Summary
تظهر الدراسة الحالية إنشاء ثلاثة نماذج مختلفة للتبرع بالرئة (التبرع بعد موت الدماغ ، والتبرع بموت ما بعد الدورة الدموية ، والتبرع بالصدمة بعد النزف). يقارن العمليات الالتهابية والاضطرابات المرضية المرتبطة بهذه الأحداث.
Abstract
النماذج التجريبية هي أدوات مهمة لفهم الظواهر المسببة التي تنطوي عليها مختلف الأحداث الفيزيولوجية المرضية. في هذا السياق ، يتم استخدام نماذج حيوانية مختلفة لدراسة العناصر التي تؤدي إلى الفيزيولوجيا المرضية لخلل الكسب غير المشروع الأولي بعد الزرع لتقييم العلاجات المحتملة. حاليا ، يمكننا تقسيم نماذج التبرع التجريبية إلى مجموعتين كبيرتين: التبرع بعد الموت الدماغي والتبرع بعد توقف الدورة الدموية. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي النظر في الآثار الضارة المرتبطة بالصدمة النزفية عند النظر في النماذج الحيوانية للتبرع بالأعضاء. هنا ، نصف إنشاء ثلاثة نماذج مختلفة للتبرع بالرئة (التبرع بعد موت الدماغ ، والتبرع بموت ما بعد الدورة الدموية ، والتبرع بالصدمة بعد النزف) ومقارنة العمليات الالتهابية والاضطرابات المرضية المرتبطة بهذه الأحداث. الهدف هو تزويد المجتمع العلمي بنماذج حيوانية موثوقة للتبرع بالرئة لدراسة الآليات المرضية المرتبطة والبحث عن أهداف علاجية جديدة لتحسين عدد الطعوم القابلة للحياة للزراعة.
Introduction
الأهمية السريرية
زرع الأعضاء هو خيار علاجي راسخ للعديد من الأمراض الخطيرة. في السنوات الأخيرة ، تم تحقيق العديد من التطورات في المجالات السريرية والتجريبية لزراعة الأعضاء ، مثل زيادة المعرفة بالفيزيولوجيا المرضية لخلل الكسب غير المشروع الأولي (PGD) والتقدم في مجالات العناية المركزة وعلم المناعة وعلم الأدوية1،2،3. على الرغم من الإنجازات والتحسينات في جودة الإجراءات الجراحية والدوائية ذات الصلة ، تظل العلاقة بين عدد الأعضاء المتاحة وعدد المتلقين في قائمة الانتظار واحدة من التحديات الرئيسية 2,4. في هذا الصدد ، اقترحت الأدبيات العلمية نماذج حيوانية لدراسة العلاجات التي يمكن تطبيقها على المتبرعين بالأعضاء لعلاج و / أو الحفاظ على الأعضاء حتى وقت الزرع5،6،7،8.
من خلال محاكاة الأحداث المختلفة التي لوحظت في الممارسة السريرية ، تسمح النماذج الحيوانية بدراسة الآليات المرضية المرتبطة بها والنهج العلاجية الخاصة بها. أدى الحث التجريبي لهذه الأحداث ، في معظم الحالات المعزولة ، إلى إنشاء نماذج تجريبية للتبرع بالأعضاء والأنسجة التي يتم التحقيق فيها على نطاق واسع في الأدبيات العلمية حول زرع الأعضاء6،7،8،9. تستخدم هذه الدراسات استراتيجيات منهجية مختلفة ، مثل تلك التي تحفز الموت الدماغي (BD) ، والصدمة النزفية (HS) ، وموت الدورة الدموية (CD) ، لأن هذه الأحداث ترتبط بعمليات ضارة مختلفة تضر بوظائف الأعضاء والأنسجة المتبرع بها.
الموت الدماغي (BD)
يرتبط BD بسلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى التدهور التدريجي للأنظمة المختلفة. يحدث عادة عندما تحدث زيادة حادة أو تدريجية في الضغط داخل الجمجمة (ICP) بسبب صدمة الدماغ أو النزيف. هذه الزيادة في برنامج المقارنات الدولية تعزز زيادة في ضغط الدم في محاولة للحفاظ على تدفق الدم الدماغي المستقر في عملية تعرف باسم منعكس كوشينغ10,11. يمكن أن تؤدي هذه التغييرات الحادة إلى اختلالات في القلب والأوعية الدموية والغدد الصماء والعصبية التي تضر بكمية ونوعية الأعضاء المتبرع بها ، بالإضافة إلى التأثير على المراضة والوفيات بعد الزرع10،11،12،13.
الصدمة النزفية (HS)
HS ، بدوره ، غالبا ما يرتبط بالمتبرعين بالأعضاء ، لأن معظمهم ضحايا للصدمة مع فقدان كبير في حجم الدم. بعض الأعضاء ، مثل الرئتين والقلب ، معرضة بشكل خاص ل HS بسبب نقص حجم الدم وما يترتب على ذلك من نقص تروية الأنسجة14. يتسبب HS في إصابة الرئة من خلال زيادة نفاذية الشعيرات الدموية ، والوذمة ، وتسلل الخلايا الالتهابية ، وهي آليات تعرض معا تبادل الغازات للخطر وتؤدي إلى تدهور تدريجي للأعضاء ، وبالتالي إخراج عملية التبرع عن مسارها 6,14.
موت الدورة الدموية (CD)
يتزايد استخدام التبرع بعد CD بشكل كبير في المراكز العالمية الرئيسية ، مما يساهم في زيادة عدد الأعضاء التي تم جمعها. الأعضاء المستعادة من المتبرعين بعد CD عرضة لتأثيرات نقص التروية الدافئ ، والذي يحدث بعد فترة منخفضة (المرحلة الأغونية) أو عدم وجود إمدادات الدم (المرحلة الانقباضية)8,15. سيؤدي نقص التروية أو غياب تدفق الدم إلى نقص الأكسجة في الأنسجة المرتبط بفقدان مفاجئ ل ATP وتراكم السموم الأيضية في الأنسجة15. على الرغم من استخدامه الحالي للزرع في الممارسة السريرية ، لا تزال هناك شكوك كثيرة حول تأثير استخدام هذه الأعضاء على جودة الكسب غير المشروع بعد الزرع وعلى بقاء المريض15. وبالتالي ، فإن استخدام النماذج التجريبية لفهم أفضل للعوامل المسببة المرتبطة ب CD ينمو أيضا8،15،16،17.
النماذج التجريبية
هناك العديد من النماذج التجريبية للتبرع بالأعضاء (BD و HS و CD). ومع ذلك ، غالبا ما تركز الدراسات على استراتيجية واحدة فقط في كل مرة. هناك فجوة ملحوظة في الدراسات التي تجمع أو تقارن بين استراتيجيتين أو أكثر. هذه النماذج مفيدة جدا في تطوير العلاجات التي تسعى إلى زيادة عدد التبرعات وبالتالي تقليل قائمة انتظار المتلقين المحتملين. تختلف الأنواع الحيوانية المستخدمة لهذا الغرض من دراسة إلى أخرى ، حيث يتم اختيار نماذج الخنازير بشكل أكثر شيوعا عندما يكون الهدف هو ترجمة أكثر مباشرة مع فسيولوجيا مورفو البشرية وصعوبة تقنية أقل في الإجراء الجراحي بسبب حجم. على الرغم من الفوائد ، ترتبط الصعوبات اللوجستية والتكاليف المرتفعة بنموذج الخنازير. من ناحية أخرى ، فإن التكلفة المنخفضة وإمكانية التلاعب البيولوجي تفضل استخدام نماذج القوارض ، مما يسمح للباحث بالبدء من نموذج موثوق به لإعادة إنتاج الآفات وعلاجها ، وكذلك دمج المعرفة المكتسبة في مجال زراعة الأعضاء.
هنا ، نقدم نموذجا للقوارض لموت الدماغ ، وموت الدورة الدموية ، والتبرع بالصدمة النزفية. وصفنا العمليات الالتهابية والحالات المرضية المرتبطة بكل من هذه النماذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
امتثلت التجارب على للجنة أخلاقيات استخدام التجارب ورعايتها التابعة لكلية الطب بجامعة ساو باولو (رقم البروتوكول 112/16).
1. تجميع
- قم بتعيين اثني عشر ذكرا من ذكور فأر Sprague Dawley بشكل عشوائي (250-300 جم) لواحدة من ثلاث مجموعات تجريبية (ن = 4) لتحليل ومقارنة التأثيرات المرتبطة بالنماذج الحيوانية.
- تعيين لمجموعة الصدمة النزفية (HS ، n = 4): المعرضة لقسطرة الأوعية الدموية مع تحريض الصدمة النزفية + الصيانة لمدة 360 دقيقة + استخراج كتلة القلب والرئة + تحضير العينة للتحليل.
- تعيين لمجموعة الموت الدماغي (BD ، n = 4): المعرضة للموت الدماغي + الصيانة لمدة 360 دقيقة + استخراج الكتلة القلبية الرئوية + تحضير العينة للتحليل.
- تعيين لمجموعة موت الدورة الدموية (CD ، n = 4): المعرضة لقسطرة الأوعية الدموية + تحريض موت الدورة الدموية + تعليق التهوية + نقص التروية في درجة حرارة الغرفة لمدة 180 دقيقة + تحضير العينة للتحليل.
2. التخدير والتحضير قبل الجراحة
- ضع الفئران في غرفة مغلقة مع 5 ٪ إيزوفلوران لمدة 1-4 دقائق. تأكد من التخدير المناسب عن طريق التحقق من منعكس قرصة إصبع القدم. في حالة عدم وجود تفاعلات منعكسة (لا تراجع مخلب) ، قم بإجراء التنبيب الرغامي (14-G angiocath) بمساعدة منظار الحنجرة للأطفال.
- باستخدام جهاز التنفس الصناعي المعدل مسبقا (FiO2 100٪ ، حجم المد والجزر 10 مل / كجم ، 90 دورة / دقيقة ، و PEEP 3.0 سم H2O) ، قم بتوصيل قسطرة القصبة الهوائية بجهاز التنفس الصناعي ، واضبط تركيز التخدير على 2٪.
ملاحظة: اتبعت جميع الإجراءات المتعلقة بالنماذج الحيوانية نفس بروتوكول التخدير الموصوف في هذا القسم. - إزالة الفراء من المناطق ذات الاهتمام (الرأس والرقبة والصدر والبطن). ثم ، باستخدام الشاش ، تطهير المجال الجراحي وذيل. يتم إجراء التطهير بثلاث جولات متناوبة من محلول كحولي من فرك الكلورهيكسيدين ديغلوكونات.
- اقطع طرف ذيل ، ضع الإبهام والسبابة فوق قاعدة الذيل ، ثم اضغط عليهما وحركهما بعيدا عن القاعدة. جمع عينة الدم المحيطية (20 ميكرولتر) من خلال الذيل لمجموع عدد الكريات البيض8.
ملاحظة: يجب تنفيذ هذا الإجراء قبل بدء فغر القصبة الهوائية ومباشرة في نهاية كل بروتوكول (BD و HS - بعد 360 دقيقة). - استخدم ماصة دقيقة لتخفيف الدم الذي تم جمعه في 380 ميكرولتر (1:20) من محلول تورك (حمض الخليك الجليدي 99٪). بمجرد تخفيفها ، قم بسحب عينة الدم في غرفة نيوباور وضعها تحت المجهر (40x). إجراء إجمالي عدد الكريات البيض في الأرباع الجانبية الأربعة للغرفة.
3. فغر القصبة الهوائية
- بمساعدة المقص والملقط المناسب ، قم بإجراء تشريح طولي للقصبة الهوائية العنقية ، بدءا من الثلث الأوسط من الرقبة إلى الشق فوق القص (
شق 1.5 سم). بعد شق الجلد والأنسجة تحت الجلد ، تشريح عضلات عنق الرحم حتى تتعرض القصبة الهوائية. - ضع رباطا حريريا واحدا 2-0 أسفل القصبة الهوائية.
- باستخدام المقص المجهري ، يقوم القصبة الهوائية باستئصال الثلث العلوي من القصبة الهوائية لتحقيق تهوية موحدة. قطع القصبة الهوائية أفقيا بين حلقتين غضروفيتين لاستيعاب قطر قنية معدنية (3.5 سم).
- أدخل أنبوب التهوية وثبته بأربطة معدة.
- قم بتوصيل أنبوب التهوية بنظام تهوية الصغيرة.
- تهوية الجرذ بحجم المد والجزر 10 مل / كجم ، بمعدل 70 دورة / دقيقة ، و PEEP من 3 cmH2O.
شق 1.5 سم). بعد شق الجلد والأنسجة تحت الجلد ، تشريح عضلات عنق الرحم حتى تتعرض القصبة الهوائية.4. قسطرة الشريان الفخذي والوريد
- كشف المثلث الفخذي من خلال شق صغير (1.5 سم) في المنطقة الأربية. تحديد وعزل الأوعية الفخذية. لهذا الإجراء ، استخدم مجهر مجسم (تكبير 3.2x).
- ضع اثنين من الأربطة الحريرية 4-0 تحت الأوعية الدموية (الوريد أو الشريان) ، أحدهما بعيد والآخر قريب. أغلق الرباط البعيد ، ثم ضع عقدة مضبوطة مسبقا في الرباط القريب واسحبها.
- أدخل القسطرة من خلال شق صغير مسبق التكوين في الأوعية. ثبت القنية لتجنب الخلع.
ملاحظة: اصنع القسطرة من موسع حديثي الولادة 20 سم ملحوم بالتسخين إلى قسطرة وريدية محيطية مناسبة لعيار الشبكة الوريدية للحيوان ، وبالتالي منع قلس محتويات الدم. قم بتشحيم القنية بالهيبارين ، وتجنب تكوين الجلطات الدموية والمضاعفات أثناء قياس متوسط الضغط الشرياني (MAP). - قم بتوصيل قسطرة الشريان بمحول ضغط ونظام مراقبة العلامات الحيوية لتسجيل متوسط الضغط الشرياني (MAP). يجب وضع محول الطاقة على مستوى قلب. سجل MAP كل فترة 10 دقائق.
- ضع قسطرة المحقنة (3 مل) في الوريد ، بهدف الترطيب والاستنزاف عند الضرورة.
5. تحريض الصدمة النزفية
- من خلال الوصول الوريدي وباستخدام حقنة هيبارين ، قم بإزالة كميات صغيرة من الدم حتى يتم الوصول إلى قيم MAP البالغة 50 مم زئبق ، وبالتالي إنشاء صدمة نزفية.
ملاحظة: اجمع 2 مل من الدم كل 10 دقائق في الساعة الأولى من التجربة وكل 30 دقيقة في الساعات التالية. - حافظ على استقرار الضغط عند حوالي 50 مم زئبق لمدة 360 دقيقة. للقيام بذلك ، قم بإزالة أو إضافة حصص من الدم إذا زاد الضغط أو انخفض ، على التوالي.
- ضع مصدرا للحرارة في مكان قريب لتجنب انخفاض حرارة الجسم.
ملاحظة: هنا ، يتم استخدام مصباح حراري. - في نهاية البروتوكول ، قم بحصاد الكتلة الرئوية عند إجمالي سعة الرئة (TLC) وإما تجميد الفلاش في النيتروجين السائل أو وضعه في محلول تثبيت لمزيد من الدراسات.
ملاحظة: بمساعدة جهاز التنفس الصناعي للحيوانات الصغيرة ، يمكن الوصول إلى معلمات التهوية أثناء البروتوكول. في الدراسة الحالية ، تم تقييم هذه المعلمات مباشرة قبل تحريض النظام المنسق (خط الأساس) وبعد 360 دقيقة (نهائي).
6. تحريض موت الدورة الدموية
- للحث على موت الدورة الدموية، يتم تطبيق 150 ملغ/ كغ ثيوبنتال الصوديوم عبر الخط الوريدي. ثم قم بإيقاف تشغيل نظام التهوية.
- لاحظ الانخفاض التدريجي في MAP حتى يصل إلى 0 مم زئبق. من هذه النقطة ، فكر في بداية فترة نقص التروية الدافئة وابدأ حساب الوقت. يجب أن يبقى في درجة حرارة الغرفة (حوالي 22 درجة مئوية) لمدة 180 دقيقة.
- في نهاية البروتوكول ، أعد توصيل الرئتين بجهاز التنفس الصناعي الميكانيكي واحصد الكتلة الرئوية في TLC لجمعها. إما أن تجمد الفلاش باستخدام النيتروجين السائل أو تضعه في محلول التثبيت لمزيد من الدراسات.
7. تحريض الموت الدماغي
- ضع الفئران في وضعية الانبطاح.
- إزالة الجلد من الجمجمة باستخدام مقص جراحي. حفر بئر عيار 1 مم 2.80 مم أمامي و 10.0 مم بطني إلى بريجما و 1.5 مم جانبي للخياطة السهمية.
- أدخل قسطرة البالون بالكامل في تجويف الجمجمة وتأكد من ملء البالون مسبقا بمحلول ملحي (500 ميكرولتر).
- بمساعدة حقنة ، قم بتضخيم القسطرة بسرعة.
- تأكيد الموت الدماغي من خلال مراقبة ارتفاع MAP المفاجئ (منعكس كوشينغ) ، وغياب ردود الفعل ، وتوسع الحدقة الثنائي ، وانقطاع النفس. بعد التأكيد ، توقف عن التخدير واحتفظ بالحيوان على التهوية الميكانيكية لمدة 360 دقيقة.
- ضع مصدرا للحرارة في مكان قريب لتجنب انخفاض حرارة الجسم.
- في نهاية البروتوكول ، قم بحصاد الكتلة الرئوية في TLC للتجميع وإما تجميدها في النيتروجين السائل أو وضعها في محلول تثبيت لمزيد من الدراسات.
ملاحظة: بمساعدة جهاز التنفس الصناعي للحيوانات الصغيرة ، يمكن الوصول إلى معلمات التهوية أثناء البروتوكول. في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم هذه المعلمات مباشرة قبل تحريض BD (خط الأساس) وبعد 360 دقيقة (نهائي).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
متوسط الضغط الشرياني (MAP)
لتحديد تداعيات الدورة الدموية ل BD و HS ، تم تقييم MAP عبر 360 دقيقة من البروتوكول. تم جمع قياس خط الأساس بعد إزالة الجلد وحفر الجمجمة وقبل جمع حصصة الدم للحيوانات المعرضة ل BD أو HS ، على التوالي. قبل تحريض BD و HS ، كانت خطة MAP الأساسية للمجموعتين متشابهة (BD: 110.5 ± 6.1 مقابل HS: 105.8 ± 2.3 مم زئبق ؛ p = 0.5 ؛ ANOVA ثنائي الاتجاه). بعد نفخ القسطرة ، شهدت مجموعة BD زيادة مفاجئة في مستويات ضغط الدم (138. 7 ± 10.1 مم زئبق). ذروة ارتفاع ضغط الدم هي حدث غريب يتعلق بزيادة الضغط داخل الجمجمة ويمكن اعتباره أول دليل على إنشاء BD. بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا عدم وجود ردود الفعل ، توسع الحدقة الثنائية ، وانقطاع النفس بعد التضخم في جميع. وأعقب ضغط الذروة هذا انخفاض سريع في MAP (10 دقائق - 81.2 ± 10 مم زئبق). استمر انخفاض ضغط الدم لمدة 50 دقيقة تقريبا ، وبعد ذلك عادت مستويات MAP إلى قيم قريبة من تلك الموجودة عند خط الأساس (120 دقيقة - 120.7 ± 7.5 مم زئبق) (الشكل 1).
على عكس مجموعة BD ، يرتبط الانخفاض في MAP في مجموعة HS بسحب حصص الدم في أول 10 دقائق من التجربة. تم الحفاظ على صدمة نقص حجم الدم لمدة 360 دقيقة (متوسط الاختلاف في جميع أنحاء البروتوكول 52.3 ± 1.2 مم زئبق). بعد نهاية البروتوكول ، أظهرت مجموعة BD نمط MAP مختلفا بشكل كبير على متابعة 6-h من مجموعة HS (BD: 93.7 ± 4.5 مقابل HS: 52.3 ± 0.5 مم زئبق ؛ p<0.0001 ؛ اختبار الطالب).
الميكانيكا الرئوية
لتقييم المعلمات المرنة والمقاومة للجهاز التنفسي ، تم إجراء تحليل لميكانيكا الرئة للحيوانات المعرضة ل BD و HS. بعد 360 دقيقة من بداية وبعد الحفاظ على انخفاض ضغط الدم ، أظهرت مجموعة HS زيادة في مقاومة أنسجة الرئة (G) (HS: خط الأساس - 0.26 ± 0.02 مقابل النهائي - 0.51 ± 0.05 سم H2O.مل -1 ؛ ع = 0.03 ؛ اتجاهين ANOVA) ، يليه انخفاض امتثال الجهاز التنفسي (Crs) (HS: خط الأساس - 0.64 ± 0.05 مقابل النهائي - 0.23 ± 0.004 سم H2O / مل ؛ p = 0.001 ؛ اتجاهين ANOVA) (الشكل 2 أ ، ب).
وذمة رئوية
في نهاية البروتوكول ، تم جمع الفص الأوسط من الرئة اليمنى لجميع المجموعات ، وتم قياس وزنه لتحليل نسبة الوزن الرطب / الجاف ، والتي تم استخدامها كمؤشر الوذمة الرئوية. تم تقييم الوزن الرطب مباشرة بعد استخراج العضو ، وتم قياس الوزن الجاف بعد 24 ساعة في فرن 80 درجة مئوية. وفقا لهذه النسبة ، أظهرت مجموعة BD (2.32 ± 0.1) وذمة أكبر من HS (1.97 ± 0.03) ومجموعات CD (2.04 ± 0.02) (الشكل 3).
المعلمات الجهازية والأنسجة الالتهابية
في نهاية البروتوكول ، كانت هناك زيادة كبيرة في العدد الإجمالي للكريات البيض الجهازية في المجموعة التي خضعت ل HS (خط الأساس - 13888 ± 887.3 مقابل النهائي - 35263 ± 4076 مم3 ؛ p = 0.0189) ؛ اتجاهين ANOVA) (الشكل 4). أظهرت مجموعة HS أيضا زيادة في عدد كريات الدم البيضاء عند مقارنتها بقيم خط الأساس وفيما يتعلق بمجموعة BD (p = 0.0132).
تم تقييم التهاب الأنسجة عن طريق تحديد علامات الالتهاب في أنسجة الرئة. لهذا الغرض ، تم تجانس عينات خزعة أنسجة الرئة في محلول الفوسفات ثم إرسالها لتحليل تعبير عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) وتعبير إنترلوكين 1 بيتا (IL1-β). كانت مستويات التعبير β IL1 أكبر في مجموعة BD (304.4 ± 91 بيكوغرام/ملغم) ومجموعة HS (327.5 ± 25.2 بيكوغرام/ملغم) منها في مجموعة CD (8 ± 2.3 بيكوغرام/ملغ؛ p=0.004; اتجاه واحد ANOVA) (الشكل 5 ب). كما أظهرت مجموعة HS مستويات أعلى من عامل نخر الورم - α (4.7 ± 0.3 بيكوغرام/ملغ؛ p<0.0001; اتجاه واحد ANOVA) من مجموعة BD (1.3 ± 0.3 بيكوغرام / ملغ) ومجموعة CD (0.4 ± 0.2 بيكوغرام / ملغ) (الشكل 5B).
الشكل 1: المسار الزمني لمتوسط الضغط الشرياني (MAP) في مجموعات الموت الدماغي (BD) والصدمة النزفية (HS). يتم التعبير عن قيم جميع القياسات كوسيلة ± الأخطاء القياسية للوسائل (SEMs). MAP ، يعني الضغط الشرياني. BD ، الموت الدماغي. HS ، صدمة نزفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ميكانيكا الرئة. ميكانيكا الرئة على النحو الذي يحدده (أ) امتثال الجهاز التنفسي و (ب) مقاومة الأنسجة في مجموعة موت الدماغ (BD) ومجموعة الصدمة النزفية (HS). * تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين قيم خط الأساس والقيم النهائية في مجموعة النظام المنسق (p<0.05). يتم التعبير عن قيم جميع القياسات كوسيلة ± الأخطاء المعيارية للوسائل (SEMs) ، وتم استخدام ANOVA ثنائي الاتجاه للمقارنات. Crs ، الامتثال للجهاز التنفسي ؛ G ، مقاومة الأنسجة. BD ، الموت الدماغي. HS ، صدمة نزفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: وذمة الرئة تحددها نسبة الوزن الرطب إلى الجاف في الرئة في مجموعة الموت الدماغي (BD) ومجموعة الصدمة النزفية (HS). يتم التعبير عن قيم جميع القياسات على أنها وسيلة ± الأخطاء القياسية للوسائل (SEMs) ، وتم إجراء مقارنات مع ANOVA . BD ، الموت الدماغي. HS ، صدمة نزفية. CD ، موت الدورة الدموية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مخطط الكريات البيض لمجموعة الصدمة النزفية (HS) ومجموعة الموت الدماغي (BD). * يشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين القيم الأساسية والنهائية في مجموعة النظام المنسق (p<0.05). يتم التعبير عن قيم جميع القياسات كوسائل ± الأخطاء المعيارية للمتوسط (SEMs) ، وتم إجراء مقارنات مع ANOVA . BD ، الموت الدماغي. HS ، صدمة نزفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: كانت الاستجابات الالتهابية المحلية أقل بروزا في مجموعة الموت الدوراني (CD). (أ) تعبير أنسجة الرئة عن IL-1β ؛ ب: تعبير أنسجة الرئة لعامل نخر الورم α. يتم التعبير عن قيم جميع القياسات كوسائل ± الأخطاء المعيارية للمتوسط (SEMs) ، وتم إجراء مقارنات مع ANOVA . BD ، الموت الدماغي. HS ، صدمة نزفية. CD ، موت الدورة الدموية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في السنوات الأخيرة ، أدى العدد المتزايد من تشخيصات الموت الدماغي إلى أن تصبح أكبر مزود للأعضاء والأنسجة المخصصة للزراعة. ومع ذلك ، فقد رافق هذا النمو زيادة لا تصدق في التبرعات بعد موت الدورة الدموية. على الرغم من طبيعتها متعددة العوامل ، فإن معظم الآليات المسببة لأسباب الوفاة تبدأ بعد أو تصاحب الصدمة مع فقدان واسع النطاق لمحتوى الدم 4,18.
في هذا السياق ، تعد النماذج التجريبية للموت الدماغي وتوقف الدورة الدموية والصدمة النزفية أدوات مهمة للدراسة المستقبلية للمضاعفات المرتبطة بسبب وفاة المتبرع وتأثيرها على صلاحية الأعضاء المحتملة المخصصة للزرع6،8،10. تم اقتراح العديد من سلالات لإنشاء نموذج ، مثل الخنازير والأرانب والجرذان والفأر. تعد نماذج الفئران والفأر أكثر شيوعا في الأدبيات لأنها ليست باهظة الثمن وتنطوي على صعوبة لوجستية منخفضة بينما تعيد إنتاج الأحداث الفيزيولوجية المرضية قيد الدراسة8،13،14،15 بشكل مرض.
نود التأكيد على أن الإرشادات والدراسات الحديثة قد أيدت استخدام تسكين ما قبل التخدير كجزء لا يتجزأ من البروتوكولات الجراحية ، حتى في الحالات الحادة ، بهدف إدارة أكثر شمولا للألم المحيط بالجراحة ورفاهية. نوصي الباحثين بتقييم مثل هذا النهج في الدراسات المستقبلية.
الموت الدماغي (BD)
ووجد أن نموذج BD قابل للتكرار عن طريق زيادة مفاجئة في برنامج المقارنات الدولية. يسمح استخدام الأدوات المناسبة والموظفين المدربين بالنجاح الجراحي واستنساخ التقنية مع بضعة أسابيع من التدريب. أثناء تطوير تقنية BD ، يجب إجراء النقب باستخدام مثقاب آلي مناسب حتى لا يكون هناك تراخي في القسطرة ، وبالتالي منع إسقاط أنسجة المخ خارج الحفرة. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء الحفر ، يجب إيقاف الحركة الأمامية للحفر بمجرد التغلب على المقاومة الأولية التي توفرها الجمجمة.
يجب أن يظل الباحثون في حالة تأهب وأن يضمنوا التضخم السريع للقسطرة ، لأن التضخم التدريجي يعزز الاستجابات الالتهابية والدورة الدموية المتميزة21. يجب مراقبة تغيرات ضغط الدم ، بدورها ، باستمرار طوال البروتوكول ، خاصة أثناء نفخ القسطرة ، والذي يجب أن يكون مصحوبا بزيادة مفاجئة في MAP وخلال الساعة الأولى بعد إنشاء BD (فترة انخفاض ضغط الدم بعد التضخم). تتفق هذه النتائج مع الأدبيات ، التي تظهر إنشاء ذروة ارتفاع ضغط الدم مباشرة بعد نفخ القسطرة ، يليها انخفاض في مستويات الضغط ، في استجابة محتملة للزيادة العابرة في مستويات الكاتيكولامين المنتشرة22.
قد يؤدي الحفاظ على في مرض بهجت لفترات طويلة إلى انخفاض ضغط الدم يليه موت الدورة الدموية ، مما يجعل التجربة غير مجدية. وفقا لذلك ، فإن معظم البروتوكولات المستخدمة في الأدبيات تحدد فترة متابعة تتراوح من 4 إلى 6 ساعات ، وبعد ذلك يجب إعطاء الأدوية الفعالة في الأوعية12،13،21،22،23.
بالإضافة إلى التغيرات الديناميكية الدموية ، يعزز الاحتشاء الدماغي ونقص التروية زيادة في الدورة الدموية الجهازية للعوامل الالتهابية ، والتي ، عندما تصل إلى الرئتين ، تساهم في إصابة حمة الرئة24،25،26.
في دراستنا ، كان BD مصحوبا بزيادة كبيرة في تعبير الأنسجة IL-1β (على CD) ونسبة الوزن الرطب / الجاف ، وهو مؤشر للوذمة الرئوية. أشارت الدراسات السابقة إلى زيادة في مستويات تعميم السيتوكينات المسببة للالتهابات بعد حدث BD ، والذي قد يفضل في النهاية تعديل التعبير عن جزيئات الالتصاق ، وزيادة نفاذية الأوعية الدموية ، وما يترتب على ذلك من هجرة الكريات البيض27،28،29،30.
الصدمة النزفية (HS)
تم إنشاء نموذج الضغط الثابت ل HS من خلال سحب أو إعادة ضخ حصص الدم بهدف الحفاظ على انخفاض ضغط الدم لفترة طويلة (≤ 50 مم زئبق) ، ويهدف إلى تقليد الانخفاض في حجم الدم الناجم عن العملية النزفية ، وبالتالي تخفيف ضغط الملء الجهازي. هذه الأحداث تؤدي إلى انخفاض في MAP ، يرافقه انخفاض في ضغط التروية الرئوية31,32.
من بين مزايا نموذج HS هذا إمكانية التحكم في درجة ومدة انخفاض ضغط الدم ، بالإضافة إلى زيادة استنساخ التقنية عند مقارنتها بالنماذج القائمة على حجم الدم المسبوق. وفقا لذلك ، فإن معظم البروتوكولات المستخدمة في الأدبيات تحدد فترة بروتوكول تتراوح من 15 دقيقة إلى أكثر من 180 دقيقة ، مع متوسط مستويات ضغط الدم تتراوح بين 20-55 مم زئبق ، اعتمادا على التحليل المختار في الدراسة 6,32. في الدراسة الحالية ، تم الحفاظ على انخفاض ضغط الدم لمدة 3 ساعات ، مما أدى إلى زيادة مقاومة الأنسجة ، تليها انخفاض امتثال الرئة في الخاضعة ل HS. لتأكيد ذلك ، أشارت دراسات مختلفة في الأدبيات إلى وجود علاقة تناسبية بين الوقت الذي يقضيه في النظام المنسق وتأثيرات نقص حجم الدم على مقاومة مجرى الهواء وامتثال الرئة6،33،34.
بالإضافة إلى ذلك ، في الدراسة الحالية ، كان HS مصحوبا بزيادة كبيرة في عدد الكريات البيضاء وزيادة التعبير النسيجي ل IL-1β (فيما يتعلق ب CD) و TNF-α. إن إصابة بطانة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية ، الناجمة عن إطلاق أنواع الأكسجين التفاعلية من العملية الأولية لنقص الأكسجة ونقص التروية المعمول بها ، ستزيد من نفاذية الأوعية الدموية ، والتي ، إلى جانب زيادة ضغط الشريان الرئوي ، ستكون بمثابة عامل كيميائي للكريات البيض والإفراج اللاحق عن الوسطاء الالتهابيين6،20،31،35،36 ، 37,38.
موت الدورة الدموية (CD)
الفرق الرئيسي بين الطعوم الهامشية الناشئة عن عمليات BD و CD هو وقت نقص التروية الدافئ (WIT) الذي سيخضع له الكسب غير المشروع ، والذي يعرفه بعض الباحثين بأنه الوقت بين غياب النبضات المحيطية وانقطاع تدفق الدم بسبب إزالة معدات دعم الحياة حتى التروية الباردة أو الإقليمية للعضو17 ، 39,40.
في هذه الدراسة ، خضعت أعضاء وأنسجة المشتقة من نموذج CD لفترة ذكاء مدتها 180 دقيقة. كشفت العديد من الدراسات في الأدبيات عن وجود علاقة تناسبية بين WIT والخلل الوظيفي بعد الزرع ، مما يشير إلى أن وقت نقص التروية يجب أن يختلف وفقا لخصائص وسلامة كل عضو. في هذا السياق ، ثبت أن ترقيع الرئة من الفئران يتحمل ما يصل إلى 3 ساعات من نقص التروية الدافئ41,42.
مع وجود دليل على إصابة الأنسجة الناجمة عن المرحلة الودية السائدة ، وعدم استقرار الدورة الدموية ، والالتهاب الجهازي الناتج عن عملية BD ، تم إعادة النظر في التبرعات بعد توقف الدورة الدموية كاستراتيجية محتملة لتقليل المضاعفات المرتبطة بالزرع41،42،43. بهذا المعنى ، تشير بياناتنا إلى انخفاض كبير في مستويات IL-1β و TNF-α في نموذج CD فيما يتعلق بالنموذجين الآخرين الذين تمت دراستهم. وتأكيدا لذلك ، لاحظ Iskender et al.4 انخفاض مستويات السيتوكينات النسيجية في نموذج لإعادة تروية الرئة في الفئران مع الأنسجة المتبرع بها بعد WIT من خلال آليات لا تزال غير مفهومة بشكل جيد.
بناء على ما سبق ، يجب أن يعتمد اختيار المنهجية وتكييفها على الأهداف التي طورها الباحث. بمجرد تحديدها ، يجب أن توجه هذه الأهداف نوع نموذج التبرع ووقت البروتوكول والتحليلات التي يتعين إجراؤها. من الممكن أيضا ربط نوع التبرع بالنماذج الحيوانية لتجديد الرئة وإعادة التروية.
الاستنتاجات
في الختام ، فإن نماذج التبرع بالأعضاء الموصوفة هنا هي أدوات محتملة في دراسة التغييرات المرتبطة بمنهجيات حصاد الكسب غير المشروع المختلفة ويمكن أن توفر وسائل يمكن من خلالها الحصول على فهم كامل لتأثير جودة هذه الأعضاء على نتائج ما بعد الزرع ، بالنظر إلى قابلية استنساخ وموثوقية المنهجيات المعروضة هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
نود أن نؤكد أنه لا يوجد تضارب معروف في المصالح مرتبط بهذا المنشور وأنه لم يكن هناك دعم مالي كبير لهذا العمل يمكن أن يؤثر على نتائجه.
Acknowledgments
نشكر FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Estado de São Paulo) على منح الدعم المالي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge angiocath | DB | 38186714 | Orotracheal intubation |
| 2.0-silk | Brasuture | AA553 | Tracheal tube fixation |
| 24-gauge angiocath | DB | 38181214 | Arterial and venous access |
| 4.0-silk | Brasuture | AA551 | Fixation of arterial and venous cannulas |
| Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%). | Vic Pharma | Y/N | Asepsis |
| Trichotomy apparatus | Oster | Y/N | Clipping device |
| Precision balance | Shimadzu | D314800051 | Analysis of the wet/dry weight ratio |
| Barbiturate (Thiopental) | Cristália | 18080003 | DC induction |
| Balloon catheter (Fogarty-4F) | Edwards Life Since | 120804 | BD induction |
| Neonatal extender | Embramed | 497267 | Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath |
| FlexiVent | Scireq | 1142254 | Analysis of ventilatory parameters |
| Heparin | Blau Farmaceutica SA | 7000982-06 | Anticoagulant |
| Isoflurane | Cristália | 10,29,80,130 | Inhalation anesthesia |
| Micropipette (1000 µL) | Eppendorf | 347765Z | Handling of small- volume liquids |
| Micropipette (20 µL) | Eppendorf | H19385F | Handling of small- volume liquids |
| Microscope | Zeiss | 1601004545 | Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure |
| Multiparameter monitor | Dixtal | 101503775 | MAP registration |
| Motorized drill | Midetronic | MCA0439 | Used to drill a 1 mm caliber borehole |
| Neubauer chamber | Kasvi | D15-BL | Cell count |
| Pediatric laryngoscope | Oxygel | Y/N | Assistance during tracheal intubation |
| Syringe (3 mL) | SR | 3330N4 | Hydration and exsanguination during HS protocol |
| Pressure transducer | Edwards Life Since | P23XL | MAP registration |
| Metallic tracheal tube | Biomedical | 006316/12 | Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator |
| Isoflurane vaporizer | Harvard Bioscience | 1,02,698 | Anesthesia system |
| Mechanical ventilator for small animals (683) | Harvard Apparatus | MA1 55-0000 | Mechanical ventilation |
| xMap methodology | Millipore | RECYTMAG-65K-04 | Analysis of inflammatory markers |
References
- Paterno, F., et al. Clinical implications of donor warm and cold ischemia time in donor after circulatory death liver transplantation. Liver Transplantation. 25 (9), 1342-1352 (2019).
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for heart and lung transplantation: thirty-third adult lung and heart-lung transplant report-2016; focus theme: primary diagnostic indications for transplant. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1170-1184 (2016).
- Jung, H. Y., et al. Comparison of transplant outcomes for low-level and standard-level tacrolimus at different time points after kidney transplantation. Journal of Korean Medical Science. 34 (12), e103 (2019).
- Cypel, M., et al. The International Society for heart and lung transplantation donation after circulatory death registry report. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 34 (10), 1278-1282 (2015).
- Drake, M., Bernard, A., Hessel, E.
- Nepomuceno, N. A., et al. Effect of hypertonic saline in the pretreatment of lung donors with hemorrhagic shock. Journal of Surgical Research. 225, 181-188 (2018).
- Menegat, L., et al. Evidence of bone marrow downregulation in brain-dead rats. International Journal of Experimental Pathology. (3), 158-165 (2017).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. (5), 760-768 (2018).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (10), 2262-2269 (2009).
- Wauters, S., et al. Evaluating lung injury at increasing time intervals in a murine brain death model. Journal of Surgical Research. 183 (1), 419-426 (2013).
- Smith, M. Physiologic changes during brain stem death--lessons for management of the organ donor. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 23 (9), S217-S222 (2004).
- Belhaj, A., et al. Mechanical versus humoral determinants of brain death-induced lung injury. PLoS One. 12 (7), e0181899 (2017).
- Kolkert, J. L., et al. The gradual onset brain death model: a relevant model to study organ donation and its consequences on the outcome after transplantation. Laboratory Animals. 41 (3), 363-371 (2007).
- Rocha-E-Silva, M. Cardiovascular effects of shock and trauma in experimental models: A review. Revista Brasileira de Cirurgia Cardiovascular. 31 (1), 45-51 (2016).
- Manara, A. R., Murphy, P. G., O'Callaghan, G.
- Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. The Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
- Boucek, M. M., et al. Pediatric heart transplantation after declaration of cardiocirculatory death. The New England Journal of Medicine. 359 (7), 709-714 (2008).
- Kramer, A. H., Baht, R., Doig, C. J. Time trends in organ donation after neurologic determination of death: a cohort study. CMAJ Open. 5 (1), E19-E27 (2017).
- Reino, D. C., et al. Trauma hemorrhagic shock-induced lung injury involves a gut-lymph-induced TLR4 pathway in mice. PLoS One. 6 (8), e14829 (2011).
- Pascual, J. L., et al. Hypertonic saline resuscitation of hemorrhagic shock diminishes neutrophil rolling and adherence to endothelium and reduces in vivo vascular leakage. Annals of Surgery. 236 (5), 634-642 (2002).
- Van Zanden, J. E., et al. Rat donor lung quality deteriorates more after fast than slow brain death induction. PLoS One. 15 (11), e0242827 (2020).
- Shivalkar, B., et al. Variable effects of explosive or gradual increase of intracranial pressure on myocardial structure and function. Circulation. 87 (1), 230-239 (1993).
- López-Aguilar, J., et al. Massive brain injury enhances lung damage in an isolated lung model of ventilator-induced lung injury. Critical Care Medicine. 33 (5), 1077-1083 (2005).
- Catania, A., Lonati, C., Sordi, A., Gatti, S. Detrimental consequences of brain injury on peripheral cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 877-884 (2009).
- McKeating, E. G., Andrews, P. J., Mascia, L. Leukocyte adhesion molecule profiles and outcome after traumatic brain injury. Acta Neurochirurgica Supplement. 71, 200-202 (1998).
- Ott, L., McClain, C. J., Gillespie, M., Young, B. Cytokines and metabolic dysfunction after severe head injury. Journal of Neurotrauma. 11 (5), 447-472 (1994).
- Avlonitis, V. S., Wigfield, C. H., Kirby, J. A., Dark, J. H. The hemodynamic mechanisms of lung injury and systemic inflammatory response following brain death in the transplant donor. American Journal of Transplantation. 5 (4), 684-693 (2005).
- De Jesus Correia, C., et al. Hypertonic saline reduces cell infiltration into the lungs after brain death in rats. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 61, 101901 (2020).
- Kalsotra, A., Zhao, J., Anakk, S., Dash, P. K., Strobel, H. W. Brain trauma leads to enhanced lung inflammation and injury: evidence for role of P4504Fs in resolution. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27 (5), 963-974 (2007).
- Simas, R., Zanoni, F. L., Silva, R., Moreira, L. F. P. Brain death effects on lung microvasculature in an experimental model of lung donor. Journal Brasileiro de Pneumologia. 46 (2), e20180299 (2020).
- Moore, K. The physiological response to hemorrhagic shock. Journal of Emergency Nursing. 40 (6), 629-631 (2014).
- Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: a review. European Surgical Research. 50 (2), 57-70 (2013).
- Hillen, G. P., Gaisford, W. D., Jensen, C. G. Pulmonary changes in treated and untreated hemorrhagic shock. I. Early functional and ultrastructural alterations after moderate shock. The American Journal of Surgery. 122 (5), 639-649 (1971).
- Sprung, J., Mackenzie, C. F., Green, M. D., O'Dwyer, J., Barnas, G. M. Chest wall and lung mechanics during acute hemorrhage in anesthetized dogs. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 11 (5), 608-612 (1997).
- Liu, X., et al. Inhibition of BTK protects lungs from trauma-hemorrhagic shock-induced injury in rats. Molecular Medicine Reports. 16 (1), 192-200 (2017).
- Maeshima, K., et al. Prevention of hemorrhagic shock-induced lung injury by heme arginate treatment in rats. Biochemical Pharmacology. 69 (11), 1667-1680 (2005).
- Gao, J., et al. Effects of different resuscitation fluids on acute lung injury in a rat model of uncontrolled hemorrhagic shock and infection. The Journal of Trauma. 67 (6), 1213-1219 (2009).
- Wohlauer, M., et al. Nebulized hypertonic saline attenuates acute lung injury following trauma and hemorrhagic shock via inhibition of matrix metalloproteinase-13. Critical Care Medicine. 40 (9), 2647-2653 (2012).
- Morrissey, P. E., Monaco, A. P. Donation after circulatory death: current practices, ongoing challenges, and potential improvements. Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).
- Snell, G. I., Levvey, B. J., Levin, K., Paraskeva, M., Westall, G. Donation after brain death versus donation after circulatory death: lung donor management issues. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 39 (2), 138-147 (2018).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Yamamoto, S., et al. Activations of mitogen-activated protein kinases and regulation of their downstream molecules after rat lung transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 43 (10), 3628-3633 (2011).
- Kang, C. H., et al. Transcriptional signatures in donor lungs from donation after cardiac death vs after brain death: a functional pathway analysis. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 30 (3), 289-298 (2011).
