Summary
Este protocolo é dedicado à visualização plus-end do microtúbulo pela transfecção de proteínaS EB3 para estudar suas propriedades dinâmicas na cultura celular primária. O protocolo foi implementado em fibroblastos de pele primários humanos obtidos de pacientes com a doença de Huntington.
Abstract
Transfecção com uma proteína marcadora fluorescente de interesse em combinação com microscopia de vídeo de lapso de tempo é um método clássico de estudar as propriedades dinâmicas do citoesqueleto. Este protocolo oferece uma técnica para transfecção do fibroblasto primário humano, que pode ser difícil devido às especificidades das condições primárias de cultivo celular. Além disso, a manutenção da propriedade dinâmica do citoesqueleto requer um baixo nível de transfecção para obter uma boa relação sinal-ruído sem causar estabilização de microtúbulos. É importante tomar medidas para proteger as células contra o estresse induzido pela luz e o desbotamento do corante fluorescente. No decorrer do nosso trabalho, testamos diferentes métodos e protocolos de transfecção, bem como diferentes vetores para selecionar a melhor combinação de condições adequadas para estudos de fibroblasto primário humano. Analisamos os vídeos resultantes do lapso de tempo e a dinâmica calculada de microtúbulos usando ImageJ. A dinâmica dos plus-ends dos microtúbulos nas diferentes partes celulares não são semelhantes, por isso dividimos a análise em subgrupos - a região centro-grande, a lamella e a cauda dos fibroblastos. Notavelmente, este protocolo pode ser usado para análise in vitro da dinâmica do citoesqueleto em amostras de pacientes, permitindo o próximo passo para entender a dinâmica do desenvolvimento de várias doenças.
Introduction
A doença de Huntington (HD) é uma patologia neurodegenerativa incurável causada por uma proteína de codificação genética de codificação de genes (HTT). O HTT está associado principalmente a vesículas e microtúbulos e provavelmente está envolvido em processos de transporte dependentes de microtúbulos1,2. Para estudar a influência do HTT mutante na dinâmica dos microtúbulos, utilizamos a visualização in vitro da proteína EB3, que regula as propriedades dinâmicas dos microtúbulos, vinculando e estabilizando o crescimento de plus-ends. Para carregar eb3 fluorescentemente rotulado em fibroblastos de pele humana, foi aplicada transfecção plasmida. Utilizou-se a cultura do fibroblasto primário obtida a partir da biópsia da pele dos pacientes HD para este estudo.
A mutação no gene da proteína HTT leva ao alongamento do trato de poliglutamina3. O HTT tem um papel em processos celulares como a endocitose4,transporte celular1,2,degradação proteica5,etc. Parte substancial desses processos envolve vários elementos do citoesqueleto celular, incluindo os microtúbulos.
As células primárias humanas são o melhor modelo para reproduzir eventos que ocorrem em células do paciente o mais próximo possível. Para criar tais modelos, é preciso isolar as células do material de biópsia humana (por exemplo, a partir de amostras cirúrgicas). A linha celular primária resultante é adequada para estudar a patogênese usando vários métodos genéticos, bioquímicos, moleculares e de biologia celular. Além disso, as culturas celulares primárias humanas servem como precursora da criação de várias culturas transdiferenciadas e transgênicas6.
No entanto, em contraste com as culturas celulares imortalizadas, a desvantagem significativa das células primárias é sua capacidade limitada de passagem. Por isso, recomendamos o uso de células na fase de passagens iniciais (até 15). Culturas mais antigas degeneram muito rapidamente, perdendo suas propriedades únicas. Assim, as células primárias recém-obtidas devem ser mantidas congeladas para armazenamento a longo prazo.
As culturas celulares primárias são suscetíveis às condições de cultivo. Portanto, muitas vezes requerem abordagens únicas e otimização de condições de crescimento. Em particular, os fibroblastos primários da pele humana usados em nossos experimentos são exigentes no substrato. Assim, utilizamos vários revestimentos adicionais (por exemplo, gelatina ou fibronectina) dependendo do tipo de experimento.
O citoesqueleto celular determina a forma da célula, mobilidade e locomoção. A dinâmica do citoesqueleto é crucial para muitos processos intracelulares tanto na interfase quanto na mitose. Em particular, o citoesqueleto polimerizado a partir de tubulina, são estruturas altamente dinâmicas e polares, permitindo o transporte intracelular direcionado mediado por proteína motora. As extremidades dos microtúbulos estão em constante rearranjo, suas fases de montagem se alternam com as fases de desmontagem, e esse comportamento é chamado de "instabilidade dinâmica"7,8,9. Várias proteínas associadas mudam o equilíbrio da reação de polimerização, levando à formação do polímero ou à formação de monômeros proteicos. A adição de subunidades de tubulina ocorre principalmente na extremidade mais alta dos microtúbulos10. A família de proteínas end-binding (EB) é composta por três membros: EB1, EB2 e EB3. Eles servem como proteínas de rastreamento plus-end (+TIPs) e regulam as propriedades dinâmicas dos microtúbulos, vinculando e estabilizando seus plus-endscrescentes 11.
Muitos estudos usam microinjeção ou transfecção de tubulina com imagem de lapso de tempo e análise de vídeo para visualizar microtúbulos in vitro. Esses métodos podem ser invasivos e prejudiciais às células, especialmente as células humanas primárias. O passo mais desafiador é encontrar condições para transfecção celular. Tentamos alcançar o mais alto nível possível de transfecção sem afetar a viabilidade e a morfologia celular nativa. Este estudo aplica o método clássico para estudar as diferenças na dinâmica dos microtúbulos nos fibroblastos de pele de doadores saudáveis e pacientes com a doença de Huntington.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes do Centro Federal de Pesquisa e Clínica de Medicina Físico-Química da Agência Federal de Biologia Médica datada de 08 de setembro de 2015.
NOTA: A Figura 1 dá uma visão geral do protocolo.
1. Obtenção de uma cultura primária de fibroblastos de pele humana (Figura2)
- Entregue a biópsia em um laboratório dentro de algumas horas no meio DMEM (Modified Eagle Media, mídia de águia modificada) de Dulbecco, complementado com 50 μg/mL de penicilina e 50 U/mL de estreptomicina.
NOTA: Uma biópsia de pele deve ser realizada em condições estéreis por um médico após um paciente assinar um consentimento informado. - Coloque o tecido da biópsia em uma placa de Petri de 6 cm juntamente com uma pequena quantidade do meio.
- Usando um bisturi estéril, corte a amostra de biópsia em pedaços de cerca de 0,5-1 mm de tamanho. Coloque fragmentos obtidos 1-2 em uma placa de Petri de 3,5 cm e coloque um deslizamento estéril sobre as peças de biópsia. Adicione lentamente 1,5 mL de um meio de crescimento à seguinte composição: DMEM, penicilina-estreptomicina u/mL e 10% de soro bovino fetal (FBS).
- Os fibroblastos culturais no meio de crescimento dentro de uma incubadora de CO2 mantiveram-se em 5% de CO2, 37 °C, 80% de umidade.
NOTA: Após 4-7 dias, primeiro os queratinócitos, depois os fibroblastos, começam a migrar do tecido para o fundo do prato.
2. Armazenamento, congelamento e descongelamento da cultura primária
- Remova as células do prato de cultura (ver pontos 3.2-3.4).
- Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e centrífuga por 5 min a 200 x g. Em seguida, descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular em 900 μL de FBS resfriado.
- Transfira para um tubo de criopreservação gota a gota e adicione 100 μL de sulfóxido de dimetila (DMSO).
- Coloque a crioprobe em um congelador de baixa temperatura a -80 °C. Vinte e quatro horas depois, transfira o criovial para o nitrogênio líquido (−196 °C) para armazenamento a longo prazo.
- Para descongelar as células criopreservadas, remova o criovial do armazenamento de nitrogênio e, dentro de 1 min, transfira 1 mL do conteúdo para um tubo cônico de 15 mL contendo 9 mL do meio de transporte pré-aquecido a 37 °C.
- Resuspengue cuidadosamente e, em seguida, centrifugar o tubo por 5 min a 200 x g. Descarte o supernasce, resuspenque a pelota celular no volume necessário do meio de crescimento e coloque-os em uma placa de Petri do diâmetro necessário.
3. Cultivo de células
- Cubra o fundo do prato com solução de gelatina autoclaved de 0,1% preparada em água destilada. Incubar por 15 min.
NOTA: Para visualização de transfecção, devem ser utilizados pratos de placas de fundo de vidro (pratos confocal com espessura de vidro de 170 μm). - Prepare um meio de cultura com a seguinte composição: DMEM complementado com 10% de FBS, 2 mM L-alanyl-L-glutamina, 50 U/mL penicilina-estreptomicina. Misture bem e armazene a 4 °C. Aqueça o médio a 37 °C antes de adicionar às células.
- Avalie a cultura sob o microscópio. Remova o meio e lave os fibroblastos com a solução de sal fosfato de Dulbecco (DPBS).
- Adicione 1 mL de solução pré-aquecida de 0,25% de trippsina às células. Verifique as células sob o microscópio se elas se desprendem completamente do substrato. Desativar trippsina com 1 mL do meio de cultura.
- Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar o tubo a 200 x g por 5 min, remover o supernascedor e resuspensar a pelota celular em 1 mL do meio de cultura.
- Conte o número de células. Calcule o número necessário de células para semeá-las com uma densidade de 8-15 x 103/cm2 e resuspense em 2 mL do meio de cultura.
- Remova a solução de gelatina do prato de cultura e adicione imediatamente 2 mL da suspensão celular. Cultivar fibroblastos a 37 °C em uma incubadora de CO2.
- Refrescar o meio a cada 2-4 dias.
NOTA: Para experimentos, use as células de passagens de 4-11.
4. Transfecção
- Substitua o meio de cultura por um meio de cultura fresco 24 horas antes da transfecção.
NOTA: A confluência celular deve ser de 70 a 80%. - Prepare um complexo de DNA-lipíde, baseado na área e densidade da semeadura celular. Use agente de transfecção à base de liposome.
NOTA: Use a densidade de semeadura celular como 1 x 104 células/cm2. - Adicione 3 μL de reagente de transfecção comercial a 125 μL de meio essencial mínimo ideal (Opti-MEM) não contendo antibióticos, sem tocar nas paredes do tubo. Levemente resuspend.
- Diluir o DNA plasmídeo (GFP-EB3) adicionando 1 μg do DNA plasmídeo a 125 μL de Opti-MEM. Levemente resuspend.
NOTA: A codificação vetorial de expressão GFP-EB311 foi recebida como um presente gentil do Dr. I. Kaverina (Universidade Vanderbilt, Nashville) com permissão do Dr. A. Akhmanova (Erasmus University, Roterdã)11. - Adicione DNA plasmídeo diluído a cada tubo de reagente de transfecção diluído (1:1). Incubar por 30 min.
- Adicione o complexo DNA-lipídico à placa de Petri de 6 cm contendo células e misture com um balanço cruciforme para 30 s. Incubar células com um agente de transfecção por 24 h e, em seguida, mudar para meio fresco. Analise a eficiência da transfecção após 24h e 48h.
NOTA: 24h após a transfecção, a eficiência foi de 10-15%, e depois de 48h até 40%.
5. Preparação para a imagem
- Antes da imagem viva das células, mude o meio de cultura para um meio sem corante indicador de pH para reduzir a autofluorescência.
- Aplique cuidadosamente o óleo mineral na superfície média para cobrir completamente o meio, isolando-o do ambiente externo para reduzir a penetração de O2 e a evaporação média.
- Use uma lâmpada de mercúrio e uma lente objetiva de imersão de óleo 60x ou 100x com uma alta abertura numélica para tirar as imagens.
NOTA: Para observações in vivo, o microscópio deve ser equipado com uma incubadora para manter as condições necessárias para as células, incluindo o aquecimento da mesa do objeto e a lente para +37 °C, uma câmara fechada com fornecimento de CO2 e suporte ao nível de umidade. Use água dupla destilada para criar umidade. Verifique o nível de água dupla destilada antes de filmar. - Coloque a antena confocal com as células no suporte do microscópio antes da imagem. Certifique-se de que o prato e a câmera estão bem ligados ao suporte para evitar a deriva enquanto tira imagens.
6. Definindo os parâmetros de imagem
- Escolha os baixos valores de exposição, uma vez que a luz induz espécies reativas de oxigênio reativa (ROS) prejudiciais às células.
NOTA: Para estudar a dinâmica dos microtúbulos nos fibroblastos da pele humana, foi selecionada uma exposição de 300 ms. - Concentre-se no objeto de interesse.
NOTA: Para imagens de lapso de tempo de longo prazo, use o sistema automático de estabilização do foco para compensar uma possível mudança ao longo do eixo z. - Escolha as condições de imagem ideais dependendo da fotosensibilidade das células e da taxa de desbotamento fluorocromático.
NOTA: Uma vez que os microtúbulos são estruturas altamente dinâmicas, um intervalo de tempo razoavelmente curto pode ser selecionado, e a taxa de quadros deve ser suficientemente alta. Para investigar a dinâmica dos microtúbulos nos fibroblastos de pele, utilizamos em uma frequência de 1 quadro/s por 3-5 min. - Ao selecionar o próximo objeto para obter a imagem, afaste-se da área já visualizada. Uma vez que esta área estava sob a influência da luz, haverá um notável branqueamento fotográfico.
NOTA: Como uma frequência de imagem relativamente alta foi usada, o obturador não se fechou entre as imagens, e a lâmpada foi acesa durante todo o período de imagem, razão pela qual o desbotamento aumentou. - Escolha o vídeo ideal para estudar a dinâmica dos microtúbulos visualmente, levando em conta a qualidade da transfecção, a qualidade das imagens dos microtúbulos (ótima relação sinal-ruído) e a ausência de deriva no caso da célula analisada(Figura 3).
- Use os vídeos selecionados para estudar a dinâmica de plus-ends dos microtúbulos, traçando-os no programa ImageJ ou Fiji(Figura 4).
NOTA: Para instruções de análise quantitativa consulte Figura Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 1.
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Representative Results
Os filmes GFP-EB3 resultantes produzidos usando o protocolo (Figura 1) ilustram as propriedades dinâmicas dos microtúbulos. Os microtúbulos estão envolvidos em diferentes processos celulares, e suas propriedades dinâmicas impactam várias características de vida da cultura celular humana primária a partir do material de biópsia dos pacientes(Figura 2).
Os seguintes parâmetros determinam a instabilidade dinâmica dos microtúbulos: as taxas de crescimento (polimerização) e encolhimento (despomerização); a frequência de catástrofes (transição da polimerização para a despomerização); a frequência de resgates (transição da despomerização para a polimerização); assim como pausas - afirma quando o microtúbulo não polimeriza e não despomeriza 12. Todos os parâmetros são fortemente regulados, e as taxas de polimerização e despolimerização de microtúbulos individuais podem variar significativamente tanto nos mesmos e diferentes tiposcelulares 13,14,15,16,17.
É necessário considerar para a análise que os microtúbulos podem ter dinâmicas diferentes dependendo de sua posição na célula. Microtúbulos localizados na região do núcleo e centroso comportam-se de forma diferente em comparação com os da periferiacelular 19. Portanto, para obter um resultado confiável, fizemos as medições dinâmicas dos microtúbulos em três regiões separadas da célula: a parte central, a borda principal e a parte traseira(Figura 3). Para controlar a correta distribuição do rótulo GFP-EB3 em várias partes celulares, utilizamos células endoteliais pulmonares humanas (HPAEC)(ver Figura Suplementar 1).
Programas especializados, como ImageJ ou Fiji (ImageJ 2 v1. 53i), permitem a análise dos vídeos pelos seguintes parâmetros: (1) a taxa de crescimento dos microtúbulos; (2) a frequência das catástrofes; (3) a frequência dos resgates; (4) a frequência das pausas; e (5) duração de pausas. Além disso, opções e plugins exclusivos do programa permitem o rastreamento automaticamente18 ou manualmente19 (Figura 4). O método de rastreamento manual funcionou melhor em nossos experimentos, uma vez que as medições automáticas são propensas a erros maiores e requerem mais repetições para um resultado mais preciso. Instruções detalhadas sobre análise de dados da dinâmica dos microtúbulos podem ser encontradas na Figura Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 1.
Os parâmetros de imagem podem exigir ajustes durante o processo de imagem. Por exemplo, a duração de uma imagem celular e os valores de exposição podem ser alterados. Tais configurações são úteis se houver um rápido burnout de sinal, ou a célula encolhe(Figura 5).
Figura 1: O esquema geral do protocolo de transfecção GFP-EB3 para a cultura dos fibroblastos primários da pele humana. O protocolo inclui as seguintes etapas: desprendimento das células pela solução trypsin; inativação de trippsina pela adição média; centrifugação do composto resultante; cálculo da concentração celular; semeadura celular para o prato de fundo de vidro (prato confocal) revestido com gelatina; transfecção da cultura celular por DNA plasmídeo (com GFP-EB3) com o reagente de transfecção liposômica; incubação 24-48 h; e análise sob um microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fibroblastos de pele humana esquema de preparação da cultura primária. Uma biópsia de pele deve ser realizada em condições estéreis por um médico após um paciente assinar um consentimento informado. Em seguida, um pedaço de tecido é transportado em uma pequena quantidade do meio sem FBS para o laboratório em uma placa de Petri. Um grande fragmento de tecido é cortado em pedaços de 0,5-1 mm de tamanho, e eles são cobertos com um vidro de cobertura com a adição do meio com FBS. Em seguida, a placa de Petri é colocada em uma incubadora de CO2, onde após 4-7 dias os fibroblastos migram do fragmento de tecido para o fundo do vidro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Marcador GFP-EB3 (verde) em diferentes áreas de fibroblastos humanos transfectados, obtidos a partir da biópsia da pele dos pacientes HD: borda superior (painel superior); cauda (painel do meio); parte central do fibroblasto (zona ao redor do centro) (painel inferior). Barra de escala = 10 μm. A frequência de imagem é de 1 quadro/s. Microscopia fluorescente de campo largo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Rastreamento manual GFP-EB3 pelo plugin ImageJ MTrackJ. Faixas que refletem o crescimento de microtúbulos foram obtidas como resultado da marcação manual quadro por quadro das pontas das etiquetas GFP-EB3 nos plus-ends durante 20 s de imagem. Fibroblastos cultivados transfectados, obtidos a partir da biópsia da pele dos pacientes hd. A frequência de imagem é de 1 quadro/s. Microscopia fluorescente de campo largo. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Solução de problemas durante a imagem dos microtúbulos rotulados GFP-EB3. (A)Microtúbulos rotulados por fluorescentes estão fora de foco devido à ausência de um sistema de focalização. (B) Os microtúbulos são estabilizados e perdem suas propriedades dinâmicas devido à superexpressão do GFP-EB3 na célula devido à longa incubação com a mistura transfeccionante. (C) Encolhimento da lamella celular como resultado da fototoxicidade devido à liberação de ROS. (D) A intensidade do sinal cai durante a imagem - fotobleaching rápido. Fibroblastos cultivados transfectados, obtidos a partir da biópsia da pele dos pacientes hd. A frequência de imagem é de 1 quadro por segundo. Microscopia fluorescente de campo largo. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Visualização seletiva de microtúbulos crescentes plus-ends. Marcador GFP-EB3 (verde) em diferentes áreas de células endoteliais humanas transfectadas (cultura do HPAEC: Células Endotelias da Artéria Pulmonar Humana) na borda principal, cauda e área central (zona ao redor do centro. Barras de escala 10 μm. A frequência de imagem é microscopia fluorescente de campo largo de 1 quadro/s. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 2: Análise da dinâmica do microtúbulo pelo rótulo GFP-EB3 após rastreamento manual usando o plugin ImageJ MTrackJ. (A,B) As faixas EB3 obtidas pelo deslocamento de patches EB3-GFP na série time-lapse de fibroblastos cultivados por vias transfectadas, obtidas a partir da biópsia da pele dos pacientes HD (são coloridas individualmente). (A) Faixa EB3 (roxo, No46) obtida por deslocamento de patches EB3-GFP durante 18 segundos. (B) Faixa EB3 (vermelho, No37) obtida pelo deslocamento de patches EB3-GFP durante 9 segundos. (C) Quantificação do deslocamento plus-ends de microtúbulos do fibroblasto de pele de pacientes humanos em HD mostrado em (A). (D) Quantificação do deslocamento de extremidades mais de microtúbulos mostrados em (B). O gráfico mostra que entre 6-8 segundos há uma pausa no crescimento do microtúbulo (não há movimento do plus-end). Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo suplementar 1: Análise quantitativa da dinâmica dos fins de microtúbulos rotulados por EB3-GFP. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Melhores resultados de qualidade para a análise dinâmica dos microtúbulos podem ser obtidos a partir de imagens microscópicas de alta qualidade. É importante observar todas as condições necessárias para a imagem de lapso de tempo das células vivas e ajustar corretamente os parâmetros de imagem. Usar pratos especiais de cultura celular com fundo de vidro (pratos confocal) é importante, já que o vidro tem um índice de luz refrativo diferente do plástico. A espessura do vidro e sua uniformidade sobre toda a sua área também é extremamente importante, uma vez que esses parâmetros são cruciais para o foco normal da amostra. A violação desses parâmetros inevitavelmente leva a uma falha do sistema de foco perfeito, resultando em um mau foco, tornando impossível o uso desse vídeo fora de foco para análise(Figura 5A). Outra condição importante para a imagem de células vivas é a proteção do ROS. Vários reagentes podem ser usados para tais fins20. Em nosso trabalho, usamos óleo mineral, que isola completamente o meio cultural da atmosfera e impede a troca de gás. Da mesma forma, a oximoras redutora de ROS pode ser usada, mas esta enzima não é adequada para todos os tipos de células e é mais frequentemente aplicável à imagem com tempo aumentado.
Ao escolher o tempo ideal de incubação das células após a transfecção (24 ou 48 h), deve-se dar atenção ao número de células transfeccionadas. Um número menor do que o número máximo de células expressando a proteína rotulada já é suficiente para a análise. A superexpressão não deve ser permitida porque os microtúbulos, nesses casos, estão estabilizados e suas propriedades dinâmicas não podem ser analisadas(Figura 5B).
Em alguns casos, pode ser necessário ajustar os parâmetros de imagem de acordo com a reação das células após o início da gravação de vídeo. Por exemplo, é possível observar o encolhimento da lamella celular devido à alta sensibilidade à luz (fototoxicidade) (Figura 5C). Quando excitadas, as moléculas fluorescentes normalmente reagem com oxigênio molecular para formar radicais livres que podem danificar os componentes celulares21. Ao projetar experimentos, os fluoroforos com o comprimento de onda máximo possível devem ser selecionados para minimizar os danos celulares sob a iluminação de ondas curtas. Além disso, há relatos de que certos componentes da mídia de cultura padrão, incluindo a vitamina riboflavina e o aminoácido triptofano, também podem contribuir para os efeitos adversos da luz sobre células cultivadas22. Entre outras coisas, isso pode ser causado por uma quantidade excessiva de rótulos fluorescentes em uma célula. Nesses casos, torna-se necessário reduzir a duração do registro e a intensidade da iluminação. Outro problema possível também pode ser a fotobleaching rápida - diminuição da intensidade do sinal durante a gravação(Figura 5D). Esse efeito deve ser levado em conta ao selecionar o próximo objeto na mesma antena experimental, uma vez que as células vizinhas ao redor da área imagem também são queimadas.
Deve-se mencionar que existem outros métodos para visualização de microtúbulos em células vivas, como microinjeção de tubulina com rótulo fluorescente na transdução celular ou celular usando vírus. Como em qualquer outro método, há vantagens e desvantagens para o método de transfecção. No entanto, do nosso ponto de vista, em comparação com o método de injeção, a transfecção é mais eficaz e permite alcançar a inclusão em massa de vetores de expressão nas células, resultando em um grande número de células fluorescentes para análise. Além disso, o método de transfecção não requer equipamentos e habilidades especiais do pesquisador. O método de transdução viral apresenta bons resultados e pode ser aplicado. Ainda assim, não é adequado para todas as culturas celulares (em particular, é menos adequado para fibroblastos humanos, obtidos a partir da biópsia da pele dos pacientes hd).
O passo mais crítico neste protocolo é a transfecção realizada para garantir expressão proteica suficiente. Uma boa relação sinal-ruído, sem fotobleaching de microtúbulos, e a ausência de drifting celular durante a gravação de vídeo time-lapse são absolutamente críticos para imagens eficazes de microtúbulos. Em nossoexperimento, a visualização de microtúbulos e a análise dinâmica fornecem informações vitais sobre propriedades microtúbulas e comportamento nas células com HTT mutante. Nosso protocolo é aplicável para estudos de outras doenças para as quais a patologia implica propriedades dinâmicas de microtúbulos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa, concedendo o nº 075-15-2019-1669 (transfecção de fibroblastos), pela Fundação Russa de Ciência, conceder nº 19-15-00425 (todos os outros trabalhos sobre o cultivo de fibroblastos in vitro). Foi parcialmente apoiado pelo programa de desenvolvimento da Universidade Estadual de Moscou, PNR5.13 (imagem e análise). Os autores reconhecem o apoio do Centro de Excelência Nikon do Instituto A. N. Belozersky de Biologia Físico-Química. Queremos oferecer nossos agradecimentos especiais a Ekaterina Taran por sua ajuda com a dublagem. Os autores também agradecem a Pavel Belikov por sua ajuda na edição de vídeo. Figuras do manuscrito foram criadas com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
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