Summary
המחקר הנוכחי מראה את הקמתם של שלושה מודלים שונים של תרומת ריאות (תרומה לאחר מוות מוחי, תרומת מוות לאחר מחזור הדם ותרומת הלם לאחר דימומים). הוא משווה את התהליכים הדלקתיים וההפרעות הפתולוגיות הקשורות לאירועים אלה.
Abstract
מודלים ניסיוניים הם כלים חשובים להבנת התופעות האטיולוגיות המעורבות באירועים פתופיזיולוגיים שונים. בהקשר זה, מודלים שונים של בעלי חיים משמשים לחקר האלמנטים המפעילים את הפתופיזיולוגיה של תפקוד לקוי של השתל הראשוני לאחר ההשתלה כדי להעריך טיפולים פוטנציאליים. כיום, אנו יכולים לחלק מודלים ניסיוניים של תרומות לשתי קבוצות גדולות: תרומה לאחר מוות מוחי ותרומה לאחר דום דם. בנוסף, יש לשקול את ההשפעות המזיקות הקשורות להלם דימומי כאשר בוחנים מודלים של בעלי חיים של תרומת איברים. במאמר זה נתאר את הקמתם של שלושה מודלים שונים של תרומת ריאות (תרומת לאחר מוות מוחי, תרומת מוות לאחר מחזור הדם ותרומת הלם לאחר דימומים) ונשווה את התהליכים הדלקתיים וההפרעות הפתולוגיות הקשורות לאירועים אלה. המטרה היא לספק לקהילה המדעית מודלים אמינים של בעלי חיים של תרומת ריאות לחקר המנגנונים הפתולוגיים הקשורים וחיפוש מטרות טיפוליות חדשות כדי לייעל את מספר השתלים ברי קיימא להשתלה.
Introduction
רלוונטיות קלינית
השתלת איברים היא אפשרות טיפולית מבוססת היטב למספר פתולוגיות חמורות. בשנים האחרונות הושגו התקדמויות רבות בתחומים הקליניים והניסיוניים של השתלות איברים, כגון ידע רב יותר על הפתופיזיולוגיה של תפקוד לקוי של השתל הראשוני (PGD) והתקדמות בתחומי טיפול נמרץ, אימונולוגיה ופרמקולוגיה 1,2,3. למרות ההישגים והשיפורים באיכות ההליכים הכירורגיים והפרמקולוגיים הקשורים, הקשר בין מספר האיברים הזמינים למספר המושתלים ברשימת ההמתנה נותר אחד האתגרים העיקריים 2,4. בהקשר זה, הספרות המדעית הציעה מודלים של בעלי חיים לחקר טיפולים שניתן ליישם על תורמי איברים לטיפול ו/או שימור האיברים עד למועד ההשתלה 5,6,7,8.
על ידי חיקוי האירועים השונים שנצפו בפרקטיקה הקלינית, מודלים של בעלי חיים מאפשרים לחקור את המנגנונים הפתולוגיים הקשורים ואת הגישות הטיפוליות שלהם. האינדוקציה הניסיונית של אירועים אלה, ברוב המקרים הבודדים, יצרה מודלים ניסיוניים של תרומת איברים ורקמות הנחקרים באופן נרחב בספרות המדעית על השתלות איברים 6,7,8,9. מחקרים אלה משתמשים באסטרטגיות מתודולוגיות שונות, כגון אלה הגורמות למוות מוחי (BD), הלם דימומי (HS) ומוות במחזור הדם (CD), שכן אירועים אלה קשורים לתהליכים מזיקים שונים המסכנים את הפונקציונליות של האיברים והרקמות שנתרמו.
מוות מוחי (BD)
BD קשורה לסדרה של אירועים המובילים להידרדרות פרוגרסיבית של מערכות שונות. זה קורה בדרך כלל כאשר עלייה חריפה או הדרגתית בלחץ תוך גולגולתי (ICP) קורה עקב טראומה מוחית או דימום. עלייה זו ב- ICP מקדמת עלייה בלחץ הדם בניסיון לשמור על זרימת דם מוחית יציבה בתהליך המכונה רפלקסקושינג 10,11. שינויים חריפים אלה עלולים לגרום להפרעות בתפקוד הלב וכלי הדם, האנדוקריניות והנוירולוגיות הפוגעות בכמות ואיכות האיברים הנתרמים, בנוסף להשפעה על התחלואה והתמותה לאחר ההשתלה 10,11,12,13.
הלם דימומי (HS)
HS, בתורו, קשור לעתים קרובות עם תורמי איברים, שכן רובם קורבנות של טראומה עם אובדן משמעותי של נפח הדם. איברים מסוימים, כגון הריאות והלב, פגיעים במיוחד ל- HS עקב היפובולמיה וכתוצאה מכך היפופרפוזיה של רקמות14. HS גורם לפגיעה ריאתית באמצעות חדירות נימים מוגברת, בצקת וחדירה של תאים דלקתיים, מנגנונים שיחד פוגעים בחילוף הגזים ומובילים להידרדרות מתקדמת של איברים, וכתוצאה מכך משבשים את תהליך התרומה 6,14.
מוות במחזור הדם (CD)
השימוש בתרומת תקליטורים לאחר תרומת תקליטורים גדל באופן אקספוננציאלי במרכזים מרכזיים בעולם, ובכך תורם לגידול במספר האיברים שנאספו. איברים שנמצאו מתורמים לאחר CD פגיעים להשפעות של איסכמיה חמה, המתרחשת לאחר מרווח של אספקת דם נמוכה (שלב אגוני) או ללא אספקת דם (שלב אסיסטולי)8,15. Hypoperfusion או היעדר זרימת הדם יוביל היפוקסיה רקמות הקשורים אובדן פתאומי של ATP הצטברות של רעלים מטבוליים ברקמות15. למרות השימוש הנוכחי בו להשתלה בפרקטיקה הקלינית, נותרו ספקות רבים לגבי השפעת השימוש באיברים אלה על איכות השתל שלאחר ההשתלה ועל הישרדות המטופל15. לפיכך, השימוש במודלים ניסיוניים להבנה טובה יותר של הגורמים האטיולוגיים הקשורים לתקליטור גדל גם הוא 8,15,16,17.
מודלים ניסיוניים
ישנם מודלים ניסיוניים שונים לתרומת איברים (BD, HS ו-CD). עם זאת, מחקרים מתמקדים לעתים קרובות רק באסטרטגיה אחת בכל פעם. קיים פער ניכר במחקרים המשלבים או משווים בין שתי אסטרטגיות או יותר. מודלים אלה שימושיים מאוד בפיתוח טיפולים המבקשים להגדיל את מספר התרומות וכתוצאה מכך להקטין את רשימת ההמתנה של מושתלים פוטנציאליים. מיני בעלי החיים המשמשים למטרה זו משתנים ממחקר למחקר, כאשר מודלים חזיריים נבחרים בדרך כלל כאשר המטרה היא תרגום ישיר יותר עם הפיזיולוגיה של מורפו האנושי ופחות קושי טכני בהליך הכירורגי בשל גודל החיה. למרות היתרונות, קשיים לוגיסטיים ועלויות גבוהות קשורים למודל החזירי. מאידך גיסא, העלות הנמוכה והאפשרות למניפולציה ביולוגית מעדיפים את השימוש במודלים של מכרסמים, המאפשרים לחוקר להתחיל ממודל אמין להתרבות ולטפל בנגעים, כמו גם לשלב את הידע שנרכש בתחום השתלות האיברים.
כאן, אנו מציגים מודל מכרסמים של מוות מוחי, מוות במחזור הדם, ותרומת הלם דימומי. אנו מתארים תהליכים דלקתיים ומצבים פתולוגיים הקשורים לכל אחד מהמודלים הללו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים עמדו בדרישות ועדת האתיקה לשימוש וטיפול בבעלי חיים ניסיוניים של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת סאו פאולו (פרוטוקול מספר 112/16).
1. קיבוץ בעלי חיים
- הקצו באופן אקראי שנים-עשר זכרים של חולדות Sprague Dawley (250-300 גרם) לאחת משלוש קבוצות ניסוי (n=4) כדי לנתח ולהשוות את ההשפעות הקשורות למודלים של בעלי חיים.
- הקצאת בעלי חיים לקבוצת הלם דימומי (HS, n = 4): בעלי חיים הנתונים לצנתור כלי דם עם השראת הלם דימום + תחזוקה למשך 360 דקות + מיצוי בלוק לב-ריאתי + הכנת דגימה לניתוח.
- הקצאת בעלי חיים לקבוצת מוות מוחי (BD, n = 4): בעלי חיים הנתונים למוות מוחי + תחזוקה למשך 360 דקות + מיצוי בלוק לב-ריאתי + הכנת דגימה לניתוח.
- הקצאת בעלי חיים לקבוצת מוות במחזור הדם (CD, n = 4): בעלי חיים הנתונים לצנתור כלי דם + השראת מוות במחזור הדם + השעיית הנשמה + איסכמיה בטמפרטורת החדר למשך 180 דקות + הכנת דגימה לניתוח.
2. הרדמה והכנה טרום ניתוחית
- מניחים את החולדה בתא סגור עם 5% איזופלורן למשך 1 - 4 דקות. ודא הרדמה נכונה על ידי בדיקת רפלקס צביטת הבוהן. בהיעדר תגובות רפלקס (ללא נסיגת כפות), בצע אינטובציה אורוטרכאלית (אנגיוקאת 14-G) בעזרת לרינגוסקופ ילדים.
- באמצעות מכונת הנשמה מכנית שהותאמה בעבר (FiO2 100%, נפח גאות ושפל 10 מ"ל/ק"ג, 90 מחזורים לדקה ו-PEEP 3.0 cmH2O), חברו את קטטר קנה הנשימה למכונת ההנשמה והתאימו את ריכוז חומר ההרדמה ל-2%.
הערה: כל ההליכים הקשורים למודלים של בעלי חיים פעלו לפי אותו פרוטוקול הרדמה המתואר בסעיף זה. - הסר פרווה מאזורי העניין (ראש, צוואר, חזה ובטן). לאחר מכן, באמצעות גזה, לחטא את שדה הניתוח ואת זנב החיה. החיטוי מתבצע עם שלושה סיבובים לסירוגין של פתרון אלכוהולי של פילינג chlorhexidine digluconate.
- חתכו את קצה זנבו של בעל החיים, הניחו את האגודל ואת האצבע המורה על בסיס הזנב, ולאחר מכן לחצו והחליקו אותם הרחק מהבסיס. לאסוף דגימת דם היקפית (20 μL) דרך הזנב עבור ספירת לויקוציטים הכוללת8.
הערה: הליך זה חייב להתבצע לפני תחילת קנה הנשימה ומיד בסוף כל פרוטוקול (BD ו- HS - לאחר 360 דקות). - השתמש פיפטה מדויקת כדי לדלל את הדם שנאסף ב 380 μL (1:20) של תמיסה של טורק (חומצה אצטית קרחונית 99%). לאחר הדילול, הכניסו את דגימת הדם לתא נויבאואר והניחו אותה תחת מיקרוסקופ (40x). בצע את ספירת לויקוציטים הכוללת בארבעת הרבעים הרוחביים של החדר.
3. טרכאוסטומיה
- בעזרת מספריים ומלקחיים מתאימים, לבצע דיסקציה אורכית של קנה הנשימה הצווארי, החל מהשליש האמצעי של הצוואר לחריץ suprasternal (
חתך 1.5 ס"מ). לאחר החתך של העור והרקמה התת עורית, לנתח את שרירי צוואר הרחם עד קנה הנשימה נחשף. - מניחים רצועת משי אחת 2-0 מתחת לקנה הנשימה.
- באמצעות microscissors, tracheostomize את השליש העליון של קנה הנשימה כדי להשיג אוורור אחיד. חותכים אופקית את קנה הנשימה בין שתי טבעות סחוס כדי להתאים לקוטר של צינורית מתכת (3.5 ס"מ).
- הכנס את צינור האוורור ותקן אותו עם ליגטורות מוכנות.
- חבר את צינור האוורור למערכת האוורור של בעלי חיים קטנים.
- אווררו את החולדה עם נפח גאות של 10 מ"ל/ק"ג, קצב של 70 מחזורים לדקה, ו-PEEP של 3 ס"מ ג'2O.
חתך 1.5 ס"מ). לאחר החתך של העור והרקמה התת עורית, לנתח את שרירי צוואר הרחם עד קנה הנשימה נחשף.4. עורק הירך וצנתור ורידים
- חשוף את משולש הירך דרך חתך קטן (1.5 ס"מ) באזור המפשעה. לזהות ולבודד את כלי הירך. עבור הליך זה, השתמש בסטריאומיקרוסקופ (הגדלה פי 3.2).
- הניחו שתי ליגטורות משי 4-0 מתחת לכלי הדם (וריד או עורק), האחת רחוקה והשנייה קרובה. סגור את הליגטורה הדיסטלית ביותר, ולאחר מכן הנח קשר מותאם מראש בליגטורה הפרוקסימלית ומשוך.
- הכנס את הצנתר דרך חתך קטן שנוצר מראש בכלי הדם. קבע את הצינורית כדי למנוע נקע.
הערה: יש להפוך את הצנתרים ממאריך יילודים בקוטר 20 ס"מ המרותך בחימום לצנתר היקפי תוך ורידי המתאים לקליבר הרשת הוורידית של בעל החיים, ובכך למנוע השבה של תכולת הדם. לשמן את הצינורית עם הפרין, הימנעות היווצרות של טרומבי וסיבוכים במהלך מדידת לחץ עורקים ממוצע (MAP). - חבר את צנתר העורק למתמר לחץ ולמערכת ניטור סימנים חיונית כדי לרשום את הלחץ העורקי הממוצע (MAP). המתמר צריך להיות ממוקם בגובה הלב של החיה. הקלט את המפה כל פרק זמן של 10 דקות.
- הכניסו את צנתר המזרק (3 מ"ל) לווריד, במטרה להידרציה ולסגנציה בעת הצורך.
5. אינדוקציה הלם Hemorrhagic
- באמצעות גישה ורידית ועם מזרק heparinized, להסיר כמויות קטנות של דם עד ערכי MAP של 50 מ"מ כספית הם הגיעו, ובכך ליצור הלם דימומי.
הערה: לאסוף aliquot 2 מ"ל של דם כל 10 דקות בשעה הראשונה של הניסוי וכל 30 דקות בשעות שלאחר מכן. - שמור על לחץ יציב על כ 50 מ"מ כספית לתקופה של 360 דקות. לשם כך, להסיר או להוסיף aliquots של דם אם הלחץ עולה או יורד, בהתאמה.
- שים מקור חום בקרבת מקום כדי למנוע היפותרמיה.
הערה: כאן, נעשה שימוש במנורת חום. - בסוף הפרוטוקול, קצרו את הבלוק הריאתי בקיבולת הריאה הכוללת (TLC) והקפיאו בחנקן נוזלי או הניחו אותו בתמיסת קיבוע למחקרים נוספים.
הערה: בעזרת מכונת הנשמה של בעלי חיים קטנים, ניתן לגשת לפרמטרי האוורור במהלך הפרוטוקול. במחקר הנוכחי, פרמטרים אלה הוערכו מיד לפני אינדוקציה HS (בסיסי) ו 360 דקות מאוחר יותר (סופי).
6. זירוז מוות במחזור הדם
- כדי לגרום למוות במחזור הדם, יש לתת 150 מ"ג/ק"ג נתרן תיאופנטל דרך קו הוורידים. לאחר מכן כבה את מערכת האוורור.
- שים לב לירידה ההדרגתית ב- MAP עד שהיא מגיעה ל- 0 מ"מ כספית. מנקודה זו, שקול את תחילת תקופת איסכמיה חמה ולהתחיל את ספירת הזמן. בעל החיים צריך להישאר בטמפרטורת החדר (כ 22 ° C) במשך 180 דקות.
- בסוף הפרוטוקול, חבר מחדש את הריאות למכונת ההנשמה המכנית וקצור את בלוק הריאות ב- TLC לאיסוף. או להקפיא הבזק באמצעות חנקן נוזלי או למקם אותו בתמיסת הקיבוע למחקרים נוספים.
7. השראת מוות מוחי
- הניחו את החולדה במצב נוטה.
- הסר את העור מהגולגולת באמצעות מספריים כירורגיים. קדח קידוח בקוטר 1 מ"מ קדמי בקוטר 2.80 מ"מ וגחוני 10.0 מ"מ לברגמה ו-1.5 מ"מ רוחבי לתפר הסגיטלי.
- הכניסו את כל צנתר הבלון לחלל הגולגולת וודאו שהבלון ממולא מראש במי מלח (500 μL).
- בעזרת מזרק, במהירות לנפח את הצנתר.
- אשרו מוות מוחי על ידי התבוננות בגובה פתאומי של MAP (רפלקס קושינג), היעדר רפלקסים, מידריאזיס דו-צדדי ודום נשימה. לאחר האישור, יש להפסיק את ההרדמה ולהשאיר את בעל החיים על הנשמה מכנית למשך 360 דקות.
- הניחו מקור חום בקרבת מקום כדי למנוע היפותרמיה.
- בסוף הפרוטוקול, קצרו את בלוק הריאתי ב-TLC לאיסוף והקפיאו בחנקן נוזלי או הניחו אותו בתמיסת קיבוע למחקרים נוספים.
הערה: בעזרת מכונת הנשמה של בעלי חיים קטנים, ניתן לגשת לפרמטרי האוורור במהלך הפרוטוקול. במחקר הנוכחי, הערכנו פרמטרים אלה מיד לפני אינדוקציה BD (בסיסי) ולאחר 360 דקות (סופי).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לחץ עורקים ממוצע (MAP)
כדי לקבוע את ההשלכות ההמודינמיות של BD ו- HS, MAP הוערך לאורך 360 הדקות של הפרוטוקול. המדידה הבסיסית נאספה לאחר הסרת עור וקידוח גולגולת ולפני איסוף אליציטוט דם לבעלי חיים הנתונים BD או HS, בהתאמה. לפני השראת BD ו-HS, מפת הבסיס של שתי הקבוצות הייתה דומה (BD: 110.5 ± 6.1 לעומת HS: 105.8 ± 2.3 מ"מ כספית; p=0.5; ANOVA דו-כיוונית). לאחר החדרת קטטר, קבוצת BD חוותה עלייה פתאומית ברמות לחץ הדם (138. 7 ± 10.1 מ"מ כספית). שיא יתר לחץ דם הוא אירוע מוזר הקשור ללחץ תוך גולגולתי מוגבר והוא יכול להיחשב עדות ראשונה להקמת BD. בנוסף, ראינו היעדר רפלקסים, מידריאזיס דו-צדדי ודום נשימה פוסט-ניפוח בכל בעלי החיים. לחץ שיא זה לווה בירידה מהירה ב- MAP (10 דקות - 81.2 ± 10 מ"מ כספית). תת-לחץ דם נמשך כ-50 דקות, ולאחר מכן רמות MAP חזרו לערכים קרובים לאלה שבתחילת המחקר (120 דקות - 120.7 ± 7.5 מ"מ כספית) (איור 1).
שלא כמו בקבוצת BD, הירידה ב- MAP בקבוצת HS קשורה לנסיגה של aliquots בדם ב -10 הדקות הראשונות של הניסוי. הלם היפו-וולמי נשמר במשך 360 דקות (שונות ממוצעת לאורך הפרוטוקול 52.3 ± 1.2 מ"מ כספית). לאחר סיום הפרוטוקול, קבוצת BD הראתה דפוס MAP שונה באופן משמעותי במהלך 6 שעות מעקב מקבוצת HS (BD: 93.7 ± 4.5 לעומת HS: 52.3 ± 0.5 מ"מ כספית; p<0.0001; מבחן התלמיד).
מכניקת ריאות
כדי להעריך את הפרמטרים האלסטיים וההתנגדותיים של מערכת הנשימה, בוצע ניתוח של מכניקת הריאות של בעלי החיים הנתונים ל- BD ו- HS. 360 דקות לאחר ההתחלה ולאחר תחזוקת לחץ דם, קבוצת HS הציגה עמידות מוגברת לרקמת הריאה (G) (HS: קו בסיס - 0.26 ± 0.02 לעומת סופי - 0.51 ± 0.05 ס"מ גובה2O.מ"ל-1; p=0.03; דו-כיווני ANOVA), ואחריו ציות מופחת למערכת הנשימה (Crs) (HS: בסיס - 0.64 ± 0.05 לעומת סופי - 0.23 ± 0.004 ס"מ H2O/mL; p = 0.001; דו-כיווני ANOVA) (איור 2A,B).
בצקת ריאות
בסוף הפרוטוקול נאספה האונה האמצעית של הריאה הימנית לכל הקבוצות, ומשקלה נמדד כדי לנתח את יחס המשקל הרטוב/יבש, ששימש כמדד בצקת ריאות. המשקל הרטוב הוערך מיד לאחר מיצוי האיבר, והמשקל היבש נמדד לאחר 24 שעות בתנור של 80 מעלות צלזיוס. לפי יחס זה, קבוצת BD (2.32 ±-0.1) הראתה בצקת גדולה יותר מאשר קבוצות HS (1.97 ±-0.03) ו-CD (2.04 ±-0.02) (איור 3).
פרמטרים סיסטמיים ודלקתיים רקמתיים
בסוף הפרוטוקול חלה עלייה משמעותית במספר הכולל של לויקוציטים מערכתיים בקבוצה שעברה HS (קו בסיס - 13888 ± 887.3 לעומת סופי - 35263 ± 4076 מ"מ3; p=0.0189); דו-כיווני ANOVA) (איור 4). קבוצת HS הראתה גם עלייה במספר הלויקוציטים הן בהשוואה לערכי הבסיס והן ביחס לקבוצת BD (p = 0.0132).
דלקת רקמות הוערכה על ידי כימות סמנים דלקתיים ברקמת הריאה. לשם כך, דגימות ביופסיה של רקמת הריאה עברו הומוגניות בחיץ פוספט ולאחר מכן נשלחו לניתוח עבור ביטוי גורם נמק הגידול אלפא (TNF-α) ואינטרלוקין 1 בטא (IL1-β). רמות הביטוי IL1-β היו גבוהות יותר בקבוצת BD (304.4 ± 91 pg/mg) ובקבוצת HS (327.5 ± 25.2 pg/mg) מאשר בקבוצת CD (8 ± 2.3 pg/mg; p=0.004; חד-כיווניים ANOVA) (איור 5B). קבוצת HS הראתה גם רמות גבוהות יותר של TNF-α (4.7 ± 0.3 pg/mg; p<0.0001; חד-כיווניים ANOVA) מאשר קבוצת BD (1.3 ± 0.3 pg/mg) וקבוצת CD (0.4 ± 0.2 pg/mg) (איור 5B).
איור 1: מהלך הזמן של לחץ עורקי ממוצע (MAP) בקבוצות של מוות מוחי (BD) והלם דימומי (HS). הערכים עבור כל המדידות מבוטאים כאמצעי ± שגיאות תקן של האמצעים (SEMs). MAP, לחץ עורקי ממוצע; BD, מוות מוחי; HS, הלם דימומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מכניקת ריאות. מכניקת ריאות כפי שנקבעה על ידי (A) תאימות מערכת הנשימה ו (B) עמידות רקמות בקבוצת מוות מוחי (BD) וקבוצת הלם דימומי (HS). * מציין הבדלים משמעותיים בין ערכי הבסיס לערך הסופי בקבוצת HS (p<0.05). הערכים עבור כל המדידות מבוטאים כאמצעי ± שגיאות תקן של האמצעים (SEMs), ו- ANOVA דו-כיווני שימש להשוואות. Crs, ציות של מערכת הנשימה; G, התנגדות רקמות; BD, מוות מוחי; HS, הלם דימומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: בצקת ריאות שנקבעה על-ידי יחס משקל רטוב ליבש של ריאות בקבוצת המוות המוחי (BD) ובקבוצת ההלם הדימומי (HS). הערכים עבור כל המדידות מבוטאים כאמצעי ± שגיאות תקן של האמצעים (SEMs), והשוואות נעשו עם ANOVA חד כיוונית . BD, מוות מוחי; HS, הלם דימומי; CD, מוות במחזור הדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: לוקוגרמה של קבוצת הלם דימומי (HS) ומוות מוחי (BD). * מציין הבדלים משמעותיים בין ערכי הבסיס לערכים הסופיים בקבוצת HS (p<0.05). הערכים עבור כל המדידות מבוטאים כאמצעי ± שגיאות תקן של הממוצע (SEMs), והשוואות נעשו עם ANOVA דו-כיוונית . BD, מוות מוחי; HS, הלם דימומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תגובות דלקתיות מקומיות היו פחות בולטות בקבוצת המוות במחזור הדם (CD). (A) ביטוי רקמת ריאה של IL-1β; (B) ביטוי רקמת ריאה של TNF-α. הערכים עבור כל המדידות מבוטאים כאמצעי ± שגיאות תקן של הממוצע (SEMs), והשוואות נעשו עם ANOVA חד-כיוונית . BD, מוות מוחי; HS, הלם דימומי; CD, מוות במחזור הדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשנים האחרונות, המספר ההולך וגדל של אבחונים של מוות מוחי הוביל אותה להיות הספקית הגדולה ביותר של איברים ורקמות המיועדים להשתלה. צמיחה זו, עם זאת, לוותה בגידול מדהים בתרומות לאחר מוות במחזור. למרות אופיו הרב-גורמי, רוב המנגנונים המפעילים של סיבות המוות מתחילים לאחר טראומה או מלווים אותה עם אובדן נרחב של תכולת דם 4,18.
בהקשר זה, מודלים ניסיוניים של מוות מוחי, דום מחזור הדם והלם דימומי הם כלים חשובים למחקר פרוספקטיבי של סיבוכים הקשורים לסיבת המוות של תורם והשפעתם על הכדאיות של איברים פוטנציאליים המיועדים להשתלה 6,8,10. מספר שושלות של בעלי חיים הוצעו להקמת מודלים, כגון חזירים, ארנבים, חולדות ועכברים. מודלים של חולדות ועכבר נפוצים יותר בספרות מכיוון שהם אינם יקרים במיוחד וכרוכים בקושי לוגיסטי נמוך תוך שחזור משביע רצון של האירועים הפתופיזיולוגיים הנחקרים 8,13,14,15.
ברצוננו להדגיש כי הנחיות ומחקרים עדכניים אישרו את השימוש במשככי כאבים טרום הרדמה כחלק בלתי נפרד מהפרוטוקולים הכירורגיים, גם במצבים אקוטיים, במטרה לנהל באופן מקיף יותר את הכאב ההיקפי ואת רווחת בעלי החיים. אנו ממליצים לחוקרים להעריך גישה כזו במחקרים עתידיים.
מוות מוחי (BD)
מודל BD נמצא ניתן לשחזור באמצעות עלייה פתאומית ב- ICP. השימוש במכשירים מתאימים וכוח אדם מיומן מאפשר הצלחה כירורגית ושכפול של הטכניקה עם כמה שבועות של אימון. במהלך הפיתוח של טכניקת BD, טרפנציה צריכה להתבצע עם מקדח ממונע מתאים, כך שאין רפיון בקטטר, ובכך למנוע הקרנה של רקמת המוח מתוך החור. בנוסף, במהלך הקידוח, יש לעצור את התנועה קדימה של המקדח ברגע שמתגברים על ההתנגדות הראשונית המוצעת על ידי הגולגולת.
על החוקרים להישאר ערניים ולהבטיח ניפוח מהיר של הצנתר, שכן אינפלציה הדרגתית מקדמת תגובות דלקתיות והמודינמיות מובהקות21. שינויים בלחץ הדם, בתורם, צריכים להיות מנוטרים כל הזמן לאורך כל הפרוטוקול, במיוחד במהלך החדרת קטטר, אשר צריך להיות מלווה בעלייה פתאומית ב- MAP ובמהלך השעה הראשונה לאחר הקמת BD (תקופה שלאחר אינפלציה). תוצאות אלה תואמות את הספרות, אשר מראה קביעת שיא יתר לחץ דם מיד לאחר החדרת קטטר, ואחריו ירידה ברמות הלחץ, בתגובה סבירה לעלייה חולפת ברמות קטכולאמיןבמחזור 22.
שמירה על בעל החיים ב-BD לפרקי זמן ממושכים עלולה להוביל ללחץ דם נמוך ואחריו למוות במחזור הדם, מה שהופך את הניסוי לבלתי אפשרי. בהתאם לכך, רוב הפרוטוקולים המשמשים בספרות קובעים תקופת מעקב הנעה בין 4 ל -6 שעות, שלאחריה יש לתת תרופות vasoactive 12,13,21,22,23.
בנוסף לשינויים המודינמיים, אוטם מוחי ואיסכמיה מקדמים עלייה במחזור הדם המערכתי של גורמים פרו-דלקתיים, אשר, כאשר הם מגיעים לריאות, תורמים לפגיעה פרנכימה ריאתית 24,25,26.
במחקר שלנו, BD לווה בעלייה משמעותית בביטוי IL-1β ברקמה (מעל CD) וביחס משקל רטוב/יבש, מדד לבצקת ריאות. מחקרים קודמים הצביעו על עלייה ברמות במחזור הדם של ציטוקינים מעודדי דלקת לאחר אירוע BD, אשר בסופו של דבר עשוי להעדיף את אפנון הביטוי של מולקולות הידבקות, חדירות כלי דם מוגברת, וכתוצאה מכך נדידת לויקוציטים 27,28,29,30.
הלם דימומי (HS)
הוקם באמצעות נסיגה או עירוי של aliquots הדם במטרה תחזוקה לחץ דם ממושך (≤ 50 מ"מ כספית), מודל הלחץ הקבוע של HS שואף לחקות את הירידה בנפח הדם הנגרמת על ידי תהליך hemorrhagic, וכתוצאה מכך, את הנחתת לחץ מילוי מערכתית. אירועים אלה מובילים לירידה ב- MAP, המלווה בירידה בלחץ זילוח ריאתי31,32.
בין היתרונות של מודל HS זה היא האפשרות לשלוט על מידת ומשך לחץ דם, בנוסף ליכולת השחזור הגדולה יותר של הטכניקה בהשוואה למודלים המבוססים על נפח דם קבוע מראש. בהתאם לכך, רוב הפרוטוקולים המשמשים בספרות קובעים תקופת פרוטוקול הנעה בין 15 דקות ליותר מ -180 דקות, עם רמות לחץ דם ממוצעות הנעות בין 20-55 מ"מ כספית, בהתאם לניתוח שנבחר במחקר 6,32. במחקר הנוכחי, לחץ דם נשמר במשך 3 שעות, מה שהוביל להתנגדות מוגברת לרקמות, ואחריה ירידה בציות הריאות בבעלי חיים שנחשפו ל- HS. כדי לאשש זאת, מחקרים שונים בספרות הצביעו על קשר פרופורציונלי בין הזמן המושקע ב- HS לבין ההשפעות של היפובולמיה על התנגדות דרכי הנשימה והיענות לריאות 6,33,34.
בנוסף, במחקר הנוכחי, HS לווה בלויקוציטוזה משמעותית ובביטוי רקמות מוגבר של IL-1β (ביחס ל-CD) ו-TNF-α. פגיעה באנדותל המיקרו-וסקולטורה הריאתי, הנגרמת על ידי שחרור מיני חמצן תגובתי מהתהליך הראשוני של היפוקסיה ואיסכמיה מבוססת, תגביר את חדירות כלי הדם, אשר, יחד עם העלייה בלחץ עורק הריאה, תפעל כגורם כימוטקטי עבור לויקוציטים ושחרור לאחר מכן של מתווכי דלקת 6,20,31,35,36, 37,38.
מוות במחזור הדם (CD)
ההבדל העיקרי בין השתלים השוליים שמקורם בתהליכי BD ו- CD הוא זמן האיסכמיה החם (WIT) אליו יהיה נתון השתל, המוגדר על ידי חוקרים מסוימים כזמן שבין היעדר פולסים היקפיים לבין הפרעה בזרימת הדם עקב הסרת ציוד תומך חיים עד זילוח קר או אזורי של האיבר17, 39,40.
במחקר הנוכחי, האיברים והרקמות של בעלי חיים שנגזרו ממודל CD היו נתונים לתקופת WIT של 180 דקות. מספר מחקרים בספרות חשפו קשר פרופורציונלי בין WIT לבין תפקוד לקוי לאחר השתלה, דבר המצביע על כך שזמן האיסכמיה צריך להשתנות בהתאם למאפיינים ולשלמות של כל איבר. בהקשר זה, השתלות ריאה מחולדות הוכחו כעמידות לתקופות של עד 3 שעות של איסכמיה חמה41,42.
עם עדויות לפגיעה ברקמה הנגרמת על ידי השלב הסימפתטי השולט, חוסר יציבות המודינמית ודלקת מערכתית כתוצאה מתהליך BD, תרומות לאחר מעצר מחזור הדם נשקלו מחדש כאסטרטגיה פוטנציאלית להפחתת סיבוכים הקשורים להשתלה 41,42,43. במובן זה, הנתונים שלנו מצביעים על ירידה דרמטית ברמות IL-1β ו- TNF-α במודל CD ביחס לשני המודלים האחרים שנחקרו. אישוש לכך, Iskender et al.4 ציינו את הרמות הנמוכות של ציטוקינים ברקמה במודל של זילוח ריאות בחולדות עם רקמות שנתרמו לאחר WIT באמצעות מנגנונים שעדיין אינם מובנים היטב.
בהתבסס על האמור לעיל, בחירת המתודולוגיה והתאמותיה צריכה להיות תלויה במטרות שפותחו על ידי החוקר. לאחר שנקבעו, יעדים אלה צריכים להנחות את סוג מודל התרומה, את זמן הפרוטוקול ואת הניתוחים שיש לבצע. ניתן גם לקשר את סוג התרומה עם מודלים בעלי חיים של שיקום ריאות ורפרפוזיה.
מסקנות
לסיכום, המודלים של תורמי איברים המתוארים כאן הם כלים פוטנציאליים בחקר השינויים הקשורים למתודולוגיות שונות של קצירת שתלים ויכולים לספק אמצעים שבאמצעותם ניתן לקבל הבנה מלאה של ההשפעה של איכות איברים אלה על התוצאות לאחר ההשתלה, בהתחשב ביכולת השחזור והאמינות של המתודולוגיות המוצגות כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ברצוננו לאשר כי לא ידוע על ניגודי עניינים הקשורים לפרסום זה וכי לא הייתה תמיכה כספית משמעותית לעבודה זו שהייתה יכולה להשפיע על תוצאותיה.
Acknowledgments
אנו מודים ל- FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) על מתן התמיכה הכספית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge angiocath | DB | 38186714 | Orotracheal intubation |
| 2.0-silk | Brasuture | AA553 | Tracheal tube fixation |
| 24-gauge angiocath | DB | 38181214 | Arterial and venous access |
| 4.0-silk | Brasuture | AA551 | Fixation of arterial and venous cannulas |
| Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%). | Vic Pharma | Y/N | Asepsis |
| Trichotomy apparatus | Oster | Y/N | Clipping device |
| Precision balance | Shimadzu | D314800051 | Analysis of the wet/dry weight ratio |
| Barbiturate (Thiopental) | Cristália | 18080003 | DC induction |
| Balloon catheter (Fogarty-4F) | Edwards Life Since | 120804 | BD induction |
| Neonatal extender | Embramed | 497267 | Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath |
| FlexiVent | Scireq | 1142254 | Analysis of ventilatory parameters |
| Heparin | Blau Farmaceutica SA | 7000982-06 | Anticoagulant |
| Isoflurane | Cristália | 10,29,80,130 | Inhalation anesthesia |
| Micropipette (1000 µL) | Eppendorf | 347765Z | Handling of small- volume liquids |
| Micropipette (20 µL) | Eppendorf | H19385F | Handling of small- volume liquids |
| Microscope | Zeiss | 1601004545 | Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure |
| Multiparameter monitor | Dixtal | 101503775 | MAP registration |
| Motorized drill | Midetronic | MCA0439 | Used to drill a 1 mm caliber borehole |
| Neubauer chamber | Kasvi | D15-BL | Cell count |
| Pediatric laryngoscope | Oxygel | Y/N | Assistance during tracheal intubation |
| Syringe (3 mL) | SR | 3330N4 | Hydration and exsanguination during HS protocol |
| Pressure transducer | Edwards Life Since | P23XL | MAP registration |
| Metallic tracheal tube | Biomedical | 006316/12 | Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator |
| Isoflurane vaporizer | Harvard Bioscience | 1,02,698 | Anesthesia system |
| Mechanical ventilator for small animals (683) | Harvard Apparatus | MA1 55-0000 | Mechanical ventilation |
| xMap methodology | Millipore | RECYTMAG-65K-04 | Analysis of inflammatory markers |
References
- Paterno, F., et al. Clinical implications of donor warm and cold ischemia time in donor after circulatory death liver transplantation. Liver Transplantation. 25 (9), 1342-1352 (2019).
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for heart and lung transplantation: thirty-third adult lung and heart-lung transplant report-2016; focus theme: primary diagnostic indications for transplant. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1170-1184 (2016).
- Jung, H. Y., et al. Comparison of transplant outcomes for low-level and standard-level tacrolimus at different time points after kidney transplantation. Journal of Korean Medical Science. 34 (12), e103 (2019).
- Cypel, M., et al. The International Society for heart and lung transplantation donation after circulatory death registry report. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 34 (10), 1278-1282 (2015).
- Drake, M., Bernard, A., Hessel, E.
- Nepomuceno, N. A., et al. Effect of hypertonic saline in the pretreatment of lung donors with hemorrhagic shock. Journal of Surgical Research. 225, 181-188 (2018).
- Menegat, L., et al. Evidence of bone marrow downregulation in brain-dead rats. International Journal of Experimental Pathology. (3), 158-165 (2017).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. (5), 760-768 (2018).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (10), 2262-2269 (2009).
- Wauters, S., et al. Evaluating lung injury at increasing time intervals in a murine brain death model. Journal of Surgical Research. 183 (1), 419-426 (2013).
- Smith, M. Physiologic changes during brain stem death--lessons for management of the organ donor. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 23 (9), S217-S222 (2004).
- Belhaj, A., et al. Mechanical versus humoral determinants of brain death-induced lung injury. PLoS One. 12 (7), e0181899 (2017).
- Kolkert, J. L., et al. The gradual onset brain death model: a relevant model to study organ donation and its consequences on the outcome after transplantation. Laboratory Animals. 41 (3), 363-371 (2007).
- Rocha-E-Silva, M. Cardiovascular effects of shock and trauma in experimental models: A review. Revista Brasileira de Cirurgia Cardiovascular. 31 (1), 45-51 (2016).
- Manara, A. R., Murphy, P. G., O'Callaghan, G.
- Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. The Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
- Boucek, M. M., et al. Pediatric heart transplantation after declaration of cardiocirculatory death. The New England Journal of Medicine. 359 (7), 709-714 (2008).
- Kramer, A. H., Baht, R., Doig, C. J. Time trends in organ donation after neurologic determination of death: a cohort study. CMAJ Open. 5 (1), E19-E27 (2017).
- Reino, D. C., et al. Trauma hemorrhagic shock-induced lung injury involves a gut-lymph-induced TLR4 pathway in mice. PLoS One. 6 (8), e14829 (2011).
- Pascual, J. L., et al. Hypertonic saline resuscitation of hemorrhagic shock diminishes neutrophil rolling and adherence to endothelium and reduces in vivo vascular leakage. Annals of Surgery. 236 (5), 634-642 (2002).
- Van Zanden, J. E., et al. Rat donor lung quality deteriorates more after fast than slow brain death induction. PLoS One. 15 (11), e0242827 (2020).
- Shivalkar, B., et al. Variable effects of explosive or gradual increase of intracranial pressure on myocardial structure and function. Circulation. 87 (1), 230-239 (1993).
- López-Aguilar, J., et al. Massive brain injury enhances lung damage in an isolated lung model of ventilator-induced lung injury. Critical Care Medicine. 33 (5), 1077-1083 (2005).
- Catania, A., Lonati, C., Sordi, A., Gatti, S. Detrimental consequences of brain injury on peripheral cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 877-884 (2009).
- McKeating, E. G., Andrews, P. J., Mascia, L. Leukocyte adhesion molecule profiles and outcome after traumatic brain injury. Acta Neurochirurgica Supplement. 71, 200-202 (1998).
- Ott, L., McClain, C. J., Gillespie, M., Young, B. Cytokines and metabolic dysfunction after severe head injury. Journal of Neurotrauma. 11 (5), 447-472 (1994).
- Avlonitis, V. S., Wigfield, C. H., Kirby, J. A., Dark, J. H. The hemodynamic mechanisms of lung injury and systemic inflammatory response following brain death in the transplant donor. American Journal of Transplantation. 5 (4), 684-693 (2005).
- De Jesus Correia, C., et al. Hypertonic saline reduces cell infiltration into the lungs after brain death in rats. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 61, 101901 (2020).
- Kalsotra, A., Zhao, J., Anakk, S., Dash, P. K., Strobel, H. W. Brain trauma leads to enhanced lung inflammation and injury: evidence for role of P4504Fs in resolution. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27 (5), 963-974 (2007).
- Simas, R., Zanoni, F. L., Silva, R., Moreira, L. F. P. Brain death effects on lung microvasculature in an experimental model of lung donor. Journal Brasileiro de Pneumologia. 46 (2), e20180299 (2020).
- Moore, K. The physiological response to hemorrhagic shock. Journal of Emergency Nursing. 40 (6), 629-631 (2014).
- Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: a review. European Surgical Research. 50 (2), 57-70 (2013).
- Hillen, G. P., Gaisford, W. D., Jensen, C. G. Pulmonary changes in treated and untreated hemorrhagic shock. I. Early functional and ultrastructural alterations after moderate shock. The American Journal of Surgery. 122 (5), 639-649 (1971).
- Sprung, J., Mackenzie, C. F., Green, M. D., O'Dwyer, J., Barnas, G. M. Chest wall and lung mechanics during acute hemorrhage in anesthetized dogs. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 11 (5), 608-612 (1997).
- Liu, X., et al. Inhibition of BTK protects lungs from trauma-hemorrhagic shock-induced injury in rats. Molecular Medicine Reports. 16 (1), 192-200 (2017).
- Maeshima, K., et al. Prevention of hemorrhagic shock-induced lung injury by heme arginate treatment in rats. Biochemical Pharmacology. 69 (11), 1667-1680 (2005).
- Gao, J., et al. Effects of different resuscitation fluids on acute lung injury in a rat model of uncontrolled hemorrhagic shock and infection. The Journal of Trauma. 67 (6), 1213-1219 (2009).
- Wohlauer, M., et al. Nebulized hypertonic saline attenuates acute lung injury following trauma and hemorrhagic shock via inhibition of matrix metalloproteinase-13. Critical Care Medicine. 40 (9), 2647-2653 (2012).
- Morrissey, P. E., Monaco, A. P. Donation after circulatory death: current practices, ongoing challenges, and potential improvements. Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).
- Snell, G. I., Levvey, B. J., Levin, K., Paraskeva, M., Westall, G. Donation after brain death versus donation after circulatory death: lung donor management issues. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 39 (2), 138-147 (2018).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Yamamoto, S., et al. Activations of mitogen-activated protein kinases and regulation of their downstream molecules after rat lung transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 43 (10), 3628-3633 (2011).
- Kang, C. H., et al. Transcriptional signatures in donor lungs from donation after cardiac death vs after brain death: a functional pathway analysis. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 30 (3), 289-298 (2011).
