Summary
Bu makalede, insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) koaksiyel akış odaklama cihazı kullanılarak kapsüllenmesi açıklanmaktadır. Bu mikroakışkan kapsülleme teknolojisinin hPSC sferoidlerinin verimli bir şekilde oluşturulmasını sağladığını gösteriyoruz.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) üç boyutlu (3D) veya sferoid kültürleri, gelişmiş farklılaşma sonuçlarının ve ölçeklenebilirliğin faydalarını sunar. Bu yazıda, hPSC'leri çekirdek kabuklu mikrokapsüllerin içine hapsetmek için bir ko-eksenel akış odaklama cihazının kullanıldığı hPSC sferoidlerinin sağlam ve tekrarlanabilir oluşumu için bir strateji açıklanmaktadır. Çekirdek çözelti, hPSC'lerin tek hücreli süspansiyonunu içeriyordu ve yüksek moleküler ağırlıklı poli (etilen glikol) (PEG) ve yoğunluk gradyan ortamının dahil edilmesiyle viskoz hale getirildi. Kabuk akışı, PEG-4 kol-maleimid veya PEG-4-Mal'dan oluşuyordu ve çekirdek akışı boyunca iki ardışık petrol kavşağına doğru akıyordu. Damlacık oluşumu, ilk yağ kavşağında, kabuk çözeltisinin çekirdeğin etrafına sarılmasıyla meydana geldi. Kabuğun kimyasal çapraz bağlanması, ikinci yağ kavşağında, bu damlacıklara bir di-tiyo çapraz bağlayıcı (1,4-ditiyotreitol veya DTT) eklenerek meydana geldi. Çapraz bağlayıcı, tıklama kimyası yoluyla maleimid fonksiyonel gruplarıyla reaksiyona girer ve mikrokapsüllerin etrafında bir hidrojel kabuğunun oluşmasına neden olur. Enkapsülasyon teknolojimiz, saniyede 10 kapsül hızında 400 μm çapında kapsüller üretti. Ortaya çıkan kapsüller, bir hidrojel kabuğa ve tek hücrelerin agregalara hızla toplanmasına ve sferoidler oluşturmasına izin veren sulu bir çekirdeğe sahipti. Kapsülleme işlemi, hPSC'lerin yaşayabilirliğini olumsuz yönde etkilemedi, kapsüllemeden 3 gün sonra% >95 canlılık gözlendi. Karşılaştırma için, katı jel mikropartiküllerinde (sulu bir çekirdek olmadan) kapsüllenmiş hPSC'ler sferoidler oluşturmadı ve kapsüllemeden 3 gün sonra% <50 canlılığa sahipti. Çekirdek-kabuk mikrokapsülleri içindeki hPSC'lerin küresel oluşumu, kapsüllemeden sonraki 48 saat içinde meydana geldi ve sferoid çap, hücre aşılama yoğunluğunun bir fonksiyonuydu. Genel olarak, bu protokolde açıklanan mikroakışkan kapsülleme teknolojisi, hPSC'lerin kapsüllenmesi ve sferoid oluşumu için çok uygundu.
Introduction
İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) 3D kültürlerine, bu kültür formatı 1,2,3'ün sağladığı gelişmiş pluripotens ve farklılaşma potansiyeli nedeniyle büyük ilgi vardır. hPSC'ler tipik olarak biyoreaktörler, mikrokuyular, hidrojeller ve polimerik iskeleler 4,5,6 aracılığıyla sferoidler veya diğer 3D kültür formatları halinde oluşturulur. Kapsülleme, tek hPSC'leri sferoidler halinde düzenlemek için başka bir yol sunar. Kapsüllendikten sonra hPSC sferoidleri kolaylıkla ele alınabilir ve farklılaşma, hastalık modelleme veya ilaç testi deneyleri için mikrotitre plakalarına aktarılabilir. hPSC'lerin bir hidrojel tabakası içinde muhafaza edilmesi ayrıca hücreleri kesme hasarına karşı korur ve sferoidlerin bir biyoreaktörde yüksek karıştırma oranlarındakültürlenmesine izin verir 7.
Kök hücre kapsülleme metodolojimiz zamanla gelişti. İlk olarak, katı hidrojel mikropartiküllerine odaklandık ve fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC'ler) başarılı bir şekilde kapsüllendiğini ve yetiştirildiğini gösterdik8. Bununla birlikte, insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler), muhtemelen bu hücrelerin kapsüllemeden sonra hücre-hücre temaslarını yeniden kurmalarına duyulan ihtiyaç nedeniyle, bu tür hidrojel mikropartiküllerde kapsüllendiğinde düşük canlılığa sahip oldukları belirtildi. Sulu bir çekirdeğe sahip heterojen mikrokapsülün, hücre-hücre temaslarının hızlı bir şekilde yeniden kurulmasına dayanan hücrelerin kapsüllenmesi için daha uygun olabileceğini düşündük. Sulu çekirdek / hidrojel kabuk mikrokapsülleri yapmak için mikroakışkan cihaz odaklı koaksiyel akış kavramı He ve ark.9'dan uyarlanmıştır, ancak orijinal yaklaşımda kullanılan aljinat yerine, PEG bazlı bir hidrojel kabuğa dahil edilmiştir. İlk olarak çekirdek-kabuk mikrokapsüllerinde primer hepatositin başarılı kapsüllenmesi ve sferoid oluşumu10 gösterdik ve en son olarak hES ve iPS hücrelerinin kapsüllenmesini tanımladık7. Şekil 1A'da belirtildiği gibi, kapsüller, kabuk ve çekirdek akış akışlarının yağ fazına atılmadan önce bir yandan diğer yana koaksiyel akışa geçtiği bir akış odaklama cihazında üretilir. Çekirdek akışı, çözeltinin viskozitesini artıran hücreler ve katkı maddeleri içerir (reaktif olmayan PEG MW 35kD ve iyodiksanol - ticari adı OptiPrep), kabuk akışı ise reaktif moleküller (PEG-4-Mal) içerir. Sürekli koaksiyel akış akışı, çekirdek-kabuk mimarisini koruyan damlacıklar halinde ayrıklaştırılır. Çekirdek-kabuk yapısı, tıklama kimyası yoluyla PEG-4-Mal ile reaksiyona giren ve ince (~ 10 μm) bir hidrojel cilt veya kabuk oluşumuna neden olan di-tiol çapraz bağlayıcıya (DTT) maruz kalınarak kalıcı hale getirilir. Emülsiyon kırıldıktan ve kapsüller sulu bir faza aktarıldıktan sonra, PEG molekülleri çekirdekten yayılır ve su molekülleri ile değiştirilir. Bu, sulu çekirdek ve hidrojel kabuk mikrokapsülleri ile sonuçlanır.
Aşağıda, mikroakışkan cihazların nasıl yapılacağı, hücrelerin nasıl hazırlanacağı ve hPSC'lerin kapsüllenmesinin nasıl gerçekleştirileceği hakkında adım adım talimatlar verilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cihaz imalatı
- CAD yazılımı10,11'i kullanarak mikrokapsülleme cihazı ve ayrışma cihazı için tasarımlar yapın.
- İstenilen yüksekliklere sahip yapılar elde etmek için SU-8 fotodirencinin üç katmanını silikon gofret üzerinde sırayla (Şekil 2A) spin-co'layın: 60, 100 ve 150 μm.
NOT: Üst ve alt kalıplar için işlem aynıdır.- İlk 60 μm katmanı oluşturmak için 1.100 rpm'de SU-8 2025 negatif fotorezistli temiz bir 10 cm'lik silikon gofret kaplayın. Sıcak plaka üzerinde 3 dakika boyunca 65 °C'de ve 10 dakika boyunca 95 °C'de yumuşak bir fırınlamadan sonra, çekirdek kanal deseninin tasarım dosyasını μPG 101 PC'ye yükleyerek maskesiz bir hizalayıcı kullanarak kalıbı ortaya çıkarın. Ardından, maruz kalma sonrası 3 dakika boyunca 65 ° C'de ve 10 dakika boyunca 95 ° C'de pişirmeye devam edin.
- İkinci SU-8 2025 katmanını (40 μm) 1.500 rpm'de döndürün ve kabuk kanalı deseni için uygun CAD dosyasını yükleyerek pozlayın.
NOT: Yumuşak ve pozlama sonrası fırınlar önceki adıma benzerdi. - 50 μm yüksekliğe ulaşmak için üçüncü SU-8 2025 katmanını 1.400 rpm'de döndürün ve yukarıdaki işlemi tekrarlayın, ancak yağ fazı için yapıları açığa çıkarın.
- Maruz kalmayan tüm fotodirenç çıkarılana kadar SU-8 geliştiricisine daldırarak kalıbı üç katmanla birlikte tek bir adımda geliştirin.
- Yapışmayı iyileştirmek ve geliştirmeden sonra ortaya çıkabilecek küçük çatlakları kapatmak için kalıbı 160 ° C'de sıcak bir plakada 10 dakika boyunca sert bir şekilde pişirin.
- Bir sonraki adımda elastomer yapışmasını önlemek için kalıbı klorotrimetilsilana maruz bırakın ve kullanıma kadar 15 cm Petri kaplarına yerleştirin.
- Ayrışma cihazı kalıbını Şekil 1D ve Şekil 2B'de açıklandığı gibi hazırlayın. İstenilen yüksekliğe sahip yapılar elde etmek için 1.2.3 adımında daha önce açıklandığı gibi, bir silikon gofret üzerinde bir kat SU-8 fotodirenci döndürün: 50 μm. Yumuşak ve maruz kalma sonrası pişirme, geliştirme ve sert pişirmeyi önceki adıma benzer şekilde yapın.
NOT: Bir dizi üçgen şekilli direk tüm odayı kapladı ve oda genişliği çıkışa doğru azaldıkça direkler arasındaki boşluk azaldı. Üçgen direkler, 400 μm (girişte) ila 30 μm (çıkışta) arasında değişen bir aralıkla yan başına 200 μm idi. - Kalıpları polidimetilsiloksan (PDMS) kullanarak yumuşak litografi ile hazırlayın.
- PDMS elastomer baz ve elastomer kürleme maddesini gezegensel bir santrifüjde 10:1 w/w oranında karıştırın. 3-4 mm'lik bir tabaka oluşturmak için karışımı hem mikrokapsülleme ana kalıplarına hem de ayrışma ana kalıbına dökün.
NOT: 50 g elastomer baz ile 5 g kürleme maddesi karışımı, 3 mm kalınlığındaki bir ana kalıbı örtmek için yeterlidir. - Kürlenmemiş PDMS'nin gazını gidermek için kalıpları içeren Petri kaplarını 15 dakika boyunca vakumlu bir kurutucuya yerleştirin.
- Petri tabaklarını bir fırına taşıyın ve en az 60 dakika boyunca 80 ° C'de pişirin.
- Ana kalıpları fırından çıkarın ve soğumalarını bekleyin. Hassas bir bıçak kullanarak, gofret şeklini takip ederek PDMS'yi dikkatlice kesin ve PDMS parçalarını ana kalıptan çıkarın.
- Her cihazın kenarlarını bir neşterle keserek PDMS plakalarını kesin, ardından ayrışma cihazındaki ve yalnızca üst mikroakışkan cihazdaki giriş/çıkış akışkan portlarını paslanmaz çelik iğneler kullanarak delin. Kirlenmeyi önlemek için cihazları sihirli bantla örtün.
NOT: İğne ölçer, giriş ve çıkış portları için sırasıyla 14 G ve 15 G'dir. - Yapıştırma için, üst ve alt PDMS parçalarının desenli taraflarını2 dakika boyunca bir plazma kazıyıcı üzerinde O2 plazma ile tedavi edin.
- Doğrudan mikro kanallara (2 μL) ince bir ayırıcı damıtılmış su tabakası ekledikten sonra her iki PDMS parçasını da bir stereoskop altında hizalayın.
- Yapıştırmayı tamamlamak ve PDMS'yi orijinal hidrofobik durumuna geri yüklemek için hizalanmış PDMS cihazını gece boyunca 80 ° C'de fırına yerleştirin. Daha fazla kullanana kadar cihazları saklayın.
NOT: Bu, çekirdek için 120 μm, kabuk için 200 μm ve yağ kanalları için 300 μm olmak üzere üç farklı yüksekliğe sahip koaksiyel akış odaklama cihazı ile sonuçlanır. - Plazma bağlanmasından hemen sonra cihazı kullanmak için, hidrofobik kaplama elde etmek için sıvı kanallara dikkatli ama sıkı bir şekilde 30 μL hidrofobik kaplama çözeltisi enjekte edin. Daha sonra, cihazda hidrofobik kaplama çözeltisinin kalıntıları gözlenmeyene kadar havayı derhal kanallara boşaltın.
- Ayrışma cihazını, önce cihazın desenli tarafını ve temizlenmiş bir slayt camınıO2 plazma ile 2 dakika boyunca işlemden geçirerek bağlayın ve daha sonra gece boyunca 80 ° C'de fırında daha fazla kürlenme için birleştirin.
NOT: Cihazlar daha fazla kullanıma kadar saklanabilir.
- PDMS elastomer baz ve elastomer kürleme maddesini gezegensel bir santrifüjde 10:1 w/w oranında karıştırın. 3-4 mm'lik bir tabaka oluşturmak için karışımı hem mikrokapsülleme ana kalıplarına hem de ayrışma ana kalıbına dökün.
2. Çözeltilerin hazırlanması
- Stok çözümleri. İlk olarak, gerçek kullanım için daha düşük konsantrasyonlara seyreltilecek stok çözeltileri (konsantre çözeltiler) hazırlayın.
NOT: Stok çözümleri, hazırlık süresinden tasarruf etmek, malzemeleri korumak, depolama alanını azaltmak ve daha düşük konsantrasyonlarda bir çalışma çözeltisi hazırlarken doğruluğu artırmak için kullanılır.- 30 mL 2x çekirdek çözeltisi (%16 PEG ve %34 yoğunluk gradyan ortamı) hazırlayın: 4,8 g 35 kDa PEG, 10,2 mL yoğunluk gradyan ortamı ve 19,8 mL DMEM/F12 ortam karıştırın. Bu çekirdek çözeltiyi 0,22 μm şırınga filtresi kullanarak filtreleyin.
- % 3 yüzey aktif madde ile 50 mL mineral yağ hazırlayın: 48.5 mL mineral yağ ve 1.5 mL yüzey aktif madde karıştırın. 0,22 μm şırınga filtresinden filtrasyondan sonra steril bir durumda tutun.
- % 0.5 yüzey aktif madde ile 50 mL mineral yağ hazırlayın: 49.75 mL mineral yağ ve 0.25 mL yüzey aktif madde karışımı. Steril bir durumda tutun.
- 1 M Ditiyoteritol (DTT) hazırlayın: 1.5425 g DTT'yi 10 mL damıtılmış suda çözün. Steril bir durumda tutun.
- 1 M Trietanolamin (TEA) hazırlayın: 433.6 μL damıtılmış suya 66.4 μL çay ekleyin. Steril bir durumda tutun.
- % 1 Pluronik F127 (PF127) hazırlayın: 10 mL damıtılmış suda 100 mg PF127 çözün. Steril bir durumda tutun.
- Çalışma çözümleri
- 4,5 mL mineral yağı% 3 yüzey aktif madde ve 300 μL 1 M DTT (1:15 oranı) ile karıştırarak bir çapraz bağlayıcı emülsiyonu hazırlayın. 2 dakika boyunca çözeltiyi vorteks edin ve 20 ° C'de ultrasonik bir banyoda 45-60 dakika boyunca sonikat. Bu çözeltiyi 27 G iğneli 5 mL'lik bir şırıngaya yükleyin.
NOT: Emülsiyon, sonikasyon yağı / su karışımı ile üretilir. - Mineral yağı% 0,5 yüzey aktif madde ile 27 G iğneli 5 mL'lik bir şırıngaya yükleyerek koruyucu yağ çözeltisi hazırlayın.
- % 8 w / v çözeltisi oluşturmak için 400 μL 1x DPBS'ye 32 mg PEG-4-Mal ekleyerek kabuk (% 8 w / v PEG-4-Mal ve 15 mM TEA) çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi 2 dakika boyunca vorteksleyin. Daha sonra, 6 μL 1 M TEA ekleyin (son konsantrasyon 15 mM TEA). Son olarak, bir spin filtresinden 5 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüj yapın ve 30 dakika boyunca rocker üzerinde karanlıkta tutun. Ardından, bu çözeltiyi 27 G'lik bir iğne ile 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin.
NOT: Kapağı açmadan önce PEG-4-Mal kabını oda sıcaklığında 10 dakika bekletin ve kapağı kapatmadan önce O2'yi N2 ile değiştirmek içinN2 gazını üfleyin. Çözüme eklemeden önce Vortex TEA.
- 4,5 mL mineral yağı% 3 yüzey aktif madde ve 300 μL 1 M DTT (1:15 oranı) ile karıştırarak bir çapraz bağlayıcı emülsiyonu hazırlayın. 2 dakika boyunca çözeltiyi vorteks edin ve 20 ° C'de ultrasonik bir banyoda 45-60 dakika boyunca sonikat. Bu çözeltiyi 27 G iğneli 5 mL'lik bir şırıngaya yükleyin.
- Çekirdek çözeltide hücre süspansiyonunu hazırlayın
- hPSC'lere 37 °C'de 5 ila 10 dakika boyunca tripsin uygulayın. Sonra onları plakalardan toplayın. Tripsini hücre ayrılmasından sonra ortamla söndürün ve ardından hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
- Toplu hücre süspansiyonunu santrifüj edin (400 x g, 5 dakika). Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve daha sonra minimum hacimli bir büyüme ortamı kullanarak hücre peletini yeniden askıya alın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
NOT: Tipik hücre alikotları 12-20 x 106 hücre içerir ve çekirdek çözeltinin 400 μL'sini yapmak için yeterlidir. - Toplu hücre süspansiyonundan 12-20 x 106 hücre alın ve hücre/ortam süspansiyonunu santrifüj edin (400 x g, 5 dakika).
- Hücre peletinden medyayı dikkatlice aspire edin. Ardından, 200 μL ortam ve 200 μL 2x PEG çözeltisi (son konsantrasyon 30-50 x 106 hücre / mL) ekleyin ve yavaşça karıştırın.
NOT: Düşük hücre konsantrasyonları (20 x 106 hücre / mL'den az) birçok boş kapsülle sonuçlandı. - Çözeltiye 30 μL% 1 PF127 ekleyin.
- 1 mL'lik bir şırıngaya bir mikro karıştırıcı çubuğu (2 mm x 7 mm) yerleştirin ve ardından çekirdek çözeltisi içeren hücreyi 27 G'lik bir iğne ile şırıngaya yükleyin. Tüm kapsülleme işlemi sırasında çözeltiyi buzla soğuk tutun.
3. Deney düzeni
- Yapıştırılmış PDMS damlacık cihazını, dört adet 20 cm uzunluğunda ve bir parça 5 cm uzunluğunda giriş mikro tüpleri (0,38 mm ID. x 1,1 mm O.D.), bir parça 10 cm çıkış tüpü (0,5 mm ID x 1,5 mm O.D.) ve altı adet 0,5 cm bağlantı tüpünü (1 mm ID. x 1,8 mm O.D.) mikrop öldürücü bir ışık kaynağının (tipik olarak biyolojik güvenlik dolaplarına yerleştirilmiş) altına yerleştirin ve 30 adet sterilize edin min.
- Boruyu akışkan giriş portlarına ve ayrışma portlarına sığdırmak için forseps kullanın.
- Kabuk, yağ, çapraz bağlayıcı emülsiyon girişleri için üç adet 20 cm uzunluğunda giriş mikrotüpü ve ayrışma cihazının girişi için bir parça kullanın. Ardından, tüplerin karşı ucunu ilgili çözelti ile şırınganın iğnesine yerleştirin. Bu arada, mikroakışkan cihazın çekirdek girişini ve ayrışma cihazının çıkışını 5 cm'lik bir mikrotüp ile bağlayın (Şekil 1C).
NOT: Giriş mikrotüpleri, son adımda yerleştirilen bağlantı tüplerinin içine sıkıca sabitlenmelidir. - Akışkan çıkış portuna bir çıkış tüpü yerleştirin ve karşı ucu bir toplama haznesine yerleştirin.
- Cihazı mikroskop aşamasına yerleştirin ve hareket etmesini önlemek için boruyu takın. Akış denetimi için mikroskobu cihaz nozuluna hizalayın ve odaklayın.
- Her şırıngayı farklı şırınga pompalarına yerleştirin ve düzgün bir şekilde sabitleyin (Şekil 1B). Her pompayı üreticinin protokollerine göre aşağıdaki akış hızlarına göre programlayın: çekirdek (3-5 μL/dak), kabuk (3-5 μL/dak), koruyucu yağ (20-80 μL/dak) ve çapraz bağlama yağı (40-60 μL/dak). Tüm pompalarda akışı başlatın.
- Her sıvının cihaza girmesini bekleyin ve kalan havayı dışarı iterken kanalları doldurun.
NOT: Giriş borusunda çok miktarda hava varsa, hava tamamen çıkarılana kadar her akış hızını geçici olarak artırın. Aşırı akış hızının PDMS'den PDMS'ye bağ hatasına yol açabileceğini unutmayın. - Kapsül oluşumu stabilize edildiğinde (Şekil 3), toplama tüpünün karşı ucunu 5 mL mTeSR ortamına sahip yeni bir konik tüpe yerleştirin.
NOT: Ortam 10 μM ROCK inhibitörü, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin içerir. - Yeterli sayıda kapsül toplandıktan sonra, 10 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. Yağ fazında bulunan kapsüller tüpün tepesinde olacaktır (bkz. Şekil 4A). Tüpe hafifçe dokunmak, kapsüllerin dibe çökelmesine neden olur. Bundan sonra, yağ ve ortamın çoğu aspire edilebilir.
- Kapsülleri konik tüpün dibinden toplayın, bir hücre süzgecine (100 μm gözenek boyutu) yerleştirin ve bol miktarda ortamla yıkayın. Daha sonra, 6 delikli bir kültür plakasında 2 mL medya kullanarak mikrokapsülleri toplayın ve medyayı kuyu plakasının üzerine ters çevrildiği için filtreden geçirin (bkz. Şekil 4A).
4. Mikrokapsüllerde hPSC kültürü ve analizi
- Temel kültür
- Kök hücre kapsüllerini, 37 ° C'de% 5 CO 2 ile 6 delikli bir tabak kültür kabındainkübe edin.
- Kapsülleri bir hücre süzgeci filtresinde toplayarak, fazla medya ile yıkayarak ve adım 3.10'da yapıldığı gibi 2 mL ortama sahip 6 delikli plakalarda yeni bir kuyuya geri döndürerek medyayı her gün değiştirin.
- Kapsülleri en az 10 gün boyunca kültürleyin.
- Kapsüllenmiş kök hücrelerin yaşayabilirliğini belirlemek için canlı / ölü tahlilini yapın.
- Canlı / ölü tahlil çözeltilerini (ethidium homodimer-1 ve calcein AM) çözün.
- 2 mL steril DPBS'ye 2 μM ethidyum homodimer-1'in 4 μL'sini ve 4 μM kalsein çözeltilerinin 1 μL'sini ekleyin. Tam karıştırma sağlamak için vorteks.
- Bir hücre süzgeci üzerinde yaklaşık 100 mikrokapsül toplayın ve ortamın kapsüllerden dışarı difüzyonuna izin vermek için steril DPBS ile durulayın.
- Adım 4.2.2'de hazırlanan çözeltinin 1 mL'sini kullanarak bunları tekrar 12 kuyucuklu bir kültür plakasına toplayın. 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Hücreleri floresan mikroskobu altında görselleştirin.
NOT: Hücre canlılığı, yeşil olarak görselleştirilen canlı hücrelerin toplam hücre sayısı içindeki yüzdesinin hesaplanmasıyla ölçülür.
- Küresel boyut karakterizasyonu.
- İstenildiğinde, kuyu plakasını mikrokapsüllerle mikroskop altına yerleştirin ve ilgili yazılımda gösterilen sferoidlerin çapını uygun ölçek çubuklarıyla ölçün.
- Küresel boyutu ölçün ve analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda belirtilen protokolü izleyerek, okuyucu mikroakışkan cihazlar üretebilecek ve hücre taşıyan mikrokapsüller üretebilecektir. Şekil 3A , mikroakışkan damlacık üretimi kullanılarak üretilen optimal ve yetersiz mikrokapsüllerin örneklerini göstermektedir. PEG-4-Mal'ın farklı formülasyonları, farklı morfolojilere sahip kapsüllerle sonuçlandı - buruşuk kapsüller zayıf jelasyon, düşük mekanik bütünlük ile ilişkiliydi ve karıştırılmış bir biyoreaktörde ekime dayanamadı. PEG içeriğinde gözlenen% >6'lık pürüzsüz kapsüller, istenen kapsül morfolojisini temsil ediyordu ve hücre yetiştiriciliği için yeterince sağlamdı. Çekirdek-kabuk yapısı, mikroboncukların çekirdeğe ve floresan köstebeklerin mikrokapsüllerin kabuğuna dahil edilmesiyle doğrulandı. Şekil 3B'de görüldüğü gibi kapsüllerin merkezinde boncukların toplanması, çekirdeğin sulu olduğunu ve boncukların hareket etmekte serbest olduğunu gösteren bir gösterge olarak kullanılmıştır. Şekil 3C'de gözlenen floresan anulus, bir hidrojel kabuğun varlığını gösterdi ve kabuk kalınlığını belirlemek için kullanıldı. Kullanıcıların, kapsülleme işleminin kurulmasının ilk aşamalarında mikroboncuk birleştirme ve floresan etiketleme kullanmalarını öneririz.
Kapsülleme işlemi kurulduktan sonra, hPSC'lerin kapsüllenmesine geçilebilir. Bu protokol H9 hücrelerinin kapsüllenmesini tanımlarken, başka bir hESC hattını (HUES-8) ve bir iPSC hattını (1016) kapsüllemek için benzer bir strateji kullandık. 7 adet
Kapsülleme sadece kapsülleme cihazı kullanılarak gerçekleştirilebilirken, hPSC'lerin sistemde kümelenme eğiliminde olduğunu ve bunun sonucunda düzgün olmayan kapsülleme veya kapsül doluluğuna neden olduğunu belirttik. Bu zorluğun üstesinden gelmek için bir ayrıştırma veya filtreleme cihazı tasarladık ve kapsülleme cihazının yukarı akışını konumlandırdık. Bu ayrışma cihazı, kenar başına 200 μm ölçülen üçgen şeklindeki direkler dizisine sahip ve girişte 400 μm ile çıkışta 30 μm arasında değişen aralıklara sahip bir akış kanalından oluşuyordu, böylece kümeler kapsülleme cihazına girmeden önce tutuluyor veya parçalanıyor (bkz. Şekil 1D)7. Ayrışma cihazının kullanımı, sferoidlerin homojenliğini önemli ölçüde iyileştirmeye ve kapsüllerin hücre doluluğunu% 57'den% >90'a çıkarmaya izin verir7.
Şekil 4B, C, bir kapsülleme çalışmasından elde edilen temsili sonuçları açıklar. Bu görüntülerden de görülebileceği gibi, H9 hücreleri, kapsülleme çalışmaları sırasında rutin olarak elde edilen% >95 canlılık ile yüksek canlılığa sahiptir. Büyüme hızını (bkz. Şekil 4B,C) ve kapsüllenmiş ve kapsüllenmemiş sferoidlerin farklılaşma potansiyelini karşılaştırdık7 ve kapsülleme işleminin hPSC'ler üzerinde olumsuz bir etkisi olmadığını belirledik. Öte yandan, hPSC'leri kapsüllemenin çeşitli faydaları vardır. Kapsüllenmiş sferoidlerin kullanımı kolaydır ve farklılaşma protokolleri geliştirmek veya tedavileri test etmek için mikrotitre plakalarına dağıtılabilir / dağıtılabilir. Laboratuvarımız mikrokapsülleri karıştırılmış biyoreaktörlerde süspansiyon yetiştiriciliği için kök hücre taşıyıcıları olarak kullanmakla ilgilenmektedir ve hidrojel kabuğun bu tür kültürlerde kayma hasarına karşı koruma sağladığını göstermiştir7. Bu, bizim tarafımızdan takip edilen ek bir yol, farklılaşma sırasında endüktif ipuçlarının lokal ve sürekli olarak verilmesi için hidrojel kabuğun büyüme faktörleri ile yüklenebileceği biyoaktif mikrokapsüller oluşturmaktır.
Şekil 1: Çekirdek-kabuk mikrokapsüllerinin imalatı . (A) Kapsül üretimi için mikroakışkan cihaz, dört giriş kanalından (çekirdek, kabuk, yağ ve çapraz bağlayıcı yağı) ve bir toplama tüpüne yol açan bir serpantin kanalından oluşur. Cihaz, çekirdek, kabuk ve yağ kanalları sırasıyla 120 μm (H1), 200 μm (H2) ve 300 μm (H3) yüksekliğinde olacak şekilde üretilmiştir. İç kısım, nozulda kesitsel bir görünümü temsil eder - sulu ve yağ akışları arasındaki kavşak. Bu kesitsel görünüm, okuyucuya koaksiyel akış kanallarını daha iyi görmesini sağlamak için 90° eğilir. Çekirdek-kabuk mikrokapsül üretim sürecinin 3D temsili, çekirdek-kabuk mikrokapsül yapısını üretmek için koaksiyel akışın akış odaklama bağlantısının yukarı yönünde nasıl üretildiğini gösterir. Emülsifikasyon, sulu damlacıkların, birincisi damlacıkları stabilize etmek için tasarlanmış ve ikincisi PEG-4-Mal ile reaksiyona giren çapraz bağlayıcı DTT'yi sağlamak için tasarlanmış iki yağ akışına maruz bırakılmasıyla elde edilir. Bu şekil referans12'den değiştirilmiştir. Telif Hakkı 2019, Amerikan Kimya Derneği. (B) Şırınga pompalarının, tüplerin, mikroakışkan cihazların ve kapsül toplama tüpünün yerlerini gösteren kapsülleme sisteminin deneysel kurulumu. (C) Bir dizi halinde ayrışma ve kapsülleme cihazlarından oluşan kapsülleme sisteminin bir görüntüsü. (D) Büyük hücre agregalarının mikrokapsülleme cihazına girmesini önlemek için kullanılan mikroakışkan ayrışma cihazının tasarımı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kapsülleme için kullanılan mikroakışkan cihazların imalatı. (A) Kapsülleme cihazının imalatı. Üç SU-8 fotodirenç tabakası spin kaplamalıydı ve farklı yüksekliklerde çekirdek, kabuk ve yağ kanalları oluşturmak için fotoğraf desenliydi. Çekirdek kanallar, kapsül bağlantısında 135 μm'ye kadar daralan 220 μm genişliğe sahiptir. Tüm fazlar için kanallar aynı prensibi izler: kabuk ve yağ kanalları 500 μm genişlikte başlar, kavşakta 220 μm'ye daralır ve koruyucu yağ 500 μm'de başlar ve 270 μm'ye daralır. Çıkış serpantini 1,5 mm genişliğe ve ~ 55 mm uzunluğa sahiptir. Üst ve alt PDMS parçaları daha sonra hizalandı ve plazma bağlandı. (B) Ayrışma cihazının imalatı. Bir SU-8 fotodirenç tabakası spin kaplamalıydı ve ayrışma kanalları oluşturmak için fotoğraf desenliydi. PDMS parçası daha sonra cam slayt ile plazma bağlandı. Ayrışma cihazı, 30 μm yüksekliğe, 16,5 mm uzunluğa ve girişte 5 mm ve çıkışta 1,7 mm genişliğe sahip küçük bir odadan oluşur. Birbirinden 420 μm giriş ile ayrılan ve çıkışa giderken son sırada 50 μm'lik bir ayırma ile daha da yakınlaşan üçgen şeklinde yapılara (200 μm, eşkenar) sahiptir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mikrokapsüllerin karakterizasyonu. (A) Kabuktaki PEG-4-Mal içeriğinin bir fonksiyonu olarak kapsül morfolojisindeki farklılıklar. Parlak kenarlı pürüzsüz kapsüller, istenen mekanik bütünlük ile ilişkilidir. (B) Mikrokapsüllerin sulu çekirdeğinin doğrulanması. Sıkışmış mikroboncuklar, sulu çekirdekte hareket etmekte serbesttir ve mikrokapsüllerin merkezinde toplanır. (C) Rhodamine B-etiketli PEG'nin mikrokapsüllerin kabuğuna dahil edilmesiyle çekirdek-kabuk yapısının doğrulanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: hPSC'lerin kapsüllenmesi . (A) Yağ fazındaki mikrokapsüller, ortamla doldurulmuş konik bir tüp içinde toplanır. Mikrokapsüller tüpün dibine yerleşmek için yapıldıktan sonra, yağ ve ortam aspire edilir, mikrokapsüller yıkanır ve daha sonra ekim için 6 delikli bir plakaya aktarılır. (B) H9 hücrelerini kapsülledikten 6 saat sonra canlı/ölü boyama. Üst görüntü 10x'te ve alt görüntü 20x'te çekildi. (C) Kapsüllerdeki ve ticari 3D kültür plakalarındaki H9 hücreleri için zamanla değişen küresel boyutları karşılaştıran görüntüler (alt görüntüler). (D) H9 ortamında 7 gün boyunca mikrokapsüllerdeki ve standart 3D kültür plakalarındaki hPSC'ler için artan sferoid çapının miktarı. İstatistiksel analiz -t-testi, p < 0.05, n = 20. Ölçek çubuğu: 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan kapsülleme işlemi, hPSC sferoidlerinin tekrarlanabilir oluşumu ile sonuçlanır. Mikrokapsül formatı, farklılaşma protokollerini iyileştirmeyi / optimize etmeyi veya tedavileri test etmeyi amaçlayan deneyler için sferoidlerin bir mikrotitre plakasının kuyucuklarına dağıtılmasını kolaylaştırır. Kapsüllenmiş kök hücre sferoidleri, hidrojel kabuğun hücreleri kesme kaynaklı hasara karşı koruduğu süspansiyon kültürlerinde de kullanılabilir7.
Protokol içinde birkaç kritik adım vardır. Çekirdek, kabuk ve petrol akışlarının akış hızlarını Protokol bölümünde açıklanan aralıkta tutmak önemlidir. Kabuk akış hızı çok düşükse, akış kararsız hale gelir ve bu da çarpık ve mekanik olarak dengesiz kapsüllere neden olur. Başarılı bir hücre kapsüllemesi, Şekil 4C'de gösterilen mikrokapsüllere benzer görünmelidir. Mikrokapsüller benzer çapta olmalı ve çekirdekte sıkışmış karşılaştırılabilir sayıda hücreye sahip olmalıdır. Tek hücrelerin sferoidlere toplanması tipik olarak 48 saat içinde gerçekleşir ve 72 saatte sferoid oluşumunun olmaması bir uyarı işaretidir. Küresel oluşum eksikliğinin bir nedeni, çekirdekteki viskoz moleküllerin hidrojel kabuğundan yeterince hızlı sızmaması olabilir. Karboksimetil selüloz (MW 250 kD) gibi yüksek moleküler ağırlıklı polimerler kullanarak çekirdek çözeltinin viskozitesini ayarlarken bu senaryoyla karşılaştık. Bu hücre boyutundaki nesnelerin çekirdek etrafında hareket etmekte özgür olup olmadığını ve çekirdeğin bileşenlerinin ne kadar hızlı sızdığını test etmek için mikroboncukları kapsülleyebilir (bkz. Şekil 3B). %>8 w/v PEG-4-Mal konsantrasyonları kullanılırken de sferoid oluşum eksikliği ile karşılaşıldı. Bu senaryoda, hidrojel kabuğun gözenekliliği ve difüzyonu azalır ve çekirdekteki yüksek viskoziteli elemanlar, hücrelerin agregalar halinde oluşmasına izin verecek kadar hızlı sızmaz. PEG-4-Mal'ın kalitesinin partiden partiye veya üreticiye değişebileceği düşünülebilir. Bu nedenle, kabuktaki polimer konsantrasyonunun bir miktar ayarlanması gerekebilir. Bir kez daha, boncuk birleştirme yöntemi, çekirdekteki viskoz bileşenlerin su molekülleri tarafından ne kadar hızlı yer değiştirdiğini ortaya çıkarmalıdır. Deneyimlerimize göre, bu, mikrokapsüllerin sulu ortama aktarılmasından sonraki 3 saat içinde gerçekleşmelidir.
Burada açıklanan kapsülleme protokolü, birkaç hPSC hattı7, primer hepatositler10 ve çoklu kanser hücresi hatları (yayınlanmamış sonuçlar) için iyi çalışmıştır. Bununla birlikte, kök hücre kaynaklı (sc)-hepatositlerin ve sc-β hücrelerinin kapsüllenmesinden sonra sferoidlerin oluşturulmasında zorluklarla karşılaştık. Kapsüllenmiş mikroboncuklarla ilgili sorun giderme, viskoz bileşenlerin çekirdekten hızla salındığını ve hücrelerin hareket etmekte ve hücre-hücre temasları oluşturmakta özgür olduğunu ortaya koymuştur. Ek sorun giderme, di-tiol çapraz bağlayıcı DTT'nin (yağ fazında mevcut) konsantrasyonunun 66 mM'den 10 mM'ye düşürülmesini içeriyordu. Sc-hepatositler ve β hücreler için sferoid oluşumu, bu düşük DTT konsantrasyonunda meydana geldi. Bu nedenle, kullanıcı çapraz bağlayıcı konsantrasyonunu optimize etmeyi düşünmek isteyebilir, ancak yalnızca yukarıda listelenen diğer sorun giderme adımları başarılı olmadıysa. DTT konsantrasyonunun, 66 mM DTT'li mikrokapsüllerin mekanik bütünlüğünü korumak için kritik öneme sahip olduğunu ve mekanik olarak sağlam mikrokapsüllerle sonuçlandığını ve bugüne kadar kullanılan hücre tiplerinin büyük çoğunluğu için toksik olmadığını görüyoruz.
Literatürde 3D kök hücre yapıları oluşturmak için bir dizi strateji tanımlanmıştır. Çekirdek kabuklu mikrokapsüller içinde kök hücre yapıları oluşturmanın faydaları çoktur. Kapsüllendikten sonra, sferoidler kayma hasarına karşı koruma sağlayan hidrojel kapsüllerle kolaylıkla işlenebilir. Kapsüllenmiş sferoidler, kök hücrelere zarar vermeden kuvvetli ajitasyonla süspansiyonda kültürlenebilir.
Mikrokapsüllerin yeteneklerini genişletmek için birden fazla yol vardır. Ekibimiz daha önce hepatositlerin ve kök hücrelerin kapsüllenmesi için heparin içeren hidrojellerin kullanımını tanımlamıştı 8,12 ve şu anda kök hücrelere endüktif ipuçlarının (GF'ler) depolanması ve lokal olarak salınması için depolar olarak hizmet veren heparin içeren biyoaktif çekirdek-kabuk mikrokapsülleri geliştirmektedir. Bu tür mikrokapsüller, farklılaşma sonuçlarını iyileştirirken pahalı GF'lerin kullanımını azaltmaya yardımcı olabilir. Mikrokapsüller, ECM proteinlerini çekirdeğe dahil ederek daha da geliştirilebilir, böylece kök hücre mikro ortamını modüle eder. Çekirdek kabuklu mikrokapsüller, hPSC sferoidlerinin13,14 alınmasını kolaylaştırmak için parçalanabilir hale getirilebilir. Genel olarak, çekirdek kabuklu mikrokapsüller, belirli bir kök hücre farklılaşma protokolünün ihtiyaçlarını karşılamak için değiştirilebilen ve geliştirilebilen bir platform teknolojisini temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Mayo Clinic Rejeneratif Tıp Merkezi, J. W. Kieckhefer Vakfı, Al Nahyan Vakfı, Rejeneratif Tıp Minnesota (RMM 101617 TR 004) ve NIH (DK107255) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
