Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrication microfluidique de microcapsules noyau-coquille transportant des sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines

Published: October 13, 2021 doi: 10.3791/62944
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic
* These authors contributed equally

Summary

Cet article décrit l’encapsulation de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) à l’aide d’un dispositif de focalisation à flux coaxial. Nous démontrons que cette technologie d’encapsulation microfluidique permet la formation efficace de sphéroïdes hPSC.

Abstract

Les cultures tridimensionnelles (3D) ou sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) offrent les avantages d’une différenciation améliorée et d’une évolutivité améliorée. Dans cet article, nous décrivons une stratégie pour la formation robuste et reproductible de sphéroïdes hPSC où un dispositif de focalisation d’écoulement coaxial est utilisé pour piéger les hPSC à l’intérieur de microcapsules noyau-coque. La solution de base contenait une suspension unicellulaire de CSEh et a été rendue visqueuse par l’incorporation de poly(éthylène glycol) (PEG) de haut poids moléculaire et de milieux de gradient de densité. Le flux de coquille composé de maléimide de bras PEG-4 ou PEG-4-Mal et s’écoulait le long du flux de noyau vers deux jonctions pétrolières consécutives. La formation de gouttelettes s’est produite à la première jonction d’huile avec une solution de coquille s’enroulant autour du noyau. La réticulation chimique de la coquille s’est produite au deuxième carrefour d’huile en introduisant un réticulant di-thiol (1,4-dithiothréitol ou DTT) dans ces gouttelettes. Le réticulant réagit avec les groupes fonctionnels de maléimide via la chimie du clic, ce qui entraîne la formation d’une coquille d’hydrogel autour des microcapsules. Notre technologie d’encapsulation a produit des capsules de 400 μm de diamètre à raison de 10 capsules par seconde. Les capsules résultantes avaient une coquille d’hydrogel et un noyau aqueux qui permettaient aux cellules individuelles de s’assembler rapidement en agrégats et de former des sphéroïdes. Le processus d’encapsulation n’a pas eu d’effet négatif sur la viabilité des CSH, avec une viabilité de >95 % observée 3 jours après l’encapsulation. À titre de comparaison, les CSEh encapsulés dans des microparticules de gel solide (sans noyau aqueux) n’ont pas formé de sphéroïdes et avaient une viabilité de <50% 3 jours après l’encapsulation. La formation de sphéroïdes de CSEh à l’intérieur des microcapsules noyau-enveloppe s’est produite dans les 48 heures suivant l’encapsulation, le diamètre du sphéroïde étant fonction de la densité d’inoculation cellulaire. Dans l’ensemble, la technologie d’encapsulation microfluidique décrite dans ce protocole était bien adaptée à l’encapsulation des HSPC et à la formation de sphéroïdes.

Introduction

Il existe un intérêt considérable pour les cultures 3D de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) en raison de l’amélioration de la pluripotence et du potentiel de différenciation offerts par ce formatde culture 1,2,3. Les cSEh sont généralement formés en sphéroïdes ou en d’autres formats de culture 3D au moyen de bioréacteurs, de micropuits, d’hydrogels et d’échafaudages polymères 4,5,6. L’encapsulation offre un autre moyen d’organiser des hPSC simples en sphéroïdes. Une fois encapsulés, les sphéroïdes hPSC peuvent être manipulés facilement et transférés dans des plaques de microtitrage pour la différenciation, la modélisation de la maladie ou les expériences de test de médicaments. L’enrobage des CSEh dans une couche d’hydrogel protège également les cellules contre les dommages de cisaillement et permet de cultiver des sphéroïdes dans un bioréacteur à des taux d’agitation élevés7.

Notre méthodologie pour l’encapsulation des cellules souches a évolué au fil du temps. Tout d’abord, nous nous sommes concentrés sur les microparticules d’hydrogel solides et avons démontré le succès de l’encapsulation et de la culture de cellules souches embryonnaires (CSM) de souris8. Cependant, il a été noté que les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) avaient une faible viabilité lorsqu’elles étaient encapsulées dans de telles microparticules d’hydrogel, probablement en raison de la plus grande nécessité pour ces cellules de rétablir les contacts cellule-cellule après l’encapsulation. Nous avons estimé que la microcapsule hétérogène, possédant un noyau aqueux, pourrait être mieux adaptée à l’encapsulation de cellules qui dépendent du rétablissement rapide des contacts cellule-cellule. Le concept de dispositif microfluidique de focalisation à écoulement coaxial pour la fabrication de microcapsules à noyau aqueux / coquille d’hydrogel a été adapté de He et al.9, mais au lieu de l’alginate utilisé dans l’approche originale, un hydrogel à base de PEG a été incorporé dans la coque. Nous avons d’abord démontré avec succès l’encapsulation et la formation de sphéroïdes d’hépatocytes primaires dans des microcapsules noyau-enveloppe10 et, plus récemment, nous avons décrit l’encapsulation de cellules hES et iPS7. Comme indiqué à la figure 1A, les capsules sont fabriquées dans un dispositif de focalisation de l’écoulement où la coque et les flux d’écoulement du noyau passent d’un flux d’un côté à l’autre à l’écoulement coaxial avant l’éjection dans la phase huileuse. Le flux de noyau contient des cellules et des additifs qui augmentent la viscosité de la solution (PEG MW 35kD non réactif et iodixanol - nom commercial OptiPrep) tandis que le flux de coquille contient des molécules réactives (PEG-4-Mal). Le flux d’écoulement coaxial continu est discrétisé en gouttelettes qui conservent l’architecture noyau-coque. La structure noyau-coquille est rendue permanente par l’exposition à un réticulant di-thiol (DTT), qui réagit avec le PEG-4-Mal via la chimie du clic et entraîne la formation d’une peau ou d’une coquille d’hydrogel mince (~ 10 μm). Une fois l’émulsion brisée et les capsules transférées en phase aqueuse, les molécules de PEG diffusent du noyau et sont remplacées par des molécules d’eau. Il en résulte des microcapsules aqueuses à noyau et à enveloppe d’hydrogel.

Vous trouverez ci-dessous des instructions étape par étape sur la fabrication de dispositifs microfluidiques, la préparation des cellules et l’encapsulation des CSEh.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fabrication de l’appareil

  1. Réalisez les conceptions du dispositif de microencapsulation et du dispositif de dissociation à l’aide du logiciel de CAO10,11.
  2. Spin-coat les trois couches de résine photosensible SU-8 séquentiellement sur une plaquette de silicium (Figure 2A) pour obtenir des structures avec les hauteurs souhaitées: 60, 100 et 150 μm.
    REMARQUE: Le processus pour les moules supérieur et inférieur est identique.
    1. Spin coat une plaquette de silicium propre de 10 cm avec la résine photosensible négative SU-8 2025 à 1 100 tr/min pour créer la première couche de 60 μm. Après une cuisson molle à 65 °C pendant 3 min et à 95 °C pendant 10 min sur une plaque chauffante, exposez le moule à l’aide d’un aligneur sans masque en téléchargeant le fichier de conception du motif de canal principal sur le PC μPG 101. Ensuite, procéder à la cuisson post-exposition à 65 °C pendant 3 min et à 95 °C pendant 10 min.
    2. Faites tourner la deuxième couche SU-8 2025 (40 μm) à 1 500 tr/min et exposez-la en téléchargeant le fichier CAO approprié pour le motif de canal de coque.
      REMARQUE: Les cuissons molles et post-exposition étaient similaires à l’étape précédente.
    3. Spin coat la troisième couche SU-8 2025 à 1 400 tr/min pour atteindre une hauteur de 50 μm et répéter le processus ci-dessus mais exposer les structures pour la phase huileuse.
    4. Développez le moule avec les trois couches en une seule étape par immersion dans le révélateur SU-8 jusqu’à ce que toute la résine photosensible non exposée soit retirée.
    5. Cuire le moule sur une plaque chauffante à 160 °C pendant 10 min pour améliorer l’adhérence et sceller les fissures mineures qui pourraient apparaître après le développement.
    6. Exposez le moule au chlorotriméthylsilane pour éviter la liaison élastomère à l’étape suivante et placez-le dans des boîtes de Petri de 15 cm jusqu’à utilisation.
  3. Préparez le moule du dispositif de dissociation de la même manière, comme décrit dans les figures 1D et 2B. Spin coat une couche de résine photosensible SU-8 sur une plaquette de silicium, comme décrit précédemment à l’étape 1.2.3, pour obtenir des structures avec la hauteur souhaitée: 50 μm. Effectuez la cuisson molle et post-exposition, le développement et la cuisson dure de la même manière que l’étape précédente.
    REMARQUE: Un ensemble de poteaux de forme triangulaire couvrait toute la chambre, l’espacement entre les poteaux diminuant à mesure que la largeur de la chambre diminuait vers la sortie. Les poteaux triangulaires étaient de 200 μm par côté avec un pas allant de 400 μm (à l’entrée) à 30 μm (à la sortie).
  4. Préparer les moules par lithographie douce à l’aide de polydiméthylsiloxane (PDMS).
    1. Mélanger la base d’élastomère PDMS et l’agent de durcissement de l’élastomère dans un rapport de 10:1 p / w dans une centrifugeuse planétaire. Versez le mélange sur les moules maîtres de microencapsulation et les moules maîtres de dissociation pour créer une couche de 3 à 4 mm.
      REMARQUE: Un mélange de 50 g de base d’élastomère avec 5 g d’agent de durcissement est suffisant pour couvrir un moule maître de 3 mm d’épaisseur.
    2. Placez les boîtes de Petri contenant les moules dans un dessiccateur sous vide pendant 15 minutes pour désamorcer le PDMS non durci.
    3. Déplacer les boîtes de Petri au four et cuire au four à 80 °C pendant au moins 60 min.
    4. Retirez les moules principaux du four et laissez-les refroidir. À l’aide d’un couteau de précision, coupez soigneusement le PDMS en suivant la forme de la plaquette et décollez les pièces PDMS du moule maître.
    5. Découpez les dalles PDMS en coupant les bords de chaque appareil avec un scalpel, puis perforez les orifices fluidiques d’entrée / sortie dans le dispositif de dissociation et uniquement dans le dispositif microfluidique supérieur à l’aide d’aiguilles en acier inoxydable. Couvrez les appareils avec du ruban magique pour éviter toute contamination.
      REMARQUE: La jauge de l’aiguille est de 14 G et 15 G pour les ports d’entrée et de sortie, respectivement.
    6. Pour le collage, traiter les côtés à motifs des pièces PDMS supérieure et inférieure avec du plasma O2 sur un graveur de plasma pendant 2 min.
    7. Alignez les deux pièces PDMS sous un stéréoscope après avoir ajouté une fine couche de séparation d’eau distillée directement dans les microcanaux (2 μL).
    8. Placez le dispositif PDMS aligné dans le four à 80 °C pendant la nuit pour terminer le collage et restaurer le PDMS à son état hydrophobe d’origine. Conservez les appareils jusqu’à ce qu’ils soient utilisés ultérieurement.
      REMARQUE: Il en résulte un dispositif coaxial de focalisation du flux avec trois hauteurs différentes de 120 μm pour le noyau, 200 μm pour la coque et 300 μm pour les canaux d’huile.
    9. Afin d’utiliser l’appareil juste après le collage plasma, injecter soigneusement mais fermement 30 μL de solution de revêtement hydrophobe dans les canaux fluidiques pour obtenir un revêtement hydrophobe. Ensuite, purgez immédiatement l’air dans les canaux jusqu’à ce qu’aucun résidu de la solution de revêtement hydrophobe ne soit observé dans l’appareil.
    10. Liez le dispositif de dissociation en traitant d’abord le côté à motifs de l’appareil et un verre coulissant nettoyé avec du plasmaO2 pendant 2 minutes, puis assemblez-les pour un durcissement ultérieur dans le four à 80 ° C pendant la nuit.
      REMARQUE: Les appareils peuvent être stockés jusqu’à une utilisation ultérieure.

2. Préparation des solutions

  1. Solutions de stock. Tout d’abord, préparez des solutions mères (solutions concentrées) qui seront diluées à des concentrations plus faibles pour une utilisation réelle.
    REMARQUE: Les solutions de stock sont utilisées pour économiser du temps de préparation, conserver les matériaux, réduire l’espace de stockage et améliorer la précision lors de la préparation d’une solution de travail à des concentrations plus faibles.
    1. Préparer 30 mL de solution à 2x noyau (16 % de PEG et 34 % de milieux de gradient de densité) : mélanger 4,8 g de PEG de 35 kDa, 10,2 mL de milieux de gradient de densité et 19,8 mL de milieux DMEM/F12. Filtrer cette solution centrale à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm.
    2. Préparer 50 mL d’huile minérale avec 3 % de tensioactif : mélanger 48,5 mL d’huile minérale et 1,5 mL de tensioactif. Conserver dans un état stérile après filtration à travers un filtre à seringue de 0,22 μm.
    3. Préparer 50 mL d’huile minérale avec 0,5 % de tensioactif : mélanger 49,75 mL d’huile minérale et 0,25 mL de tensioactif. Conserver dans un état stérile.
    4. Préparer 1 M de dithiotheritol (DTT) : dissoudre 1,5425 g de DTT dans 10 mL d’eau distillée. Conserver dans un état stérile.
    5. Préparer 1 M de triéthanolamine (TEA) : ajouter 66,4 μL de TEA dans 433,6 μL d’eau distillée. Conserver dans un état stérile.
    6. Préparer 1% de Pluronic F127 (PF127) : dissoudre 100 mg de PF127 dans 10 mL d’eau distillée. Conserver dans un état stérile.
  2. Solutions de travail
    1. Préparer une émulsion réticulante en mélangeant 4,5 mL d’huile minérale avec 3 % de tensioactif et 300 μL de 1 M TNT (rapport 1:15). Vortex la solution pendant 2 min et sonicate pendant 45-60 min dans un bain à ultrasons à 20 °C. Chargez cette solution dans une seringue de 5 mL avec une aiguille de 27 G.
      REMARQUE: L’émulsion est générée par un mélange d’huile / eau sonique.
    2. Préparer une solution d’huile de protection en chargeant l’huile minérale avec un tensioactif à 0,5% dans une seringue de 5 mL avec une aiguille de 27 G.
    3. Préparer la solution de coquille (8 % p/v de PEG-4-Mal et 15 mM de TEA) en ajoutant 32 mg de PEG-4-Mal dans 400 μL de 1x DPBS pour former une solution à 8 % p/v, et faire tourbillonner la solution pendant 2 min. Ensuite, ajouter 6 μL de 1 M TEA (concentration finale 15 mM TEA). Enfin, centrifugez à 13 000 x g pendant 5 min à travers un filtre à rotation et maintenez-le dans l’obscurité sur la bascule pendant 30 min. Ensuite, chargez cette solution dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 27 G.
      REMARQUE: Laissez le récipient PEG-4-Mal reposer à température ambiante pendant 10 minutes avant d’ouvrir le couvercle et soufflez le gaz N2 pour remplacer le O2 par N2 avant de fermer le couvercle. Vortex TEA avant d’ajouter à la solution.
  3. Préparer la suspension cellulaire en solution centrale
    1. Traiter les cSEh avec de la trypsine pendant 5 à 10 min à 37 °C. Ensuite, récupérez-les dans des assiettes. Trempez la trypsine avec le milieu après le détachement cellulaire, puis transférez les cellules dans un tube conique de 15 mL.
    2. Centrifuger la suspension de cellule en vrac (400 x g, 5 min). Aspirer soigneusement le surnageant, puis remettre en suspension la pastille cellulaire en utilisant un volume minimal de milieu de croissance. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
      REMARQUE: Les aliquotes cellulaires typiques contiennent 12-20 x 106 cellules et sont suffisantes pour faire 400 μL de la solution de base.
    3. Prélever 12-20 x 106 cellules de la suspension de cellules en vrac et centrifuger la suspension de cellules/milieux (400 x g, 5 min).
    4. Aspirer soigneusement les milieux de la pastille cellulaire. Ensuite, ajouter 200 μL de milieu et 200 μL de solution de PEG 2x (concentration finale 30-50 x 106 cellules/mL) et mélanger doucement.
      REMARQUE: De faibles concentrations cellulaires (moins de 20 x 106 cellules / mL) ont entraîné de nombreuses capsules vides.
    5. Ajouter 30 μL de 1% de PF127 à la solution.
    6. Insérez une barre de micro-agitateur (2 mm x 7 mm) dans une seringue de 1 mL, puis chargez la solution de noyau contenant la cellule dans la seringue avec une aiguille de 27 G. Gardez la solution froide avec de la glace pendant tout le processus d’encapsulation.

3. Configuration expérimentale

  1. Placer le dispositif de gouttelettes PDMS collé, quatre pièces de 20 cm de long et une pièce de microtubes d’entrée de 5 cm de long (0,38 mm D.I. x 1,1 mm O.D.), une pièce de tube de sortie de 10 cm (0,5 mm I.D. x 1,5 mm O.D.), et six pièces de tubes de raccord de 0,5 cm (1 mm I.D. x 1,8 mm O.D.) sous une source de lumière germicide (généralement intégrée dans les armoires de sécurité biologique) et stériliser pendant 30 Min.
  2. Utilisez des pinces pour insérer le tube dans les orifices d’entrée fluidiques et les orifices de dissociation.
  3. Utilisez les trois morceaux de microtubes d’entrée de 20 cm de long pour la coque, l’huile, les entrées d’émulsion de réticulation et une pièce pour l’entrée du dispositif de dissociation. Ensuite, insérez l’extrémité opposée des tubes à l’aiguille de la seringue avec la solution correspondante. Pendant ce temps, connectez l’entrée centrale du dispositif microfluidique et la sortie du dispositif de dissociation avec un microtube de 5 cm (Figure 1C).
    REMARQUE: Les microtubes d’entrée doivent être étroitement fixés dans les tubes de raccord, qui ont été insérés à la dernière étape.
  4. Insérez un tube de sortie dans l’orifice de sortie fluidique et placez l’extrémité opposée dans un réservoir de collecte.
  5. Placez l’appareil sur une scène de microscope et fixez le tube pour éviter de bouger. Alignez et concentrez le microscope sur la buse de l’appareil pour l’inspection du débit.
  6. Placez chaque seringue sur différentes pompes à seringues et fixez-la correctement (Figure 1B). Programmez chaque pompe selon les protocoles du fabricant aux débits suivants : noyau (3-5 μL/min), coque (3-5 μL/min), huile de blindage (20-80 μL/min) et huile de réticulation (40-60 μL/min). Démarrez le débit dans toutes les pompes.
  7. Attendez que chaque fluide pénètre dans l’appareil et remplissez les canaux tout en poussant l’air restant.
    REMARQUE: S’il y a une grande quantité d’air dans le tuyau d’entrée, augmentez temporairement chaque débit jusqu’à ce que l’air soit complètement éliminé. Gardez à l’esprit qu’un débit excessif pourrait entraîner une défaillance de la liaison PDMS-PDMS.
  8. Lorsque la formation de la capsule est stabilisée (Figure 3), placer l’extrémité opposée du tube de collecte sur un nouveau tube conique avec 5 mL de milieu mTeSR.
    REMARQUE: Le milieu contient 10 μM d’inhibiteur de ROCK, 100 U / mL de pénicilline et 100 μg / mL de streptomycine.
  9. Après avoir recueilli un nombre suffisant de capsules, incuber à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 10 min. Les capsules résidant en phase huileuse seront en haut du tube (voir Figure 4A). En tapotant doucement sur le tube, les capsules se sédimentent au fond. Après cela, la plupart de l’huile et des médias peuvent être aspirés.
  10. Recueillez les capsules au fond du tube conique, placez-les sur une passoire cellulaire (taille des pores de 100 μm) et lavez-les avec de grandes quantités de milieu. Ensuite, collectez les microcapsules à l’aide d’un milieu de 2 mL dans une plaque de culture de 6 puits en faisant passer le média à travers le filtre lorsqu’il est inversé sur la plaque du puits (voir la figure 4A).

4. Culture et analyse de cSEh dans des microcapsules

  1. Culture de base
    1. Incuber les capsules de cellules souches dans une boîte de culture à 6 puits à 37 °C avec 5 % de CO2.
    2. Changez le média tous les deux jours en collectant les capsules sur un filtre à tamis cellulaire, en les lavant avec un excès de média et en les resusmettant dans un nouveau puits dans des plaques de 6 puits avec un média de 2 mL comme cela a été fait à l’étape 3.10.
    3. Cultivez les capsules pendant au moins 10 jours.
  2. Effectuer le test vivant/mort pour déterminer la viabilité des cellules souches encapsulées.
    1. Décongeler les solutions d’essai vivantes/mortes (homodimère d’éthidium-1 et calcéine AM).
    2. Ajouter 4 μL de l’homodimère d’éthidium 2 μM 1 et 1 μL des solutions AM de calcéine 4 μM à 2 mL de DPBS stérile. Vortex pour assurer un mélange complet.
    3. Recueillir environ 100 microcapsules sur une passoire cellulaire et les rincer avec du DPBS stérile pour permettre la diffusion du milieu hors des capsules.
    4. Collectez-les à nouveau sur une plaque de culture de 12 puits en utilisant 1 mL de la solution préparée à l’étape 4.2.2. Incuber à 37 °C pendant 20 min.
    5. Visualisez les cellules sous un microscope à fluorescence.
      REMARQUE: La viabilité cellulaire est quantifiée en calculant le pourcentage de cellules vivantes, qui sont visualisées en vert, parmi le nombre total de cellules.
  3. Caractérisation de la taille des sphéroïdes.
    1. Si vous le souhaitez, placez la plaque de puits avec des microcapsules sous le microscope et mesurez le diamètre des sphéroïdes indiqué sur le logiciel associé avec des barres d’échelle appropriées.
    2. Mesurez et analysez la taille des sphéroïdes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En suivant le protocole mentionné ci-dessus, le lecteur sera en mesure de fabriquer des dispositifs microfluidiques et de produire des microcapsules porteuses de cellules. La figure 3A montre des exemples de microcapsules optimales et sous-optimales fabriquées à l’aide de la génération de gouttelettes microfluidiques. Différentes formulations de PEG-4-Mal ont donné lieu à des capsules de morphologies variables - les capsules ridées étaient associées à une mauvaise gélification, à une faible intégrité mécanique et ne résistaient pas à la culture dans un bioréacteur agité. Les capsules lisses observées à une teneur en PEG de >6% représentaient la morphologie de capsule souhaitée et étaient suffisamment robustes pour la culture cellulaire. La structure noyau-coquille a été confirmée par l’incorporation de microbilles dans le noyau et de fractions fluorescentes dans la coquille de microcapsules. L’agrégation des perles au centre des capsules, comme on le voit sur la figure 3B , a été utilisée comme indication que le noyau était aqueux et que les perles étaient libres de se déplacer. L’anneau fluorescent observé à la figure 3C indiquait la présence d’une coquille d’hydrogel et a été utilisé pour déterminer l’épaisseur de la coquille. Nous recommandons aux utilisateurs d’utiliser l’incorporation de microbilles et le marquage fluorescent dans les premières étapes de l’établissement du processus d’encapsulation.

Une fois le processus d’encapsulation établi, on peut passer à l’encapsulation des HPC. Bien que ce protocole décrive l’encapsulation des cellules H9, nous avons utilisé une stratégie similaire pour encapsuler une autre ligne hESC (HUES-8) et une ligne iPSC (1016). 7

Bien que l’encapsulation puisse être effectuée en utilisant uniquement le dispositif d’encapsulation, nous avons noté que les CSEh avaient tendance à s’agglutiner dans le système, ce qui entraînait une encapsulation non uniforme ou une occupation de la capsule. Pour relever ce défi, nous avons conçu un dispositif de dissociation ou de filtration et l’avons positionné en amont du dispositif d’encapsulation. Ce dispositif de dissociation comprenait un canal d’écoulement avec un réseau de poteaux en forme de triangle mesurant 200 μm par côté et avec un pas allant de 400 μm à l’entrée à 30 μm à la sortie, de sorte que les touffes sont retenues ou brisées avant d’entrer dans le dispositif d’encapsulation (voir figure 1D)7. L’utilisation du dispositif de dissociation permet d’améliorer considérablement l’uniformité des sphéroïdes et d’augmenter l’occupation cellulaire des capsules de 57% à >90%7.

La figure 4B,C décrit les résultats représentatifs d’une exécution d’encapsulation. Comme on peut le voir sur ces images, les cellules H9 ont une viabilité élevée avec une viabilité de >95% obtenue régulièrement pendant les cycles d’encapsulation. Nous avons comparé le taux de croissance (voir la figure 4B, C) et le potentiel de différenciation des sphéroïdes encapsulés par rapport aux sphéroïdes non encapsulés7, et avons déterminé que le processus d’encapsulation n’a pas d’effets néfastes sur les CSEh. D’autre part, l’encapsulation des HSCC présente plusieurs avantages. Les sphéroïdes encapsulés sont faciles à manipuler et peuvent être distribués dans des plaques de microtitrage pour développer des protocoles de différenciation ou tester des thérapies. Notre laboratoire s’intéresse à l’utilisation de microcapsules comme supports de cellules souches pour la culture en suspension dans des bioréacteurs agités et a démontré que l’enveloppe d’hydrogel offre une protection contre les dommages de cisaillement dans de telles cultures7. C’est une voie supplémentaire que nous poursuivons en créant des microcapsules bioactives où l’enveloppe d’hydrogel peut être chargée de facteurs de croissance pour la livraison locale et continue d’indices inductifs pendant la différenciation.

Figure 1
Figure 1 : Fabrication de microcapsules noyau-enveloppe. (A) Le dispositif microfluidique pour la génération de capsules se compose de quatre canaux d’entrée (noyau, coquille, huile et huile de réticulation) et d’un canal serpentin qui mène à un tube de collecte. Le dispositif est fabriqué de telle sorte que les canaux de noyau, de coque et d’huile mesurent respectivement 120 μm (H1),200 μm (H 2) et 300 μm (H3). L’encart représente une vue en coupe transversale au niveau de la buse - la jonction entre les flux aqueux et d’huile. Cette vue en coupe transversale est inclinée de 90° pour donner au lecteur une meilleure vue des canaux d’écoulement coaxiaux. Une représentation 3D du processus de fabrication de microcapsule noyau-coque illustre comment le flux coaxial est généré en amont de la jonction focalisant l’écoulement pour produire une structure de microcapsule noyau-coque. L’émulsification est obtenue en exposant des gouttelettes aqueuses à deux flux d’huile, dont le premier est conçu pour stabiliser les gouttelettes, et le second pour fournir la TNT réticulée, qui réagit avec PEG-4-Mal. Ce chiffre a été modifié par rapport à la référence12. Copyright 2019, American Chemical Society. B) Configuration expérimentale du système d’encapsulation montrant l’emplacement des pompes à seringues, des tubes, des dispositifs microfluidiques et du tube de collecte des capsules. (C) Image du système d’encapsulation, qui consiste en des dispositifs de dissociation et d’encapsulation dans une séquence. D) Conception du dispositif de dissociation microfluidique utilisé pour éviter que de gros agrégats cellulaires ne pénètrent dans le dispositif de microencapsulation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Fabrication de dispositifs microfluidiques utilisés pour l’encapsulation. (A) Fabrication du dispositif d’encapsulation. Trois couches de résine photosensible SU-8 ont été recouvertes d’un revêtement de rotation et de motifs photo pour générer des canaux de noyau, de coque et d’huile de différentes hauteurs. Les canaux centraux ont une largeur de 220 μm qui se rétrécit à la jonction de la capsule à 135 μm. Les canaux pour toutes les phases suivent le même principe: les canaux de coque et d’huile commencent avec une largeur de 500 μm, se rétrécissent à la jonction à 220 μm et l’huile de blindage commence à 500 μm se rétrécissant à 270 μm. La serpentine de sortie a une largeur de 1,5 mm et une longueur d’environ 55 mm. Les pièces PDMS supérieures et inférieures ont ensuite été alignées et collées au plasma. (B) Fabrication du dispositif de dissociation. Une couche de résine photosensible SU-8 a été recouverte d’un revêtement de spin et d’un motif photo pour générer des canaux de dissociation. La pièce PDMS a ensuite été collée au plasma avec une lame de verre. Le dispositif de dissociation se compose d’une petite chambre d’une hauteur de 30 μm, d’une longueur de 16,5 mm et d’une largeur de 5 mm à l’entrée et de 1,7 mm à la sortie. Il a des structures en forme de triangle (200 μm, équilatéral) qui sont séparées les unes des autres par 420 μm de l’entrée et se rapprochent sur le chemin de la sortie, avec une séparation de 50 μm dans la dernière rangée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Caractérisation des microcapsules. (A) Différences dans la morphologie de la capsule en fonction de la teneur en PEG-4-Mal dans la coquille. Les capsules lisses aux bords brillants sont associées à l’intégrité mécanique souhaitée. (B) Confirmation du noyau aqueux des microcapsules. Les microbilles piégées sont libres de se déplacer dans le noyau aqueux et de s’agréger au centre des microcapsules. (C) Confirmation de la structure noyau-enveloppe par l’incorporation de PEG marqué Rhodamine B dans la coque des microcapsules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Encapsulation des CSEh. (A) Les microcapsules en phase huileuse sont collectées dans un tube conique rempli de milieu. Une fois que les microcapsules sont faites pour se déposer au fond du tube, l’huile et les milieux sont aspirés, les microcapsules sont lavées puis transférées dans une plaque de 6 puits pour la culture. (B) Coloration vivante/morte 6 h après l’encapsulation des cellules H9. L’image supérieure a été prise à 10x, et l’image inférieure à 20x. (C) Images comparant les tailles de sphéroïdes qui changent au fil du temps pour les cellules H9 dans les capsules et dans les plaques de culture 3D commerciales (images du bas). (D) Quantification du diamètre des sphéroïdes qui augmente pour les CSEh dans les microcapsules et dans les plaques de culture 3D standard pendant 7 jours dans les milieux H9. Analyse statistique -t-test, p < 0,05, n = 20. Barre d’échelle : 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le processus d’encapsulation décrit ici entraîne la formation reproductible de sphéroïdes hPSC. Le format microcapsule facilite la distribution de sphéroïdes dans les puits d’une plaque de microtitrage pour des expériences visant à améliorer / optimiser les protocoles de différenciation ou à tester des thérapies. Les sphéroïdes de cellules souches encapsulés peuvent également être utilisés dans des cultures en suspension où l’enveloppe d’hydrogel protège les cellules contre les dommages induits par le cisaillement7.

Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole. Il est important de maintenir les débits des flux de noyaux, d’obus et de pétrole dans la plage décrite dans la section Protocole. Si le débit de la coquille est trop faible, le débit devient instable, ce qui entraîne des capsules déformées et mécaniquement instables. Une encapsulation cellulaire réussie doit ressembler aux microcapsules illustrées à la figure 4C. Les microcapsules doivent avoir un diamètre similaire et avoir un nombre comparable de cellules piégées dans le noyau. L’agrégation de cellules individuelles en sphéroïdes se produit généralement dans les 48 h et l’absence de formation de sphéroïdes à 72 h est un signe avant-coureur. L’une des raisons de l’absence de formation de sphéroïdes peut être que les molécules visqueuses dans le noyau ne s’échappent pas assez rapidement à travers la coquille de l’hydrogel. Nous avons rencontré ce scénario lors de l’ajustement de la viscosité de la solution centrale à l’aide de polymères de haut poids moléculaire tels que la carboxyméthylcellulose (MW 250 kD). On peut encapsuler des microbilles (voir la figure 3B) pour tester si ces objets de la taille d’une cellule sont libres de se déplacer autour du noyau et à quelle vitesse les composants du noyau s’échappent. Nous avons également constaté un manque de formation de sphéroïdes lors de l’utilisation de concentrations de PEG-4-Mal de >8 % p/v. Dans ce scénario, la porosité et la diffusivité de la coquille d’hydrogel sont diminuées et les éléments à viscosité élevée dans le noyau ne s’échappent pas assez rapidement pour permettre aux cellules de se former en agrégats. Il est concevable que la qualité du PEG-4-Mal puisse varier d’un lot à l’autre ou d’un fabricant à l’autre. Par conséquent, un certain ajustement de la concentration de polymère dans la coque peut être nécessaire. Encore une fois, la méthode d’incorporation des billes devrait révéler à quelle vitesse les composants visqueux du noyau sont déplacés par les molécules d’eau. D’après notre expérience, cela devrait se produire dans les 3 heures suivant le transfert de microcapsules dans l’environnement aqueux.

Le protocole d’encapsulation décrit ici a bien fonctionné pour plusieurs lignées hPSC7, les hépatocytes primaires10 et plusieurs lignées cellulaires cancéreuses (résultats non publiés). Cependant, nous avons rencontré des difficultés à former des sphéroïdes après l’encapsulation d’hépatocytes dérivés de cellules souches (sc) et de cellules β sc. Le dépannage avec des microbilles encapsulées a révélé que les composants visqueux étaient rapidement élués du noyau et que les cellules étaient libres de se déplacer et de former des contacts cellule-cellule. Un dépannage supplémentaire a consisté à titrer la concentration de DTT réticulant di-thiol (présente dans la phase huileuse) de 66 mM à 10 mM. La formation de sphéroïdes pour les sc-hépatocytes et les cellules β s’est produite à cette concentration plus faible de TNT. Par conséquent, l’utilisateur peut envisager d’optimiser la concentration du réticulateur, mais uniquement si les autres étapes de dépannage répertoriées ci-dessus n’ont pas réussi. Nous constatons que la concentration de TNT est essentielle au maintien de l’intégrité mécanique des microcapsules avec une TNT de 66 mM, ce qui donne des microcapsules mécaniquement robustes et est non toxique pour la grande majorité des types de cellules utilisés à ce jour.

Un certain nombre de stratégies pour créer des constructions de cellules souches 3D ont été décrites dans la littérature. Les avantages de la formation de constructions de cellules souches dans des microcapsules noyau-enveloppe sont multiples. Une fois encapsulés, les sphéroïdes peuvent être manipulés facilement avec des capsules d’hydrogel offrant une protection contre les dommages de cisaillement. Les sphéroïdes encapsulés peuvent être cultivés en suspension avec une agitation vigoureuse sans endommager les cellules souches.

Il existe de multiples moyens d’étendre les capacités des microcapsules. Notre équipe a déjà décrit l’utilisation d’hydrogels contenant de l’héparine pour l’encapsulation des hépatocytes et des cellules souches 8,12, et développe actuellement des microcapsules bioactives contenant de l’héparine qui servent de dépôts pour le stockage et la libération locale d’indices inductifs (GF) aux cellules souches. De telles microcapsules peuvent aider à réduire l’utilisation de GF coûteux tout en améliorant les résultats de différenciation. Les microcapsules peuvent être encore améliorées en incorporant des protéines ECM dans le noyau, modulant ainsi le microenvironnement des cellules souches. Les microcapsules noyau-coque peuvent être rendues dégradables pour faciliter la récupération des sphéroïdes hPSC13,14. Dans l’ensemble, les microcapsules noyau-enveloppe représentent une technologie de plate-forme qui peut être modifiée et améliorée pour répondre aux besoins d’un protocole spécifique de différenciation des cellules souches.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue en partie par les subventions du Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, de la J. W. Kieckhefer Foundation, de la Al Nahyan Foundation, de Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) et des NIH (DK107255).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Syringe Filters Genesee Scientific 25-244
1 ml syringe luer-lock tip BD 309628
1x DPBS Corning 23220003
4-arm PEG maleimide, 10kDa Laysan Inc. 164-68
5 ml syringe luer-lock tip BD 309646
6-WELL NON-TREATED PLATE USA Scientific CC7672-7506
Aquapel Applicator Pack Aquapel Glass Treatment 47100
CAD software Autodesk AutoCAD v2020
CELL STRAINER 100 µm pore size cardinal 335583
Chlorotrimethylsilane Aldrich 386529-100mL
Countess II FL Automated Cell Counter Life technology A27974
Digital hot plate Dataplate
Digital vortex mixer Fisher Scientific 215370
Distilled water Gibco 15230-162
Dithiotheritol (DTT) Sigma D0632-10G
DMEM/F12 media gibco 11320-033
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher scientific 14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge live 13-100-675
HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Inverted Fluorescence Motorized Microscope Olympus Olympus IX83
Laurell Spin Coaters Laurell Technologies WS-650MZ-23NPPB
Live/Dead mammalian staining kit Fisher L3224
Magic tape Staples 483535
Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) Scientific Commodities, Inc BB31695-PE/2
Micro stir bar Daigger Scientific EF3288E
MilliporeSigma Filter Forceps Fisher scientific XX6200006P
Mineral oil Sigma M8410-1L
mTeSR 1 Basal Medium STEMCELL TECHNOLOGY 85850
Needles-Stainless Steel  14 Gauge CML supply 901-14-025
Needles-Stainless Steel  15 Gauge CML supply 901-15-050
OptiPrep STEMCELL TECHNOLOGY 7820
Oven Thermo Scientific HERA THERM Oven
Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) Gemini 400-109
Petri Dish 150X20 Sterile Vent Sarstedt, Inc. 82.1184.500
Plasma Cleaning System Yield Engineering System, Inc. YES-G500
Pluronic F-127 Sigma P2443-250G
Poly(ethylene glycol) 35kDa Sigma 94646-250G-F
PrecisionGlide Needle 27G BD 305109
Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride SELLECK CHEM S1049-10mg
Silicon wafer 100mm University Wafer 452
Slide glass (75mm ´ 25mm) CardinalHealth M6146
Span 80 Sigma S6760-250ML
SpeedMixer Thinky ARE-310
Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) Costar 8160
SU-8 2025 Kayaku Advanced Materials Y111069 0500L1GL
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials Y020100 4000L1PE
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades fisher scientific 22-079-684
SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow Corning 2065622
Syringe pump New Era Pump System, Inc NE-4000
Triethanolamine Sigma-aldrich T58300-25G
TrypLE Express Gibco 12604-013
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) Cole-Parmer 06419-01
Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) Cole-Parmer 06419-04
Ultrasonic cleaner FS20D Fisher Scientific CPN-962-152R
Vacuum desiccator Bel-Art F42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x ZEISS 435421-0000-000
μPG 101 laser writer Heidelberg Instruments HI 1128

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
  2. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
  3. Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
  4. Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
  5. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
  6. Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
  7. Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
  8. Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
  9. Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
  10. Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
  11. Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
  12. Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
  13. Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
  14. You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).

Tags

Bioingénierie numéro 176 fabrication microfluidique biofabrication chimie du clic microcapsules noyau-enveloppe encapsulation sphéroïdes de cellules souches
Fabrication microfluidique de microcapsules noyau-coquille transportant des sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gwon, K., Hong, H. J.,… More

Gwon, K., Hong, H. J., Gonzalez-Suarez, A. M., Stybayeva, G., Revzin, A. Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids. J. Vis. Exp. (176), e62944, doi:10.3791/62944 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter