैं।
    5. समाधान के लिए 1% PF127 के 30 μL जोड़ें।
    6. एक 1 एमएल सिरिंज में एक माइक्रो हलचल बार (2 मिमी x 7 मिमी) डालें, और फिर 27 जी सुई के साथ सिरिंज के लिए कोर समाधान वाले सेल को लोड करें। पूरी encapsulation प्रक्रिया के दौरान बर्फ के साथ समाधान ठंडा रखें।

3. प्रयोगात्मक सेटअप

  1. बंधुआ PDMS ड्रॉपलेट डिवाइस, 20 सेमी लंबे के चार टुकड़े और 5 सेमी लंबे इनलेट माइक्रो ट्यूबों का एक टुकड़ा (0.38 मिमी आईडी एक्स 1.1 मिमी ओ.डी.), 10 सेमी आउटलेट ट्यूब का एक टुकड़ा (0.5 मिमी आईडी एक्स 1.5 मिमी ओ.डी.), और 0.5 सेमी फिटिंग ट्यूबों के छह टुकड़े (1 मिमी आईडी एक्स 1.8 मिमी ओ.डी.) एक कीटाणुनाशक प्रकाश स्रोत के नीचे (आमतौर पर 3 मिमी 30 मिमी ओ.डी.) और 3 के लिए जैविक सुरक्षा स्रोत के नीचे स्टरलाइज़ करें मिनट।
  2. fluidic इनलेट बंदरगाहों और पृथक्करण बंदरगाहों में टयूबिंग फिट करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  3. शेल, तेल, क्रॉसलिंकर इमल्शन इनलेट्स के लिए 20 सेमी लंबे इनलेट माइक्रोट्यूब के तीन टुकड़ों का उपयोग करें, और पृथक्करण डिवाइस के इनलेट के लिए एक टुकड़ा। फिर, संबंधित समाधान के साथ सिरिंज की सुई के लिए ट्यूबों के विपरीत छोर डालें। इस बीच, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के कोर इनलेट और एक 5 सेमी माइक्रोट्यूब (चित्रा 1 सी) के साथ पृथक्करण डिवाइस के आउटलेट को कनेक्ट करें।
    नोट: इनलेट माइक्रोट्यूब को फिटिंग ट्यूबों के भीतर कसकर सुरक्षित किया जाना चाहिए, जिन्हें अंतिम चरण में डाला गया था।
  4. Fluidic आउटलेट पोर्ट में एक आउटलेट ट्यूब डालें और एक संग्रह जलाशय में विपरीत छोर जगह।
  5. डिवाइस को माइक्रोस्कोप चरण पर रखें और हिलने से बचने के लिए टयूबिंग को संलग्न करें। संरेखित करें और प्रवाह निरीक्षण के लिए डिवाइस नोजल पर माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें।
  6. विभिन्न सिरिंज पंपों पर प्रत्येक सिरिंज रखें और ठीक से सुरक्षित करें (चित्रा 1 बी)। निम्नलिखित प्रवाह दरों के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्रत्येक पंप को प्रोग्राम करें: कोर (3-5 μL / मिनट), खोल (3-5 μL / मिनट), परिरक्षण तेल (20-80 μL / मिनट), और क्रॉसलिंकिंग तेल (40-60 μL / मिनट)। सभी पंपों में प्रवाह शुरू करें।
  7. डिवाइस में प्रवेश करने के लिए प्रत्येक तरल पदार्थ की प्रतीक्षा करें और शेष हवा को धक्का देते हुए चैनलों को भरें।
    नोट: यदि इनलेट टयूबिंग में बड़ी मात्रा में हवा है, तो अस्थायी रूप से प्रत्येक प्रवाह दर को बढ़ाएं जब तक कि हवा पूरी तरह से हटा न जाए। ध्यान रखें कि अत्यधिक प्रवाह दर पीडीएमएस-टू-पीडीएमएस बॉन्ड विफलता का कारण बन सकती है।
  8. जब कैप्सूल गठन स्थिर हो जाता है (चित्रा 3), संग्रह ट्यूब के विपरीत छोर को एमटीईएसआर मीडिया के 5 एमएल के साथ एक नई शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
    नोट: मीडिया में 10 μM ROCK अवरोधक, 100 U/ mL पेनिसिलिन, और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं।
  9. कैप्सूल की पर्याप्त संख्या एकत्र करने के बाद, 10 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। तेल चरण में रहने वाले कैप्सूल ट्यूब के शीर्ष पर होंगे ( चित्रा 4 ए देखें)। ट्यूब पर धीरे से दोहन कैप्सूल को नीचे तक तलछट करने का कारण बनता है। इसके बाद, अधिकांश तेल और मीडिया को एस्पिरेटेड किया जा सकता है।
  10. शंक्वाकार ट्यूब के नीचे से कैप्सूल ले लीजिए, उन्हें एक सेल छलनी (100 μm ताकना आकार) पर रखें, और मीडिया की प्रचुर मात्रा के साथ धोएं। फिर, फिल्टर के माध्यम से मीडिया चलाकर 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में 2 एमएल मीडिया का उपयोग करके माइक्रोकैप्सूल एकत्र करें क्योंकि यह अच्छी तरह से प्लेट के शीर्ष पर उलटा है ( चित्रा 4 ए देखें)।

4. hPSC संस्कृति और माइक्रोकैप्सूल में विश्लेषण

  1. मूल संस्कृति
    1. स्टेम सेल कैप्सूल को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 6-अच्छी तरह से प्लेट संस्कृति डिश में इनक्यूबेट करें।
    2. एक सेल छलनी फिल्टर पर कैप्सूल एकत्र करके मीडिया को हर दूसरे दिन बदलें, उन्हें अतिरिक्त मीडिया के साथ धोएं, और उन्हें 2 एमएल मीडिया के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेटों में एक नए कुएं पर फिर से निलंबित करें जैसा कि चरण 3.10 में किया गया था।
    3. कम से कम 10 दिनों के लिए कैप्सूल को संस्कृति दें।
  2. encapsulated स्टेम कोशिकाओं की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए जीवित / मृत परख प्रदर्शन।
    1. Thaw लाइव / मृत परख समाधान (ethidium homodimer-1 और calcein AM).
    2. बाँझ DPBS के 2 mL करने के लिए 2 μM ethidium homodimer-1 और 4 μM calcein AM समाधान के 1 μL के 4 μL जोड़ें। पूर्ण मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए भंवर.
    3. एक सेल छलनी पर लगभग 100 microcapsules ले लीजिए और कैप्सूल से बाहर माध्यम के प्रसार की अनुमति देने के लिए उन्हें बाँझ DPBS के साथ कुल्ला।
    4. चरण 4.2.2 में तैयार समाधान के 1 मिलीलीटर का उपयोग करके उन्हें फिर से 12 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में इकट्ठा करें। 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की कल्पना करें।
      नोट: सेल व्यवहार्यता को जीवित कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करके निर्धारित किया जाता है, जिन्हें कोशिकाओं की कुल संख्या के बीच हरे रंग के रूप में विज़ुअलाइज़ किया जाता है।
  3. गोलाकार आकार लक्षण वर्णन.
    1. जब वांछित हो, माइक्रोस्कोप के नीचे माइक्रोकैप्सूल के साथ अच्छी तरह से प्लेट रखें और उचित पैमाने पर सलाखों के साथ संबंधित सॉफ़्टवेयर पर दिखाए गए गोलाकार के व्यास को मापें।
    2. मापने और गोलाकार आकार का विश्लेषण करें।

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Representative Results

उपर्युक्त प्रोटोकॉल का पालन करके, पाठक माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को बनाने और सेल-ले जाने वाले माइक्रोकैप्सूल का उत्पादन करने में सक्षम होगा। चित्रा 3A माइक्रोफ्लुइडिक ड्रॉपलेट पीढ़ी का उपयोग करके निर्मित इष्टतम और सबऑप्टिमल माइक्रोकैप्सूल के उदाहरण दिखाता है। PEG-4-Mal के विभिन्न योगों के परिणामस्वरूप अलग-अलग आकारिकी के कैप्सूल हुए - झुर्रियों वाले कैप्सूल खराब जेलेशन, कम यांत्रिक अखंडता से जुड़े थे, और एक उत्तेजित बायोरिएक्टर में खेती का सामना नहीं करते थे। >6% की पीईजी सामग्री पर देखे गए चिकनी कैप्सूल वांछित कैप्सूल आकृति विज्ञान का प्रतिनिधित्व करते थे और सेल खेती के लिए पर्याप्त मजबूत थे। कोर-शेल संरचना की पुष्टि माइक्रोबीड्स को कोर में शामिल करके की गई थी और माइक्रोकैप्सूल के खोल में फ्लोरोसेंट moieties। कैप्सूल के केंद्र में मोतियों का एकत्रीकरण जैसा कि चित्रा 3 बी में देखा गया है, का उपयोग इस संकेत के रूप में किया गया था कि कोर जलीय था, और मोती चारों ओर स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र थे। चित्रा 3 C में देखे गए फ्लोरोसेंट एनुलस ने हाइड्रोजेल शेल की उपस्थिति का संकेत दिया और इसका उपयोग शेल मोटाई निर्धारित करने के लिए किया गया था। हम अनुशंसा करते हैं कि उपयोगकर्ताओं को encapsulation प्रक्रिया की स्थापना के शुरुआती चरणों में microbead निगमन और फ्लोरोसेंट लेबलिंग को नियोजित करें।

एक बार encapsulation प्रक्रिया स्थापित हो जाने के बाद, कोई भी hPSCs के encapsulation पर जा सकता है। जबकि यह प्रोटोकॉल एच 9 कोशिकाओं के एनकैप्सुलेशन का वर्णन करता है, हमने एक और एचईएससी लाइन (एचईईएस -8) और एक आईपीएससी लाइन (1016) को एनकैप्सुलेट करने के लिए एक समान रणनीति का उपयोग किया है। 7

जबकि एनकैप्सुलेशन केवल एनकैप्सुलेशन डिवाइस का उपयोग करके किया जा सकता है, हमने नोट किया कि एचपीएससी सिस्टम में झुकाव करते हैं जिसके परिणामस्वरूप गैर-समान एनकैप्सुलेशन या कैप्सूल अधिभोग होता है। इस चुनौती को संबोधित करने के लिए, हमने एक पृथक्करण या निस्पंदन डिवाइस डिज़ाइन किया और इसे एनकैप्सुलेशन डिवाइस के अपस्ट्रीम में तैनात किया। इस पृथक्करण उपकरण में त्रिभुज के आकार के पदों की एक सरणी के साथ एक प्रवाह चैनल शामिल था जिसे प्रति पक्ष 200 μm मापा जाता है और इनलेट पर 400 μm से लेकर आउटलेट पर 30 μm तक की पिच होती है जैसे कि एनकैप्सुलेशन डिवाइस में प्रवेश करने से पहले clumps को या तो बनाए रखा जाता है या टूट जाता है ( चित्रा 1D)7 देखें। पृथक्करण उपकरण का उपयोग गोलाकार की एकरूपता में काफी सुधार करने और कैप्सूल के सेल अधिभोग को 57% से >90% 7 तक बढ़ाने की अनुमति देता है।

चित्रा 4B, C एक encapsulation रन से प्रतिनिधि परिणामों का वर्णन करता है। जैसा कि इन छवियों से देखा जा सकता है, एच 9 कोशिकाओं में >95% व्यवहार्यता के साथ उच्च व्यवहार्यता होती है जो एनकैप्सुलेशन रन के दौरान नियमित रूप से प्राप्त की जाती है। हमने विकास दर की तुलना की ( चित्रा 4 बी, सी देखें) और एनकैप्सुलेटेड बनाम अनएनकैप्सुलेटेड गोलाकार7 की भेदभाव क्षमता, और निर्धारित किया कि एनकैप्सुलेशन की प्रक्रिया का एचपीएससी पर कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं पड़ता है। दूसरी ओर, एचपीएससी को encapsulating करने के लिए कई लाभ हैं। Encapsulated गोलाकार को संभालना आसान है और भेदभाव प्रोटोकॉल या परीक्षण उपचार विकसित करने के लिए माइक्रोटिटर प्लेटों में वितरित / वितरित किया जा सकता है। हमारी प्रयोगशाला उत्तेजित बायोरिएक्टर में निलंबन खेती के लिए स्टेम सेल वाहक के रूप में माइक्रोकैप्सूल का उपयोग करने में रुचि रखती है और यह प्रदर्शित किया है कि हाइड्रोजेल शेल ऐसी संस्कृतियों में कतरनी क्षति के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करताहै। यह एक अतिरिक्त एवेन्यू है जो हमारे द्वारा पीछा किया जा रहा है बायोएक्टिव माइक्रोकैप्सूल बनाने में है जहां हाइड्रोजेल शेल को भेदभाव के दौरान आगमनात्मक संकेतों के स्थानीय और निरंतर वितरण के लिए विकास कारकों के साथ लोड किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र1: कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल का निर्माण(A) कैप्सूल उत्पादन के लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में चार इनलेट चैनल (कोर, शेल, तेल और क्रॉसलिंकर तेल) और एक सर्पाइन चैनल होता है जो एक संग्रह ट्यूब की ओर जाता है। डिवाइस को इस तरह से गढ़ा गया है कि कोर, शेल और तेल चैनल क्रमशः ऊंचाई में 120 μm (H1), 200 μm (H2), और 300 μm (H3) हैं। इनसेट नोजल पर एक क्रॉस-अनुभागीय दृश्य का प्रतिनिधित्व करता है - जलीय और तेल धाराओं के बीच जंक्शन। यह क्रॉस-अनुभागीय दृश्य पाठक को समाक्षीय प्रवाह चैनलों का बेहतर दृश्य देने के लिए 90 डिग्री तक झुका हुआ है। कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल निर्माण प्रक्रिया का एक 3 डी प्रतिनिधित्व दर्शाता है कि कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल संरचना का उत्पादन करने के लिए प्रवाह-फोकसिंग जंक्शन के अपस्ट्रीम में समाक्षीय प्रवाह कैसे उत्पन्न होता है। इमल्सीफिकेशन दो तेल धाराओं में जलीय बूंदों को उजागर करके प्राप्त किया जाता है, जिनमें से पहला बूंदों को स्थिर करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और दूसरा क्रॉसलिंकर डीटीटी प्रदान करने के लिए, जो पीईजी -4-माल के साथ प्रतिक्रिया करता है। इस आंकड़े को संदर्भ12 से संशोधित किया गया है। कॉपीराइट 2019, अमेरिकन केमिकल सोसाइटी। (बी) सिरिंज पंपों, टयूबिंग, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों और कैप्सूल संग्रह ट्यूब के स्थानों को दर्शाते हुए एनकैप्सुलेशन प्रणाली का प्रयोगात्मक सेटअप। (C) encapsulation system की एक छवि, जिसमें एक अनुक्रम में पृथक्करण और encapsulation उपकरण होते हैं। (d) माइक्रोएनकैप्सुलेशन डिवाइस में प्रवेश करने वाले बड़े सेल समुच्चय से बचने के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोफ्लुइडिक पृथक्करण उपकरण का डिजाइन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: encapsulation के लिए इस्तेमाल किया microfluidic उपकरणों का निर्माण. (ए) एनकैप्सुलेशन डिवाइस का निर्माण। SU-8 photoresist की तीन परतों को स्पिन-लेपित किया गया था, और विभिन्न ऊंचाइयों के साथ कोर, शेल और तेल चैनलों को उत्पन्न करने के लिए फोटो पैटर्न किया गया था। कोर चैनलों में 220 μm की चौड़ाई होती है जो कैप्सूल जंक्शन पर 135 μm तक संकीर्ण होती है। सभी चरणों के लिए चैनल एक ही सिद्धांत का पालन करते हैं: शेल और तेल चैनल 500 μm की चौड़ाई के साथ शुरू होते हैं, जंक्शन पर 220 μm तक संकीर्ण होते हैं, और परिरक्षण तेल 500 μm पर शुरू होता है जो 270 μm तक संकीर्ण होता है। आउटलेट सर्पेंटाइन की चौड़ाई 1.5 मिमी और ~ 55 मिमी की लंबाई है। ऊपर और नीचे पीडीएमएस के टुकड़े तब संरेखित किए गए थे, और प्लाज्मा बंधुआ था। (बी) पृथक्करण उपकरण का निर्माण। SU-8 photoresist की एक परत स्पिन-लेपित थी, और पृथक्करण चैनलों को उत्पन्न करने के लिए फोटो पैटर्न किया गया था। PDMS टुकड़ा तब प्लाज्मा कांच स्लाइड के साथ बंधे थे. पृथक्करण उपकरण में 30 μm की ऊंचाई, 16.5 मिमी की लंबाई, और इनलेट पर 5 मिमी की चौड़ाई और आउटलेट पर 1.7 मिमी की चौड़ाई के साथ एक छोटा कक्ष होता है। इसमें त्रिभुज के आकार की संरचनाएं (200 μm, समबाहु) हैं जो इनलेट के 420 μm द्वारा एक दूसरे से अलग हो जाती हैं और अंतिम पंक्ति में 50 μm के अलगाव के साथ आउटलेट के रास्ते में करीब हो जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोकैप्सूल का लक्षण वर्णन। (ए) शेल में पीईजी -4-माल सामग्री के एक समारोह के रूप में कैप्सूल आकृति विज्ञान में अंतर। उज्ज्वल किनारों के साथ चिकनी कैप्सूल वांछित यांत्रिक अखंडता के साथ जुड़े हुए हैं। (बी) माइक्रोकैप्सूल के जलीय कोर की पुष्टि। फंसे हुए माइक्रोबीड्स जलीय कोर में स्थानांतरित करने और माइक्रोकैप्सूल के केंद्र में एकत्रित करने के लिए स्वतंत्र हैं। (ग) माइक्रोकैप्सूल के खोल में रोडामाइन बी-लेबल पीईजी को शामिल करके कोर-शेल संरचना की पुष्टि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: hPSCs का encapsulation. (A) तेल चरण में माइक्रोकैप्सूल को मीडिया से भरे शंक्वाकार ट्यूब में एकत्र किया जाता है। माइक्रोकैप्सूल को ट्यूब के नीचे बसने के लिए बनाया जाता है, तेल और मीडिया को एस्पिरेटेड किया जाता है, माइक्रोकैप्सूल को धोया जाता है और फिर खेती के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित कर दिया जाता है। (बी) एच 9 कोशिकाओं को encapsulating के बाद 6 ज जीवित / मृत धुंधला। ऊपरी छवि 10x पर ली गई थी, और 20x पर निचली छवि (सी) गोलाकार आकारों की तुलना करने वाली छवियां जो कैप्सूल में H9 कोशिकाओं के लिए समय के साथ बदलती हैं और वाणिज्यिक 3 डी संस्कृति प्लेटों (नीचे की छवियों) में। (घ) गोलाकार व्यास का परिमाणीकरण जो एच9 मीडिया में 7 दिनों के दौरान माइक्रोकैप्सूल में और मानक 3डी संस्कृति प्लेटों में एचपीएससी के लिए बढ़ता है। सांख्यिकीय विश्लेषण -टी-परीक्षण, पी < 0.05, एन = 20। स्केल बार: 200 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यहां वर्णित encapsulation प्रक्रिया hPSC गोलाकार के पुनरुत्पादक गठन में परिणाम है। माइक्रोकैप्सूल प्रारूप भेदभाव प्रोटोकॉल में सुधार / अनुकूलन या परीक्षण उपचार के उद्देश्य से प्रयोगों के लिए एक माइक्रोटिटर प्लेट के कुओं में गोलाकार वितरित करना आसान बनाता है। Encapsulated स्टेम सेल गोलाकार भी निलंबन संस्कृतियों में इस्तेमाल किया जा सकता है जहां हाइड्रोजेल खोल कतरनी प्रेरित क्षति के खिलाफ कोशिकाओं की रक्षा करताहै 7.

प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण चरण हैं। प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित सीमा के भीतर कोर, शेल और तेल धाराओं की प्रवाह दरों को रखना महत्वपूर्ण है। यदि शेल प्रवाह दर बहुत कम है, तो प्रवाह अस्थिर हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप विकृत और यांत्रिक रूप से अस्थिर कैप्सूल होते हैं। एक सफल सेल encapsulation चित्र4C में दिखाए गए microcapsules के समान दिखना चाहिए। माइक्रोकैप्सूल समान व्यास के होने चाहिए और कोर में फंसी कोशिकाओं की एक तुलनीय संख्या होनी चाहिए। गोलाकार में एकल कोशिकाओं का एकत्रीकरण आमतौर पर 48 घंटे के भीतर होता है और 72 घंटे में गोलाकार गठन की कमी एक चेतावनी संकेत है। गोलाकार गठन की कमी का एक कारण यह हो सकता है कि कोर में चिपचिपा अणु हाइड्रोजेल शेल के माध्यम से पर्याप्त तेजी से बाहर नहीं निकल रहे हैं। कार्बोक्सीमिथाइल सेल्यूलोज (मेगावाट 250 केडी) जैसे उच्च आणविक भार पॉलिमर का उपयोग करके कोर समाधान की चिपचिपाहट को समायोजित करते समय हमें इस परिदृश्य का सामना करना पड़ा। कोई माइक्रोबीड्स को समाहित कर सकता है ( चित्रा 3 बी देखें) यह परीक्षण करने के लिए कि क्या ये सेल-आकार की वस्तुएं कोर के बारे में स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र हैं और कोर लीच के घटकों को कितनी तेजी से बाहर निकालते हैं। गोलाकार गठन की कमी भी हमारे द्वारा सामना किया गया था जब >8% w / v के PEG-4-Mal सांद्रता का उपयोग कर रहे थे। इस परिदृश्य में, हाइड्रोजेल शेल की सरंध्रता और विसरणशीलता कम हो जाती है और कोर में उच्च चिपचिपाहट तत्व कोशिकाओं को समुच्चय में बनाने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त तेजी से बाहर नहीं निकलते हैं। यह कल्पनीय है कि PEG-4-Mal की गुणवत्ता बैच से बैच या निर्माता तक भिन्न हो सकती है। इसलिए, खोल में बहुलक एकाग्रता के कुछ समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। एक बार फिर, मनका निगमन विधि को यह प्रकट करना चाहिए कि कोर में चिपचिपा घटक पानी के अणुओं द्वारा कितनी तेजी से विस्थापित होते हैं। हमारे अनुभव में, यह जलीय वातावरण में माइक्रोकैप्सूल को स्थानांतरित करने के 3 घंटे के भीतर होना चाहिए।

यहां वर्णित एनकैप्सुलेशन प्रोटोकॉल ने कई एचपीएससी लाइनों7, प्राथमिक हेपेटोसाइट्स10 और कई कैंसर सेल लाइनों (अप्रकाशित परिणाम) के लिए अच्छी तरह से काम किया है। हालांकि, हमें स्टेम सेल-व्युत्पन्न (एससी) -हेपेटोसाइट्स और एससी-β-कोशिकाओं के एनकैप्सुलेशन के बाद गोलाकार बनाने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ा। Encapsulated microbeads के साथ समस्या निवारण से पता चला है कि चिपचिपा घटकों को कोर से तेजी से eluted थे और यह कि कोशिकाओं को स्थानांतरित करने और सेल-सेल संपर्कों को बनाने के लिए स्वतंत्र थे। अतिरिक्त समस्या निवारण में 66 mM से 10 mM तक di-thiol crosslinker DTT (तेल चरण में मौजूद) की सांद्रता को टिटरेट करना शामिल था। एससी-हेपेटोसाइट्स और β-कोशिकाओं के लिए गोलाकार गठन डीटीटी की इस कम एकाग्रता पर हुआ था। इसलिए, उपयोगकर्ता क्रॉसलिंकर एकाग्रता को अनुकूलित करने पर विचार करना चाह सकता है लेकिन केवल तभी जब ऊपर सूचीबद्ध अन्य समस्या निवारण चरण सफल नहीं हुए हैं। हम पाते हैं कि डीटीटी एकाग्रता 66 एमएम डीटीटी के साथ माइक्रोकैप्सूल की यांत्रिक अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, जिसके परिणामस्वरूप यांत्रिक रूप से मजबूत माइक्रोकैप्सूल होते हैं और आज तक उपयोग किए जाने वाले अधिकांश सेल प्रकारों के लिए गैर-विषाक्त होते हैं।

साहित्य में 3 डी स्टेम सेल निर्माण बनाने के लिए कई रणनीतियों का वर्णन किया गया है। कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल के भीतर स्टेम सेल निर्माण बनाने के लाभ कई हैं। एक बार encapsulated, गोलाकार hydrogel कैप्सूल कतरनी क्षति के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करने के साथ आसानी से संभाला जा सकता है। Encapsulated गोलाकार स्टेम कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाए बिना जोरदार आंदोलन के साथ निलंबन में सुसंस्कृत किया जा सकता है।

माइक्रोकैप्सूल की क्षमताओं का विस्तार करने के लिए कई रास्ते हैं। हमारी टीम ने पहले हेपेटोसाइट्स और स्टेम कोशिकाओं 8,12 के encapsulation के लिए हेपरिन युक्त हाइड्रोजेल के उपयोग का वर्णन किया है, और वर्तमान में हेपरिन युक्त बायोएक्टिव कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल विकसित कर रहा है जो स्टेम कोशिकाओं के लिए आगमनात्मक संकेतों (जीएफ) के भंडारण और स्थानीय रिलीज के लिए डिपो के रूप में काम करते हैं। इस तरह के माइक्रोकैप्सूल भेदभाव परिणामों में सुधार करते हुए महंगे जीएफ के उपयोग को कम करने में मदद कर सकते हैं। माइक्रोकैप्सूल को कोर में ईसीएम प्रोटीन को शामिल करके आगे बढ़ाया जा सकता है, इस प्रकार स्टेम सेल माइक्रोएन्वायरमेंट को मॉड्युलेट किया जा सकता है। कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल को एचपीएससी गोलाकार13,14 को पुनः प्राप्त करना आसान बनाने के लिए डिग्रेडेबल बनाया जा सकता है। कुल मिलाकर, कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल एक प्लेटफ़ॉर्म तकनीक का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसे एक विशिष्ट स्टेम सेल भेदभाव प्रोटोकॉल की जरूरतों को पूरा करने के लिए संशोधित और बढ़ाया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को मेयो क्लिनिक सेंटर फॉर रीजेनरेटिव मेडिसिन, जे डब्ल्यू किचेफर फाउंडेशन, अल नाहयान फाउंडेशन, पुनर्योजी चिकित्सा मिनेसोटा (आरएमएम 101617 टीआर 004), और एनआईएच (डीके 107255) से अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Syringe Filters Genesee Scientific 25-244
1 ml syringe luer-lock tip BD 309628
1x DPBS Corning 23220003
4-arm PEG maleimide, 10kDa Laysan Inc. 164-68
5 ml syringe luer-lock tip BD 309646
6-WELL NON-TREATED PLATE USA Scientific CC7672-7506
Aquapel Applicator Pack Aquapel Glass Treatment 47100
CAD software Autodesk AutoCAD v2020
CELL STRAINER 100 µm pore size cardinal 335583
Chlorotrimethylsilane Aldrich 386529-100mL
Countess II FL Automated Cell Counter Life technology A27974
Digital hot plate Dataplate
Digital vortex mixer Fisher Scientific 215370
Distilled water Gibco 15230-162
Dithiotheritol (DTT) Sigma D0632-10G
DMEM/F12 media gibco 11320-033
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher scientific 14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge live 13-100-675
HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Inverted Fluorescence Motorized Microscope Olympus Olympus IX83
Laurell Spin Coaters Laurell Technologies WS-650MZ-23NPPB
Live/Dead mammalian staining kit Fisher L3224
Magic tape Staples 483535
Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) Scientific Commodities, Inc BB31695-PE/2
Micro stir bar Daigger Scientific EF3288E
MilliporeSigma Filter Forceps Fisher scientific XX6200006P
Mineral oil Sigma M8410-1L
mTeSR 1 Basal Medium STEMCELL TECHNOLOGY 85850
Needles-Stainless Steel  14 Gauge CML supply 901-14-025
Needles-Stainless Steel  15 Gauge CML supply 901-15-050
OptiPrep STEMCELL TECHNOLOGY 7820
Oven Thermo Scientific HERA THERM Oven
Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) Gemini 400-109
Petri Dish 150X20 Sterile Vent Sarstedt, Inc. 82.1184.500
Plasma Cleaning System Yield Engineering System, Inc. YES-G500
Pluronic F-127 Sigma P2443-250G
Poly(ethylene glycol) 35kDa Sigma 94646-250G-F
PrecisionGlide Needle 27G BD 305109
Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride SELLECK CHEM S1049-10mg
Silicon wafer 100mm University Wafer 452
Slide glass (75mm ´ 25mm) CardinalHealth M6146
Span 80 Sigma S6760-250ML
SpeedMixer Thinky ARE-310
Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) Costar 8160
SU-8 2025 Kayaku Advanced Materials Y111069 0500L1GL
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials Y020100 4000L1PE
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades fisher scientific 22-079-684
SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow Corning 2065622
Syringe pump New Era Pump System, Inc NE-4000
Triethanolamine Sigma-aldrich T58300-25G
TrypLE Express Gibco 12604-013
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) Cole-Parmer 06419-01
Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) Cole-Parmer 06419-04
Ultrasonic cleaner FS20D Fisher Scientific CPN-962-152R
Vacuum desiccator Bel-Art F42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x ZEISS 435421-0000-000
μPG 101 laser writer Heidelberg Instruments HI 1128

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References

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