Summary
본 연구는 세 가지 다른 폐 기증 모델(뇌사 후 기증, 순환 후 사망 기증, 출혈 후 쇼크 기증)의 확립을 보여줍니다. 이러한 사건과 관련된 염증 과정과 병리학적 장애를 비교합니다.
Abstract
실험 모델은 다양한 병태생리학적 사건과 관련된 병인학적 현상을 이해하는 데 중요한 도구입니다. 이러한 맥락에서 이식 후 원발성 이식편 기능 장애의 병태생리를 유발하는 요소를 연구하여 잠재적인 치료법을 평가하기 위해 다양한 동물 모델을 사용합니다. 현재 우리는 실험적 기증 모델을 크게 뇌사 후 기증과 순환 정지 후 기증의 두 그룹으로 나눌 수 있습니다. 또한, 장기 기증의 동물 모델을 고려할 때 출혈성 쇼크와 관련된 해로운 영향을 고려해야 합니다. 여기서는 세 가지 폐 기증 모델(뇌사 후 기증, 순환 후 사망 기증, 출혈 후 쇼크 기증)의 확립을 설명하고 이러한 사건과 관련된 염증 과정과 병리학적 장애를 비교합니다. 목표는 관련 병리학적 메커니즘을 연구하고 이식을 위한 생존 가능한 이식편 수를 최적화하기 위한 새로운 치료 표적을 찾기 위해 신뢰할 수 있는 폐 기증 동물 모델을 과학계에 제공하는 것입니다.
Introduction
임상적 관련성
장기 이식은 여러 심각한 병리에 대해 잘 확립된 치료 옵션입니다. 최근 몇 년 동안 원발성 이식편 기능 장애(PGD)의 병태생리학에 대한 지식 향상과 집중 치료, 면역학 및 약리학 분야의 발전과 같은 장기 이식의 임상 및 실험 분야에서 많은 발전이 이루어졌습니다 1,2,3. 관련 수술 및 약리학적 시술의 성과와 질적 향상에도 불구하고, 이용 가능한 장기의 수와 대기자 명단에 있는 수혜자 수 사이의 관계는 여전히 주요 과제 중 하나로 남아 있다 2,4. 이와 관련하여, 과학 문헌은 이식 시점까지 장기를 치료 및/또는 보존하기 위해 장기 기증자에게 적용할 수 있는 치료법을 연구하기 위한 동물 모델을 제안했다 5,6,7,8.
임상 실습에서 관찰된 다양한 사건을 모방함으로써 동물 모델은 관련 병리학적 메커니즘과 각각의 치료 접근법을 연구할 수 있습니다. 이러한 사건의 실험적 유도는 대부분의 고립된 사례에서 장기 이식에 관한 과학 문헌에서 널리 조사된 장기 및 조직 기증의 실험 모델을 생성했다 6,7,8,9. 이러한 연구는 뇌사(BD), 출혈성 쇼크(HS) 및 순환사(CD)를 유발하는 것과 같은 다양한 방법론적 전략을 사용하는데, 이는 이러한 사건이 기증된 장기와 조직의 기능을 손상시키는 다양한 유해 과정과 관련이 있기 때문입니다.
뇌사 (BD)
BD는 다른 시스템의 점진적인 악화로 이어지는 일련의 사건과 관련이 있습니다. 일반적으로 뇌 외상이나 출혈로 인해 두개내압(ICP)의 급성 또는 점진적인 증가가 발생할 때 발생합니다. 이러한 ICP의 증가는 쿠싱 반사10,11로 알려진 과정에서 안정적인 대뇌 혈류를 유지하기 위해 혈압 상승을 촉진합니다. 이러한 급격한 변화는 심혈관, 내분비, 신경학적 기능 장애를 일으켜 기증된 장기의 양과 질을 손상시킬 뿐만 아니라 이식 후 이환율과 사망률에 영향을 미칠 수 있다 10,11,12,13.
출혈성 쇼크(HS)
HS는 종종 장기 기증자와 관련이 있는데, 그들 중 대부분은 혈액량이 크게 손실된 외상의 희생자이기 때문입니다. 폐 및 심장과 같은 일부 장기는 저혈량혈증과 그에 따른 조직 저관류로 인해 HS에 특히 취약하다14. HS는 모세혈관 투과성 증가, 부종 및 염증 세포의 침윤을 통해 폐 손상을 유발하며, 이는 함께 가스 교환을 손상시키고 점진적인 장기 악화를 초래하여 결과적으로 기증 과정을 탈선시킵니다 6,14.
순환기 사망(CD)
CD 이후 기증의 사용은 세계 주요 센터에서 기하급수적으로 증가하고 있으며, 이에 따라 수집된 장기의 수가 증가하는 데 기여하고 있습니다. CD 기증 후 장기는 혈액 공급이 적거나(고통 단계) 혈액 공급이 전혀 없는(무수축기) 후에 발생하는 온열 허혈의 영향에 취약합니다8,15. 저관류 또는 혈류의 부재는 ATP의 갑작스런 손실과 조직 내 대사 독소의 축적과 관련된 조직 저산소증을 유발한다15. 현재 임상에서 이식에 사용되고 있음에도 불구하고, 이식 후 이식편의 질과 환자 생존율에 미치는 영향에 대해서는 여전히 많은 의구심이 남아 있다15. 따라서 CD와 관련된 병인학적 요인을 더 잘 이해하기 위한 실험 모델의 사용도 증가하고 있습니다 8,15,16,17.
실험 모델
다양한 실험적 장기 기증 모델(BD, HS, CD)이 있습니다. 그러나 연구는 종종 한 번에 하나의 전략에만 초점을 맞춥니다. 두 가지 이상의 전략을 결합하거나 비교하는 연구에서는 눈에 띄는 격차가 있습니다. 이러한 모델은 기증 횟수를 늘리고 결과적으로 잠재적 수혜자의 대기자 명단을 줄이려는 치료법 개발에 매우 유용합니다. 이 목적으로 사용되는 동물 종은 연구마다 다르며, 돼지 모델은 인간의 형태 생리학을 보다 직접적으로 번역하고 동물의 크기로 인한 수술 절차의 기술적 어려움이 적은 경우에 더 일반적으로 선택됩니다. 이점에도 불구하고 물류상의 어려움과 높은 비용은 돼지 모델과 관련이 있습니다. 반면에 생물학적 조작의 저렴한 비용과 가능성은 설치류 모델의 사용을 선호하여 연구자가 신뢰할 수 있는 모델에서 시작하여 병변을 재현 및 치료하고 장기 이식 분야에서 습득한 지식을 통합할 수 있도록 합니다.
여기에서는 뇌사, 순환사, 출혈성 쇼크 기증의 설치류 모델을 제시합니다. 우리는 이러한 각 모델과 관련된 염증 과정 및 병리학적 상태를 설명합니다.
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Protocol
동물 실험은 상파울루 대학교 의과대학의 실험동물 사용 및 관리 윤리위원회(프로토콜 번호 112/16)를 준수했습니다.
1. 동물 그룹화
- 12마리의 수컷 Sprague Dawley 쥐(250-300g)를 3개의 실험 그룹(n=4) 중 하나에 무작위로 할당하여 동물 모델과 관련된 효과를 분석하고 비교합니다.
- 출혈성 쇼크 그룹(HS, n=4)에 동물 할당: 출혈성 쇼크 유도로 혈관 카테터 삽입 + 360분 유지 + 심폐 차단 추출 + 분석을 위한 샘플 준비를 받은 동물.
- 동물을 뇌사 그룹(BD, n=4)에 할당: 뇌사 + 360분 동안 유지 + 심폐 블록 추출 + 분석을 위한 샘플 준비 대상인 동물.
- 동물을 순환 사망 그룹(CD, n=4)에 할당: 혈관 카테터 삽입 + 순환 사망 유도 + 환기 중단 + 실온에서 180분 동안 허혈 + 분석을 위한 샘플 준비를 받은 동물.
2. 마취 및 수술 전 준비
- 쥐를 5% 이소플루란이 있는 밀폐된 챔버에 1 - 4분 동안 둡니다. 발가락 꼬집기 반사를 확인하여 적절한 마취를 확인합니다. 반사 반응이 없는 경우(발 후퇴 없음) 소아 후두경을 사용하여 구기관 삽관(14-G 혈관 삽관)을 수행합니다.
- 이전에 조정된 기계식 인공호흡기(FiO2 100%, 일회 호흡량 10mL/kg, 90주기/분, PEEP 3.0cmH2O)를 사용하여 기관카테터를 인공호흡기에 연결하고 마취 농도를 2%로 조정합니다.
참고: 동물 모델과 관련된 모든 절차는 이 섹션에 설명된 것과 동일한 마취 프로토콜을 따랐습니다. - 관심 부위(머리, 목, 가슴 및 복부)에서 털을 제거합니다. 그런 다음 거즈를 사용하여 수술 부위와 동물의 꼬리를 소독합니다. 소독은 클로르헥시딘 디글루코네이트 스크럽의 알코올 용액을 3회 번갈아 가며 수행합니다.
- 동물의 꼬리 끝을 자르고 엄지와 검지를 꼬리 밑면에 놓은 다음 눌러서 꼬리에서 밀어냅니다. 총 백혈구 수8을 위해 꼬리를 통해 말초 혈액 샘플(20μL)을 수집합니다.
알림: 이 절차는 기관 절개술을 시작하기 전과 각 프로토콜이 끝날 때 즉시 수행해야 합니다(BD 및 HS - 360분 후). - 정밀 피펫을 사용하여 수집된 혈액을 380μL(1:20)의 Turk's 용액(빙초산 99%)으로 희석합니다. 희석되면 혈액 샘플을 Neubauer 챔버에 피펫팅하고 현미경(40x) 아래에 놓습니다. 챔버의 4개 측면 사분면에서 총 백혈구 수를 수행합니다.
3. 기관절개술
- 적절한 가위와 집게를 사용하여 목의 중간 1/3에서 시작하여 흉골 상부 노치(
1.5cm 절개)까지 경추 기관의 세로 절개를 수행합니다. 피부와 피하 조직을 절개 한 후 기관이 노출 될 때까지 경추 근육을 절개합니다. - 기관 아래에 2-0 실크 합자 하나를 놓습니다.
- 미세 가위를 사용하여 기관의 위쪽 1/3을 기관절개하여 균일한 환기를 달성합니다. 금속 캐뉼라의 직경(3.5cm)을 수용하기 위해 두 개의 연골 고리 사이의 기관을 수평으로 자릅니다.
- 환기 튜브를 삽입하고 준비된 합자로 고정하십시오.
- 환기 튜브를 소동물 환기 시스템에 연결합니다.
- 10mL/kg의 일회 호흡량, 70사이클/분의 속도, 3cmH2O의 PEEP로 쥐를 환기시킵니다.
1.5cm 절개)까지 경추 기관의 세로 절개를 수행합니다. 피부와 피하 조직을 절개 한 후 기관이 노출 될 때까지 경추 근육을 절개합니다.4. 대퇴 동맥 및 정맥 카테터 삽입
- 사타구니 부위의 작은 절개(1.5cm)를 통해 대퇴골 삼각형을 노출시킵니다. 대퇴부 혈관을 식별하고 격리합니다. 이 절차에서는 실체현미경(3.2배 확대)을 사용합니다.
- 혈관(정맥 또는 동맥) 아래에 두 개의 4-0 실크 합자를 하나는 원위에, 다른 하나는 근위부에 배치합니다. 가장 원위 합자를 닫은 다음 미리 조정된 매듭을 근위 합자에 넣고 당깁니다.
- 혈관에 미리 형성된 작은 절개를 통해 카테터를 삽입합니다. 탈구를 방지하기 위해 캐뉼라를 고정하십시오.
알림: 20cm 신생아 익스텐더의 카테터를 동물의 정맥 네트워크 구경에 적합한 주변 정맥 카테터에 가열하여 용접하여 혈액 내용물의 역류를 방지합니다. 캐뉼라에 헤파린을 바르고 평균 동맥압(MAP) 측정 중 혈전 형성 및 합병증을 방지합니다. - 동맥 카테터를 압력 변환기 및 생체 신호 모니터링 시스템에 연결하여 평균 동맥압(MAP)을 기록합니다. 변환기는 동물의 심장 높이에 위치해야 합니다. 10분마다 MAP을 기록합니다.
- 주사기 카테터(3mL)를 정맥에 삽입하고 필요한 경우 수분 공급과 출혈을 목표로 합니다.
5. 출혈성 쇼크 유도
- 정맥 접근을 통해 헤파린화 주사기를 사용하여 MAP 값이 50mmHg에 도달할 때까지 소량의 혈액을 제거하여 출혈성 쇼크를 일으킵니다.
참고: 실험 첫 1시간 동안 10분마다, 이후 몇 시간 동안 30분마다 2mL의 혈액 분취액을 수집합니다. - 50분 동안 약 360mmHg에서 압력을 안정적으로 유지합니다. 이렇게하려면 압력이 각각 증가하거나 감소하는 경우 혈액의 부분 표본을 제거하거나 추가하십시오.
- 저체온증을 피하기 위해 근처에 열원을 두십시오.
알림: 여기서는 열 램프가 사용됩니다. - 프로토콜이 끝나면 총 폐활량(TLC)에서 폐 차단을 채취하고 액체 질소에서 급속 동결하거나 추가 연구를 위해 고정 용액에 넣습니다.
알림: 작은 동물 인공호흡기의 도움으로 프로토콜 중에 인공호흡기 매개변수에 액세스할 수 있습니다. 본 연구에서 이러한 매개변수는 HS 유도 직전(기준선)과 360분 후(최종)에 평가되었습니다.
6. 순환 사망 유도
- 순환계 사멸을 유도하려면 정맥 라인을 통해 150mg/kg의 티오펜탈 나트륨을 투여합니다. 그런 다음 환기 시스템을 끕니다.
- MAP가 0mmHg에 도달할 때까지 점진적으로 감소하는 것을 볼 수 있습니다. 이 시점부터 온열 허혈 기간의 시작을 고려하고 시간 계산을 시작합니다. 동물은 실온(약 22°C)에서 180분 동안 유지되어야 합니다.
- 프로토콜이 끝나면 폐를 기계 인공호흡기에 다시 연결하고 TLC에서 폐 차단을 채취하여 수집합니다. 액체 질소를 사용하여 급속 동결하거나 추가 연구를 위해 고정 용액에 넣으십시오.
7. 뇌사 유도
- 쥐를 엎드린 자세로 놓습니다.
- 수술용 가위를 사용하여 두개골에서 피부를 제거합니다. 1mm 구경 시추공을 브레그마에 전방 2.80mm, 복부 10.0mm, 시상 봉합사에 측면 1.5mm를 뚫습니다.
- 전체 풍선 카테터를 두개강에 삽입하고 풍선에 식염수(500μL)가 미리 채워져 있는지 확인합니다.
- 주사기를 사용하여 카테터를 빠르게 팽창시킵니다.
- 갑작스런 MAP 상승(쿠싱 반사), 반사 부재, 양측 산동증 및 무호흡증을 관찰하여 뇌사를 확인합니다. 확인 후 마취를 중단하고 동물을 360분 동안 기계적 환기 상태로 유지하십시오.
- 저체온증을 피하기 위해 근처에 열원을 두십시오.
- 프로토콜이 끝나면 수집을 위해 TLC에서 폐 블록을 수확하고 액체 질소에서 급속 동결하거나 추가 연구를 위해 고정 용액에 넣습니다.
알림: 작은 동물 인공호흡기의 도움으로 프로토콜 중에 인공호흡기 매개변수에 액세스할 수 있습니다. 본 연구에서는 BD 유도 직전(기준선)과 360분 후(최종)에 이러한 매개변수를 평가했습니다.
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Representative Results
평균 동맥압(MAP)
BD와 HS의 혈역학적 영향을 결정하기 위해 MAP은 프로토콜의 360분 동안 평가되었습니다. 기준선 측정은 피부 제거 및 두개골 드릴링 후 및 BD 또는 HS를 투여한 동물에 대한 혈액 부분 표본 수집 전에 각각 수집되었습니다. BD 및 HS 유도 이전에는 두 그룹의 기준선 MAP이 유사했습니다(BD: 110.5 ± 6.1 vs. HS: 105.8 ± 2.3mmHg; p=0.5; 양방향 ANOVA). 카테터 삽입 후 BD 그룹은 혈압 수치가 급격히 상승했습니다(138.7 ± 10.1mmHg). 고혈압 피크는 두개내압 증가와 관련된 특이한 사건이며 BD의 확립에 대한 첫 번째 증거로 간주될 수 있습니다. 또한, 우리는 모든 동물에서 반사 작용, 양측 근육증 및 팽창 후 무호흡증의 부재를 관찰했습니다. 이 피크 압력 이후 MAP의 급격한 감소가 뒤따랐습니다(10분 - 81.2 ± 10mmHg). 저혈압은 약 50분 동안 지속되었으며, 그 후 MAP 수치는 기준선에 가까운 값(120분 - 120.7 ± 7.5mmHg)으로 돌아왔습니다(그림 1).
BD 그룹과 달리 HS 그룹에서 MAP의 감소는 실험의 처음 10분 동안 혈액 부분 표본의 철수와 관련이 있습니다. 저혈량성 쇼크는 360분 동안 유지되었습니다(프로토콜 전체의 평균 변동 52.3 ± 1.2mmHg). 프로토콜 종료 후, BD 그룹은 HS 그룹과 6시간 추적 관찰에서 유의하게 다른 MAP 패턴을 보였다(BD: 93.7 ± 4.5 vs. HS: 52.3 ± 0.5 mmHg; p<0.0001; Student's t test)를 참조하십시오.
폐 역학
호흡계의 탄성 및 저항성 매개변수를 평가하기 위해, BD 및 HS를 받은 동물의 폐 역학에 대한 분석을 수행하였다. 발병 후 360분 및 저혈압 유지 후 HS 그룹은 폐 조직 저항(G)이 증가했습니다(HS: 기준선 - 0.26 ± 0.02 vs. 최종 - 0.51 ± 0.05 cmH2O.mL-1; 피=0.03; 양방향 ANOVA), 호흡기 순응도 감소(Crs)(HS: 기준선 - 0.64 ± 0.05 vs. 최종 - 0.23 ± 0.004 cmH2O/mL; p=0.001; 양방향 ANOVA)(그림 2A,B).
폐부종
프로토콜 마지막에는 모든 그룹에 대해 우측 폐의 중엽을 채취하고 체중을 측정하여 습식/건식 중량비를 분석하여 폐부종 지수로 사용했습니다. 습윤 중량은 장기 추출 직후에 평가하고, 건조 중량은 80°C 오븐에서 24시간 후에 측정하였다. 이 비율에 따르면, BD 그룹(2.32 ± 0.1)은 HS(1.97 ± 0.03) 및 CD 그룹(2.04 ± 0.02)보다 더 큰 부종을 보였다(그림 3).
전신 및 조직 염증 매개변수
프로토콜이 끝날 무렵, HS를 받은 그룹에서 전신 백혈구의 총 수가 유의하게 증가했습니다(기준선 - 13888 ± 887.3 vs. 최종 - 35263 ± 4076 mm3; p=0.0189). 양방향 ANOVA)를 사용합니다(그림 4). HS 그룹은 또한 기준선과 비교했을 때와 BD 그룹과 관련하여 백혈구 수가 증가한 것으로 나타났습니다(p=0.0132).
조직 염증은 폐 조직의 염증 마커를 정량화하여 평가했습니다. 이를 위해 폐 조직 생검 샘플을 인산염 완충액에서 균질화한 다음 종양괴사인자 알파(TNF-α) 및 인터루킨 1 베타(IL1-β) 발현 분석을 위해 보냈습니다. IL1-β 발현 수준은 CD 그룹(8 ±±± 2.3 pg/mg; p=0.004; 편도 ANOVA)를 사용합니다(그림 5B). HS 그룹은 또한 TNF-α 수치가 더 높았다(4.7 ± 0.3pg/mg; p<0.0001; 편도 ANOVA)가 BD 그룹(1.3 ± 0.3pg/mg) 및 CD 그룹(0.4 ± 0.2pg/mg)보다 더 많이 나타납니다(그림 5B).
그림 1: 뇌사(BD) 및 출혈성 쇼크(HS) 그룹의 평균 동맥압(MAP)의 시간 경과. 모든 측정값의 값은 평균의 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표현됩니다. MAP, 평균 동맥압; BD, 뇌사; HS, 출혈성 쇼크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 폐 역학. 뇌사(BD) 그룹 및 출혈성 쇼크(HS) 그룹의 (A) 호흡기 순응도 및 (B) 조직 저항에 의해 결정되는 폐 역학. *는 HS 그룹의 기준선과 최종 값 간의 유의한 차이를 나타냅니다(p<0.05). 모든 측정값의 값은 평균의 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표현되며 비교를 위해 이원 분산 분석이 사용되었습니다. Crs, 호흡기 계통의 순응도; G, 조직 저항; BD, 뇌사; HS, 출혈성 쇼크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 뇌사(BD) 그룹과 출혈성 쇼크(HS) 그룹의 폐 습식 대 건식 체중 비율로 측정된 폐부종. 모든 측정값의 값은 평균의 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표현되며 일원 분산 분석으로 비교되었습니다. BD, 뇌사; HS, 출혈성 쇼크; CD, 순환기 사망. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 출혈성 쇼크(HS) 그룹 및 뇌사(BD) 그룹의 류코그램. *는 HS 그룹의 기준선과 최종 값 간의 유의한 차이를 나타냅니다(p<0.05). 모든 측정값의 값은 평균의 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표현되며 이원 ANOVA로 비교되었습니다. BD, 뇌사; HS, 출혈성 쇼크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 국소 염증 반응은 순환성 사망(CD) 그룹에서 덜 두드러졌습니다. (A) IL-1β의 폐 조직 발현; (B) TNF-α의 폐 조직 발현. 모든 측정값의 값은 평균의 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표현되며 일원 분산 분석으로 비교되었습니다. BD, 뇌사; HS, 출혈성 쇼크; CD, 순환기 사망. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
최근 몇 년 동안 뇌사 진단의 수가 증가함에 따라 이식을 위한 장기 및 조직의 가장 큰 공급업체가 되었습니다. 그러나 이러한 성장은 순환기 사망 후 기증의 놀라운 증가를 동반했습니다. 다인자적 특성에도 불구하고, 사망 원인의 유발 메커니즘의 대부분은 광범위한 혈액 함량 손실을 동반한 외상 후에 시작되거나 동반된다 4,18.
이러한 맥락에서 뇌사, 순환 정지 및 출혈성 쇼크의 실험 모델은 기증자 사망 원인과 관련된 합병증 및 이식을 위한 잠재적 장기의 생존 가능성에 미치는 영향에 대한 전향적 연구를 위한 중요한 도구입니다 6,8,10. 돼지, 토끼, 쥐 및 쥐와 같은 여러 동물 계통이 모델 설정을 위해 제안되었습니다. 쥐 및 생쥐 모델은 연구 8,13,14,15에 따른 병태생리학적 사건을 만족스럽게 재현하면서 비용이 많이 들지 않고 물류 난이도가 낮기 때문에 문헌에서 더 일반적입니다.
우리는 최근 지침과 연구에서 수술 전후 통증과 동물 복지에 대한 보다 포괄적인 관리를 목표로 급성 상황에서도 수술 프로토콜의 필수적인 부분으로 마취 전 진통제의 사용을 승인했다는 점을 강조하고 싶습니다. 연구자들은 향후 연구에서 이러한 접근 방식을 평가할 것을 권장합니다.
뇌사 (BD)
BD 모델은 ICP의 급격한 증가를 통해 재현 가능한 것으로 밝혀졌습니다. 적절한 기구와 훈련된 인력을 사용하면 몇 주간의 훈련을 통해 수술에 성공하고 기술을 재현할 수 있습니다. BD 기술을 개발하는 동안 카테터가 느슨해지지 않도록 적절한 전동 드릴로 트레파니션을 수행하여 뇌 조직이 구멍 밖으로 튀어나오는 것을 방지해야 합니다. 또한 드릴링 중에는 두개골이 제공하는 초기 저항이 극복되는 즉시 드릴의 전진 이동을 중지해야 합니다.
연구자들은 점진적인 팽창이 뚜렷한 염증 및 혈역학적 반응을 촉진하기 때문에 카테터의 빠른 팽창을 경계하고 보장해야 한다21. 혈압 변화는 프로토콜 전반에 걸쳐 지속적으로 모니터링되어야 하며, 특히 MAP의 급격한 증가와 BD 설정 후 첫 시간(인플레이션 후 저혈압 기간) 동안 카테터 삽입 중에 지속적으로 모니터링해야 합니다. 이러한 결과는 카테터 삽입 직후 고혈압 피크가 발생하고, 이어서 압력 수준이 감소하는 것을 보여주는 문헌과 일치하며, 이는 순환 카테콜아민 수치의 일시적인 증가에 대한 반응일 가능성이 있다22.
동물을 BD에 장기간 보관하면 저혈압 후 순환기 사망으로 이어질 수 있으며, 이는 실험을 불가능하게 만들 수 있습니다. 따라서, 문헌에 사용된 대부분의 프로토콜은 4시간 내지 6시간의 추적 기간을 설정하며, 그 후 혈관 활성 약물을 투여해야 한다 12,13,21,22,23.
혈역학적 변화 외에도 뇌경색과 허혈은 전염증 인자의 전신 순환 증가를 촉진하여 폐에 도달하면 폐 실질 손상에 기여합니다 24,25,26.
본 연구에서 BD는 조직 IL-1β 발현(CD 이상)과 폐부종의 지표인 습식/건식 중량비의 유의한 증가를 동반했습니다. 이전 연구에서는 BD 발생 후 전염증성 사이토카인의 순환 수준이 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 궁극적으로 접착 분자 발현의 조절, 혈관 투과성 증가 및 그에 따른 백혈구 이동에 유리할 수 있습니다 27,28,29,30.
출혈성 쇼크(HS)
장기간의 저혈압 유지(≤ 50mmHg)를 목표로 혈액 부분 표본의 회수 또는 재주입을 통해 확립된 HS의 고정 압력 모델은 출혈 과정으로 인한 혈액량 감소와 결과적으로 전신 충전 압력의 감쇠를 모방하는 것을 목표로 합니다. 이러한 사건은 MAP의 감소를 초래하고 폐 관류 압력의 감소를 동반한다31,32.
이 HS 모델의 장점 중 하나는 저혈압의 정도와 지속 기간을 제어할 수 있을 뿐만 아니라 접두사가 붙은 혈액량을 기반으로 하는 모델과 비교할 때 기술의 재현성이 더 높다는 것입니다. 따라서, 문헌에 사용된 대부분의 프로토콜은 연구 6,32에서 선택한 분석에 따라 평균 혈압 수준이 20-55mmHg 범위인 15분에서 180분 이상까지 다양한 프로토콜 기간을 설정합니다. 본 연구에서는 저혈압이 3시간 동안 유지되어 조직 저항이 증가하고 HS를 투여받은 동물의 폐 순응도가 감소했습니다. 이를 뒷받침하는 문헌의 여러 연구는 HS에서 보낸 시간과 저혈량혈증이 기도 저항 및 폐 순응도에 미치는 영향 사이에 비례 관계가 있음을 보여주었습니다 6,33,34.
또한, 본 연구에서 HS는 상당한 백혈구 증가증과 IL-1β(CD와 관련하여) 및 TNF-α의 조직 발현 증가를 동반했습니다. 저산소증 및 확립된 허혈의 1차 과정에서 활성 산소 종의 방출에 의해 유도된 폐 미세혈관 내피의 손상은 혈관 투과성을 증가시키며, 이는 폐동맥압의 증가와 함께 백혈구에 대한 화학주성 인자로 작용하고 염증 매개체의 후속 방출 6,20,31,35,36, 37,38.
순환기 사망(CD)
BD 및 CD 과정에서 발생하는 가장자리 이식편 간의 주요 차이점은 이식편이 적용되는 온열 허혈 시간(WIT)으로, 일부 연구자들은 장기의 냉기 또는 국소 관류까지 생명 유지 장치의 제거로 인한 말초 맥박의 부재와 혈류 중단 사이의 시간으로 정의한다17, 39,40.
본 연구에서는 CD 모델에서 유래한 동물의 장기와 조직을 180분의 WIT 기간으로 진행하였다. 문헌의 여러 연구에서 WIT와 이식 후 기능 장애 사이의 비례 관계가 밝혀졌으며, 허혈 시간은 각 장기의 특성과 무결성에 따라 달라져야 함을 시사합니다. 이러한 맥락에서, 쥐의 폐 이식편은 최대 3-시간의 온열 허혈을 견디는 것으로 나타났다41,42.
BD 과정으로 인한 우세한 교감신경기, 혈역학적 불안정성 및 전신 염증으로 인한 조직 손상의 증거와 함께, 순환 정지 후 기증은 이식과 관련된 합병증을 줄이기 위한 잠재적 전략으로 재검토되었습니다 41,42,43. 이러한 의미에서, 우리의 데이터는 연구된 다른 두 모델에 비해 CD 모델에서 IL-1β 및 TNF-α 수치가 극적으로 감소했음을 나타냅니다. 이를 뒷받침하기 위해 Iskender et al.4은 아직 잘 이해되지 않은 메커니즘을 통해 WIT 후 조직을 기증한 쥐의 폐 재관류 모델에서 조직 사이토카인 수치가 낮다는 점에 주목했습니다.
위의 내용을 바탕으로 방법론의 선택과 적응은 연구자가 개발한 목표에 따라 달라져야 합니다. 일단 결정되면 이러한 목표는 기부 모델의 유형, 프로토콜 시간 및 수행할 분석을 안내해야 합니다. 기증 유형을 폐 재생 및 재관류의 동물 모델과 연관시키는 것도 가능합니다.
결론
결론적으로, 여기에 설명된 장기 기증자 모델은 다양한 이식편 채취 방법론과 관련된 변화를 연구하는 데 잠재적인 도구이며, 여기에 제시된 방법론의 재현성과 신뢰성을 감안할 때 이식 후 결과에 대한 이러한 장기의 품질이 미치는 영향을 완전히 이해할 수 있는 수단을 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
우리는 이 출판물과 관련하여 알려진 이해 상충이 없으며 결과에 영향을 미칠 수 있는 이 작업에 대한 상당한 재정적 지원이 없었음을 확인하고자 합니다.
Acknowledgments
재정 지원을 해주신 FAPESP(Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge angiocath | DB | 38186714 | Orotracheal intubation |
| 2.0-silk | Brasuture | AA553 | Tracheal tube fixation |
| 24-gauge angiocath | DB | 38181214 | Arterial and venous access |
| 4.0-silk | Brasuture | AA551 | Fixation of arterial and venous cannulas |
| Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%). | Vic Pharma | Y/N | Asepsis |
| Trichotomy apparatus | Oster | Y/N | Clipping device |
| Precision balance | Shimadzu | D314800051 | Analysis of the wet/dry weight ratio |
| Barbiturate (Thiopental) | Cristália | 18080003 | DC induction |
| Balloon catheter (Fogarty-4F) | Edwards Life Since | 120804 | BD induction |
| Neonatal extender | Embramed | 497267 | Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath |
| FlexiVent | Scireq | 1142254 | Analysis of ventilatory parameters |
| Heparin | Blau Farmaceutica SA | 7000982-06 | Anticoagulant |
| Isoflurane | Cristália | 10,29,80,130 | Inhalation anesthesia |
| Micropipette (1000 µL) | Eppendorf | 347765Z | Handling of small- volume liquids |
| Micropipette (20 µL) | Eppendorf | H19385F | Handling of small- volume liquids |
| Microscope | Zeiss | 1601004545 | Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure |
| Multiparameter monitor | Dixtal | 101503775 | MAP registration |
| Motorized drill | Midetronic | MCA0439 | Used to drill a 1 mm caliber borehole |
| Neubauer chamber | Kasvi | D15-BL | Cell count |
| Pediatric laryngoscope | Oxygel | Y/N | Assistance during tracheal intubation |
| Syringe (3 mL) | SR | 3330N4 | Hydration and exsanguination during HS protocol |
| Pressure transducer | Edwards Life Since | P23XL | MAP registration |
| Metallic tracheal tube | Biomedical | 006316/12 | Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator |
| Isoflurane vaporizer | Harvard Bioscience | 1,02,698 | Anesthesia system |
| Mechanical ventilator for small animals (683) | Harvard Apparatus | MA1 55-0000 | Mechanical ventilation |
| xMap methodology | Millipore | RECYTMAG-65K-04 | Analysis of inflammatory markers |
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