Summary
Denna artikel beskriver inkapsling av humana pluripotenta stamceller (hPSC) med hjälp av en koaxiell flödesfokuseringsanordning. Vi visar att denna mikrofluidiska inkapslingsteknik möjliggör effektiv bildning av hPSC-sfäroider.
Abstract
Tredimensionella (3D) eller sfäroidkulturer av humana pluripotenta stamceller (hPSC) erbjuder fördelarna med förbättrade differentieringsresultat och skalbarhet. I det här dokumentet beskriver vi en strategi för robust och reproducerbar bildning av hPSC-sfäroider där en koaxiell flödesfokuseringsanordning används för att fånga hPSC inuti kärnskalmikrokapslar. Kärnlösningen innehöll encellssuspension av hPSC och gjordes viskös genom införlivande av poly (etylenglykol) med hög molekylvikt (PEG) och densitetsgradientmedier. Skalströmmen bestod av PEG-4 arm-maleimid eller PEG-4-Mal och flödade längs kärnströmmen mot två på varandra följande oljekorsningar. Droppbildning inträffade vid den första oljekorsningen med skallösning som lindade sig runt kärnan. Kemisk tvärbindning av skalet inträffade vid den andra oljekorsningen genom att införa en di-tiolkribärbindning (1,4-ditiotreitol eller DTT) till dessa droppar. Tvärbindningen reagerar med maleimidfunktionella grupper via klickkemi, vilket resulterar i bildandet av ett hydrogelskal runt mikrokapslarna. Vår inkapslingsteknik producerade kapslar med en diameter på 400 μm med en hastighet av 10 kapslar per sekund. De resulterande kapslarna hade ett hydrogelskal och en vattenhaltig kärna som gjorde det möjligt för enskilda celler att snabbt monteras i aggregat och bilda sfäroider. Inkapslingsprocessen påverkade inte hPSC:s livskraft negativt, med >95 % viabilitet observerad 3 dagar efter inkapslingen. Som jämförelse bildade hPSC inkapslade i fasta gelmikropartiklar (utan vattenhaltig kärna) inte sfäroider och hade <50% livskraft 3 dagar efter inkapsling. Sfäroidbildning av hPSC inuti mikrokapslar med kärnskal inträffade inom 48 timmar efter inkapsling, med sfäroiddiametern som en funktion av cellinokuleringsdensiteten. Sammantaget var den mikrofluidiska inkapslingstekniken som beskrivs i detta protokoll väl lämpad för hPSC-inkapsling och sfäroidbildning.
Introduction
Det finns ett stort intresse för 3D-kulturer av humana pluripotenta stamceller (hPSC) på grund av den förbättrade pluripotensen och differentieringspotentialen som detta odlingsformatger 1,2,3. hPSC bildas typiskt till sfäroider eller andra 3D-odlingsformat med hjälp av bioreaktorer, mikrobrunnar, hydrogeler och polymera byggnadsställningar 4,5,6. Inkapsling erbjuder ett annat sätt att organisera enskilda hPSC i sfäroider. En gång inkapslade hPSC-sfäroider kan hanteras med lätthet och överföras till mikrotiterplattor för differentiering, sjukdomsmodellering eller drogtestexperiment. Inneslutning av hPSC i ett hydrogelskikt skyddar också celler mot skjuvskador och gör det möjligt att odla sfäroider i en bioreaktor vid höga omrörningshastigheter7.
Vår metodik för stamcellinkapsling utvecklades över tid. Först fokuserade vi på fasta hydrogelmikropartiklar och demonstrerade framgångsrik inkapsling och odling av musembryonstamceller (mESC)8. Det noterades emellertid att mänskliga embryonala stamceller (hESC) hade låg livskraft när de inkapslades i sådana hydrogelmikropartiklar, förmodligen på grund av det större behovet av dessa celler att återupprätta cell-cellkontakter efter inkapslingen. Vi resonerade att heterogen mikrokapsel, som har en vattenhaltig kärna, kan vara bättre lämpad för inkapsling av celler som är beroende av snabb återupprättande av cell-cellkontakter. Konceptet med koaxiell flödesfokuserande mikrofluidisk anordning för tillverkning av vattenhaltiga kärn-/hydrogelskalmikrokapslar anpassades från He et al.9, men istället för alginat som användes i det ursprungliga tillvägagångssättet införlivades en PEG-baserad hydrogel i skalet. Vi visade först framgångsrik inkapsling och sfäroidbildning av primär hepatocyt i kärnskalmikrokapslar10 och senast beskriven inkapsling av hES- och iPS-celler7. Som beskrivs i figur 1A tillverkas kapslar i en flödesfokuseringsanordning där skal- och kärnflödesströmmarna övergår från sida till sida till koaxiellt flöde innan de kastas ut i oljefasen. Kärnflödet innehåller celler och tillsatser som ökar lösningens viskositet (icke-reaktiv PEG MW 35kD och jodoxanol - kommersiellt namn OptiPrep) medan skalströmmen innehåller reaktiva molekyler (PEG-4-Mal). Kontinuerlig koaxiell flödesström diskretiseras till droppar som behåller kärnskalarkitekturen. Kärnskalstrukturen görs permanent genom exponering för di-tiolkribvärsbindning (DTT), som reagerar med PEG-4-Mal via klickkemi och resulterar i bildandet av en tunn (~ 10 μm) hydrogelhud eller skal. Efter att emulsionen har brutits och kapslar överförs till en vattenhaltig fas diffunderar molekyler av PEG från kärnan och ersätts av vattenmolekyler. Detta resulterar i vattenhaltiga kärn- och hydrogelskalmikrokapslar.
Nedan följer steg-för-steg-instruktioner om hur man gör mikrofluidiska enheter, hur man förbereder celler och hur man utför inkapsling av hPSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillverkning av enheter
- Gör designen för mikroinkapslingsanordningen och dissociationsanordningen med CAD-programvara10,11.
- Spin-coat de tre skikten av SU-8 fotoresist sekventiellt på en kiselskiva (figur 2A) för att uppnå strukturer med önskade höjder: 60, 100 och 150 μm.
OBS: Processen för de övre och nedre formarna är identisk.- Snurra täck en ren 10 cm kiselskiva med SU-8 2025 negativ fotoresist vid 1 100 rpm för att skapa det första 60 μm lagret. Efter en mjuk bakning vid 65 ° C i 3 minuter och 95 ° C i 10 min på en kokplatta, exponera formen med en masklös justerare genom att ladda upp designfilen för kärnkanalmönstret till μPG 101-datorn. Fortsätt sedan med efterexponeringen baka vid 65 ° C i 3 minuter och vid 95 ° C i 10 min.
- Snurra täck det andra SU-8 2025-lagret (40 μm) vid 1 500 rpm och exponera genom att ladda upp lämplig CAD-fil för skalkanalmönstret.
OBS: Mjuka bakningar och bakningar efter exponering liknade föregående steg. - Spinnlack det tredje SU-8 2025-lagret vid 1 400 rpm för att uppnå 50 μm höjd och upprepa ovanstående process men exponera strukturerna för oljefasen.
- Utveckla formen med alla tre lagren i ett enda steg genom nedsänkning i SU-8-utvecklaren tills all oexponerad fotoresist har tagits bort.
- Hårdgrädda formen på en kokplatta vid 160 ° C i 10 min för att förbättra vidhäftningen och täta mindre sprickor som kan uppstå efter utvecklingen.
- Utsätt formen för klortrimetylsilan för att undvika elastomerbindning i nästa steg och placera den i 15 cm petriskålar tills den används.
- Förbered dissociationsanordningens form på samma sätt, som beskrivs i figur 1D och figur 2B. Snurra täck ett lager SU-8 fotoresist på en kiselskiva, som beskrivits tidigare i steg 1.2.3, för att uppnå strukturer med önskad höjd: 50 μm. Utför den mjuka och efterexponeringen baka, utveckla och hårdbaka på samma sätt som föregående steg.
OBS: En rad triangulära stolpar täckte hela kammaren, med avstånd mellan stolparna som minskade när kammarbredden minskade mot utloppet. Triangelstolpar var 200 μm per sida med en stigning som sträckte sig från 400 μm (vid inloppet) till 30 μm (vid utloppet). - Förbered formarna genom mjuk litografi med polydimetylsiloxan (PDMS).
- Blanda PDMS-elastomerbas och elastomerhärdningsmedel i ett förhållande på 10:1 w/w i en planetcentrifug. Häll blandningen på både mikroinkapslingsmasterformar och dissociationsform för att skapa ett 3-4 mm lager.
OBS: En blandning av 50 g elastomerbas med 5 g härdningsmedel är tillräcklig för att täcka en masterform med 3 mm tjocklek. - Placera petriskålarna som innehåller formarna i en vakuumtorkator i 15 minuter för att avgasa de ohärdade PDMS.
- Flytta petriskålarna till en ugn och grädda vid 80 °C i minst 60 minuter.
- Ta bort huvudformarna från ugnen och låt dem svalna. Skär försiktigt PDMS efter skivans form med en precisionskniv och skala ut PDMS-bitarna från huvudformen.
- Klipp ut PDMS-plattorna genom att trimma kanterna på varje enhet med en skalpell och stansa sedan ut flytande inlopps- / utloppsportar i dissociationsanordningen och endast i den övre mikrofluidiska enheten med nålar av rostfritt stål. Täck enheterna med magisk tejp för att undvika kontaminering.
OBS: Nålmätaren är 14 G respektive 15 G för inlopps- och utloppsportar. - För limning, behandla de mönstrade sidorna av de övre och nedre PDMS-bitarna medO2-plasma på en plasmaetsare i 2 minuter.
- Rikta in båda PDMS-delarna under ett stereoskop efter tillsats av ett tunt separerande lager destillerat vatten direkt i mikrokanalerna (2 μL).
- Placera den justerade PDMS-enheten i ugnen vid 80 °C över natten för att slutföra bindningen och återställa PDMS till sitt ursprungliga hydrofoba tillstånd. Förvara enheterna tills vidare.
OBS: Detta resulterar i en koaxial flödesfokuseringsanordning med tre olika höjder på 120 μm för kärna, 200 μm för skal och 300 μm för oljekanaler. - För att kunna använda anordningen direkt efter plasmabindningen injicerar du försiktigt men bestämt 30 μL hydrofob beläggningslösning i de flytande kanalerna för att uppnå hydrofob beläggning. Rensa sedan omedelbart luft in i kanalerna tills inga rester av den hydrofoba beläggningslösningen observeras i anordningen.
- Bind dissociationsanordningen genom att först behandla den mönstrade sidan av enheten och ett rengjort glidglas medO2-plasma i 2 minuter och montera dem sedan för ytterligare härdning i ugnen vid 80 ° C över natten.
OBS: Enheter kan lagras tills vidare användning.
- Blanda PDMS-elastomerbas och elastomerhärdningsmedel i ett förhållande på 10:1 w/w i en planetcentrifug. Häll blandningen på både mikroinkapslingsmasterformar och dissociationsform för att skapa ett 3-4 mm lager.
2. Framställning av lösningar
- Lagerlösningar. Förbered först stamlösningar (koncentrerade lösningar) som kommer att spädas till lägre koncentrationer för faktisk användning.
OBS: Lagerlösningar används för att spara förberedelsetid, spara material, minska lagringsutrymmet och förbättra noggrannheten vid beredning av en arbetslösning i lägre koncentrationer.- Förbered 30 ml 2x kärnlösning (16% PEG och 34% densitetsgradientmedier): blanda 4,8 g 35 kDa PEG, 10,2 ml densitetsgradientmedier och 19,8 ml DMEM / F12-media. Filtrera denna kärnlösning med ett 0,22 μm sprutfilter.
- Förbered 50 ml mineralolja med 3% ytaktivt medel: blanda 48,5 ml mineralolja och 1,5 ml ytaktivt medel. Förvaras i sterilt tillstånd efter filtrering genom ett 0,22 μm sprutfilter.
- Förbered 50 ml mineralolja med 0,5% ytaktivt medel: blanda 49,75 ml mineralolja och 0,25 ml ytaktivt medel. Förvara i sterilt skick.
- Förbered 1 M dithiotheritol (DTT): Lös upp 1,5425 g DTT i 10 ml destillerat vatten. Förvara i sterilt skick.
- Förbered 1 M trietanolamin (TEA): tillsätt 66,4 μL TEA i 433,6 μL destillerat vatten. Förvara i sterilt skick.
- Förbered 1% Pluronic F127 (PF127): Lös upp 100 mg PF127 i 10 ml destillerat vatten. Förvara i sterilt skick.
- Arbetslösningar
- Förbered en tvärbindningsemulsion genom att blanda 4,5 ml mineralolja med 3% ytaktivt medel och 300 μL 1 M DTT (1:15-förhållande). Vortex lösningen för 2 min och sonicate för 45-60 min i ett ultraljud bad vid 20 ° C. Ladda denna lösning på en 5 ml spruta med en 27 G nål.
OBS: Emulsion genereras genom ultraljudsbehandling olja / vattenblandning. - Förbered skärmoljelösningen genom att ladda mineraloljan med 0,5% ytaktivt medel till en 5 ml spruta med en 27 G nål.
- Förbered skallösningen (8 % w/v PEG-4-Mal och 15 mM TEA) genom att tillsätta 32 mg PEG-4-Mal i 400 μL 1x DPBS för att bilda 8 % vikt/v-lösning och virvla lösningen i 2 min. Tillsätt sedan 6 μL 1 M TEA (slutlig koncentration 15 mM TEA). Slutligen centrifug vid 13 000 x g i 5 min genom ett spinnfilter och håll den i mörkret på vippan i 30 min. Ladda sedan denna lösning till en 1 ml spruta med en 27 G nål.
OBS: Låt PEG-4-Mal-behållaren sitta vid rumstemperatur i 10 minuter innan du öppnar locket och blåsN2-gas för att ersättaO2 medN2 innan du stänger locket. Vortex TEA innan du lägger till lösningen.
- Förbered en tvärbindningsemulsion genom att blanda 4,5 ml mineralolja med 3% ytaktivt medel och 300 μL 1 M DTT (1:15-förhållande). Vortex lösningen för 2 min och sonicate för 45-60 min i ett ultraljud bad vid 20 ° C. Ladda denna lösning på en 5 ml spruta med en 27 G nål.
- Förbered cellsuspensionen i kärnlösningen
- Behandla hPSC med trypsin i 5 till 10 minuter vid 37 °C. Samla dem sedan från tallrikar. Släck trypsin med mediet efter cellavskiljning och överför sedan cellerna till ett 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera bulkcellsuspensionen (400 x g, 5 min). Aspirera försiktigt supernatanten och resuspendera sedan cellpelleten med en minimal volym tillväxtmedium. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare.
OBS: Typiska cellalikvoter innehåller 12-20 x 106 celler och räcker för att göra 400 μL av kärnlösningen. - Ta 12-20 x 106 celler från bulkcellsuspensionen och centrifugera cellen / mediasuspensionen (400 x g, 5 min).
- Aspirera försiktigt media från cellpelleten. Tillsätt sedan 200 μL media och 200 μL 2x PEG-lösning (slutlig koncentration 30-50 x 106 cell / ml) och blanda försiktigt.
OBS: Låga cellkoncentrationer (mindre än 20 x 106 celler / ml) resulterade i många tomma kapslar. - Tillsätt 30 μL 1% PF127 till lösningen.
- Sätt i en mikroomrörarstång (2 mm x 7 mm) i en 1 ml spruta och ladda sedan cellen som innehåller kärnlösningen till sprutan med en 27 G nål. Håll lösningen kall med is under hela inkapslingsprocessen.
3. Experimentell inställning
- Placera bunden PDMS-droppanordning, fyra stycken 20 cm långa och en bit 5 cm långa inloppsmikrorör (0,38 mm I.D. x 1,1 mm O.D.), ett stycke 10 cm utloppsrör (0,5 mm I.D. x 1,5 mm O.D.) och sex stycken 0,5 cm passande rör (1 mm I.D. x 1,8 mm O.D.) under en bakteriedvästljuskälla (vanligtvis inbyggd i biologiska säkerhetsskåp) och sterilisera i 30 min.
- Använd pincett för att montera slangen i de flytande inloppsportarna och dissociationsportarna.
- Använd de tre styckena av 20 cm långa inloppsmikrorör för skalet, oljan, tvärbindningsemulsionsinloppen och ett stycke för dissociationsanordningens inlopp. Sätt sedan in den motsatta änden av rören i sprutans nål med motsvarande lösning. Anslut under tiden kärninloppet på den mikrofluidiska anordningen och dissociationsanordningens utlopp med ett 5 cm mikrorör (figur 1C).
OBS: Inloppsmikrorören ska vara tätt fastsatta i monteringsrören, som sattes in i det sista steget. - Sätt i ett utloppsrör i den fluidiska utloppsporten och placera motsatt ände i en uppsamlingsbehållare.
- Placera enheten på ett mikroskopsteg och fäst slangen för att undvika att röra sig. Rikta in och fokusera mikroskopet på enhetens munstycke för flödesinspektion.
- Placera varje spruta på olika sprutpumpar och säkra ordentligt (figur 1B). Programmera varje pump enligt tillverkarens protokoll till följande flödeshastigheter: kärna (3-5 μL/min), skal (3-5 μL/min), skärmningsolja (20-80 μL/min) och tvärbindningsolja (40-60 μL/min). Starta flödet i alla pumpar.
- Vänta tills varje vätska kommer in i enheten och fyll på kanalerna medan du trycker ut den återstående luften.
OBS: Om det finns en stor mängd luft i inloppsslangen, öka tillfälligt varje flödeshastighet tills luften är helt borttagen. Tänk på att överdriven flödeshastighet kan leda till PDMS-till-PDMS-bindningsfel. - När kapselbildningen stabiliseras (figur 3), placera den motsatta änden av uppsamlingsröret till ett nytt koniskt rör med 5 ml mTeSR-media.
OBS: Mediet innehåller 10 μM ROCK-hämmare, 100 U /ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin. - Efter att ett tillräckligt antal kapslar har samlats inkubera, inkubera vid 37 °C med 5 % CO2 i 10 min. Kapslar som finns i oljefasen kommer att vara högst upp i röret (se figur 4A). Att försiktigt knacka på röret får kapslar att sedimentera till botten. Efter detta kan det mesta av oljan och media aspireras.
- Samla kapslarna från botten av det koniska röret, placera dem på en cellsil (100 μm porstorlek) och tvätta med rikliga mängder media. Samla sedan mikrokapslar med 2 ml media i en 6-brunns odlingsplatta genom att köra mediet genom filtret när det är inverterat ovanpå brunnsplattan (se figur 4A).
4. hPSC-odling och analys i mikrokapslar
- Grundläggande kultur
- Inkubera stamcellskapslarna i en 6-brunns tallriksodlingsskål vid 37 ° C med 5% CO2.
- Byt media varannan dag genom att samla kapslarna på ett cellsilfilter, tvätta dem med överflödiga medier och återanvända dem till en ny brunn i 6-brunnsplattor med 2 ml media som gjordes i steg 3.10.
- Odla kapslarna i minst 10 dagar.
- Utför den levande / döda analysen för att bestämma livskraften hos inkapslade stamceller.
- Tina levande / döda analyslösningar (ethidium homodimer-1 och kalcein AM).
- Tillsätt 4 μL av 2 μM efidiumhomodimer-1 och 1 μL av 4 μM kalcein-AM-lösningarna till 2 ml steril DPBS. Vortex för att säkerställa fullständig blandning.
- Samla cirka 100 mikrokapslar på en cellsil och skölj dem med steril DPBS för att möjliggöra diffusion av medium ut från kapslarna.
- Samla dem igen till en odlingsplatta med 12 brunnar genom att använda 1 ml av lösningen framställd i steg 4.2.2. Inkubera vid 37 ° C i 20 min.
- Visualisera cellerna under ett fluorescensmikroskop.
OBS: Cellviabilitet kvantifieras genom att beräkna procentandelen levande celler, som visualiseras som gröna, bland det totala antalet celler.
- Karakterisering av sfäroidstorlek.
- När så önskas, placera brunnsplattan med mikrokapslar under mikroskopet och mät diametern på sfäroider som visas på den relaterade programvaran med korrekta skalstänger.
- Mät och analysera sfäroidstorleken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att följa ovannämnda protokoll kommer läsaren att kunna tillverka mikrofluidiska enheter och producera cellbärande mikrokapslar. Figur 3A visar exempel på optimala och suboptimala mikrokapslar tillverkade med mikrofluidisk droppgenerering. Olika formuleringar av PEG-4-Mal resulterade i kapslar med varierande morfologier - skrynkliga kapslar var förknippade med dålig gelering, låg mekanisk integritet och tålde inte odling i en omrörd bioreaktor. Släta kapslar observerade vid PEG-innehåll på >6% representerade den önskade kapselmorfologin och var tillräckligt robusta för cellodling. Kärnskalstrukturen bekräftades genom införlivande av mikropärlor i kärnan och fluorescerande deligheter i skalet av mikrokapslar. Aggregering av pärlor i mitten av kapslarna som ses i figur 3B användes som indikation på att kärnan var vattenhaltig och pärlorna var fria att röra sig om. Fluorescerande annulus observerad i figur 3C indikerade närvaron av ett hydrogelskal och användes för att bestämma skaltjockleken. Vi rekommenderar att användare använder mikropärlinkorporering och fluorescerande märkning i de tidiga stadierna av att upprätta inkapslingsprocessen.
När inkapslingsprocessen är etablerad kan man gå vidare till inkapsling av hPSC. Medan detta protokoll beskriver inkapsling av H9-celler har vi använt en liknande strategi för att kapsla in en annan hESC-linje (HUES-8) och en iPSC-linje (1016). 7
Medan inkapsling kan utföras med endast inkapslingsanordningen noterade vi att hPSC tenderade att klumpa sig i systemet vilket resulterade i ojämn inkapsling eller kapselbeläggning. För att ta itu med denna utmaning utformade vi en dissociations- eller filtreringsenhet och placerade den uppströms om inkapslingsanordningen. Denna dissociationsanordning bestod av en flödeskanal med en uppsättning triangelformade stolpar uppmätta 200 μm per sida och med stigning från 400 μm vid inloppet till 30 μm vid utloppet så att klumpar antingen behålls eller bryts upp innan de kommer in i inkapslingsanordningen (se figur 1D)7. Användningen av dissociationsanordningen möjliggör en signifikant förbättring av sfäroidernas enhetlighet och öka cellbeläggningen av kapslar från 57% till >90%7.
Figur 4B,C beskriver representativa resultat från en inkapslingskörning. Som framgår av dessa bilder har H9-celler hög livskraft med >95% livskraft som uppnås rutinmässigt under inkapslingskörningarna. Vi jämförde tillväxthastigheten (se figur 4B,C) och differentieringspotentialen för inkapslade kontra oinkapslade sfäroider7 och bestämde att inkapslingsprocessen inte har några negativa effekter på hPSC. Å andra sidan finns det flera fördelar med att kapsla in hPSC. Inkapslade sfäroider är lätta att hantera och kan dispenseras / distribueras till mikrotiterplattor för att utveckla differentieringsprotokoll eller testa terapier. Vårt laboratorium är intresserat av att använda mikrokapslar som stamcellsbärare för suspensionsodling i omrörda bioreaktorer och har visat att hydrogelskal erbjuder skydd mot skjuvskador i sådana kulturer7. Detta är en ytterligare väg som vi eftersträvar är att skapa bioaktiva mikrokapslar där hydrogelskal kan laddas med tillväxtfaktorer för lokal och kontinuerlig leverans av induktiva signaler under differentiering.
Figur 1: Tillverkning av mikrokapslar av kärnskal. (A) Den mikrofluidiska anordningen för kapselgenerering består av fyra inloppskanaler (kärna, skal, olja och tvärbindningsolja) och en serpentinkanal som leder till ett uppsamlingsrör. Anordningen är tillverkad så att kärn-, skal- och oljekanaler är 120 μm (H1), 200 μm (H2) respektive 300 μm (H3) i höjd. Insatsen representerar en tvärsnittsvy vid munstycket - korsningen mellan vattenhaltiga och oljeströmmar. Denna tvärsnittsvy lutas med 90 ° för att ge läsaren en bättre bild av koaxialflödeskanaler. En 3D-representation av kärnskalets mikrokapseltillverkningsprocess visar hur koaxialflödet genereras uppströms den flödesfokuserande korsningen för att producera mikrokapselstruktur med kärnskal. Emulgering uppnås genom att exponera vattenhaltiga droppar för två oljeströmmar, varav den första är utformad för att stabilisera dropparna och den andra för att tillhandahålla tvärbindningen DTT, som reagerar med PEG-4-Mal. Denna siffra har ändrats från referens12. Copyright 2019, American Chemical Society. (B) Experimentell installation av inkapslingssystemet som visar placeringen av sprutpumpar, slangar, mikrofluidiska anordningar och kapseluppsamlingsrör. (C) En bild av inkapslingssystemet, som består av dissociations- och inkapslingsanordningar i en sekvens. D) Konstruktion av den mikrofluidiska dissociationsanordning som används för att undvika att storcellsaggregat kommer in i mikroinkapslingsanordningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Tillverkning av mikrofluidiska enheter som används för inkapsling. A) Tillverkning av inkapslingsanordningen. Tre lager su-8 fotoresist var spinnbelagda och fotomönstrade för att generera kärn-, skal- och oljekanaler med olika höjder. Kärnkanaler har en bredd på 220 μm som smalnar vid kapselkorsningen till 135 μm. Kanaler för alla faser följer samma princip: skal- och oljekanaler börjar med en bredd av 500 μm, smalnar vid korsningen till 220 μm och skärmningsolja börjar vid 500 μm och minskar till 270 μm. Utloppsormen har en bredd på 1,5 mm och en längd på ~55 mm. Övre och nedre PDMS-bitar justerades sedan och plasmalimrades. (B) Tillverkning av dissociationsanordningen. Ett lager av SU-8 fotoresist var spinnbelagd och fotomönstrad för att generera dissociationskanaler. PDMS-biten var sedan plasmabunden med glasskiva. Dissociationsanordningen består av en liten kammare med en höjd av 30 μm, längd av 16,5 mm och bredd på 5 mm vid inloppet och 1,7 mm vid utloppet. Den har triangelformade strukturer (200 μm, liksidiga) som separeras från varandra med 420 μm av inloppet och blir närmare på väg till utloppet, med en separation av 50 μm i sista raden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Karakterisering av mikrokapslar. (A) Skillnader i kapselmorfologi som en funktion av PEG-4-Mal-halten i skalet. Släta kapslar med ljusa kanter är förknippade med önskad mekanisk integritet. (B) Bekräftelse av mikrokapslarnas vattenkärna. Fångade mikropärlor är fria att röra sig i den vattenhaltiga kärnan och aggregera i mitten av mikrokapslar. (C) Bekräftelse av kärnskalstrukturen genom att införliva Rhodamine B-märkt PEG i skalet av mikrokapslar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Inkapsling av hPSC. (A) Mikrokapslar i oljefasen samlas upp i ett koniskt rör fyllt med media. Efter att mikrokapslar har gjorts för att sätta sig till botten av röret, sugs olja och media, mikrokapslar tvättas och överförs sedan till en 6-brunnsplatta för odling. (B) Levande/död färgning 6 timmar efter inkapsling av H9-celler. Övre bilden togs vid 10x och nedre bilden vid 20x. (C) Bilder som jämför sfäroidstorlekar som förändras över tid för H9-celler i kapslar och i kommersiella 3D-odlingsplattor (bottenbilder). (D) Kvantifiering av sfäroiddiametern som ökar för hPSC i mikrokapslar och i standard 3D-odlingsplattor under 7 dagar i H9-medier. Statistisk analys -t-test, p < 0,05, n = 20. Skala bar: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inkapslingsprocessen som beskrivs här resulterar i reproducerbar bildning av hPSC-sfäroider. Mikrokapselformatet gör det enkelt att dispensera sfäroider i brunnar på en mikrotiterplatta för experiment som syftar till att förbättra / optimera differentieringsprotokoll eller testa terapier. Inkapslade stamcellsfäroider kan också användas i suspensionskulturer där hydrogelskal skyddar celler mot skjuvinducerad skada7.
Det finns flera kritiska steg i protokollet. Det är viktigt att hålla flödeshastigheterna för kärn-, skal- och oljeströmmar inom det område som beskrivs i avsnittet Protokoll. Om skalflödeshastigheten är för låg blir flödet instabilt, vilket resulterar i förvrängda och mekaniskt instabila kapslar. En lyckad cellinkapsling bör likna de mikrokapslar som visas i figur 4C. Mikrokapslar bör ha liknande diameter och ha ett jämförbart antal celler fångade i kärnan. Aggregering av enskilda celler i sfäroider sker vanligtvis inom 48 timmar och brist på sfäroidbildning vid 72 timmar är ett varningstecken. En orsak till brist på sfäroidbildning kan vara att viskösa molekyler i kärnan inte läcker ut tillräckligt snabbt genom hydrogelskalet. Vi stötte på detta scenario vid justering av viskositeten hos kärnlösningen med användning av polymerer med hög molekylvikt såsom karboximetylcellulosa (MW 250 kD). Man kan kapsla in mikropärlor (se figur 3B) för att testa om dessa cellstora objekt är fria att röra sig runt kärnan och hur snabbt komponenter i kärnan läcker ut. Brist på sfäroidbildning uppstod också av oss vid användning av PEG-4-Mal-koncentrationer på >8% w / v. I detta scenario minskar porositeten och diffusiviteten hos hydrogelskalet och element med hög viskositet i kärnan läcker inte ut tillräckligt snabbt för att celler ska kunna bildas till aggregat. Det är tänkbart att kvaliteten på PEG-4-Mal kan variera från sats till sats eller tillverkare. Därför kan viss justering av polymerkoncentrationen i skalet behövas. Återigen bör pärlinkorporeringsmetoden avslöja hur snabbt viskösa komponenter i kärnan förskjuts av vattenmolekyler. Enligt vår erfarenhet bör detta ske inom 3 timmar efter överföring av mikrokapslar till vattenmiljön.
Inkapslingsprotokollet som beskrivs här har fungerat bra för flera hPSC-linjer7, primära hepatocyter10 och flera cancercellinjer (opublicerade resultat). Vi stötte emellertid på svårigheter att bilda sfäroider efter inkapsling av stamcellshärledda (sc) -hepatocyter och sc-β-celler. Felsökning med inkapslade mikropärlor avslöjade att viskösa komponenter snabbt eluerades från kärnan och att celler var fria att röra sig och bilda cell-cellkontakter. Ytterligare felsökning involverade titrering av di-tioltvärbindning DTT (närvarande i oljefasen) ner från 66 mM till 10 mM. Sfäroidbildning för sc-hepatocyter och β-celler inträffade vid denna lägre koncentration av DTT. Därför kanske användaren vill överväga att optimera tvärbindningskoncentrationen, men endast om andra felsökningssteg som anges ovan inte har lyckats. Vi finner att DTT-koncentrationen är avgörande för att upprätthålla mekanisk integritet hos mikrokapslar med 66 mM DTT vilket resulterar i mekaniskt robusta mikrokapslar och är giftfri för de allra flesta celltyper som hittills använts.
Ett antal strategier för att skapa 3D-stamcellskonstruktioner har beskrivits i litteraturen. Fördelarna med att bilda stamcellskonstruktioner inom mikrokapslar med kärnskal är flera. När de är inkapslade kan sfäroider hanteras med lätthet med hydrogelkapslar som ger skydd mot skjuvskador. Inkapslade sfäroider kan odlas i suspension med kraftig omrörning utan att skada stamceller.
Det finns flera vägar för att utöka kapaciteten hos mikrokapslar. Vårt team har tidigare beskrivit användningen av heparinhaltiga hydrogeler för inkapsling av hepatocyter och stamceller 8,12 och utvecklar för närvarande heparinhaltiga bioaktiva kärnskalmikrokapslar som fungerar som depåer för lagring och lokal frisättning av induktiva signaler (GF) till stamceller. Sådana mikrokapslar kan bidra till att minska användningen av dyra GF samtidigt som differentieringsresultaten förbättras. Mikrokapslar kan förbättras ytterligare genom att införliva ECM-proteiner i kärnan och därmed modulera stamcellsmikromiljön. Mikrokapslar med kärnskal kan göras nedbrytbara för att göra det lättare att hämta hPSC-sfäroider13,14. Sammantaget representerar mikrokapslar med kärnskal en plattformsteknik som kan modifieras och förbättras för att tillgodose behoven hos ett specifikt stamcellsdifferentieringsprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av bidragen från Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) och NIH (DK107255).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
