Summary
Bu protokol, deniz suyu örneklerinde zararlı alg çiçeklerini ve ilişkili mikrobiyomlarını izlemek için 16S rRNA ve 18S rRNA genlerini hedefleyen metabarkodlama analizi adımlarını tanıtır. Güçlü bir moleküler tabanlı araçtır, ancak burada adım adım görsel olarak açıklanan çeşitli prosedürler gerektirir.
Abstract
Zararlı alg çiçekleri (QB' ler) izleme dünya çapında uygulanmıştır ve balıkçılık ve su ürünleri yetiştiriciliği ile ünlü bir ülke olan Şili, bu amaçla on yıllardır mikroskobik ve toksin analizlerini yoğun bir şekilde kullanmıştır. Şili HAB izlemesinde yüksek verimli DNA dizilimi ve bakteriyel montaj tabanlı yaklaşımlar gibi moleküler biyolojik yöntemler yeni uygulanmaya başlandı ve prosedürler henüz standart hale getirilmedi. Burada, Şili OSB'lerini izlemek için 16S rRNA ve 18S rRNA metabarkodlama analizleri adım adım tanıtıldı. Yakın tarihli bir hipoteze göre, alg-bakteriyel karşılıklı ilişki, çiçek açma, bakım ve gerileme için kritik bir sinerjik veya antagonistik ilişkiyi oynamaktadır. Bu nedenle, HAB'ın alg-bakteriyel perspektiflerden izlenmesi, HAB mekanizmalarının daha geniş bir şekilde anlaşılmasını ve erken uyarının temelini sağlayabilir. Metabarkodlama analizi, bir numunedeki büyük alg-bakteriyel taksonomik bilgileri tespit edebildiği için bu amaç için en uygun moleküler tabanlı araçlardan biridir. Burada metabarcoding analizine örneklemenin görsel prosedürleri, hataları ve güvenilir verilerin toplanmasını azaltmayı amaçlayan özel talimatlar sağlar.
Introduction
Birçok deniz fitoplankton türünün endojen toksinler ürettiği bilinmektedir ve bu türler yeterli sayıda biriktiğinde deniz ortamına zararlıdır. Bu Tür Zararlı Alg Çiçekleri (QB'ler) bugün dünyanın çoğu kıtasının kıyılarında gözlenmektedir1. Toksik fitoplanktonlar ilk olarak bivalve dokularda birikir ve sindirim üzerine insanlar da dahil olmak üzere daha yüksek trofik organizma seviyelerinde hastalığa ve ölüme yol haline gelir. Daha sonra, bu olaylar yerel ekonomiye, sosyoekonomiye ve halk sağlığına ciddi etkiler getirir2. QB'lerin küresel ekonomiye verdiği zararın her yıl milyonlarca ila milyarlarca dolar olduğu tahmin edilmektedir3. Şili, sık sık HAC'lerden muzdarip birçok ülkeden biridir.
Şili, 4.300 km kuzey ve güneye uzanan uzun bir arazi ülkesidir. Uzun batı toprakları Pasifik Okyanusu'na bakmaktadır ve bu da doğal olarak Şili'nin HAY'leri deneyimleme şansını arttırır. Özellikle güney Şili'de, dünyaca ünlü birçok somon su ürünleri vardır ve bölgede her HAB meydana geldiğinde, alg toksinleri büyük çiftlik somonlarının hasta olmasına ve ölmesine neden olur4,5,6. Şili'de, HAB'ın ekonomiyi en sert vurduğu yıl 2016'ydı ve tahmini yıllık kaybı 800 milyonABDdoları7 ,8. Nedensel toksik alg türleri yıla ve konuma göre değişir. 2016 vakası için, Alexandrium catanella ve Pseudochattonella verruclosa kompleksi, güney Şili kıyılarının çoğunda yaygın bir HAB'a neden oldu7,8. Şili'deki en son HAB, Mart 2021'de Şili'nin güneyinde bulunan ve bölgenin büyük bir somon çiftliğine sahip olduğu Camanchaca'da Heterosigma Akashiwo'nun etken alg türüyle meydana geldi.
Şili uzun yıllardır iki ana yöntem kullanarak kıyı izleme çalışmaları yürütmektedir; zehirli alg türlerini düzenli olarak tanımlamak için deniz suyunu mikroskoplarla gözlemlemek ve biyokimyasal tahlillerle kabuklu deniz ürünlerindeki toksin seviyelerini ölçmek9. Kabuklu deniz ürünlerinde toksik alglerin ve toksin seviyelerinin erken tespiti QB'leri engellemez; ancak, bu analizler acil karşı önlemleri tetikleyebilir ve yerel topluluklara zarar verebilir. Bu stratejinin etkinliğini daha da güçlendirmek için, deniz suyu örneklerindeki algleri ve ilgili bakteri topluluklarını tespit etmek için geleneksel Şili HAB izleme programımıza yakın zamanda moleküler tabanlı bir analitik yöntem eklendi. Özellikle, 16S rRNA ve 18S rRNA genlerini hedefleyen metabarkodlama kullanan bir Massive Parallel Sequencing yöntemi seçildi. Bu teknik karmaşık prosedürler ve pahalı makine ve reaktifler gerektirmesine rağmen, bir deniz suyu örneğinde bulunan binlerce alg ve bakteri cinsini / türünü aynı anda tespit edebilen ileri bir teknolojidir.
HAB'ın nedenlerinin sıcaklık ve mevsim gibi çeşitli olduğu tahmin edilmektedir, ancak bunları genellemek imkansızdır. Bunun nedeni, HAB türlerinin ve frekanslarının bölgeye ve mekansal koşullara bağlı olmasıdır, coğrafi benzersizlik, kabarık besin karıştırma ve errosion 2 , 10 , 11,12nedeniyle karadan element akıntısı gibi doğa olaylarınıiçerir. Ek olarak, ötrofikasyon gibi yapay faktörler yerel12,13. Karmaşık multifaktör nedeniyle, doğru bir HAB tahmini yapmak kolay değildir. Son yıllarda, spesifik bakteri popülasyonlarının faktörlerden biri olarak QB'lerin gelişimiyle ilişkili olabileceği görüşü vardır ve bu hipotezi destekleyen araştırmalar giderek daha belirgin hale gelmiştir14,15,16,17,18. Moleküler biyoloji teknikleri genellikle bakteriyel montajı incelemek için kullanılır; ancak, şili HAB izleme9'da böyle standartlaştırılmış bir yöntem henüz oluşturulmamıştır. Alg-bakteriyel ilişkiyi HAB'lerle incelemek için, mevcut Şili kıyı izleme programları için aynı anda metabarkodlama analizi yapmak zorunludur. Bu nedenle, bu protokol, deniz suyu örneklerinde alg ve bakteri türlerinin metabarkodlama analizi kullanılarak analiz edilmesi için adım adım bir prosedüre odaklanan Şili HAB izleme programımızı görsel olarak tanıtmaktadır.
Şili HAB izleme programımızı açıklayan tam protokol Yarimizu veark. Deniz suyu örneklemesi, mikroskobik alg türleri tespiti, alg-bakteriyel gen tespiti, pigment analizi, meteorolojik veri toplama ve fiziksel ve kimyasal su özelliği tahlilleri işlemlerini içerir. Alg ve bakteriyel türlerin tespiti için 16S rRNA ve 18S rRNA metabarkodlama analizinin adım adım protokolü ön baskı olarak mevcuttur19. Bu protokol, HAB izleme programımızın en karmaşık kısmı ve en önemli parçası olduğu için özellikle metabarcoding analiz adımlarını göstermektedir. Bu protokol aynı zamanda programın tanıtılmasını ve alg türlerinin mikroskopi tespitini içerir. Alg türlerini metabarkodlama ile analiz ederken, iki yöntemden elde edilen sonuçları doğrulamak için aynı anda mikroskopi yapmak çok önemlidir. Bu protokol, taksonomi ataması için yazılımın nasıl kullanılacağını içermez, ancak veritabanı önerisi aşağıdaki bölümün sonunda kısaca belirtilir.
Protocol
1. Numune toplama ve ön işlem
- Hedef noktadan yaklaşık 3 L su örneği toplayın.
- Serbest yaşayan ve bağlı bakterileri ayırmak için tandem filtrasyon (1 μm ve 0,2 μm gözenek boyutunda membran) aracılığıyla 16S rRNA analizi için 1 L su örneğini filtreleyin.
- 18S-rRNA analizi (fitoplankton algılama) için 1 L'lik bir su örneğini daha 0,2 μm membranlı tek bir filtrasyonla filtreleyin.
NOT: Su numunesinin filtrasyonu örneklemeden 12 saat içinde tamamlanmalıdır. - Filtrelenmiş membranı steril cerrahi makasla ikiye bölün ve alüminyum folyo ile sarın. -20 °C'de 1 aya kadar saklayın veya bir sonraki adıma geçin.
- Açıklandığı gibi Chelex yöntemi ile DNA ayıklayın9. -20 °C'de 1 aya kadar saklayın.
2. Mikroskop analizi
- Su örneğinin 1 mL'lik kısmını pipetle 1 mL'lik bir ızgara kaydırağı üzerine aktarın.
- Örneği mikroskop altında gözlemleyin.
- Fitoplankton türlerinin adlarını ve miktarını kaydedin.
3. 16S rRNA ve 18S rRNA metabarkodlama analizi
NOT: Bu işlem yedi bölümden oluşur: hazırlık, ilk PCR amplicon üretimi, birinci amplicon temizliği, ikinci PCR ile indeksleme, ikinci PCR amplicon doğrulama ve temizleme, DNA konsantrasyon ayarlama ve DNA denatürasyonu ve dizilimi. Tüm süreç deneyimli bir laboratuvar personeli tarafından en az 5 gün (40 saat) sürer. Ürün numaraları ve imalatları için Malzeme Tablosu'na bakın.
- Hazırlık
- Pipetleri ve laminar davlumbaz dolabı % 70 etanol ile temizleyin ve ardından 30 dakika boyunca UV maruziyeti sık sık. Kullanılacak malzemeleri sterilize edin.
- DNA örneklerini oda sıcaklığında çözün, 2 dakika boyunca 100 x g'da santrifüj ve her numunenin 100 μL'si 8 tüplü şeritlere aktarın.
- İlk PCR amplicon üretimi
NOT: Laminar davlumbaz kabininde aşağıdaki işlemleri gerçekleştirin. Astar kirlenmesini önlemek için astarları her zaman 1 μM stoktan hedef konsantrasyona PCR sınıfı su ile seyreltin.- Reaksiyonlar için steril 1,5 mL tüpte ilk PCR ana karışımını hazırlayın (Tablo 1, Tablo 2).
- Aliquot 22.5 μL ana karışımı 8 tüplü bir şeritte ve 2.5 μL DNA örneği ekleyin. Negatif kontrol için 2,5 μL PCR sınıfı su kullanın.
- İlk PCR döngüsünü çalıştırın (Tablo 3).
- 10 μL 1x nükleik asit jel lekesi içeren 100 mL%2 Agarose-TBE jel hazırlayın.
- Agarose jel üzerine 1,5 μL 1x DNA yükleme boyası ve 4 μL PCR ürününün bir karışımını yükleyin. Ayrıca, jel üzerine 100 bp DNA merdiveni yükleyin.
- 30 dakika boyunca 100 V'ta elektroforezi gerçekleştirin.
- UV ışık görüntü yakalama altında 500-600 bp aralığında bir bant olduğundan emin olun. Astar-dimer bant yuvarlak 80 bp.
NOT: Deniz suyu numuneleri PCR inhibitörleri içerir. Eksik ampliconlar bazen 1:100 veya 1:1000 numunelerinin PCR sınıfı su ile seyreltilmesiyle çözülebilir. - İlk PCR ürünlerini bir sonraki adıma kadar -20 °C'de saklayın.
DİkKAT: Bir haftalık depolama alanını aşmayın.
- İlk PCR amplicon temizliği
NOT: Bu bölüm laminar davlumbaz kabininin dışında gerçekleştirilebilir.- Astar-dimer ürünleri de dahil olmak üzere PCR reaksiyon kalıntılarını gidermek için manyetik boncuk DNA temizleme sistemini kullanın.
- Temizlenen her bir ilk PCR ürününün 20 μL'lik kısmını yeni bir 96 kuyu plakasına aktarın. Plakayı bir mikro mühür filmi ile kapatın. Bir sonraki adım ilerleyene kadar -20 °C'de saklayın.
DİkKAT: Bir haftadan fazla depolama alanını aşmayın.
- İkinci PCR ile dizin oluşturma
NOT: Bu bölümde, saflaştırılmış ilk PCR ürünleri çeşitli indeks astar kombinasyonları ile güçlendirilecektir.- Laminar davlumbaz kabinine yerleştirilen 8 tüp PCR şeridinde tüm İndeks 1 ve İndeks 2 astarlarını (Tablo 4)1 μM'ye kadar PCR sınıfı su ile seyreltin.
NOT: Dizin astarları ilk PCR reaksiyon çıkıntı adaptörüne özgü olduğundan, bu bölümdeki adımlar laminar davlumbaz kabininin dışında gerçekleştirilebilir. - Yatay bir satırda Konum Dizini 1 astarı Dizin 2 astar dikey bir satırda (Tablo 5).
- Yeni bir 96 kuyu plakasında, her kuyuya 12,5 μL sıcak başlatmaya hazır formülasyon ekleyin.
- Çok kanallı pipet kullanarak tablo 4'te her bir indeks astarının (1 μM) 2,5 μL'sini ekleyin.
- 7,5 μL saflaştırılmış ilk PCR ürünü ekleyin.
- 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hafifçe karıştırın. Plakayı bir mikro mühür filmi ile örtün.
- İkinci PCR döngüsünü çalıştırın (Tablo 3).
- Plakayı -20 °C'de tutun.
DİkKAT: Bir haftalık depolama alanını aşmayın.
- Laminar davlumbaz kabinine yerleştirilen 8 tüp PCR şeridinde tüm İndeks 1 ve İndeks 2 astarlarını (Tablo 4)1 μM'ye kadar PCR sınıfı su ile seyreltin.
- İkinci PCR amplicon doğrulama ve temizleme
- Parça çözümleyicisi ve ilişkili reaktif kullanın. Vortex ve kullanmadan önce reaktif aşağı döndürün.
- Örnek tamponun ve DNA ekran bandının oda sıcaklığında 30 dakika boyunca aşındırmasına izin verin. Ardından, DNA ekran bandını bir parça analizörüne yerleştirin.
- Yeni 8 tüp şeritte 2 μL numune tamponu ve 3 μL ikinci PCR amplicon karıştırın. 8 tüp şeridini parça analizörüne yerleştirin. Başlatmak için Çalıştır'a basın.
DİkKAT: Hava kabarcıklarının oluşumundan kaçınılmalıdır. - İkinci PCR ampliconlarının hem 16S hem de 18S rRNA genleri için yaklaşık 613 bp (600 - 630 bp) olduğundan emin olun.
- Manyetik boncuk DNA temizleme sistemi kullanarak ikinci PCR ürünlerini saflaştırın.
- DNA konsantrasyonu ayarı
- Saflaştırılmış ikinci PCR ürünlerindeki DNA konsantrasyonunu nükleik asit niceleme spektrofotometresi kullanarak ölçün.
- nM'deki hedef gen konsantrasyonu hesaplayın, ortalama son kütüphane boyutunu hem 16S hem de 18S rRNA genleri için 613 bp olarak hesaplayın:
- Arıtılmış her ikinci PCR ürününü steril PCR suyu ile yeni bir 0,2 mL 96 kuyu plakasında 4 nM'ye seyreltin.
NOT: Plaka burada -20 °C'de saklanabilir. Aksi takdirde, işlemlerin geri kalanı durdurulmadan yapılmalıdır. - Her 4 nM ikinci PCR ürününün Aliquot 3 μL'si ve hepsini havuzlu bir kütüphane olarak yeni bir steril 1,5 mL tüpte karıştırın. Tüpü her zaman 4 °C'de veya buz banyosunda tutun.
- Nükleik asit niceleme spektrofotometresi kullanarak onay için havuza alınan kütüphanenin konsantrasyonunu ölçün. 4 nM'den yüksekse konsantrasyonu 4 nM'ye ayarlayın.
NOT: Aşırı konsantre DNA, aşırı tahmin edilen okuma sayıları üretir ve analizi engeller.
- DNA denatürasyonu ve dizilimi
NOT: Bu bölümde belirli reaktiflere sahip Illumina MiSeq sistemi haline gelinir. Malzeme Tablosu'ndakiürün numaralarına bakın.
NOT: Kesinlikle zamanı takip edin. Kartuşlar dışındaki tüm reaktifleri sıralama gününde çözün.- Sıralamadan bir gün önce, önceden doldurulmuş kullanıma hazır bir reaktif kartuşunu -20 °C'den çıkarın ve çözülme için 4 °C'de saklayın.
- 1,5 mL santrifüj tüpleri için uygun bir ısı bloğunu 96 °C'ye ayarlayın.
- Melezleme tamponunu buza yerleştirin.
- PCR sınıfı su ile yeni bir tüpte moleküler sınıf NaOH'u 1 N'den 0,2 N'ye seyreltin.
- Kullanıma hazır bir kontrol kitaplığını TE arabelleği (pH 8.0) ile yeni bir tüpte 10 nM stoktan 4 nM'ye (örneğin, 2 μL kontrol kütüphanesi + 3 μL TE arabelleği) seyreltin.
- 16 μL 4 nM havuzlu örnek kütüphaneyi 4 μL 4 nM kontrol kütüphanesi ile "1" etiketli yeni bir tüpte karıştırın.
- "1" tüpünde 10 μL numuneyi 10 μL 0,2 N NaOH ile "2" etiketli yeni bir tüpte karıştırın.
- Vortex tüp 2 için 5 s, kısa bir süre aşağı döndürün ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
- Tüp 2'ye 980 μL hibridizasyon tamponu ekleyin.
- "3" etiketli yeni bir tüpte, 260 μL'lik numuneyi tüp 2'den 390 μL hibridizasyon tamponu ile karıştırın. Tüpü ters çevirerek karıştırın.
- Tüp 3'i 96 °C'de 2 dakika kuluçkaya yatırın ve hemen maksimum 2 dakika boyunca buza yerleştirin.
- Kartuşu 4 °C buzdolabından çıkarın.
- Tablo 6'da olduğu gibi, örnek sayfayı karşılık gelen her dizin 1 ve dizin 2 bağdaştırıcısıyla sıralama için ayarlayın.
- Akış hücresini MiSeq v3 kitinden çıkarın. Akış hücresini steril moleküler sınıf PCR su ile hafifçe temizleyin.
NOT: Akış hücresinin kılcal noktalarına su dökmeyin. Lifli olmayan kağıtla akış hücresinden suyu hafifçe silin. - Tüp 3'ün (650 μL) tam hacmini kartuşa yükleyin.
- Cihaz çalışma yazılımında sıralamayı seçin ve yönergeleri izleyin. Akış hücre, kuruluş tamponu ve kartuş takın. Örnek sayfayı yükleyin. Tepkiyi başlatmak için Çalıştır'a basın.
NOT: Bu sıralı çalışma 3-5 gün sürecektir. Veriler otomatik olarak Basespace platformuna yüklenecektir. Ham veriler bilgisayardaki iki klasörde depolanacaktır: fastq dosyalarını içeren analiz klasörü ve bcl dosyalarını ve jpeg resimlerini içeren Çıktı.
4.Verileri sıralamak için taksonomik atama
- FASTQ dosya işleme
NOT: R 24'ün DADA2 paketi23, FASTQ dosyalarını işlemek için önerilen veritabanlarından biridir. Kılavuz [https://github.com/mickeykawai/exec_dada2] adresinde mevcuttur. Bu kılavuz, DADA2 ardışık düzen öğreticisinin son sürümü [https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html] benimsenerek hazırlanmıştır.- Kırpma, kalite filtreleme, benzersiz dizilerin dereplication ve sayımı, örnek çıkarım, contigs birleştirme ve kimerik dizileri kaldırma için ham FASTQ eşleştirilmiş uç dizilerini işleyin.
- Hem 16S rRNA hem de 18S rRNA gen parçaları için aşağıdaki DADA2 belirtilen parametrelerini kullanın; trimLefts=0, 0, truncLens=[Sıra kalitesini denetleyin ve uygun uzunluğa ayarlayın].
NOT: Diğer parametreler için varsayılan değerler maxN=0, maxEE=2,2, trancQ=2'dir.
- Taksonomi ataması
NOT: DADA2 için taksonomi ataması için SILVA rRNA veritabanı önerilir [silva_nr_v132_train_set.fa.gz varsayılan olarak ayarlanır].- 16S rRNA gen parçası analizi için kloroplast ve mitokondriyal OPU'ları çıkarın. Singletonları 16S rRNA ve 18S rRNA analizinden çıkarın.
- En düşük sıralama derinliğine sahip numuneye göre tüm örnekleri sıralama derinliğine eşit olarak nadirleştirin.
- Okuma sayısını, atanan OTU'ları ve hangi düzeyde filtre uygulanmış okumaları ve hariç tutulan singleton sayısını kaydedin.
- İstatistiksel analiz
- Phyloseq25 ve vegan26'nınR paketlerini kullanarak mikrobiyal veriler üzerinde istatistiksel analiz yapın.
Representative Results
Bu protokol, deniz suyu örneklerindeki alg türlerini tanımlamak için 18S rRNA gen metabarkodlama analizini kullanır. 19 Şubat 2019tarihinde Metri, Puerto Montt, Şili'den toplanan deniz suyunun (−41.597; −72.7056) bu protokolle analiz edildiği Şekil 1'de temsili bir sonuç gösterilmiştir. Sonuç, deniz suyu örneğinde 30'dan fazla alg türü ile toplam 13.750 okuma gösterdi. Bu örnekteki baskın alg Navicula sppidi. göreceli bolluk % 70.77 ile. Ayrıca, Micromonas (%6.40), Chaetoceros spp. (%4.44), Scripsiella spp. (%2.44) ve Prorocentrum spp. (1.28%). Şili HAB'ının en yüksek toksik alg etkenlerinden biri olan pseudochattonella spp.,bu deniz suyu örneğinden% 0.52 ile tespit edildi.
Veri güvenilirliğini doğrulamak için, 18S rRNA gen analizi ile tanımlanan alg türleri, aynı deniz suyu örneğinde mikroskopi ile elde edilenlerle karşılaştırıldı (Şekil 2). 18S rRNA gen analizi ile tutarlı olarak, mikroskopi baskın türün Navicula sppolduğunu gösterdi. küçük bir tür olarak% 74.1 ve Prorocentrum spp. (% 0.60) göreceli bolluğu ile. Tersine, mikroskobik gözlemden belgelenen Heterocapsa spp. (%9.04) bu örnekte 18S rRNA gen analizi ile tanımlanamamıştır. Mikroskopi ile kaydedilen tanımlanamayan fitoplankton hücrelerinin %12,6'sı vardı. Bu micromonasolabilir 18S rRNA sonuçlarına göre.
Protokol, deniz suyu örneklerindeki bakteri türlerini tanımlamak için 16S rRNA gen metabarkodlama analizini kullanır. 18S rRNA gen analizi için kullanılan aynı deniz suyunun 16S rRNA gen analizi ile analiz edildiği Şekil 3'tetemsili bir sonuç gösterilmiştir. Sonuç, deniz suyu örneğinde 30'dan fazla bakteri türü ile toplam 31.758 okuma olduğunu gösterdi. Bu deniz suyu örneğinin, serbest yaşayan bakterileri bağlı bakterilerden ayırmak için tandem filtre membranlarından (1 μm ve 0,2 μm gözenek boyutları) geçirildiğı belirtilmelidir. Daha sonra, her filtre zarı tarafından yakalanan hücreler DNA ekstraksiyonu için tedavi edildi ve ardından 16S rRNA gen analizi yapıldı. Şekil 3'teki temsili sonuç, serbest yaşayan bakteriler olarak tanımlanan 0,2 μm gözenek boyutu membrandan tanımlanan bakteri türlerini göstermektedir. Baskın serbest yaşayan bakteri, göreceli bolluk% 20.02 ile Amylibacter spp. idi, onu Clade Ia (% 13.53) ve Aligiphilus spp. (7.06%). Bu deniz suyu örneğinden tespit edilen bakteri türlerinin geri kalanı nispeten eşit olarak dağıtıldı. Aynı analiz, attach-bakteri türleri tespiti olarak 1 μm gözenek büyüklüğündeki membran tarafından yakalanan hücreler için de yapılabilir.
Bu metabarkodlama tahlilleri belirli bir çalışma süresi boyunca planlanan zaman noktalarında gerçekleştirildiğinde, sonuçlar zaman serisi analizi olarak özetlenebilir. Bunu yapmanın bir yolu, benzersiz bir büyüme deseni bulmak için zamanın bir işlevi olarak belirli alg ve bakteri türlerinin göreceli bolluğunu çizmektir. Şekil 4, Metri, Şili'deki Alexandrium ve Pseudochattonella'nın temsili bir zaman serisi arsayı göstermektedir. Zaman serisi metabarkodlama analizini özetlemenin bir başka yolu, belirli organizma gruplarının popülasyon değişimini temsil eden, tanımlanan tüm alg ve bakterileri zamanın bir işlevi olarak çizmektir. Şekil 5 ve Şekil 6, Metri'nin deniz suyundan beş ay boyunca tespit edilen sırasıyla tüm bakteri cinsinin ve düzeninin göreceli bolluğunu özetlemektedir.
Tablo 1: İlk PCR ana karışım içeriği: Tablo, 16S rRNA ve 18S rRNA analizleri için reaksiyon başına ana karışım içeriğini gösterir. Astar dizileri Tablo 3'te listelenmiştir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Astar dizileri: İlk PCR için astarlar 16S rRNA ve 18S rRNA analizleri için listelenmiştir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 3: PCR döngüleri: Birinci PCR ve ikinci PCR için termal döngüler listelenir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 4: Dizin dizileri: İkinci PCR için kullanılacak Dizin 1 (i7) ve Dizin 2 (i5) primerleri listelenmiştir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 5: Dizin 1 ve Dizin 2 konumlandırma örneği: Hatayı azaltmak için, indeks astarları önce konuma yerleştirilmelidir ve her birinin aliquot'u çok kanallı pipet kullanılarak 96 kuyulu bir plakaya aktarılır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 6: Örnek sayfa örneği: Sıralamadan önce, dizin 1 ve dizin 2 bağdaştırıcılarına karşılık gelen bir örnek sayfa oluşturulmalıdır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 1: 18S rRNA metabarcoding analizinin temsili sonucu: 19 Şubat 2019 tarihinde Şili'nin Los Lagos kentindeki Metri kentinden toplanan bir deniz suyu örneğinde bulunan alg türleri, 18S rRNA metabarcoding tahlilleri ile tespit edilmiştir. "Bilinmeyen" atanan diziler ortadan kaldırıldı ve tanımlanan her türün göreceli bolluğu çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikroskobik analizin temsili sonucu: Alg türleri, 19 Şubat 2019'da Metri, Los Lagos, Şili'den alınan bir su örneğinden mikroskopi ile tanımlanmıştır. Her türün miktarı manuel olarak sayıldı ve çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 16S rRNA metabarcoding analizinin temsili sonucu: 19 Şubat 2019 tarihinde Şili'nin Los Lagos kentinden Metri'den alınan bir su örneğinde bulunan bakteri türleri 16S rRNA metabarcoding tahlil ile tespit edilmiştir. Tanımlanan her türün göreceli bolluğu çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 18S rRNA metabarcodingin Metri, Şili'den elde edilen Alexandrium spp. ve Pseudochattonella spp. İki zehirli alg türü, Alexandrium ve Pseudochattonella, zaman içinde 18S rRNA analizi ile seçici olarak izlendi ve göreceli bolluk zaman noktasının bir işlevi olarak çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 16S rRNA ve 18S rRNA metabarkodlamadan elde edilen temsili cins zaman serisi arsa: Metri, Şili suyunda tanımlanan tüm bakteriyel ve ökaryotik cins, beş ay boyunca izlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: 16S rRNA ve 18S rRNA metabarkodlamadan elde edilen temsili sipariş zaman serisi arsa: Metri, Şili suyunda tanımlanan tüm bakteriyel ve ökaryotik siparişler, beş ay boyunca izlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo S1 ve Tablo S2:
Tablo S1: Şekil 5 ve Şekil 6için ham veriler. Tablo S2: Şekil 5 ve Şekil 6ham verileri üzerinde QC kontrolü sonucu . Bu Tabloları indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Bu protokol, Şili OSB'lerini izlemek için deniz suyu örneklerinde alg ve bakteri türlerini tanımlamak için 18S rRNA ve 16S rRNA gen metabarkodlama analizini başarıyla gerçekleştirdi. Bu protokol tarafından tespit edilen baskın algler ve bazı küçük algler, mikroskopi ile elde edilenlerle tutarlıydı ve protokolün güvenilirliğini doğruladı. Protokolün en önemli özelliği, analizin Güney Şili'de türlere neden olan en sorunlu iki HAB olan Alexandrium spp. ve Pseudochattonella spp.'yidüşük bir bollukta bile Metri'nin deniz suyundan tespit ettiğidir. Özellikle, Pseudochattonella spp. hücreler küçük ve kolayca ışık altında yırtılmış veya fiksatiflerin kullanımı27,28. Metabarcoding, mikroskopinin tanımlayamadığı deniz suyu örneklerinde az bulunan alg türleri bilgilerini sağlayabilir. Protokolde ayrıca 30'dan fazla bakteri türü tespit edildi. Bu bakterilerin alg büyümesi ile nasıl ilişkili olduğu bu noktada bilinmemekle birlikte, zaman serisi analizinde alg-bakteri türlerinin büyük veri toplaması muhtemelen bu kadar önemli keşifler sağlayacaktır. Bu nedenle, geleneksel Şili HAB izleme programlarına metabarkod analizi eklemek şüphesiz mevcut HAB izleme verimliliğini güçlendirecektir. Aslında, metabarkod analizi için bu görsel protokol sadece Şili suyunun alg-bakteriyel izlemesi için değil, aynı zamanda dünya çapında HAB'dan etkilenen diğer bölgelerdeki kıyı izleme programları için de yararlı olabilir.
Bu protokol yukarıda belirtilen avantajları sağlasa da, yöntemin dezavantajları tartışılmalıdır. Görsel protokolde görüldüğü gibi, metabarcoding yöntemi zaman alıcı ve karmaşıktır, pahalı makineler ve reaktifler gerektirir. Laboratuvar personeli özel olarak eğitilmelidir, aksi nedenle malzeme, emek ve zaman harcar. Ek olarak, metabarkodlama ile alg tespiti, aynı baskın türün iki ortogonal yöntemden tanımlandığını doğrulamak için mikroskopi ile eşleştirilmelidir29. Mikroskopi, çoğunlukla alg türlerini tanımlamak için invaziv olmayan bir araçtır, yani alg türleri benzersiz ve belirgin şekillere sahip olduğunda hata yapmak daha zordur. Tabii ki, türler birbirine çok benzer şekillere sahipse insan hatası oluşabilir. Öte yandan, metabarcoding analizi birden fazla adım gerektirdiğinden, doğal olarak hataları artırır. Bir örnek karıştırılabilir, yanlış reaktif ilavesi veya bazı prosedürler eksik olabilir. Bu nedenle, metabarkodlama sonuçlarının mikroskopi ile elde edilenlerle karşılaştırılması kritik öneme sahiptir. Son olarak, protokol yalnızca nitel olarak uygulanabilir ve sonuçlar göreli bolluk için hesaplanmalıdır. Lamb ve arkadaşlarının 2019'da belirttiği gibi, nicel performans olarak mevcut metabarcoding hala sınırlıdır ve metabarcoding nicel uygulamalar için güvenle kullanılmadan önce ek araştırma gereklidir30.
Bu protokol, Illumina Inc. tarafından yayınlanan 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation kılavuzundan çalışma başına 140 - 170 örnek için optimize edilmiştir. En iyi duruma getirilmiş protokol birçok kez test edildi ve bu son sürümü yayınlamak için daha da değiştirildi. Bu nedenle, her adımı tam olarak izlemeniz şiddetle tavsiye edilir. Protokolün en kritik kısmı, numune kirlenmesini önlemek için ekstra bakım yapılması gerektiğidir. Pipetler ve laminar akış davlumbaz her zaman% 70 alkol ve UV maruziyeti ile temizlenmeli ve sterilize edilebilir malzemeler otoklavlanmalıdır. Astarlar ve reaktifler her yeni çalıştırmada doğrudan stoktan seyreltilmeli veya reaktiflerin yeniden kullanımı ve birkaç seyreltmeye maruz kalmak örnek bir kontaminasyon nedeni olabilir. Protokol, işlemin laminer akış başlığı dışında ne zaman yapılabileceğini belirtir. Aksi sürece, numuneler temizlenmiş bir laminer akış başlığında tedavi edilmelidir. Aynı anda birden fazla 8 tüplü şeritle uğraşırken, ilk 8 tüplü şerit üzerinde çalışmanız ve bir sonraki 8 tüplü şeride geçmeden önce kaplanız önerilir. 16S ve 18S rRNA genleri çevrede oldukça yaygın olduğu için kapağın uzun süre açık bırakılması numune kirlenmesine neden olabilir. Karıştırma süresi ve kuluçka süresi gibi belirtilen süre, her adım için en iyi süre birden çok test çalıştırmasına göre seçildiğinden tam olarak açıklandığı gibi takip edilmelidir. Örneğin, fazla veya yetersiz zaman örnek verimini azaltabilir. İşlem yalnızca protokolün durdurabileceğini söylediği kısımda durdurulmalıdır. Olumlu sonuçların yapay yanlış pozitifler olmadığını doğrulayan negatif bir kontrole sahip olmak çok önemlidir. Son olarak, tüm adımları işlemek için en az beş gün gerektirdiğinden ve bazı parçalar bir sonraki durdurma işaretine kadar durdurulamadığından, günleri planlamanız şiddetle önerilir.
Sıralı veriler için taksonomik atamanın sınırlandırılması burada kısaca not edilir. Bakteriyel ve alg türleri için yeni keşfedilen nükleotid dizileri her gün veri bankasında güncellenmektedir. İyi çalışılmış alg ve bakteri türleri güvenilir bir şekilde kaydedilirken, veri bankasında güncellenen bilinmeyen türler için birçok dizi de vardır. Kayıtlı nükleotid dizilerinin çözünürlüğünün her zaman tür tanımlaması için değil, sadece cins tanımlaması için yeterli olduğunu gösterir. Bu nedenle, mikroskobik tür tanımlaması ortogonal olarak yapılmalıdır. Bu iş için bir açık erişim ardışık düzeni oluşturmak, aynı anda büyük bir dizi sıralı veriyle başa çıkmada ve bir hata oluştuğunda verimli bir şekilde araştırmada önemli bir avantaja sahiptir. Ayrıca, DADA2'nin çıktısı bir metin veya csv dosyasındadır, bu da daha fazla istatistiksel analiz yapmayı kolaylaştırır. Öte yandan, özellikle bir veri kümesi büyükse, taksonomik atamaları gerçekleştirmek için büyük bir sunucu gerekir. Boru hattını kurmak için mühendislere ihtiyaç vardır ve profesyoneller parametreleri, işletimi, Linux'u ve biyoinformatikleri anlamalıdır.
HAB izleme aracı olarak kapsamın yanı sıra, bu protokolün kullanımı araştırmacı araştırma amacıyla genişletilebilir. Örneğin, Şili hükümeti ve yerel balıkçılar arasında, yerel HAB31 , 32sayısının artmasıyla ilgili çevre barış dernekleri ile birlikte devam eden tartışmalar vardır. Hükümet bunun küresel ısınma ve El Niño gibi doğal bir fenomenden kaynaklandığını iddia ederken, sonraki partiler somon su ürünlerinin neden olduğunu iddia ediyor. Somon, Şili'nin yerli bir türü değildir ve yarım yüzyıl önce Şili suyunda değildi. O dönemde Şili hükümeti, bir somon işletmesi geliştirerek ekonomiyi büyütmeyi ve yoksul bölgelere iş yaratmayı amaçladi33. Sermaye karı için denizaşırı ülkelerden gelen müdahale ile Şili kalem tarzı su ürünleri geliştirmede büyük başarı elde etti ve somon sayısı son birkaç on yılda dikkat çekici bir şekilde arttı31,32,33. Daha sonra, somon için çok miktarda yiyecek denize atılmıştır, bu da yerel halkın somon su ürünlerinin sık görülen yerel HABs31,32'ninnedeni olduğundan şüphe etmesine yol açtı. Gerçek şu anda bilinmemektedir, ancak yerel deniz ortamını, ekonomisini ve insan sağlığını HAY'lerden korumak için stratejiler tasarlanabilmesi için eninde sonunda anlaşılmalıdır. Lokal alg-bakteriyel ilişki üzerine yapılan moleküler tabanlı analiz, böyle bir konu için ileriye dönük bir açıklamaya katkıda bulunabilir. Örneğin, teknik daha önce hedef okyanus alanında bulunmayan ancak son yıllarda önemli ölçüde artan alg ve bakteri türlerini arayabilir, bu da Sakai ve ark. tarafından GIS ve eDNA analizi34tarafından kaydedilmiş bir Yamato semender popülasyonunun(Hynobius vandenburghi)keşfi için yapılan çalışmaya biraz benzer. Bu nedenle, HAB izleme aracının ötesinde, bu metabarcoding protokolü diğer potansiyel müşteriler için potansiyel kullanıma sahiptir.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun. Fon sağlayıcılar çalışmanın tasarımında, verilerin toplanmasında, analizlerinde veya yorumlanmasında hiçbir rol oynamamışlardır; yazının yazımında veya sonuçların yayımlanması kararında.
Acknowledgments
Bu çalışma, Şili'de Sürdürülebilir Kalkınma-İzleme Algleri için Bilim ve Teknoloji Araştırma Ortaklığı (SATREPS-MACH) üzerine bir çalışma için hibe (JPMJSA1705) tarafından desteklendi. Dr. Sandra Rios'a (Universidad de Los Lagos) bir film klibi kullanmamıza izin verdiği için teşekkür ederiz. Neal Andrew Holland'a el yazmasını titizlikle düzelttikten dolayı teşekkür ederiz. Puerto Montt, Şili'deki CREAN-IFOP'taki laboratuvar grubu üyelerine fitoplankton tanımlaması konusunda bize tavsiyelerde bulundular için en içten takdirlerimizi sunuyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL single tube | ThermoFisher | Q32856 | sterile |
| 1.5 mL tubes | ThermoFisher | 2150N | sterile |
| 8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap | ThermoFisher | AB0451 & 4323032 | sterile |
| 96-well 0.2 mL PCR plate | ThermoFisher | N8010560 | |
| AccuRuler 100 bp DNA Ladder | MaestroGen | 02001-500 | |
| Chelex 100 Chelating Resin | Bio-Rad | 1432832 | |
| Chemical Duty Vacuum Pressure Pump | MilliporeSigma | WP6122050 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
| D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5602 | |
| DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) | Promega | G1881 | |
| Ethanol Molecular Biology Grade | E7023 | Merck KGaA | |
| Filtration device | ThermoFisher | 09-740-36H, 09-740-23E | |
| Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
| Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) | ThermoFisher | Q33238 | |
| Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
| Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) | Agilent | G2992AA | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41002 | |
| Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Heat block | |||
| High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X | Roche | KK2602 | |
| HT1 Hybridization buffer | Illumina | 20015892 | |
| Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D | Illumina | FC-131-2001, -2002, -2003, -2004 | |
| Laminar hood cabinet | Biobase Co. | Biobase PCR-800 PCR Cabinet | |
| Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) | Agilent Technologies | 5067-5598 | |
| Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) | Promega | NG2002 | |
| Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) | ThermoFisher | AM10027 | |
| Micro-seal film for 96-well plate | ThermoFisher | 4311971 | sterile |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3003 | includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges. |
| MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | includes pre-installed software |
| Molecular grade nuclease-free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-04 | |
| Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M | Merck KGaA | 1091371000 | |
| Multichannel pipettes | Not specified | Not specified | |
| Multi-Purpose Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System | ThermoFisher | D2 | |
| Ow EC-105 Compact Power Supply | ThermoFisher | 105ECA-115 | |
| Pellet Pestle— Cordless Motor | ThermoFisher | K749540-0000 | |
| PhiX control Kit v3 | Illumina | FC-110-300 | ready-to-use control library for Illumina sequencing |
| Pipette tips | Not specified | Not specified | sterile |
| Pipettes | Not specified | Not specified | 2, 10, 20, 100, 1000 μL |
| SterivexTM GP 0.22 μm filter unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf 5427R Centrifuge | Eppendorf AG | |
| TBE buffer | ThermoFisher | B52 | |
| TE buffer (pH 8.0) | ThermoFisher | AM9849 | |
| Terr PCR Direct FFPE Kit | Takara Bio USA | 639284 | includes 2X Terra PCR Direct Buffer |
| Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL | Takara Bio USA | 639271 | High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase |
| ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) | ThermoFisher | A37835 | |
| TransIlluminator and image capture system | Analytik Jena, AG | GelDoc-ItTS2 Imager | |
| Whatman 1.0 m pore-sized membrane | MilliporeSigma | WHA111110 |
References
- Hallegraeff, G., Enevoldsen, H., Zingone, A. Global harmful algal bloom status reporting. Harmful Algae. 102, 101992 (2021).
- Anderson, D. M. Red Tides. Scientific American. 271 (2), 52-58 (1994).
- Sanseverino, I., Conduto, A. D. S., Pozzoli, L., Dobricic, S., Lettieri, T. Algal Bloom and its Economic Impact. , Publications Office of the European Union. (2016).
- Molinet, C., Niklitschek, E., Seguel, M., Díaz, P. Trends of natural accumulation and detoxification of paralytic shellfish poison in two bivalves from the Norwest Patagonian inland sea. Revista de Biologia Marina Y Oceanografia. 45, 195-204 (2010).
- Mardones, J., Clement, A., Rojas, X., Aparicio, C. Alexandrium catenella during 2009 in Chilean waters, and recent expansion to coastal ocean. Harmful Algae News. 41, 8-9 (2010).
- Alvarez, G., et al. Paralytic shellfish toxins in surf clams Mesodesma donacium during a large bloom of Alexandrium catenella dinoflagellates associated to an intense shellfish mass mortality. Toxins (Basel). 11 (4), (2019).
- Clément, A., et al. Exceptional summer conditions and HABs of Pseudochattonella in Southern Chile create record impacts on salmon farms. Harmful Algae News. 53, 1-3 (2016).
- Trainer, V. L., et al. Pelagic harmful algal blooms and climate change: Lessons from nature's experiments with extremes. Harmful Algae. 91, 101591 (2020).
- Yarimizu, K., et al. Protocols for monitoring harmful algal blooms for sustainable aquaculture and coastal fisheries in Chile. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (20), (2020).
- Roegner, G. C., Hickey, B. M., Newton, J. A., Shanks, A. L., Armstrong, D. A. Wind-induced plume and bloom intrusions into Willapa Bay, Washington. Limnology & Oceanography. 47 (4), 1033-1042 (2002).
- Tweddle, J. F., et al. Relationships among upwelling, phytoplankton blooms, and phycotoxins in coastal Oregon shellfish. Marine Ecology Progress Series. 405, 131-145 (2010).
- Glibert, P. M., Anderson, D. M., Gentien, P., Graneli, E., Sellner, K. G. The global complex phenomena of harmful algae blooms. Oceanography. 18 (2), 130-141 (2005).
- Paredes-Mella, J., Varela, D., Fernández, P., Espinoza-González, O. Growth performance of Alexandrium catenella from the Chilean fjords under different environmental drivers: Plasticity as a response to a highly variable environment. Journal of Plankton Research. 42 (2), 119-134 (2020).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
- Amin, S. A., et al. Interaction and signaling between a cosmopolitan phytoplankton and associated bacteria. Nature. 522, 98-101 (2015).
- Berdalet, E., et al. Marine harmful algal blooms, human health, and wellbeing: Challenges and opportunities in the 21st century. Journal of Marine Biology Association. 2015, U. K. 1-31 (2015).
- Ramanan, R., Kim, B. -H., Cho, D. -H., Oh, H. -M., Kim, H. -S. Algae-bacteria interactions: Evolution, ecology, and emerging applications. Biotechnology Advances. 34 (1), 14-29 (2016).
- Seymour, J. R., Amin, S. A., Raina, J. B., Stocker, R. Zooming in on the phycosphere: The ecological interface for phytoplankton-bacteria relationships. Nature Reviews Microbiology. 2, 17065 (2017).
- Maruyama, F., et al. 16S and 18S Metabarcoding analysis for Chilean coastal waters harmful algal blooms. protocol.io. , (2020).
- Tanabe, A. S., et al. Comparative study of the validity of three regions of the 18S-rRNA gene for massively parallel sequencing-based monitoring of the planktonic eukaryote community. Molecular Ecology Resources. 16, 402-414 (2016).
- Nishitani, G., et al. Multiple plastids collected by the Dinoflagellate Dinophysis mitra through Kleptoplastidy. Applied and Environmental Microbiology. 78 (3), 813-821 (2012).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1 (2013).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- R, R Team DCore. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2007).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R Package for Reproducible Interactive Analysis and Graphics of Microbiome Census Data. PLoS One. 8 (4), 61217 (2013).
- Dixon, P. VEGAN, a package of R functions for community ecology. Journal of Vegetation Science. 14 (6), 927-930 (2003).
- Dittami, S. M., Riisberg, I., Edvardsen, B. Molecular probes for the detection and identification of ichthyotoxic marine microalgae of the genus Pseudochattonella (Dictyochophyceae, Ochrophyta). Environmental Science and Pollution Research. 20 (10), 6824-6837 (2013).
- Mardones, J. I., et al. Salinity-growth response and ichthyotoxic potency of the Chilean Pseudochattonella verruculosa. Frontiers in Marine Science. 6 (24), (2019).
- Santi, I., Kasapidis, P., Karakassis, I., Pitta, P. A comparison of DNA metabarcoding and microscopy methodologies for the study of aquatic microbial eukaryotes. Diversity. 13 (5), 180 (2021).
- Lamb, P. D., et al. How quantitative is metabarcoding: A meta-analytical approach. Molecular Ecology. 28 (2), 420-430 (2019).
- Mascareño, A., et al. Controversies in social-ecological systems: lessons from a major red tide crisis on Chiloe Island, Chile. Ecology and Society. 23, (2018).
- Armijo, J., Oerder, V., Auger, P. -A., Bravo, A., Molina, E. The 2016 red tide crisis in southern Chile: Possible influence of the mass oceanic dumping of dead salmons. Marine Pollution Bulletin. 150, 110603 (2020).
- Swanson, H. A. Caught in Comparisons: Japanese Salmon in an Uneven World. , University of California, Santa Cruz. Doctor of Phylosophy thesis (2013).
- Sakai, Y., et al. Discovery of an unrecorded population of Yamato salamander (Hynobius vandenburghi) by GIS and eDNA analysis. Environmental DNA. 1 (3), 281-289 (2019).
