Summary
Dieser Artikel beschreibt die Verkapselung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) mit einem koaxialen Flussfokussiergerät. Wir zeigen, dass diese mikrofluidische Verkapselungstechnologie eine effiziente Bildung von hPSC-Sphäroiden ermöglicht.
Abstract
Dreidimensionale (3D) oder sphäroide Kulturen humaner pluripotenter Stammzellen (hPS-Zellen) bieten die Vorteile verbesserter Differenzierungsergebnisse und Skalierbarkeit. In diesem Artikel beschreiben wir eine Strategie für die robuste und reproduzierbare Bildung von hPSC-Sphäroiden, bei der eine koaxiale Flussfokussierungsvorrichtung verwendet wird, um hPSCs in Kern-Shell-Mikrokapseln einzuschließen. Die Kernlösung enthielt Einzelzellsuspension von hPS-Zellen und wurde durch den Einbau von hochmolekularem Polyethylenglykol (PEG) und Dichtegradientenmedien viskos gemacht. Der Schalenstrom bestand aus PEG-4-Armmaleimid oder PEG-4-Mal und floss entlang des Kernstroms zu zwei aufeinanderfolgenden Ölverbindungen. Die Tröpfchenbildung erfolgte an der ersten Ölverbindung, wobei sich die Schalenlösung um den Kern wickelte. Die chemische Vernetzung der Schale erfolgte am zweiten Ölübergang durch Einbringen eines Dithiol-Vernetzers (1,4-Dithiothreitol oder DTT) in diese Tröpfchen. Der Vernetzer reagiert mit Malemid-funktionellen Gruppen über die Klickchemie, wodurch eine Hydrogelhülle um die Mikrokapseln gebildet wird. Unsere Verkapselungstechnologie produzierte Kapseln mit einem Durchmesser von 400 μm bei einer Rate von 10 Kapseln pro Sekunde. Die resultierenden Kapseln hatten eine Hydrogelhülle und einen wässrigen Kern, der es einzelnen Zellen ermöglichte, sich schnell zu Aggregaten zusammenzusetzen und Sphäroide zu bilden. Der Prozess der Verkapselung wirkte sich nicht negativ auf die Lebensfähigkeit von hPSCs aus, wobei 3 Tage nach der Verkapselung eine Lebensfähigkeit von >95% beobachtet wurde. Zum Vergleich: In festen Gel-Mikropartikeln (ohne wässrigen Kern) verkapselte hPS-Zellen bildeten keine Sphäroide und hatten 3 Tage nach der Verkapselung eine <50%ige Lebensfähigkeit. Die Sphäroidbildung von hPS-Zellen in Kernhüllen-Mikrokapseln erfolgte innerhalb von 48 h nach der Verkapselung, wobei der Sphäroiddurchmesser eine Funktion der Zellimpfdichte war. Insgesamt war die in diesem Protokoll beschriebene mikrofluidische Verkapselungstechnologie für die Verkapselung und Sphäroidbildung von hPSCs gut geeignet.
Introduction
Aufgrund der verbesserten Pluripotenz und des Differenzierungspotenzials dieses Kulturformats 1,2,3 besteht ein erhebliches Interesse an 3D-Kulturen humaner pluripotenter Stammzellen (hPSCs). hPS-Zellen werden typischerweise mittels Bioreaktoren, Mikrotöpfen, Hydrogelen und polymeren Gerüsten zu Sphäroiden oder anderen 3D-Kulturformaten geformt 4,5,6. Die Verkapselung bietet eine weitere Möglichkeit, einzelne hPSCs in Sphäroide zu organisieren. Einmal verkapselte hPSC-Sphäroide können mit Leichtigkeit gehandhabt und in Mikrotiterplatten zur Differenzierung, Krankheitsmodellierung oder Drogentestexperimenten übertragen werden. Die Einkapselung von hPSCs in einer Hydrogelschicht schützt die Zellen auch vor Scherschäden und ermöglicht es, Sphäroide in einem Bioreaktor mit hohen Rührraten zu kultivieren7.
Unsere Methodik zur Stammzellverkapselung hat sich im Laufe der Zeit weiterentwickelt. Zunächst konzentrierten wir uns auf feste Hydrogel-Mikropartikel und demonstrierten eine erfolgreiche Verkapselung und Kultivierung von embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) der Maus)8. Es wurde jedoch festgestellt, dass menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen) eine geringe Lebensfähigkeit aufwiesen, wenn sie in solchen Hydrogel-Mikropartikeln verkapselt wurden, vermutlich aufgrund der größeren Notwendigkeit für diese Zellen, Zell-Zell-Kontakte nach der Verkapselung wiederherzustellen. Wir argumentierten, dass heterogene Mikrokapseln, die einen wässrigen Kern besitzen, besser für die Verkapselung von Zellen geeignet sein könnten, die auf einer schnellen Wiederherstellung von Zell-Zell-Kontakten beruhen. Das Konzept der koaxialen Strömungsfokussierung mikrofluidischer Vorrichtung zur Herstellung von wässrigen Kern- / Hydrogel-Hüllen-Mikrokapseln wurde von He et al.9 übernommen, aber anstelle von Alginat, das im ursprünglichen Ansatz verwendet wurde, wurde ein PEG-basiertes Hydrogel in die Schale integriert. Wir zeigten zunächst eine erfolgreiche Verkapselung und Sphäroidbildung von primären Hepatozyten in Kernhüllen-Mikrokapseln10 und beschrieben zuletzt die Verkapselung von hES- und iPS-Zellen7. Wie in Abbildung 1A dargestellt, werden Kapseln in einer Strömungsfokussierungsvorrichtung hergestellt, bei der die Schalen- und Kernströme von Seite zu Seite in koaxiale Strömung übergehen, bevor sie in die Ölphase ausgestoßen werden. Der Kernstrom enthält Zellen und Additive, die die Viskosität der Lösung erhöhen (nicht-reaktives PEG MW 35kD und Iodixanol - Handelsname OptiPrep), während der Schalenstrom reaktive Moleküle enthält (PEG-4-Mal). Der kontinuierliche koaxiale Strömungsstrom wird in Tröpfchen diskretisiert, die die Kern-Shell-Architektur beibehalten. Die Kern-Schalen-Struktur wird durch die Exposition gegenüber Di-Thiol-Vernetzer (DTT) dauerhaft, der mit PEG-4-Mal über Klickchemie reagiert und zur Bildung einer dünnen (~ 10 μm) Hydrogelhaut oder -schale führt. Nachdem die Emulsion gebrochen und die Kapseln in eine wässrige Phase überführt wurden, diffundieren Moleküle des PEG aus dem Kern und werden durch Wassermoleküle ersetzt. Dies führt zu wässrigen Kern- und Hydrogelschalen-Mikrokapseln.
Im Folgenden finden Sie Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Herstellung mikrofluidischer Geräte, zur Vorbereitung von Zellen und zur Verkapselung von hPS-Systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Geräteherstellung
- Erstellen Sie die Entwürfe für die Mikroverkapselungsvorrichtung und die Dissoziationsvorrichtung mit der CAD-Software10,11.
- Schichten Sie die drei Schichten des SU-8-Fotolacks nacheinander auf einem Siliziumwafer (Abbildung 2A), um Strukturen mit den gewünschten Höhen zu erreichen: 60, 100 und 150 μm.
HINWEIS: Der Prozess für die oberen und unteren Formen ist identisch.- Schichten Sie einen sauberen 10-cm-Siliziumwafer mit SU-8 2025-Negativ-Fotolack bei 1.100 U / min, um die erste 60-μm-Schicht zu erzeugen. Nach einem weichen Backen bei 65 °C für 3 min und 95 °C für 10 min auf einer heißen Platte belichten Sie die Form mit einem maskenlosen Aligner, indem Sie die Designdatei des Kernkanalmusters auf den μPG 101 PC hochladen. Fahren Sie dann mit dem Nachbelichtungsbacken bei 65 ° C für 3 Minuten und bei 95 ° C für 10 Minuten fort.
- Schichten Sie die zweite SU-8 2025-Schicht (40 μm) mit 1.500 U / min und belichten Sie, indem Sie die entsprechende CAD-Datei für das Schalenkanalmuster hochladen.
HINWEIS: Weiche und Nachbelichtungsbacken ähnelten dem vorherigen Schritt. - Schichten Sie die dritte SU-8 2025-Schicht mit 1.400 U / min an, um eine Höhe von 50 μm zu erreichen, und wiederholen Sie den obigen Vorgang, legen Sie jedoch die Strukturen für die Ölphase frei.
- Entwickeln Sie die Form mit allen drei Schichten in einem einzigen Schritt durch Eintauchen in SU-8 Developer, bis der gesamte unbelichtete Fotolack entfernt ist.
- Backen Sie die Form auf einer heißen Platte bei 160 ° C für 10 Minuten, um die Haftung zu verbessern und kleinere Risse zu versiegeln, die nach der Entwicklung auftreten könnten.
- Setzen Sie die Form Chlortrimethylsilan aus, um im nächsten Schritt eine Elastomerbindung zu vermeiden, und legen Sie sie bis zur Verwendung in 15 cm große Petrischalen ein.
- Bereiten Sie die Form der Dissoziationsvorrichtung auf die gleiche Weise vor, wie in Abbildung 1D und Abbildung 2B beschrieben. Schichten Sie eine Schicht SU-8-Fotolack auf einen Siliziumwafer, wie weiter oben in Schritt 1.2.3 beschrieben, um Strukturen mit der gewünschten Höhe zu erreichen: 50 μm. Führen Sie das weiche Backen, die Entwicklung und das harte Backen nach der Belichtung ähnlich wie im vorherigen Schritt durch.
HINWEIS: Eine Reihe von dreieckigen Pfosten bedeckte die gesamte Kammer, wobei der Abstand zwischen den Pfosten abnahm, wenn die Kammerbreite zum Auslass hin abnahm. Die Dreieckspfosten betrugen 200 μm pro Seite mit einer Steigung von 400 μm (am Einlass) bis 30 μm (am Auslass). - Bereiten Sie die Formen durch Softlithographie mit Polydimethylsiloxan (PDMS) vor.
- Mischen Sie PDMS-Elastomerbasis und Elastomerhärter im Verhältnis 10:1 w/w in einer Planetenzentrifuge. Gießen Sie die Mischung sowohl auf Mikroverkapselungs-Master-Formen als auch auf Dissoziations-Master-Form, um eine 3-4-mm-Schicht zu erzeugen.
HINWEIS: Eine Mischung aus 50 g Elastomerbasis mit 5 g Härter reicht aus, um eine Masterform mit 3 mm Dicke abzudecken. - Legen Sie die Petrischalen mit den Formen für 15 Minuten in einen Vakuum-Exsikkator, um das nicht ausgehärtete PDMS zu entgasen.
- Die Petrischalen in den Ofen schieben und bei 80 °C mindestens 60 min backen.
- Entfernen Sie die Master-Formen aus dem Ofen und lassen Sie sie abkühlen. Schneiden Sie das PDMS vorsichtig mit einem Präzisionsmesser nach der Form des Wafers und ziehen Sie die PDMS-Stücke aus der Masterform ab.
- Schneiden Sie die PDMS-Platten aus, indem Sie die Kanten jedes Geräts mit einem Skalpell beschneiden, und stanzen Sie dann die Einlass-/Auslassfluidikanschlüsse in der Dissoziationsvorrichtung und nur im oberen mikrofluidischen Gerät mit Edelstahlnadeln aus. Decken Sie die Geräte mit magischem Klebeband ab, um eine Kontamination zu vermeiden.
HINWEIS: Die Nadelanzeige beträgt 14 G bzw. 15 G für Einlass- bzw. Auslassanschlüsse. - Zum Verkleben behandeln Sie die gemusterten Seiten der oberen und unteren PDMS-Stücke mitO2-Plasma auf einem Plasma-Radierer für 2 min.
- Richten Sie beide PDMS-Teile unter einem Stereoskop aus, nachdem Sie eine dünne Trennschicht aus destilliertem Wasser direkt in die Mikrokanäle (2 μL) gegeben haben.
- Legen Sie das ausgerichtete PDMS-Gerät über Nacht bei 80 °C in den Ofen, um die Verklebung abzuschließen und das PDMS wieder in seinen ursprünglichen hydrophoben Zustand zu versetzen. Lagern Sie die Geräte bis zur weiteren Verwendung.
HINWEIS: Dies führt zu einem koaxialen Flussfokussiergerät mit drei verschiedenen Höhen von 120 μm für den Kern, 200 μm für die Schale und 300 μm für Ölkanäle. - Um das Gerät direkt nach der Plasmabindung zu verwenden, injizieren Sie vorsichtig, aber fest 30 μL hydrophobe Beschichtungslösung in die fluidischen Kanäle, um eine hydrophobe Beschichtung zu erreichen. Dann spülen Sie sofort Luft in die Kanäle, bis keine Rückstände der hydrophoben Beschichtungslösung im Gerät beobachtet werden.
- Verkleben Sie die Dissoziationsvorrichtung, indem Sie zuerst die gemusterte Seite des Geräts und ein gereinigtes Objektträgerglas für 2 min mitO2-Plasma behandeln und dann über Nacht zur weiteren Aushärtung im Ofen bei 80 °C zusammenbauen.
HINWEIS: Geräte können bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt werden.
- Mischen Sie PDMS-Elastomerbasis und Elastomerhärter im Verhältnis 10:1 w/w in einer Planetenzentrifuge. Gießen Sie die Mischung sowohl auf Mikroverkapselungs-Master-Formen als auch auf Dissoziations-Master-Form, um eine 3-4-mm-Schicht zu erzeugen.
2. Vorbereitung von Lösungen
- Lagerlösungen. Bereiten Sie zunächst Stammlösungen (konzentrierte Lösungen) vor, die für den tatsächlichen Gebrauch auf niedrigere Konzentrationen verdünnt werden.
HINWEIS: Lagerlösungen werden verwendet, um Vorbereitungszeit zu sparen, Materialien zu sparen, Lagerplatz zu reduzieren und die Genauigkeit bei der Herstellung einer Arbeitslösung in niedrigeren Konzentrationen zu verbessern.- Bereiten Sie 30 ml 2x Kernlösung (16% PEG und 34% Dichtegradientenmedien) vor: Mischen Sie 4,8 g 35 kDa PEG, 10,2 ml Dichtegradientenmedien und 19,8 ml DMEM/F12-Medien. Filtern Sie diese Kernlösung mit einem 0,22 μm Spritzenfilter.
- Bereiten Sie 50 ml Mineralöl mit 3% Tensid vor: Mischen Sie 48,5 ml Mineralöl und 1,5 ml Tensid. Nach der Filtration durch einen 0,22 μm Spritzenfilter in einem sterilen Zustand halten.
- Bereiten Sie 50 ml Mineralöl mit 0,5% Tensid vor: Mischen Sie 49,75 ml Mineralöl und 0,25 ml Tensid. In sterilem Zustand aufbewahren.
- 1 M Dithiotheritol (DTT) herstellen: 1,5425 g DVB-t in 10 ml destilliertem Wasser auflösen. In sterilem Zustand aufbewahren.
- 1 M Triethanolamin (TEA) herstellen: 66,4 μL TEA in 433,6 μL destilliertem Wasser hinzufügen. In sterilem Zustand aufbewahren.
- Bereiten Sie 1% Pluronic F127 (PF127) vor: 100 mg PF127 in 10 ml destilliertem Wasser auflösen. In sterilem Zustand aufbewahren.
- Funktionierende Lösungen
- Bereiten Sie eine Vernetzeremulsion vor, indem Sie 4,5 ml Mineralöl mit 3% Tensid und 300 μL 1 M DTT (Verhältnis 1:15) mischen. Wirbeln Sie die Lösung für 2 min vor und beschallen Sie für 45-60 min in einem Ultraschallbad bei 20 °C. Laden Sie diese Lösung in eine 5-ml-Spritze mit einer 27-G-Nadel.
HINWEIS: Emulsion entsteht durch Beschallung von Öl/Wasser-Gemisch. - Bereiten Sie Abschirmöllösung vor, indem Sie das Mineralöl mit 0,5% Tensid auf eine 5-ml-Spritze mit einer 27-G-Nadel laden.
- Bereiten Sie die Schalenlösung (8% w/v PEG-4-Mal und 15 mM TEA) vor, indem Sie 32 mg PEG-4-Mal in 400 μL 1x DPBS hinzufügen, um 8% w/v Lösung zu bilden, und wirbeln Sie die Lösung für 2 min. Fügen Sie dann 6 μL von 1 M TEA hinzu (Endkonzentration 15 mM TEA). Zum Schluss 5 min durch einen Schleuderfilter bei 13.000 x g zentrifugieren und 30 min im Dunkeln auf der Wippe halten. Dann laden Sie diese Lösung in eine 1-ml-Spritze mit einer 27-G-Nadel.
HINWEIS: Lassen Sie den PEG-4-Mal-Behälter 10 Minuten lang bei Raumtemperatur sitzen, bevor Sie den Deckel öffnen, und blasen SieN2-Gas, um das O2 durchN2 zu ersetzen, bevor Sie den Deckel schließen. Vortex TEA vor dem Hinzufügen zur Lösung.
- Bereiten Sie eine Vernetzeremulsion vor, indem Sie 4,5 ml Mineralöl mit 3% Tensid und 300 μL 1 M DTT (Verhältnis 1:15) mischen. Wirbeln Sie die Lösung für 2 min vor und beschallen Sie für 45-60 min in einem Ultraschallbad bei 20 °C. Laden Sie diese Lösung in eine 5-ml-Spritze mit einer 27-G-Nadel.
- Bereiten Sie die Zellsuspension in der Kernlösung vor
- Behandeln Sie die hPSCs mit Trypsin für 5 bis 10 min bei 37 °C. Dann sammle sie von Tellern. Löschen Sie das Trypsin nach der Zellablösung mit dem Medium und übertragen Sie die Zellen dann in eine 15 ml konische Röhre.
- Die Bulk-Cell-Suspension zentrifugieren (400 x g, 5 min). Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und suspendieren Sie dann das Zellpellet mit einem minimalen Volumen an Wachstumsmedium. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines automatisierten Zellzählers.
HINWEIS: Typische Zellaliquoten enthalten 12-20 x 106 Zellen und reichen aus, um 400 μL der Kernlösung herzustellen. - Nehmen Sie 12-20 x 106 Zellen aus der Bulk-Zellsuspension und zentrifugieren Sie die Zell-/Mediensuspension (400 x g, 5 min).
- Saugen Sie vorsichtig Medien aus dem Zellpellet ab. Dann 200 μL Medien und 200 μL 2x PEG-Lösung (Endkonzentration 30-50 x 106 Zellen/ml) hinzufügen und vorsichtig mischen.
HINWEIS: Niedrige Zellkonzentrationen (weniger als 20 x 106 Zellen/ml) führten zu vielen leeren Kapseln. - 30 μL 1% PF127 in die Lösung geben.
- Führen Sie eine Mikro-Rührstange (2 mm x 7 mm) in eine 1-ml-Spritze ein und laden Sie dann die Zelle, die die Kernlösung enthält, mit einer 27-G-Nadel auf die Spritze. Halten Sie die Lösung während des gesamten Verkapselungsprozesses mit Eis kalt.
3. Versuchsaufbau
- Platzieren Sie geklebte PDMS-Tröpfchenvorrichtung, vier Stück 20 cm lang und ein Stück 5 cm lange Einlassmikroröhrchen (0,38 mm I.D. x 1,1 mm O.D.), ein Stück 10 cm Auslassrohr (0,5 mm I.D. x 1,5 mm O.D.) und sechs Stück 0,5 cm passende Rohre (1 mm I.D. x 1,8 mm O.D.) unter einer keimtötenden Lichtquelle (typischerweise in biologische Sicherheitswerkbänke eingebaut) und sterilisieren Sie für 30 Min.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um den Schlauch in die fluidischen Einlassanschlüsse und die Dissoziationsöffnungen einzupassen.
- Verwenden Sie die drei Stücke von 20 cm langen Einlassmikroröhrchen für die Schale, Öl, Vernetzer-Emulsionseinlässe und ein Stück für den Einlass der Dissoziationsvorrichtung. Führen Sie dann das gegenüberliegende Ende der Röhrchen mit der entsprechenden Lösung in die Nadel der Spritze ein. Verbinden Sie in der Zwischenzeit den Kerneinlass der mikrofluidischen Vorrichtung und den Auslass der Dissoziationsvorrichtung mit einem 5 cm großen Mikroröhrchen (Abbildung 1C).
HINWEIS: Die Einlassmikroröhrchen sollten fest in den Armaturenrohren befestigt werden, die im letzten Schritt eingeführt wurden. - Stecken Sie ein Auslassrohr in den Fluidic-Auslassanschluss und legen Sie das gegenüberliegende Ende in ein Auffangbecken.
- Stellen Sie das Gerät auf einen Mikroskoptisch und befestigen Sie den Schlauch, um ein Bewegen zu vermeiden. Richten und fokussieren Sie das Mikroskop zur Durchflusskontrolle auf die Gerätedüse.
- Legen Sie jede Spritze auf verschiedene Spritzenpumpen und befestigen Sie sie ordnungsgemäß (Abbildung 1B). Programmieren Sie jede Pumpe gemäß den Protokollen des Herstellers auf die folgenden Durchflussraten: Kern (3-5 μL/min), Schale (3-5 μL/min), Abschirmöl (20-80 μL/min) und Vernetzungsöl (40-60 μL/min). Starten Sie den Durchfluss in allen Pumpen.
- Warten Sie, bis jede Flüssigkeit in das Gerät gelangt ist, und füllen Sie die Kanäle auf, während Sie die verbleibende Luft herausdrücken.
HINWEIS: Wenn sich eine große Menge Luft im Einlassschlauch befindet, erhöhen Sie vorübergehend jede Durchflussrate, bis die Luft vollständig entfernt ist. Beachten Sie, dass eine übermäßige Durchflussrate zu einem Ausfall der PDMS-zu-PDMS-Bindung führen kann. - Wenn die Kapselbildung stabilisiert ist (Abbildung 3), platzieren Sie das gegenüberliegende Ende des Auffangrohrs in einem neuen konischen Röhrchen mit 5 ml mTeSR-Medien.
HINWEIS: Das Medium enthält 10 μM ROCK-Inhibitor, 100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin. - Nachdem eine ausreichende Anzahl von Kapseln gesammelt wurde, bei 37 °C mit 5% CO2 für 10 min inkubieren. Kapseln, die sich in der Ölphase befinden, befinden sich oben auf dem Röhrchen (siehe Abbildung 4A). Durch sanftes Klopfen auf die Röhre gelangen Kapseln zu Bodensedimenten. Danach kann der größte Teil des Öls und der Medien angesaugt werden.
- Sammeln Sie die Kapseln vom Boden des konischen Röhrchens, legen Sie sie auf ein Zellsieb (100 μm Porengröße) und waschen Sie sie mit reichlich Medien. Sammeln Sie dann Mikrokapseln mit 2 ml Medien in einer 6-Well-Kulturplatte, indem Sie das Medium durch den Filter laufen lassen, während es auf der Oberseite der Well-Platte invertiert wird (siehe Abbildung 4A).
4. hPSC-Kultur und -Analyse in Mikrokapseln
- Grundkultur
- Die Stammzellkapseln in einer 6-Well-Plattenkulturschale bei 37 °C mit 5% CO2 inkubieren.
- Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag, indem Sie die Kapseln auf einem Zellsiebfilter sammeln, sie mit überschüssigen Medien waschen und sie in einem neuen Vertiefungsbereich in 6-Well-Platten mit 2-ml-Medien aufhängen, wie in Schritt 3.10 durchgeführt.
- Gießen Sie die Kapseln für mindestens 10 Tage.
- Führen Sie den Lebend-/Totentest durch, um die Lebensfähigkeit verkapselter Stammzellen zu bestimmen.
- Tauen Sie lebende/tote Assay-Lösungen auf (Ethidium homodimer-1 und Calcein AM).
- 4 μL der 2 μM Ethidium Homodimer-1 und 1 μL der 4 μM Calcein AM Lösungen zu 2 mL sterilem DPBS geben. Vortex, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten.
- Sammeln Sie ungefähr 100 Mikrokapseln auf einem Zellsieb und spülen Sie sie mit sterilem DPBS ab, um die Diffusion von Medium aus den Kapseln zu ermöglichen.
- Sie werden erneut zu einer Kulturplatte mit 12 Vertiefungen gesammelt, indem Sie 1 ml der in Schritt 4.2.2 hergestellten Lösung verwenden. 20 min bei 37 °C inkubieren.
- Visualisieren Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.
HINWEIS: Die Zelllebensfähigkeit wird quantifiziert, indem der Prozentsatz der lebenden Zellen, die als grün visualisiert werden, an der Gesamtzahl der Zellen berechnet wird.
- Charakterisierung der Sphäroidgröße.
- Legen Sie bei Bedarf die Vertiefungsplatte mit Mikrokapseln unter das Mikroskop und messen Sie den Durchmesser der in der zugehörigen Software gezeigten Sphäroide mit geeigneten Maßstabsstäben.
- Messen und analysieren Sie die Sphäroidgröße.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Durch die Befolgung des oben genannten Protokolls wird der Leser in der Lage sein, mikrofluidische Geräte herzustellen und zelltragende Mikrokapseln herzustellen. Abbildung 3A zeigt Beispiele für optimale und suboptimale Mikrokapseln, die mittels mikrofluidischer Tröpfchenerzeugung hergestellt werden. Verschiedene Formulierungen von PEG-4-Mal führten zu Kapseln unterschiedlicher Morphologien - faltige Kapseln waren mit schlechter Gelierung, geringer mechanischer Integrität verbunden und hielten der Kultivierung in einem gerührten Bioreaktor nicht stand. Glatte Kapseln, die bei einem PEG-Gehalt von >6% beobachtet wurden, stellten die gewünschte Kapselmorphologie dar und waren robust genug für die Zellkultivierung. Die Kern-Schalen-Struktur wurde durch den Einbau von Mikrokügelchen in den Kern und fluoreszierenden Einheiten in die Schale von Mikrokapseln bestätigt. Die Aggregation von Perlen in der Mitte der Kapseln, wie in Abbildung 3B zu sehen, wurde als Hinweis darauf verwendet, dass der Kern wässrig war und die Perlen sich frei bewegen konnten. Der in Abbildung 3C beobachtete fluoreszierende Ring zeigte das Vorhandensein einer Hydrogelhülle an und wurde zur Bestimmung der Schalendicke verwendet. Wir empfehlen, dass Benutzer Mikroperleneinarbeitung und Fluoreszenzmarkierung in den frühen Phasen der Etablierung des Verkapselungsprozesses verwenden.
Sobald der Verkapselungsprozess etabliert ist, kann man zur Verkapselung von hPSCs übergehen. Während dieses Protokoll die Verkapselung von H9-Zellen beschreibt, haben wir eine ähnliche Strategie für die Verkapselung einer anderen hESC-Linie (HUES-8) und einer iPSC-Linie (1016) verwendet. 7
Während die Verkapselung nur mit der Verkapselungsvorrichtung durchgeführt werden kann, stellten wir fest, dass hPSCs dazu neigten, im System zu verklumpen, was zu einer ungleichmäßigen Verkapselung oder Kapselbelegung führte. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir eine Dissoziations- oder Filtervorrichtung entwickelt und vor der Verkapselungsvorrichtung positioniert. Diese Dissoziationsvorrichtung umfasste einen Strömungskanal mit einer Anordnung von dreieckigen Pfosten, die 200 μm pro Seite gemessen wurden und deren Steigung von 400 μm am Einlass bis 30 μm am Auslass reichte, so dass Klumpen entweder zurückgehalten oder aufgebrochen wurden, bevor sie in die Verkapselungsvorrichtung eintraten (siehe Abbildung1D)7. Die Verwendung der Dissoziationsvorrichtung ermöglicht es, die Gleichmäßigkeit von Sphäroiden signifikant zu verbessern und die Zellbelegung von Kapseln von 57% auf >90% zu erhöhen7.
Abbildung 4B,C beschreibt repräsentative Ergebnisse eines Kapselungslaufs. Wie auf diesen Bildern zu sehen ist, haben H9-Zellen eine hohe Lebensfähigkeit mit >95% Lebensfähigkeit, die routinemäßig während der Verkapselungsläufe erreicht wird. Wir verglichen die Wachstumsrate (siehe Abbildung 4B,C) und das Differenzierungspotenzial von verkapselten vs. unverkapselten Sphäroiden7 und stellten fest, dass der Prozess der Verkapselung keine nachteiligen Auswirkungen auf hPSCs hat. Auf der anderen Seite gibt es mehrere Vorteile bei der Verkapselung von hPSCs. Verkapselte Sphäroide sind einfach zu handhaben und können in Mikrotiterplatten dosiert / verteilt werden, um Differenzierungsprotokolle zu entwickeln oder Therapien zu testen. Unser Labor ist daran interessiert, Mikrokapseln als Stammzellträger für die Suspensionskultivierung in gerührten Bioreaktoren zu verwenden und hat gezeigt, dass die Hydrogelhülle in solchen Kulturen Schutz vor Scherschäden bietet7. Dies ist ein weiterer Weg, den wir bei der Herstellung bioaktiver Mikrokapseln verfolgen, bei denen die Hydrogelhülle mit Wachstumsfaktoren für die lokale und kontinuierliche Abgabe induktiver Hinweise während der Differenzierung belastet werden kann.
Abbildung 1: Herstellung von Kern-Hüllen-Mikrokapseln . (A) Die mikrofluidische Vorrichtung zur Kapselerzeugung besteht aus vier Einlasskanälen (Kern, Schale, Öl und Vernetzeröl) und einem Serpentinkanal, der zu einem Sammelrohr führt. Die Baugruppe wird so hergestellt, dass Kern-, Schalen- und Ölkanäle eine Höhe von 120 μm (H1), 200 μm (H2) bzw. 300 μm (H3) haben. Der Einschub stellt eine Querschnittsansicht an der Düse dar - der Verbindung zwischen wässrigen und Ölströmen. Diese Querschnittsansicht ist um 90° geneigt, um dem Leser eine bessere Sicht auf koaxiale Strömungskanäle zu geben. Eine 3D-Darstellung des Kern-Shell-Mikrokapselherstellungsprozesses zeigt, wie die koaxiale Strömung vor der Strömungsfokussierungsstelle erzeugt wird, um eine Kern-Shell-Mikrokapselstruktur zu erzeugen. Die Emulgierung wird erreicht, indem wässrige Tröpfchen zwei Ölströmen ausgesetzt werden, von denen der erste die Tröpfchen stabilisieren soll und der zweite den Vernetzer DTT liefert, der mit PEG-4-Mal reagiert. Diese Zahl wurde gegenüber Referenz12 geändert. Copyright 2019, American Chemical Society. B) Versuchsaufbau des Verkapselungssystems mit den Standorten der Spritzenpumpen, Schläuche, mikrofluidischen Vorrichtungen und des Kapselsammelrohrs. (C) Ein Bild des Verkapselungssystems, das aus Dissoziations- und Verkapselungsvorrichtungen in einer Sequenz besteht. D) Auslegung der mikrofluidischen Dissoziationsvorrichtung, mit der verhindert werden soll, dass großzellige Aggregate in die Mikroverkapselungsvorrichtung gelangen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Herstellung von mikrofluidischen Geräten zur Verkapselung. a) Herstellung der Verkapselungsvorrichtung. Drei Schichten SU-8-Fotolack wurden gedreht und fotogemustert, um Kern-, Schalen- und Ölkanäle mit unterschiedlichen Höhen zu erzeugen. Kernkanäle haben eine Breite von 220 μm, die sich am Kapselübergang auf 135 μm verengt. Kanäle für alle Phasen folgen dem gleichen Prinzip: Schalen- und Ölkanäle beginnen mit einer Breite von 500 μm, verengen sich am Übergang auf 220 μm, und Abschirmöl beginnt bei 500 μm und verengt sich auf 270 μm. Auslaufschlange hat eine Breite von 1,5 mm und eine Länge von ~55 mm. Obere und untere PDMS-Stücke wurden dann ausgerichtet und Plasma gebunden. b) Herstellung der Dissoziationsvorrichtung. Eine Schicht SU-8-Fotolack wurde gedreht und fotogemustert, um Dissoziationskanäle zu erzeugen. Das PDMS-Stück wurde dann mit Glasobjektträger plasmaverklebt. Die Dissoziationsvorrichtung besteht aus einer kleinen Kammer mit einer Höhe von 30 μm, einer Länge von 16,5 mm und einer Breite von 5 mm am Einlass und 1,7 mm am Auslass. Es hat dreieckige Strukturen (200 μm, gleichseitig), die durch 420 μm des Einlasses voneinander getrennt sind und auf dem Weg zum Auslass näher kommen, mit einem Abstand von 50 μm in der letzten Reihe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Charakterisierung von Mikrokapseln. (A) Unterschiede in der Kapselmorphologie als Funktion des PEG-4-Mal-Gehalts in der Schale. Glatte Kapseln mit hellen Kanten sind mit der gewünschten mechanischen Integrität verbunden. (B) Bestätigung des wässrigen Kerns der Mikrokapseln. Eingeschlossene Mikrokügelchen können sich im wässrigen Kern frei bewegen und in der Mitte der Mikrokapseln aggregieren. (C) Bestätigung der Kern-Schalen-Struktur durch Einarbeitung von Rhodamin B-markiertem PEG in die Schale von Mikrokapseln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Verkapselung von hPSC . (A) Mikrokapseln in der Ölphase werden in einem mit Medien gefüllten konischen Röhrchen gesammelt. Nachdem sich Mikrokapseln auf dem Boden des Röhrchens abgesetzt haben, werden Öl und Medien abgesaugt, Mikrokapseln gewaschen und dann zur Kultivierung auf eine 6-Well-Platte übertragen. (B) Lebende/tote Färbung 6 h nach Verkapselung von H9-Zellen. Das obere Bild wurde bei 10x und das untere Bild bei 20x aufgenommen. (C) Bilder zum Vergleich von Sphäroidgrößen, die sich im Laufe der Zeit für H9-Zellen in Kapseln und in kommerziellen 3D-Kulturplatten ändern (untere Bilder). (D) Quantifizierung des Sphäroiddurchmessers, der für hPSCs in Mikrokapseln und in Standard-3D-Kulturplatten während 7 Tagen in H9-Medien zunimmt. Statistische Analyse -t-test, p < 0,05, n = 20. Maßstabsbalken: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der hier beschriebene Verkapselungsprozess führt zu einer reproduzierbaren Bildung von hPSC-Sphäroiden. Das Mikrokapselformat erleichtert die Abgabe von Sphäroiden in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte für Experimente zur Verbesserung / Optimierung von Differenzierungsprotokollen oder zum Testen von Therapien. Verkapselte Stammzellsphäroide können auch in Suspensionskulturen verwendet werden, in denen die Hydrogelhülle die Zellen vor scherinduzierten Schäden schützt7.
Es gibt mehrere kritische Schritte innerhalb des Protokolls. Es ist wichtig, die Durchflussraten von Kern-, Schalen- und Ölströmen innerhalb des im Abschnitt Protokoll beschriebenen Bereichs zu halten. Wenn die Schalenflussrate zu niedrig ist, wird der Fluss instabil, was zu verzerrten und mechanisch instabilen Kapseln führt. Eine erfolgreiche Zellverkapselung sollte den in Abbildung 4C gezeigten Mikrokapseln ähneln. Mikrokapseln sollten einen ähnlichen Durchmesser haben und eine vergleichbare Anzahl von Zellen haben, die im Kern gefangen sind. Die Aggregation einzelner Zellen zu Sphäroiden erfolgt typischerweise innerhalb von 48 h und der Mangel an Sphäroidbildung bei 72 h ist ein Warnzeichen. Ein Grund für die fehlende Sphäroidbildung könnte sein, dass viskose Moleküle im Kern nicht schnell genug durch die Hydrogelhülle austreten. Wir sind auf dieses Szenario gestoßen, als wir die Viskosität der Kernlösung mit hochmolekularen Polymeren wie Carboxymethylcellulose (MW 250 kD) eingestellt haben. Man kann Mikrokügelchen einkapseln (siehe Abbildung 3B), um zu testen, ob sich diese zellgroßen Objekte frei im Kern bewegen können und wie schnell Komponenten des Kerns auslaugen. Ein Mangel an Sphäroidbildung wurde auch bei der Verwendung von PEG-4-Mal-Konzentrationen von >8% w/v festgestellt. In diesem Szenario werden Porosität und Diffusivität der Hydrogelhülle verringert und hochviskose Elemente im Kern laugen nicht schnell genug aus, damit sich Zellen zu Aggregaten bilden können. Es ist denkbar, dass die Qualität von PEG-4-Mal von Charge zu Charge oder Hersteller variieren kann. Daher kann eine gewisse Anpassung der Polymerkonzentration in der Schale erforderlich sein. Auch hier soll die Perleneinbaumethode zeigen, wie schnell viskose Bestandteile im Kern durch Wassermoleküle verdrängt werden. Nach unserer Erfahrung sollte dies innerhalb von 3 Stunden nach dem Transfer von Mikrokapseln in die wässrige Umgebung geschehen.
Das hier beschriebene Verkapselungsprotokoll hat für mehrere hPSC-Linien7, primäre Hepatozyten10 und mehrere Krebszelllinien (unveröffentlichte Ergebnisse) gut funktioniert. Wir hatten jedoch Schwierigkeiten bei der Bildung von Sphäroiden nach der Verkapselung von Stammzell-abgeleiteten (sc)-Hepatozyten und sc-β-Zellen. Die Fehlersuche mit verkapselten Mikrokügelchen ergab, dass viskose Komponenten schnell aus dem Kern eluiert wurden und dass Zellen frei waren, sich zu bewegen und Zell-Zell-Kontakte zu bilden. Eine weitere Fehlersuche bestand darin, die Konzentration des Dithiol-Vernetzers DTT (in der Ölphase vorhanden) von 66 mM auf 10 mM zu senken. Die Sphäroidbildung für sc-Hepatozyten und β-Zellen erfolgte bei dieser niedrigeren Konzentration von DTT. Daher sollte der Benutzer die Optimierung der Vernetzerkonzentration in Betracht ziehen, jedoch nur, wenn andere oben aufgeführte Schritte zur Fehlerbehebung nicht erfolgreich waren. Wir stellen fest, dass die DTT-Konzentration entscheidend für die Aufrechterhaltung der mechanischen Integrität von Mikrokapseln mit 66 mM DTT ist, was zu mechanisch robusten Mikrokapseln führt und für die überwiegende Mehrheit der bisher verwendeten Zelltypen ungiftig ist.
In der Literatur wurde eine Reihe von Strategien zur Erstellung von 3D-Stammzellkonstrukten beschrieben. Die Vorteile der Bildung von Stammzellkonstrukten in Kern-Hüllen-Mikrokapseln sind vielfältig. Nach der Verkapselung können Sphäroide mit Hydrogelkapseln, die Schutz vor Scherschäden bieten, problemlos gehandhabt werden. Verkapselte Sphäroide können in Suspension mit kräftiger Bewegung kultiviert werden, ohne Stammzellen zu schädigen.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, die Fähigkeiten von Mikrokapseln zu erweitern. Unser Team hat zuvor die Verwendung von Heparin-haltigen Hydrogelen zur Verkapselung von Hepatozyten und Stammzellen 8,12 beschrieben und entwickelt derzeit heparinhaltige bioaktive Kern-Hüllen-Mikrokapseln, die als Depots für die Lagerung und lokale Freisetzung von induktiven Hinweisen (GFs) an Stammzellen dienen. Solche Mikrokapseln können dazu beitragen, die Verwendung teurer GFs zu verringern und gleichzeitig die Differenzierungsergebnisse zu verbessern. Mikrokapseln können weiter verbessert werden, indem ECM-Proteine in den Kern eingebaut werden, wodurch die Mikroumgebung der Stammzellen moduliert wird. Kernhüllen-Mikrokapseln können abbaubar gemacht werden, um die Gewinnung von hPSC-Sphäroidenzu erleichtern 13,14. Insgesamt stellen Core-Shell-Mikrokapseln eine Plattformtechnologie dar, die modifiziert und verbessert werden kann, um die Anforderungen eines bestimmten Stammzelldifferenzierungsprotokolls zu erfüllen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde zum Teil durch die Zuschüsse des Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, der J. W. Kieckhefer Foundation, der Al Nahyan Foundation, der Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) und der NIH (DK107255) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
