Bu makalede, insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) koaksiyel akış odaklama cihazı kullanılarak kapsüllenmesi açıklanmaktadır. Bu mikroakışkan kapsülleme teknolojisinin hPSC sferoidlerinin verimli bir şekilde oluşturulmasını sağladığını gösteriyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Pluripotent Kök Hücre Sferoidlerini Taşıyan Core-Shell Mikrokapsüllerinin Mikroakışkan İmalatı
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) üç boyutlu (3D) veya sferoid kültürleri, gelişmiş farklılaşma sonuçlarının ve ölçeklenebilirliğin faydalarını sunar. Bu yazıda, hPSC'leri çekirdek kabuklu mikrokapsüllerin içine hapsetmek için bir ko-eksenel akış odaklama cihazının kullanıldığı hPSC sferoidlerinin sağlam ve tekrarlanabilir oluşumu için bir strateji açıklanmaktadır. Çekirdek çözelti, hPSC'lerin tek hücreli süspansiyonunu içeriyordu ve yüksek moleküler ağırlıklı poli (etilen glikol) (PEG) ve yoğunluk gradyan ortamının dahil edilmesiyle viskoz hale getirildi. Kabuk akışı, PEG-4 kol-maleimid veya PEG-4-Mal'dan oluşuyordu ve çekirdek akışı boyunca iki ardışık petrol kavşağına doğru akıyordu. Damlacık oluşumu, ilk yağ kavşağında, kabuk çözeltisinin çekirdeğin etrafına sarılmasıyla meydana geldi. Kabuğun kimyasal çapraz bağlanması, ikinci yağ kavşağında, bu damlacıklara bir di-tiyo çapraz bağlayıcı (1,4-ditiyotreitol veya DTT) eklenerek meydana geldi. Çapraz bağlayıcı, tıklama kimyası yoluyla maleimid fonksiyonel gruplarıyla reaksiyona girer ve mikrokapsüllerin etrafında bir hidrojel kabuğunun oluşmasına neden olur. Enkapsülasyon teknolojimiz, saniyede 10 kapsül hızında 400 μm çapında kapsüller üretti. Ortaya çıkan kapsüller, bir hidrojel kabuğa ve tek hücrelerin agregalara hızla toplanmasına ve sferoidler oluşturmasına izin veren sulu bir çekirdeğe sahipti. Kapsülleme işlemi, hPSC'lerin yaşayabilirliğini olumsuz yönde etkilemedi, kapsüllemeden 3 gün sonra% >95 canlılık gözlendi. Karşılaştırma için, katı jel mikropartiküllerinde (sulu bir çekirdek olmadan) kapsüllenmiş hPSC'ler sferoidler oluşturmadı ve kapsüllemeden 3 gün sonra% <50 canlılığa sahipti. Çekirdek-kabuk mikrokapsülleri içindeki hPSC'lerin küresel oluşumu, kapsüllemeden sonraki 48 saat içinde meydana geldi ve sferoid çap, hücre aşılama yoğunluğunun bir fonksiyonuydu. Genel olarak, bu protokolde açıklanan mikroakışkan kapsülleme teknolojisi, hPSC'lerin kapsüllenmesi ve sferoid oluşumu için çok uygundu.
Giriş
İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) 3D kültürlerine, bu kültür formatı 1,2,3'ün sağladığı gelişmiş pluripotens ve farklılaşma potansiyeli nedeniyle büyük ilgi vardır. hPSC'ler tipik olarak biyoreaktörler, mikrokuyular, hidrojeller ve polimerik iskeleler 4,5,6 aracılığıyla sferoidler veya diğer 3D kültür formatları halinde oluşturulur. Kapsülleme, tek hPSC'leri sferoidler halinde düzenlemek için başka bir yol sunar. Kapsüllendikten sonra hPSC sferoidleri kolaylıkla ele alına....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Cihaz imalatı
- CAD yazılımı10,11'i kullanarak mikrokapsülleme cihazı ve ayrışma cihazı için tasarımlar yapın.
- İstenilen yüksekliklere sahip yapılar elde etmek için SU-8 fotodirencinin üç katmanını silikon gofret üzerinde sırayla (Şekil 2A) spin-co'layın: 60, 100 ve 150 μm.
NOT: Üst ve alt kalıplar için işlem aynıdır.- İlk 60 μm katmanı oluşturmak için 1.100 rpm'de SU-8 2025 negatif fotorezistli temiz bir 10 cm'lik silikon gofret kaplayın. Sıcak plaka üzerinde 3 dakika boyunca 65 °C'de ve 10 dakika boyunca 95 °C'de yumuşak bir fırınlamadan sonra, çek....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yukarıda belirtilen protokolü izleyerek, okuyucu mikroakışkan cihazlar üretebilecek ve hücre taşıyan mikrokapsüller üretebilecektir. Şekil 3A , mikroakışkan damlacık üretimi kullanılarak üretilen optimal ve yetersiz mikrokapsüllerin örneklerini göstermektedir. PEG-4-Mal'ın farklı formülasyonları, farklı morfolojilere sahip kapsüllerle sonuçlandı - buruşuk kapsüller zayıf jelasyon, düşük mekanik bütünlük ile ilişkiliydi ve karıştırılmış bir biyoreaktörde ekime dayanamadı. PEG içeriğinde gözle.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan kapsülleme işlemi, hPSC sferoidlerinin tekrarlanabilir oluşumu ile sonuçlanır. Mikrokapsül formatı, farklılaşma protokollerini iyileştirmeyi / optimize etmeyi veya tedavileri test etmeyi amaçlayan deneyler için sferoidlerin bir mikrotitre plakasının kuyucuklarına dağıtılmasını kolaylaştırır. Kapsüllenmiş kök hücre sferoidleri, hidrojel kabuğun hücreleri kesme kaynaklı hasara karşı koruduğu süspansiyon kültürlerinde de kullanılabilir7.
Protokol içinde bi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen Mayo Clinic Rejeneratif Tıp Merkezi, J. W. Kieckhefer Vakfı, Al Nahyan Vakfı, Rejeneratif Tıp Minnesota (RMM 101617 TR 004) ve NIH (DK107255) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.22 ve mikro; m Şırınga Filtreleri | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml şırınga luer-kilit ucu | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4 kollu PEG maleimid, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml şırınga luer-kilit ucu | BD | 309646 | |
| 6 KUYULU İŞLEM GÖRMEMIŞ PLAKA | ABD Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Aplikatör Paketi | Aquapel Cam Tedavisi | 47100 | |
| CAD yazılımı | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| HÜCRE SÜZGECİ 100 & m gözenek boyutu | kardinal | 335583 | |
| Klorotrimetilsilan | Aldrich | 386529-100mL | |
| Kontes II FL Otomatik Hücre Sayacı Yaşam | teknolojisi | A27974 | |
| Dijital sıcak plaka | Dataplate | ||
| Dijital girdap karıştırıcı | Fisher Scientific | 215370 | |
| Damıtılmış su | Gibco | 15230-162 | |
| Ditiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM / F12 medya | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Konik Santrifüj Tüpleri | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Mikrosantrifüj | canlı | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 İnkübatör | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Ters Floresan Motorlu Mikroskop | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Kaplayıcılar | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Canlı/Ölü memeli boyama kiti | Fisher | L3224 | |
| Sihirli bant | Zımba | 483535 | |
| Mikro Tıbbi Boru (0.015 "ID x 0.043" OD) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE / 2 | |
| Mikro karıştırma çubuğu | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filtre Forseps | Fisher bilimsel | XX6200006P | |
| Mineral yağ | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Bazal Orta | KÖK HÜCRE TEKNOLOJİSİ | 85850 | |
| İğneler-Paslanmaz Çelik 14 Gauge | CML kaynağı | 901-14-025 | |
| İğneler-Paslanmaz Çelik 15 Gauge | CML kaynağı | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TEKNOLOJİSİ | 7820 | |
| Fırın | Thermo Scientific | HERA THERM Fırın Penisilin | |
| :Streptomisin (10.000 U/mL Penisilin G, 10mg/mL Streptomisin) | İkizler | 400-109 | |
| Petri Çanak 150X20 Steril Havalandırma | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plazma Temizleme Sistemi | Verim Mühendislik Sistemi, Inc. | EVET-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poli (etilen glikol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide İğne 27G | BD | 305109 | |
| Kaya inhibitörü Y-27632 dihidroklorit | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silikon gofret 100mm | Üniversite Gofret | 452 | |
| Sürgülü cam (75 mm ve akut; 25 mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Açıklık 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Santrifüj Tüp Filtresi (0.22 ve mikro; m) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku İleri Malzemeler | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 geliştirici | Kayaku İleri Malzemeler | Y020100 4000L1PE | |
| Cerrahi Tasarım Royaltek Paslanmaz Çelik Cerrahi Neşter Bıçakları | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silikon Elastomer Kiti (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Şırınga pompası | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Trietanolamin | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Boru (0.02 "ID x 0.06" OD) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Boru (0.04" ID x 0.07" OD) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonik temizleyici FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vakumlu kurutucu | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Mikroskop 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μ PG 101 lazer yazıcı | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
Kaynaklar
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history,....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
