Summary
El presente estudio muestra el establecimiento de tres modelos diferentes de donación pulmonar (donación post-muerte encefálica, donación post-muerte circulatoria y donación post-shock hemorrágico). Compara los procesos inflamatorios y los trastornos patológicos asociados a estos eventos.
Abstract
Los modelos experimentales son herramientas importantes para comprender los fenómenos etiológicos implicados en diversos eventos fisiopatológicos. En este contexto, se utilizan diferentes modelos animales para estudiar los elementos desencadenantes de la fisiopatología de la disfunción primaria del injerto después del trasplante para evaluar posibles tratamientos. Actualmente, podemos dividir los modelos experimentales de donación en dos grandes grupos: donación tras muerte encefálica y donación tras parada circulatoria. Además, los efectos nocivos asociados con el shock hemorrágico deben tenerse en cuenta al considerar modelos animales de donación de órganos. En este trabajo se describe el establecimiento de tres modelos diferentes de donación pulmonar (donación post-muerte encefálica, donación post-muerte circulatoria y donación post-shock hemorrágico) y se comparan los procesos inflamatorios y trastornos patológicos asociados a estos eventos. El objetivo es proporcionar a la comunidad científica modelos animales fiables de donación pulmonar para el estudio de los mecanismos patológicos asociados y la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas para optimizar el número de injertos viables para trasplante.
Introduction
Relevancia clínica
El trasplante de órganos es una opción terapéutica bien establecida para varias patologías graves. En los últimos años, se han logrado muchos avances en los campos clínicos y experimentales del trasplante de órganos, como un mayor conocimiento de la fisiopatología de la disfunción primaria del injerto (DGP) y avances en las áreas de cuidados intensivos, inmunología y farmacología 1,2,3. A pesar de los logros y mejoras en la calidad de los procedimientos quirúrgicos y farmacológicos relacionados, la relación entre el número de órganos disponibles y el número de receptores en lista de espera sigue siendo uno de los principales desafíos 2,4. En este sentido, la literatura científica ha propuesto modelos animales para el estudio de terapias que puedan ser aplicadas a donantes de órganos para tratar y/o preservar los órganos hasta el momento del trasplante 5,6,7,8.
Al imitar los diferentes eventos observados en la práctica clínica, los modelos animales permiten el estudio de los mecanismos patológicos asociados y sus respectivos abordajes terapéuticos. La inducción experimental de estos eventos, en la mayoría de los casos aislados, ha generado modelos experimentales de donación de órganos y tejidos que son ampliamente investigados en la literatura científica sobre trasplante de órganos 6,7,8,9. Estos estudios emplean diferentes estrategias metodológicas, como las que inducen la muerte encefálica (TB), el shock hemorrágico (HS) y la muerte circulatoria (EC), ya que estos eventos se asocian a diferentes procesos deletéreos que comprometen la funcionalidad de los órganos y tejidos donados.
Muerte encefálica (BD)
La BD se asocia a una serie de eventos que conducen al deterioro progresivo de diferentes sistemas. Por lo general, ocurre cuando se produce un aumento agudo o gradual de la presión intracraneal (PIC) debido a un traumatismo cerebral o una hemorragia. Este aumento de la PIC promueve un aumento de la presión arterial en un intento de mantener un flujo sanguíneo cerebral estable en un proceso conocido como reflejo de Cushing10,11. Estos cambios agudos pueden resultar en disfunciones cardiovasculares, endocrinas y neurológicas que comprometen la cantidad y calidad de los órganos donados, además de impactar en la morbimortalidad postrasplante 10,11,12,13.
Shock hemorrágico (HS)
La HS, a su vez, a menudo se asocia con donantes de órganos, ya que la mayoría de ellos son víctimas de traumatismos con pérdida significativa de volumen sanguíneo. Algunos órganos, como los pulmones y el corazón, son particularmente vulnerables a la HS debido a la hipovolemia y la consiguiente hipoperfusión tisular14. La HS induce lesión pulmonar a través del aumento de la permeabilidad capilar, edema e infiltración de células inflamatorias, mecanismos que en conjunto comprometen el intercambio gaseoso y conducen al deterioro progresivo de los órganos, descarrilando consecuentemente el proceso de donación 6,14.
Muerte circulatoria (EC)
El uso de la donación post-EC ha ido creciendo exponencialmente en los principales centros del mundo, contribuyendo así al aumento del número de órganos recogidos. Los órganos recuperados de donantes post-EC son vulnerables a los efectos de la isquemia caliente, que ocurre después de un intervalo de baja (fase agónica) o nula irrigación sanguínea (fase asistólica)8,15. La hipoperfusión o ausencia de flujo sanguíneo conducirá a la hipoxia tisular asociada a la pérdida brusca de ATP y a la acumulación de toxinas metabólicas en los tejidos15. A pesar de su uso actual para trasplante en la práctica clínica, persisten muchas dudas sobre el impacto del uso de estos órganos en la calidad del injerto post-trasplante y en la supervivencia del paciente15. Así, el uso de modelos experimentales para una mejor comprensión de los factores etiológicos asociados a la EC también está creciendo 8,15,16,17.
Modelos experimentales
Existen varios modelos experimentales de donación de órganos (BD, HS y CD). Sin embargo, los estudios a menudo se centran en una sola estrategia a la vez. Existe una brecha notable en los estudios que combinan o comparan dos o más estrategias. Estos modelos son muy útiles en el desarrollo de terapias que buscan aumentar el número de donaciones y en consecuencia disminuir la lista de espera de potenciales receptores. Las especies animales utilizadas para este fin varían de un estudio a otro, siendo más comúnmente seleccionados los modelos porcinos cuando el objetivo es una traslación más directa con la morfofisiología humana y una menor dificultad técnica en el procedimiento quirúrgico debido al tamaño del animal. A pesar de los beneficios, las dificultades logísticas y los altos costos están asociados con el modelo porcino. Por otro lado, el bajo coste y la posibilidad de manipulación biológica favorecen el uso de modelos de roedores, permitiendo al investigador partir de un modelo fiable para reproducir y tratar lesiones, así como integrar los conocimientos adquiridos en el campo del trasplante de órganos.
Aquí, presentamos un modelo de roedores de muerte encefálica, muerte circulatoria y donación por shock hemorrágico. Describimos los procesos inflamatorios y las condiciones patológicas asociadas a cada uno de estos modelos.
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Protocol
Los experimentos con animales cumplieron con el Comité de Ética para el Uso y Cuidado de Animales de Experimentación de la Facultad de Medicina de la Universidad de São Paulo (protocolo número 112/16).
1. Agrupación de animales
- Asigne aleatoriamente doce ratas macho Sprague Dawley (250-300 g) a uno de los tres grupos experimentales (n = 4) para analizar y comparar los efectos asociados con los modelos animales.
- Asignar animales al grupo de shock hemorrágico (HS, n=4): animales sometidos a cateterismo vascular con inducción de shock hemorrágico + mantenimiento durante 360 min + extracción de bloqueo cardiopulmonar + preparación de la muestra para análisis.
- Asignar animales al grupo de muerte encefálica (BD, n=4): animales sometidos a muerte encefálica + mantenimiento durante 360 min + extracción de bloqueo cardiopulmonar + preparación de la muestra para análisis.
- Asignar animales al grupo de muerte circulatoria (EC, n=4): animales sometidos a cateterismo vascular + inducción de muerte circulatoria + suspensión de la ventilación + isquemia a temperatura ambiente durante 180 min + preparación de la muestra para análisis.
2. Anestesia y preparación prequirúrgica
- Coloque a la rata en una cámara cerrada con isoflurano al 5% durante 1 a 4 min. Confirme la anestesia adecuada comprobando el reflejo de pellizco del dedo del pie. En ausencia de reacciones reflejas (sin retracción de la pata), realizar la intubación orotraqueal (angiocath 14-G) con la ayuda de un laringoscopio pediátrico.
- Con un ventilador mecánico previamente ajustado (FiO2 100%, volumen corriente 10 mL/kg, 90 ciclos/min y PEEP 3,0 cmH2O), conecte el catéter traqueal al ventilador y ajuste la concentración anestésica al 2%.
NOTA: Todos los procedimientos relacionados con modelos animales siguieron el mismo protocolo anestésico descrito en esta sección. - Retire el pelo de las regiones de interés (cabeza, cuello, pecho y abdomen). Luego, con una gasa, desinfecte el campo quirúrgico y la cola del animal. La desinfección se realiza con tres rondas alternas de una solución alcohólica de exfoliante de digluconato de clorhexidina.
- Corta la punta de la cola del animal, coloca el pulgar y el índice sobre la base de la cola, y luego presiónalos y deslízalos lejos de la base. Recolectar una muestra de sangre periférica (20 μL) a través de la cola para el recuento total de leucocitos8.
NOTA: Este procedimiento debe realizarse antes del inicio de la traqueostomía e inmediatamente al final de cada protocolo (BD y HS - después de 360 min). - Utilice una pipeta de precisión para diluir la sangre recolectada en 380 μL (1:20) de solución de Turk (ácido acético glacial 99%). Una vez diluida, pipetear la muestra de sangre en una cámara de Neubauer y colocarla bajo un microscopio (40x). Realizar el recuento total de leucocitos en los cuatro cuadrantes laterales de la cámara.
3. Traqueostomía
- Con la ayuda de unas tijeras y fórceps adecuados, realice una disección longitudinal de la tráquea cervical, comenzando desde el tercio medio del cuello hasta la muesca supraesteral (
incisión de 1,5 cm). Después de la incisión de la piel y el tejido subcutáneo, diseccionar los músculos cervicales hasta que la tráquea quede expuesta. - Coloque una ligadura de seda 2-0 debajo de la tráquea.
- Con unas microtijeras, traqueostomizar el tercio superior de la tráquea para lograr una ventilación uniforme. Cortar horizontalmente la tráquea entre dos anillos cartilaginosos para acomodar el diámetro de una cánula metálica (3,5 cm).
- Inserte el tubo de ventilación y fíjelo con las ligaduras preparadas.
- Conecte el tubo de ventilación al sistema de ventilación para animales pequeños.
- Ventilar la rata con un volumen corriente de 10 mL/kg, una velocidad de 70 ciclos/min y una PEEP de 3 cmH2O.
incisión de 1,5 cm). Después de la incisión de la piel y el tejido subcutáneo, diseccionar los músculos cervicales hasta que la tráquea quede expuesta.4. Cateterismo de arterias y venas femorales
- Exponga el triángulo femoral a través de una pequeña incisión (1,5 cm) en la región inguinal. Identificar y aislar los vasos femorales. Para este procedimiento, utilice un microscopio estereoscópico (aumento de 3,2x).
- Coloque dos ligaduras de seda 4-0 debajo de los vasos sanguíneos (vena o arteria), una distalmente y la otra proximalmente. Cierre la ligadura más distal, luego coloque un nudo preajustado en la ligadura proximal y tire de ella.
- Inserte el catéter a través de una pequeña incisión preformada en los vasos. Fije la cánula para evitar la luxación.
NOTA: Fabricar los catéteres a partir de un extensor neonatal de 20 cm soldado por calentamiento a un catéter intravenoso periférico adecuado al calibre de la red venosa del animal, evitando así la regurgitación del contenido sanguíneo. Lubricar la cánula con heparina, evitando la formación de trombos y complicaciones durante la medición de la presión arterial media (PAM). - Conecte el catéter arterial a un transductor de presión y a un sistema de monitoreo de signos vitales para registrar la presión arterial media (PAM). El transductor debe colocarse a la altura del corazón del animal. Registre el MAP cada período de 10 minutos.
- Coloque el catéter de jeringa (3 mL) en la vena, con el objetivo de hidratarlo y desangrarlo cuando sea necesario.
5. Inducción de shock hemorrágico
- A través de un acceso venoso y con una jeringa heparinizada, extraer pequeños volúmenes de sangre hasta alcanzar valores de PAM de 50 mmHg, estableciendo así un shock hemorrágico.
NOTA: Recolectar una alícuota de 2 ml de sangre cada 10 min en la primera hora del experimento y cada 30 min en las horas subsiguientes. - Mantenga la presión estable en aproximadamente 50 mmHg durante un período de 360 min. Para ello, retira o añade alícuotas de sangre si la presión aumenta o disminuye, respectivamente.
- Coloque una fuente de calor cerca para evitar la hipotermia.
NOTA: Aquí, se utiliza una lámpara de calor. - Al final del protocolo, recoja el bloqueo pulmonar en la capacidad pulmonar total (TLC) y congélelo rápidamente en nitrógeno líquido o colóquelo en una solución de fijación para estudios adicionales.
NOTA: Con la ayuda de un ventilador para animales pequeños, se puede acceder a los parámetros ventilatorios durante el protocolo. En el presente estudio, estos parámetros se evaluaron inmediatamente antes de la inducción de HS (Línea de base) y 360 min después (Final).
6. Inducción de la muerte circulatoria
- Para inducir la muerte circulatoria, administrar 150 mg/kg de tiopental sódico a través de la vía venosa. A continuación, apague el sistema de ventilación.
- Obsérvese la disminución progresiva de la PAM hasta llegar a 0 mmHg. A partir de este punto, considere el inicio del período de isquemia cálida y comience el conteo de tiempo. El animal debe permanecer a temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C) durante 180 min.
- Al final del protocolo, vuelva a conectar los pulmones al ventilador mecánico y recoja el bloqueo pulmonar en TLC para su recolección. Congele rápidamente con nitrógeno líquido o colóquelo en la solución de fijación para realizar más estudios.
7. Inducción de muerte encefálica
- Coloca a la rata en posición prona.
- Retire la piel del cráneo con unas tijeras quirúrgicas. Perforar un pozo de calibre 1 mm, 2,80 mm anterior y 10,0 mm ventral al bregma y 1,5 mm lateral a la sutura sagital.
- Inserte todo el catéter con balón en la cavidad craneal y asegúrese de que el balón esté precargado con solución salina (500 μL).
- Con la ayuda de una jeringa, infle rápidamente el catéter.
- Confirmar la muerte encefálica mediante la observación de una elevación abrupta de la PAM (reflejo de Cushing), ausencia de reflejos, midriasis bilateral y apnea. Después de la confirmación, suspenda la anestesia y mantenga al animal con ventilación mecánica durante 360 min.
- Coloque una fuente de calor cerca para evitar la hipotermia.
- Al final del protocolo, recoja el bloqueo pulmonar en TLC para su recolección y congélelo rápidamente en nitrógeno líquido o colóquelo en una solución de fijación para estudios adicionales.
NOTA: Con la ayuda de un ventilador para animales pequeños, se puede acceder a los parámetros ventilatorios durante el protocolo. En el presente estudio, evaluamos estos parámetros inmediatamente antes de la inducción de la ME (Inicio) y después de 360 minutos (Final).
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Representative Results
Presión arterial media (PAM)
Para determinar las repercusiones hemodinámicas de BD y HS, se evaluó la PAM a lo largo de los 360 min del protocolo. La medición basal se recogió después de la extracción de la piel y la perforación del cráneo y antes de la recolección de alícuotas de sangre para los animales sometidos a BD o HS, respectivamente. Antes de la inducción de BD y HS, la PAM basal de los dos grupos fue similar (BD: 110,5 ± 6,1 vs. HS: 105,8 ± 2,3 mmHg; p=0,5; ANOVA de dos vías). Después de la insuflación del catéter, el grupo BD experimentó un aumento brusco de los niveles de presión arterial (138,7 ± 10,1 mmHg). El pico hipertensivo es un evento peculiar relacionado con el aumento de la presión intracraneal y puede considerarse la primera evidencia del establecimiento de la EB. Además, observamos la ausencia de reflejos, midriasis bilateral y apnea post-inflado en todos los animales. Esta presión máxima fue seguida por una rápida disminución de la PAM (10 min - 81,2 ± 10 mmHg). La hipotensión persistió durante aproximadamente 50 min, después de lo cual los niveles de PAM volvieron a valores cercanos a los basales (120 min - 120,7 ± 7,5 mmHg) (Figura 1).
A diferencia del grupo BD, la disminución de la PAM en el grupo HS se asocia con la retirada de alícuotas sanguíneas en los primeros 10 minutos del experimento. El shock hipovolémico se mantuvo durante 360 min (variación media a lo largo del protocolo 52,3 ± 1,2 mmHg). Una vez finalizado el protocolo, el grupo BD mostró un patrón de PAM significativamente diferente durante el seguimiento de 6 h con respecto al grupo HS (BD: 93,7 ± 4,5 vs. HS: 52,3 ± 0,5 mmHg; p<0,0001; Prueba t de Student).
Mecánica pulmonar
Para evaluar los parámetros elásticos y resistivos del sistema respiratorio, se realizó un análisis de la mecánica pulmonar de los animales sometidos a BD y HS. 360 min después del inicio y después del mantenimiento de la hipotensión, el grupo HS mostró un aumento de la resistencia del tejido pulmonar (G) (HS: Basal - 0,26 ± 0,02 vs. Final - 0,51 ± 0,05 cmH2O.mL-1; p=0,03; bidireccional ANOVA), seguido de una distensibilidad reducida del sistema respiratorio (Crs) (HS: Basal - 0,64 ± 0,05 vs. Final - 0,23 ± 0,004 cmH2O/mL; p=0,001; bidireccional ANOVA) (Figura 2A,B).
Edema pulmonar
Al final del protocolo, se recolectó el lóbulo medio del pulmón derecho para todos los grupos, y se midió su peso para analizar la relación peso húmedo/seco, que se utilizó como índice de edema pulmonar. El peso húmedo se evaluó inmediatamente después de la extracción del órgano, y el peso seco se midió después de 24 h en un horno a 80 °C. De acuerdo con esta relación, el grupo BD (2,32 ± 0,1) presentó mayor edema que los grupos HS (1,97 ± 0,03) y CD (2,04 ± 0,02) (Figura 3).
Parámetros inflamatorios sistémicos y tisulares
Al final del protocolo, hubo un aumento significativo en el número total de leucocitos sistémicos en el grupo que se sometió a HS (Basal - 13888 ± 887,3 vs. Final - 35263 ± 4076 mm3; p=0,0189); bidireccional ANOVA) (Figura 4). El grupo HS también mostró un aumento en el número de leucocitos tanto en comparación con los valores basales como en relación con el grupo BD (p = 0,0132).
La inflamación tisular se evaluó mediante la cuantificación de marcadores inflamatorios en el tejido pulmonar. Para ello, las muestras de biopsia de tejido pulmonar se homogeneizaron en tampón fosfato y luego se enviaron para su análisis para determinar la expresión del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y la interleucina 1 beta (IL1-β). Los niveles de expresión de IL1-β fueron mayores en el grupo BD (304,4 ± 91 pg/mg) y HS (327,5 ± 25,2 pg/mg) que en el grupo CD (8 ± 2,3 pg/mg; p=0,004; unidireccional ANOVA) (Figura 5B). El grupo HS también mostró niveles más altos de TNF-α (4,7 ± 0,3 pg/mg; p<0,0001; unidireccional ANOVA) que el grupo BD (1,3 ± 0,3 pg/mg) y el grupo CD (0,4 ± 0,2 pg/mg) (Figura 5B).
Figura 1: Evolución temporal de la presión arterial media (PAM) en los grupos de muerte encefálica (BD) y shock hemorrágico (HS). Los valores de todas las mediciones se expresan como las medias ± los errores estándar de las medias (SEM). PAM: presión arterial media; BD: muerte encefálica; HS: shock hemorrágico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mecánica pulmonar. Mecánica pulmonar determinada por (A) la distensibilidad del sistema respiratorio y (B) la resistencia tisular en el grupo de muerte encefálica (BD) y el grupo de shock hemorrágico (HS). * indica diferencias significativas entre los valores basales y finales en el grupo SA (p<0,05). Los valores de todas las mediciones se expresan como medias ± errores estándar de las medias (SEM), y se utilizó ANOVA de dos factores para las comparaciones. Crs, distensibilidad del sistema respiratorio; G: resistencia de los tejidos; BD: muerte encefálica; HS: shock hemorrágico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Edema pulmonar determinado por la relación entre el peso húmedo y seco del pulmón en el grupo de muerte encefálica (BD) y en el grupo de shock hemorrágico (HS). Los valores de todas las mediciones se expresan como medias ± errores estándar de las medias (SEM), y las comparaciones se realizaron con ANOVA de un factor . BD: muerte encefálica; HS: shock hemorrágico; EC: muerte circulatoria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Leucograma del grupo de shock hemorrágico (HS) y del grupo de muerte encefálica (BD). * indica diferencias significativas entre los valores basales y finales en el grupo HS (p<0,05). Los valores de todas las mediciones se expresan como medias ± errores estándar de la media (SEM), y las comparaciones se realizaron con ANOVA de dos vías . BD: muerte encefálica; HS: shock hemorrágico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Las respuestas inflamatorias locales fueron menos prominentes en el grupo de muerte circulatoria (EC). (A) Expresión de IL-1β en el tejido pulmonar; (B) Expresión del tejido pulmonar de TNF-α. Los valores de todas las mediciones se expresan como medias ± errores estándar de la media (SEM), y las comparaciones se realizaron con ANOVA de una vía . BD: muerte encefálica; HS: shock hemorrágico; EC: muerte circulatoria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En los últimos años, el creciente número de diagnósticos de muerte encefálica le ha llevado a convertirse en el mayor proveedor de órganos y tejidos destinados a trasplantes. Este crecimiento, sin embargo, ha ido acompañado de un increíble aumento de las donaciones después de la muerte circulatoria. A pesar de su naturaleza multifactorial, la mayoría de los mecanismos desencadenantes de las causas de muerte comienzan después o acompañan a un traumatismo con una pérdida extensa del contenido sanguíneo 4,18.
En este contexto, los modelos experimentales de muerte encefálica, paro circulatorio y shock hemorrágico son herramientas importantes para el estudio prospectivo de las complicaciones asociadas a la causa de muerte del donante y su impacto en la viabilidad de los potenciales órganos destinados al trasplante 6,8,10. Se han sugerido varios linajes de animales para el establecimiento modelo, como cerdos, conejos, ratas y ratones. Los modelos de rata y ratón son más comunes en la literatura porque no son muy costosos e implican baja dificultad logística, a la vez que reproducen satisfactoriamente los eventos fisiopatológicos estudiados 8,13,14,15.
Cabe destacar que las guías y estudios recientes han avalado el uso de la analgesia preanestésica como parte integral de los protocolos quirúrgicos, incluso en situaciones agudas, con el objetivo de un manejo más integral del dolor perioperatorio y del bienestar animal. Recomendamos que los investigadores evalúen este enfoque en estudios futuros.
Muerte encefálica (BD)
Se encontró que el modelo BD era reproducible por medio de un aumento abrupto de la PIC. El uso de instrumental adecuado y personal capacitado permite el éxito quirúrgico y la reproducción de la técnica con unas pocas semanas de entrenamiento. Durante el desarrollo de la técnica BD, la trepanación debe realizarse con un taladro motorizado adecuado para que no haya holgura en el catéter, evitando así la proyección del tejido cerebral fuera del orificio. Además, durante la perforación, el movimiento hacia adelante del taladro debe detenerse tan pronto como se supere la resistencia inicial ofrecida por el cráneo.
Los investigadores deben permanecer alerta y asegurar un inflado rápido del catéter, ya que el inflado gradual promueve respuestas inflamatorias y hemodinámicas distintas21. Los cambios en la presión arterial, a su vez, deben ser monitoreados constantemente durante todo el protocolo, especialmente durante la insuflación del catéter, que debe ir acompañada de un aumento brusco de la PAM y durante la primera hora después del establecimiento de la ME (período de hipotensión post-inflado). Estos resultados concuerdan con la literatura, que muestra el establecimiento de un pico hipertensivo inmediatamente después de la insuflación del catéter, seguido de una disminución de los niveles de presión, en una probable respuesta al aumento transitorio de los niveles de catecolaminas circulantes22.
Mantener al animal en BD durante períodos prolongados puede provocar hipotensión seguida de muerte circulatoria, lo que hace que el experimento sea inviable. En consecuencia, la mayoría de los protocolos utilizados en la literatura establecen un período de seguimiento que varía de 4 a 6 horas, después del cual se deben administrar fármacos vasoactivos 12,13,21,22,23.
Además de las alteraciones hemodinámicas, el infarto cerebral y la isquemia promueven un aumento de la circulación sistémica de factores proinflamatorios, los cuales, cuando llegan a los pulmones, contribuyen a la lesión del parénquima pulmonar 24,25,26.
En nuestro estudio, la BD se acompañó de un aumento significativo de la expresión tisular de IL-1β (sobre la EC) y de la relación peso húmedo/seco, un índice de edema pulmonar. Estudios previos han indicado un aumento en los niveles circulantes de citoquinas proinflamatorias después de un evento de BD, lo que en última instancia puede favorecer la modulación de la expresión de moléculas de adhesión, el aumento de la permeabilidad vascular y la consecuente migración leucocitaria 27,28,29,30.
Shock hemorrágico (HS)
Establecido a través de la retirada o reinfusión de alícuotas sanguíneas con el objetivo de mantener la hipotensión durante un tiempo prolongado (≤ 50 mmHg), el modelo de presión fija de HS tiene como objetivo imitar la disminución del volumen sanguíneo causada por el proceso hemorrágico y, en consecuencia, la atenuación de la presión sistémica de llenado. Estos eventos conducen a una disminución de la PAM, acompañada de una disminución de la presión de perfusión pulmonar31,32.
Entre las ventajas de este modelo HS se encuentra la posibilidad de controlar el grado y la duración de la hipotensión, además de la mayor reproducibilidad de la técnica en comparación con los modelos basados en un volumen sanguíneo prefijado. En consecuencia, la mayoría de los protocolos utilizados en la literatura establecen un período de protocolo que varía de 15 min a más de 180 min, con niveles medios de presión arterial que oscilan entre 20-55 mmHg, dependiendo del análisis elegido en el estudio 6,32. En el presente estudio, la hipotensión se mantuvo durante 3 horas, lo que condujo a un aumento de la resistencia tisular, seguido de una disminución de la distensibilidad pulmonar en los animales sometidos a HS. Corroborando esto, diferentes estudios en la literatura han indicado una relación proporcional entre el tiempo de permanencia en HS y los impactos de la hipovolemia sobre la resistencia de la vía aérea y la distensibilidad pulmonar 6,33,34.
Además, en el presente estudio, la HS se acompañó de leucocitosis significativa y aumento de la expresión tisular de IL-1β (con respecto a la EC) y TNF-α. La lesión del endotelio de la microvasculatura pulmonar, inducida por la liberación de especies reactivas de oxígeno del proceso primario de hipoxia e isquemia establecida, aumentará la permeabilidad vascular, lo que, junto con el aumento de la presión arterial pulmonar, actuará como factor quimiotáctico para los leucocitos y la posterior liberación de mediadores inflamatorios 6,20,31,35,36, 37,38.
Muerte circulatoria (EC)
La principal diferencia entre los injertos marginales originados en los procesos BD y CD es el tiempo de isquemia caliente (WIT) al que será sometido el injerto, definido por algunos investigadores como el tiempo que transcurre entre la ausencia de pulsos periféricos y la interrupción del flujo sanguíneo debido a la retirada del equipo de soporte vital hasta la perfusión fría o regional del órgano17, 39,40.
En el presente estudio, los órganos y tejidos de animales derivados del modelo CD fueron sometidos a un periodo WIT de 180 min. Varios estudios en la literatura han revelado una relación proporcional entre el WIT y la disfunción postrasplante, sugiriendo que el tiempo de isquemia debe variar de acuerdo con las particularidades e integridad de cada órgano. En este contexto, se ha demostrado que los injertos pulmonares de ratas toleran hasta 3 h períodos de isquemia caliente41,42.
Con evidencia de lesión tisular causada por la fase simpática predominante, inestabilidad hemodinámica e inflamación sistémica resultante del proceso de BD, las donaciones después de la parada circulatoria han sido reconsideradas como una estrategia potencial para disminuir las complicaciones asociadas al trasplante 41,42,43. En este sentido, nuestros datos indican una disminución drástica de los niveles de IL-1β y TNF-α en el modelo de EC con respecto a los otros dos modelos estudiados. Corroborando esto, Iskender et al.4 observaron los bajos niveles de citoquinas tisulares en un modelo de reperfusión pulmonar en ratas con tejidos donados después del WIT a través de mecanismos que aún son poco conocidos.
Con base en lo anterior, la elección de la metodología y sus adaptaciones deben depender de los objetivos desarrollados por el investigador. Una vez determinados, estos objetivos deben guiar el tipo de modelo de donación, el tiempo de protocolo y los análisis a realizar. También es posible relacionar el tipo de donación con modelos animales de reacondicionamiento y reperfusión pulmonar.
Conclusiones
En conclusión, los modelos de donantes de órganos aquí descritos son herramientas potenciales en el estudio de los cambios asociados a diferentes metodologías de extracción de injertos y podrían proporcionar medios para obtener una comprensión completa del impacto de la calidad de estos órganos en los resultados post-trasplante, dada la reproducibilidad y fiabilidad de las metodologías aquí presentadas.
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Disclosures
Deseamos confirmar que no hay conflictos de intereses conocidos asociados con esta publicación y que no ha habido un apoyo financiero significativo para este trabajo que pudiera haber influido en su resultado.
Acknowledgments
Agradecemos a la FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) por otorgar el apoyo financiero.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge angiocath | DB | 38186714 | Orotracheal intubation |
| 2.0-silk | Brasuture | AA553 | Tracheal tube fixation |
| 24-gauge angiocath | DB | 38181214 | Arterial and venous access |
| 4.0-silk | Brasuture | AA551 | Fixation of arterial and venous cannulas |
| Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%). | Vic Pharma | Y/N | Asepsis |
| Trichotomy apparatus | Oster | Y/N | Clipping device |
| Precision balance | Shimadzu | D314800051 | Analysis of the wet/dry weight ratio |
| Barbiturate (Thiopental) | Cristália | 18080003 | DC induction |
| Balloon catheter (Fogarty-4F) | Edwards Life Since | 120804 | BD induction |
| Neonatal extender | Embramed | 497267 | Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath |
| FlexiVent | Scireq | 1142254 | Analysis of ventilatory parameters |
| Heparin | Blau Farmaceutica SA | 7000982-06 | Anticoagulant |
| Isoflurane | Cristália | 10,29,80,130 | Inhalation anesthesia |
| Micropipette (1000 µL) | Eppendorf | 347765Z | Handling of small- volume liquids |
| Micropipette (20 µL) | Eppendorf | H19385F | Handling of small- volume liquids |
| Microscope | Zeiss | 1601004545 | Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure |
| Multiparameter monitor | Dixtal | 101503775 | MAP registration |
| Motorized drill | Midetronic | MCA0439 | Used to drill a 1 mm caliber borehole |
| Neubauer chamber | Kasvi | D15-BL | Cell count |
| Pediatric laryngoscope | Oxygel | Y/N | Assistance during tracheal intubation |
| Syringe (3 mL) | SR | 3330N4 | Hydration and exsanguination during HS protocol |
| Pressure transducer | Edwards Life Since | P23XL | MAP registration |
| Metallic tracheal tube | Biomedical | 006316/12 | Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator |
| Isoflurane vaporizer | Harvard Bioscience | 1,02,698 | Anesthesia system |
| Mechanical ventilator for small animals (683) | Harvard Apparatus | MA1 55-0000 | Mechanical ventilation |
| xMap methodology | Millipore | RECYTMAG-65K-04 | Analysis of inflammatory markers |
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