माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में कार्यात्मक न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के साथ मानव मोटर इकाइयों का उत्पादन

यह अपेक्षाकृत सरल विधि स्वास्थ्य और बीमारी में मोटर न्यूरॉन्स और न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों पर ध्यान केंद्रित करने वाले शोध में मदद कर सकती है। यह प्रोटोकॉल मानक स्टेम सेल प्रौद्योगिकी और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करता है जो पुनरुत्पादन को बढ़ाता है। मोटर न्यूरॉन्स और मांसपेशियों की कोशिकाओं का विच्छेदन कई न्यूरोमस्कुलर रोगों में एक प्रारंभिक घटना है।

एक सरल मानवीकृत मॉडल इस घटना का मुकाबला करने के लिए रणनीतियों को विकसित करने में मदद कर सकता है। हम मोटर न्यूरॉन विकार, एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस की जांच करने के लिए इस मॉडल का उपयोग करते हैं, हालांकि, इस मॉडल का उपयोग अन्य विकारों के लिए भी किया जा सकता है जिसमें मोटर इकाई आवश्यक है। शिपिंग कंटेनर से संदंश का उपयोग करके डिवाइस को पेट्री डिश में स्थानांतरित करके शुरू करें जिसमें 10 सेकंड के लिए नसबंदी के लिए 70% से 100% इथेनॉल के 10 मिलीलीटर होते हैं।

लगभग 30 मिनट के लिए लैमिनर फ्लो में हवा सूखने के लिए कागज के एक टुकड़े में संदंश के साथ डिवाइस को स्थानांतरित करें। एक बार जब कोई डिवाइस सूख जाता है, तो प्रत्येक डिवाइस को एक व्यक्ति 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश में ले जाने के लिए संदंश का उपयोग करें। पॉली-एल-ऑर्निथिन या पीएलओ के साथ डिवाइस को कोट करने के लिए, शीर्ष पर पीएलओ समाधान के 100 माइक्रोलीटर अच्छी तरह से जोड़ें और चैनल के माध्यम से अच्छी तरह से नीचे तक जाने वाले तरल पदार्थ का निरीक्षण करें।

फिर, नीचे अच्छी तरह से पीएलओ समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और माइक्रो खांचे के दूसरी तरफ दोहराएं। माइक्रो खांचे कोट करने के लिए डिवाइस के दो प्रतिबिंबित पक्षों के बीच एक वॉल्यूम ग्रेडिएंट बनाने के लिए एक तरफ पीएलओ समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़कर समाप्त करें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर तीन घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

तीन घंटे के बाद, डिवाइस को DPBS के साथ पांच मिनट के लिए तीन बार धोएं। पीएलओ कोटिंग के समान प्रक्रिया का पालन करके 20 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर लैमिनिन और न्यूरोबेसल माध्यम के साथ डिवाइस को कोट करें। डिवाइस को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर रात भर इनक्यूबेट करें।

अगले दिन एक 200 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करें और कुओं से लैमिनिन कोटिंग को हटाने के लिए चैनल खोलने के विपरीत अच्छी तरह से टिप को स्थिति दें। सभी कुओं में DPBS जोड़ने के बाद, सेल सीडिंग के लिए कमरे के तापमान पर लैमिनर फ्लो में DPBS के साथ उपकरणों को छोड़ दें। प्रत्येक पक्ष पर कुछ मिलीमीटर छोड़ते हुए एससीएम शीट को डिवाइस के आकार में काटें।

10 सेकंड के लिए 70% से 100% इथेनॉल के 10 मिलीलीटर वाले पेट्री डिश में उपकरणों और एससीएम शीट्स को स्टरलाइज़ करने के बाद, एक्सोम्प्स के साथ उपकरणों को छह-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें और एससीएम शीट्स को लैमिनर फ्लो में हवा सुखाने के लिए 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। सभी पक्षों को लगभग 30 मिनट के लिए सूखने की अनुमति देने के लिए डिवाइस को किनारे पर रखें। छह अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक डिवाइस के लिए प्रति अच्छी तरह से PLO समाधान के एक मिलीलीटर जोड़कर उपकरणों को कोट करें।

सुनिश्चित करें कि डिवाइस चैनल और माइक्रो नाली पक्ष तरल में नीचे का सामना करना पड़ के साथ PLO समाधान के शीर्ष पर चल रहा है। 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश में पीएलओ समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़कर एससीएम शीट को कोट करें, और तरल में एससीएम शीट को नीचे धकेलने के लिए संदंश का उपयोग करें। तीन घंटे के लिए उपकरणों और एससीएम शीट को इनक्यूबेट करें जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था।

तीन घंटे के बाद, उपकरणों और एससीएम शीट को डीपीबीएस के साथ पांच मिनट के लिए दो बार धोएं, इसके बाद बाँझ पानी के साथ पांच मिनट के लिए एक और धोएं। फिर प्रत्येक एससीएम शीट को एक व्यक्ति को 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश को एयर-ड्राई में स्थानांतरित करें। लैमिनर फ्लो में माइक्रोस्कोप के तहत काम करते समय, चैनल के साथ सिलिकॉन डिवाइस को माउंट करने के लिए संदंश का उपयोग करें और एससीएम शीट पर 90 डिग्री कोण पर माइक्रो नाली पक्ष नीचे की ओर यह सुनिश्चित करें कि सभी पक्ष संरेखित हैं।

न केवल बाहरी किनारों को सील करना सुनिश्चित करने के लिए डिवाइस पर हल्के से दबाएं, बल्कि कुओं, चैनलों और माइक्रो खांचे के आसपास भी। लैमिनिन के साथ डिवाइस को कोट करने के लिए, लैमिनर फ्लो के अंदर और माइक्रोस्कोप के नीचे, 200 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके शीर्ष अच्छी तरह से लैमिनिन के 20 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। अच्छी तरह से और चैनल के चारों ओर किसी भी रिसाव के बिना चैनल के माध्यम से नीचे तक अच्छी तरह से ऊपर से गुजरने वाले तरल पदार्थ का निरीक्षण करें।

इसके बाद, नीचे अच्छी तरह से लैमिनिन समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, माइक्रो खांचे के दूसरी तरफ दोहराएं और माइक्रो खांचे को कोट करने के लिए डिवाइस के दो प्रतिबिंबित पक्षों के बीच एक वॉल्यूम ग्रेडिएंट बनाने के लिए एक तरफ लैमिनिन के अतिरिक्त 100 माइक्रोलीटर के साथ समाप्त करें, फिर डिवाइस को रातभर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, चैनल खोलने के विपरीत अच्छी तरह से टिप की स्थिति द्वारा 200 माइक्रोलीटर पिपेट के साथ कुओं से कोटिंग को हटा दें, सभी कुओं में डीपीबीएस जोड़ने के बाद, सेल सीडिंग के लिए कमरे के तापमान पर लैमिनर फ्लो में डीपीबीएस के साथ उपकरणों को छोड़ दें। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में तंत्रिका पूर्वजों या एनपीसी को प्लेट करने के लिए, 200 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके डिवाइस में माइक्रो खांचे के एक तरफ दो कुओं से डीपीबीएस को हटा दें।

कुल 250, 000 एनपीसी और 60 से 100 माइक्रोलीटर प्रति डिवाइस 10 मोटर न्यूरॉन माध्यम के बीज के लिए, शीर्ष दाएं कुएं में, 45 डिग्री के कोण पर चैनल खोलने के करीब सेल निलंबन के बीज आधे हिस्से में। सेल निलंबन को चैनल के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए कुछ सेकंड के लिए रोकें, इससे पहले कि सेल निलंबन के शेष आधे हिस्से को निचले कुएं में जोड़ा जा सके। माइक्रोस्कोप के बिना डिवाइस के आसान अभिविन्यास के लिए, एनपीसी या समकक्ष के रूप में सीडेड साइड को चिह्नित करने के लिए एक पेन का उपयोग करें, और सेल अनुलग्नक के लिए पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

इसके बाद, धीरे-धीरे दो एनपीसी सीडेड कुओं को एक अतिरिक्त दिन 10 मोटर न्यूरॉन माध्यम के साथ 200 माइक्रोलीटर प्रति अच्छी तरह से कुल मात्रा में ऊपर उठाएं। एक 200 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करते हुए, ताजा बीजवाले एनपीसी के विपरीत सूक्ष्म खांचे के दूसरी ओर दो कुओं से DPBS को हटा दें। गैर-वरीयता प्राप्त कुओं के लिए प्रति अच्छी तरह से दिन 10 मोटर न्यूरॉन मीडिया के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।

फिर इनक्यूबेशन के दौरान माध्यम के वाष्पीकरण को रोकने के लिए डिवाइस के चारों ओर प्रति 10 सेंटीमीटर डिश प्रति डीपीबीएस के छह मिलीलीटर जोड़ें। माध्यम को बदलने के लिए, धीरे-धीरे चैनल खोलने के विपरीत अच्छी तरह से दीवार के निचले किनारे पर 200 माइक्रोलीटर पिपेट टिप को स्थित करके एनपीसी के साथ दोनों कुओं में मीडिया को हटा दें। चैनल पर कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने से एक मजबूत मध्यम प्रवाह को रोकने के लिए, धीरे-धीरे ऊपर और नीचे अच्छी तरह से अच्छी तरह से लगातार बदलते हुए प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा मोटर न्यूरॉन माध्यम के 50 से 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।

प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम के 200 माइक्रोलीटर न हों। मोटर न्यूरॉन भेदभाव के 17 वें दिन, 200 माइक्रोलीटर पिपेट के साथ डिवाइस में माइक्रो खांचे के गैर-वरीयता प्राप्त पक्ष पर मोटर न्यूरॉन माध्यम को हटा दें और डीपीबीएस के साथ कुओं को धोएं। बीज कुल 200, 000 मानव प्राथमिक mesoangioblasts या MABs, 60 से 100 माइक्रोलीटर प्रति डिवाइस वृद्धि माध्यम में शीर्ष अच्छी तरह से सेल निलंबन के आधे सीडिंग द्वारा।

सेल निलंबन को नीचे अच्छी तरह से सेल निलंबन के शेष आधे हिस्से को सीडिंग करने से पहले चैनल के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए कुछ सेकंड के लिए रोकें, जैसा कि एनपीसी चढ़ाना के लिए पहले प्रदर्शित किया गया था। सेल अनुलग्नक के लिए डिवाइस को पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर एक अतिरिक्त विकास माध्यम के साथ दो ताजा एमएबी सीडेड कुओं को ऊपर उठाएं और फिर से इनक्यूबेट करें जैसा कि प्रदर्शित किया गया है।

मोटर न्यूरॉन भेदभाव के 21 वें दिन कीमो रणनीति और वॉल्यूमेट्रिक ग्रेडिएंट शुरू करने के लिए, मायोट्यूब डिब्बे में विकास कारकों वाले मोटर न्यूरॉन न्यूरोबेसल माध्यम के प्रति 200 माइक्रोलीटर प्रति अच्छी तरह से जोड़ें, फिर मोटर न्यूरॉन डिब्बे में विकास कारकों के बिना मोटर न्यूरॉन बेसल माध्यम के प्रति 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में सह-खेती करने से पहले सेल लाइनों की विभेदन क्षमता का आकलन करना महत्वपूर्ण है। एमएबी का संलयन सूचकांक निर्धारित किया गया था, और लगभग 8% सह-संस्कृति के लिए पर्याप्त होने का अनुमान लगाया गया था।

उत्पन्न मोटर न्यूरॉन संस्कृतियां मोटर न्यूरॉन मार्करों के लिए 85 से 95% सकारात्मक थीं। न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों या एनएमजे की मात्रा की विशेषता और परिमाणित करने के लिए, मोटर न्यूरॉन और प्री-सिनैप्टिक मार्करों न्यूरोफिलामेंट भारी श्रृंखला और सिनैप्टोफिसिन और पोस्टसिनैप्टिक एसिटिलीन रिसेप्टर मार्कर अल्फा बुंगारोटॉक्सिन के बीच सह-स्थानीयकरणों की संख्या, प्रत्येक रोग स्टैक के माध्यम से गिना गया था और जेड-स्टैक में मौजूद मायोट्यूब लेबल किए गए मायोट्यूब ्स की संख्या में सामान्यीकृत किया गया था। NMJs एकल संपर्क बिंदु NMJs के रूप में दिखाई दिए जहां न्यूराइट ने एक इंटरैक्शन बिंदु पर एक सूक्ष्म कोलीन रिसेप्टर के एक क्लस्टर को छुआ।

या एकाधिक संपर्क बिंदु NMJs के रूप में जहां एक neurite बाहर fanned और एक बड़ी सतह पर एक सूक्ष्म choline रिसेप्टर क्लस्टर के साथ लगे हुए. मोटर न्यूरॉन नवाचार Myotubes के प्रतिशत के परिमाणीकरण ने संकेत दिया कि सभी मायोट्यूब में NMJs नहीं थे। पोटेशियम क्लोराइड के साथ मोटर न्यूरॉन सक्रियण पर, कैल्शियम प्रवाह को फ्लुओ -4 लेबल मायोट्यूब्स में देखा गया था, जिसने मायोट्यूब में मोटर न्यूरॉन न्यूराइट के माध्यम से एक कार्यात्मक कनेक्शन की पुष्टि की थी, एनएमजे ब्लॉकर डी-ट्यूबोक्यूरारिन, या मायोट्यूब डिब्बे में डीटीसी के अलावा कैल्शियम प्रवाह का निषेध हुआ।

इस मॉडल के साथ सबसे बड़ी सफलता प्राप्त करने के लिए सेल लाइन गुणवत्ता की जांच करना और डिवाइस के चैनलों में हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए अविश्वसनीय रूप से महत्वपूर्ण है। अन्य आईपीसी प्रत्यक्ष सेल प्रकारों के साथ एक डिश में न्यूरोमस्कुलर जंक्शन का संयोजन इन विट्रो स्थिति में भी बेहतर नकल करता है, यह इन सेल प्रकारों की भूमिका का अध्ययन करने की भी अनुमति देता है।