Summary
本研究显示了三种不同肺捐献模型（脑死亡后捐献、循环后死亡捐献和失血性休克后捐献）的建立。它比较了与这些事件相关的炎症过程和病理疾病。
Abstract
实验模型是了解各种病理生理事件所涉及的病因现象的重要工具。在这种情况下，使用不同的动物模型来研究触发移植后原发性移植物功能障碍病理生理学的因素，以评估潜在的治疗方法。目前，我们可以将实验性捐赠模型分为两大类：脑死亡后的捐赠和循环停止后的捐赠。此外，在考虑器官捐献的动物模型时，应考虑与失血性休克相关的有害影响。在这里，我们描述了三种不同肺捐献模型（脑死亡后捐献、循环后死亡捐献和失血性休克捐献）的建立，并比较了与这些事件相关的炎症过程和病理疾病。目的是为科学界提供可靠的肺捐献动物模型，以研究相关的病理机制并寻找新的治疗靶点，以优化移植的可行移植物数量。
Introduction
临床相关性
器官移植是治疗多种严重疾病的成熟治疗选择。近年来，器官移植的临床和实验领域取得了许多进展，例如对原发性移植物功能障碍 （PGD） 的病理生理学有了更多的了解，并在重症监护、免疫学和药理学领域取得了进展 1,2,3。尽管相关外科和药物治疗程序的质量取得了成就和改进，但可用器官数量与等待名单上的接受者数量之间的关系仍然是主要挑战之一2,4。在这方面，科学文献提出了用于研究可用于器官捐献者的疗法的动物模型，以治疗和/或保存器官直到移植时 5,6,7,8。
通过模拟临床实践中观察到的不同事件，动物模型可以研究相关的病理机制及其各自的治疗方法。在大多数孤立的情况下，这些事件的实验诱导产生了器官和组织捐献的实验模型，这些模型在器官移植的科学文献中被广泛研究 6,7,8,9。这些研究采用了不同的方法学策略，例如诱导脑死亡 （BD）、失血性休克 （HS） 和循环死亡 （CD） 的方法学策略，因为这些事件与损害捐赠器官和组织功能的不同有害过程有关。
脑死亡 （BD）
BD与一系列事件有关，这些事件导致不同系统的逐渐恶化。它通常发生在由于脑外伤或出血导致颅内压 （ICP） 急性或逐渐升高时。颅内压的这种增加促进了血压的升高，试图在称为库欣反射10,11 的过程中维持稳定的脑血流。这些急性变化可导致心血管、内分泌和神经功能障碍，从而损害捐献器官的数量和质量，此外还会影响移植后的发病率和死亡率 10,11,12,13。
失血性休克 （HS）
反过来，HS 通常与器官捐献者有关，因为他们中的大多数是血容量严重损失的创伤受害者。一些器官，如肺和心脏，由于血容量不足和随之而来的组织灌注不足，特别容易受到 HS 的影响14。HS 通过增加毛细血管通透性、水肿和炎症细胞浸润诱发肺损伤，这些机制共同损害气体交换并导致器官进行性恶化，从而破坏捐赠过程 6,14。
循环死亡 （CD）
在世界主要中心，CD后捐献的使用呈指数级增长，从而促进了收集器官数量的增加。从CD捐献者身上恢复的器官容易受到温缺血的影响，温缺血发生在低血（激动期）或无血液供应（收缩期）的间隔后8,15。灌注不足或血流不足将导致与ATP突然丢失和组织中代谢毒素积累相关的组织缺氧15。尽管目前在临床实践中将其用于移植，但对于使用这些器官对移植后移植物质量和患者生存的影响仍然存在许多疑问15。因此，使用实验模型来更好地了解与CD相关的病因也在增长8,15,16,17。
实验模型
有各种实验性器官捐献模型（BD、HS 和 CD）。然而，研究通常一次只关注一种策略。在结合或比较两种或多种策略的研究中存在明显差距。这些模型在开发旨在增加捐赠数量从而减少潜在接受者的等待名单的疗法方面非常有用。用于此目的的动物种类因研究而异，当目标是更直接地翻译人类形态生理学并且由于动物的大小而在外科手术中减少技术难度时，更常选择猪模型。尽管有好处，但物流困难和高成本与猪模型有关。另一方面，生物操作的低成本和可能性有利于使用啮齿动物模型，使研究人员能够从可靠的模型开始复制和治疗病变，并整合在器官移植领域获得的知识。
在这里，我们提出了一个脑死亡、循环死亡和失血性休克捐献的啮齿动物模型。我们描述了与这些模型相关的炎症过程和病理状况。
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Protocol
动物实验符合圣保罗大学医学院实验动物使用和护理伦理委员会（协议编号 112/16）。
1. 动物分组
- 将12只雄性 Sprague Dawley 大鼠（250-300g）随机分配到三个实验组（n = 4）之一，以分析和比较与动物模型相关的效果。
- 将动物分配到失血性休克组（HS，n = 4）：动物接受血管导管插入术，诱导失血性休克+维持360分钟+心肺阻滞提取+样品制备分析。
- 将动物归入脑死亡组（BD，n=4）：动物脑死亡+维持360分钟+心肺阻滞提取+样品制备分析。
- 将动物分配到循环死亡组（CD，n = 4）：接受血管导管插入术+诱导循环死亡+暂停通气+室温缺血180分钟+样品制备分析的动物。
2.麻醉和术前准备
- 将大鼠置于含有5%异氟烷的密闭室中1-4分钟。通过检查脚趾捏反射来确认正确的麻醉。在没有反射反应（无爪缩回）的情况下，在小儿喉镜的帮助下进行经口气管插管（14-G血管管）。
- 使用先前调整的机械呼吸机（FiO2 100%，潮气量 10 mL/kg，90 个周期/分钟，PEEP 3.0 cmH2O），将气管导管连接到呼吸机，并将麻醉剂浓度调节至 2%。
注意：与动物模型相关的所有程序都遵循本节中描述的相同麻醉方案。 - 从感兴趣的区域（头部、颈部、胸部和腹部）去除毛皮。然后，使用纱布对手术区域和动物的尾巴进行消毒。用三轮交替的二葡萄糖酸氯己定酒精溶液擦洗进行消毒。
- 切开动物尾巴的尖端，将拇指和食指放在尾巴的底部，然后按压并将它们从底部滑开。通过尾部收集外周血样本 （20 μL） 以获得总白细胞计数8。
注意：此程序必须在气管切开术开始之前执行，并在每个方案结束时立即执行（BD和HS - 360分钟后）。 - 使用精密移液管将收集的血液稀释在380μL（1：20）Turk溶液（冰川乙酸99%）中。稀释后，将血液样本移液到Neubauer室中，并将其置于显微镜（40x）下。在腔室的四个外侧象限中进行总白细胞计数。
3. 气管切开术
- 在适当的剪刀和镊子的帮助下，从颈部的中间三分之一到胸骨上切迹（
1.5厘米切口）对颈部气管进行纵向解剖。切开皮肤和皮下组织后，解剖颈部肌肉，直到气管暴露。 - 在气管下方放置一个 2-0 的丝结扎线。
- 使用显微剪刀，气管切开气管的上三分之一，以实现均匀通气。在两个软骨环之间水平切割气管，以适应金属套管的直径（3.5 厘米）。
- 插入通气管并用准备好的结扎线固定。
- 将通风管连接到小动物通风系统。
- 用10mL / kg的潮气量，70个循环/ min的速率和3cmH2O的PEEP给大鼠通风。
1.5厘米切口）对颈部气管进行纵向解剖。切开皮肤和皮下组织后，解剖颈部肌肉，直到气管暴露。4.股动脉和静脉导管插入术
- 通过腹股沟区域的小切口（1.5 cm）暴露股骨三角。识别并隔离股血管。对于此过程，请使用体视显微镜（3.2 倍放大倍率）。
- 在血管（静脉或动脉）下方放置两个 4-0 丝结扎线，一个在远端，另一个在近端。闭合最远端的结扎，然后在近端结扎处打一个预先调整的结并拉动。
- 通过血管中预先形成的小切口插入导管。固定套管以避免脱位。
注意：使导管从加热焊接的 20 厘米新生儿延长器到适合动物静脉网络口径的外周静脉导管，从而防止血液内容物反流。用肝素润滑套管，避免在平均动脉压 （MAP） 测量期间形成血栓和并发症。 - 将动脉导管连接到压力传感器和生命体征监测系统，以记录平均动脉压 （MAP）。换能器应放置在动物心脏的水平。每 10 分钟记录一次 MAP。
- 将注射器导管 （3 mL） 放入静脉中，必要时进行补液和放血。
5.失血性休克诱导
- 通过静脉通路和肝素化注射器，抽取少量血液，直到 MAP 值 达到 50 mmHg，从而建立失血性休克。
注意：在实验的第一个小时内每 10 分钟收集一次 2 mL 等分试样，随后每 30 分钟收集一次。 - 将压力稳定在约50mmHg360分钟。为此，如果压力分别增加或减少，请分别取出或添加等分试样的血液。
- 在附近放置热源以避免体温过低。
注意： 这里使用加热灯。 - 在方案结束时，以总肺活量 （TLC） 收获肺阻滞，并在液氮中快速冷冻或将其置于固定溶液中以进行进一步研究。
注意：在小动物呼吸机的帮助下，可以在方案期间访问通气参数。在本研究中，这些参数在 HS 诱导前（基线）和 360 分钟后（最终）进行了评估。
6.循环死亡诱导
- 为了诱导循环死亡，通过静脉管路给予 150 mg/kg 硫喷妥钠。然后关闭通风系统。
- 注意 MAP 逐渐降低，直到达到 0 mmHg。从这一点开始，考虑温暖缺血期的开始并开始时间计数。动物应在室温（约22°C）下保持180分钟。
- 在方案结束时，将肺部重新连接到机械呼吸机，并在 TLC 收集肺阻滞以进行收集。使用液氮快速冷冻或将其放入固定溶液中以进行进一步研究。
7.脑死亡诱导
- 将老鼠置于俯卧位。
- 使用手术剪刀从颅骨上取下皮肤。钻一个 1 毫米口径的钻孔，前方 2.80 毫米，前方 10.0 毫米，矢状缝线外侧 1.5 毫米。
- 将整个球囊导管插入颅腔，并确保球囊预先充满生理盐水（500μL）。
- 在注射器的帮助下，迅速给导管充气。
- 通过观察 MAP 突然升高（库欣反射）、反射消失、双侧瞳孔散大和呼吸暂停来确认脑死亡。确认后，停止麻醉并使动物保持机械通气360分钟。
- 在附近放置一个热源以避免体温过低。
- 在方案结束时，在TLC收集肺阻滞进行收集，并在液氮中快速冷冻或将其置于固定溶液中以进行进一步研究。
注意：在小动物呼吸机的帮助下，可以在方案期间访问通气参数。在本研究中，我们在 BD 诱导前（基线）和 360 分钟后（最终）评估了这些参数。
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Representative Results
平均动脉压 （MAP）
为了确定 BD 和 HS 的血流动力学影响，在方案的 360 分钟内评估了 MAP。基线测量值分别在皮肤去除和颅骨钻孔后以及分别对接受 BD 或 HS 的动物的血液等分试样采集之前收集。在BD和HS诱导之前，两组的基线MAP相似（BD：110.5±6.1vs.HS：105.8±2.3mmHg;p=0.5;双因素方差分析）。导管吹气后，BD组的血压水平突然升高（138.7±10.1mmHg）。高血压峰值是与颅内压升高相关的特殊事件，可被认为是BD建立的第一个证据。此外，我们观察到所有动物均无反射、双侧瞳孔散大和充气后呼吸暂停。在此峰值压力之后，MAP迅速降低（10分钟 - 81.2±10mmHg）。低血压持续约50分钟，之后MAP水平恢复到接近基线水平（120分钟-120.7±7.5mmHg）的值（图1）。
与BD组不同，HS组MAP的降低与实验前10分钟内血分试样的退出有关。低血容量性休克维持 360 分钟（整个方案的平均变异为 52.3 ± 1.2 mmHg）。方案结束后，BD组在6小时的随访中显示出与HS组显著不同的MAP模式（BD：93.7±4.5vs.HS：52.3±0.5mmHg;p<0.0001;学生 的 t 测试）。
肺力学
为了评估呼吸系统的弹性和电阻参数，对经受BD和HS的动物的肺力学进行了分析。发病后 360 分钟和低血压维持后，HS 组表现出肺组织阻力 （G） 增加（HS：基线 - 0.26 ± 0.02 vs. 最终 - 0.51 ± 0.05 cmH2O。毫升-1;p=0.03;双向的方差分析），然后是呼吸系统顺应性 （Crs） 降低（HS：基线 - 0.64 ± 0.05 vs. 最终 - 0.23 ± 0.004 cmH2O/mL;p=0.001;双向的方差分析）（图2A，B）。
肺水肿
在方案结束时，收集所有组的右肺中叶，测量其重量以分析干湿体重比，用作肺水肿指数。提取器官后立即评估湿重，并在80°C烘箱中24小时后测量干重。根据这个比例，BD组（2.32±0.1）比HS（1.97±0.03）和CD组（2.04±0.02）表现出更大的水肿（图3）。
全身和组织炎症参数
在方案结束时，接受HS的组中系统性白细胞总数显着增加（基线-13888±887.3vs.最终-35263±4076mm3;p=0.0189）; 双向的 方差分析）（图4）。与基线值相比，HS组的白细胞数量也与BD组有关（p = 0.0132）。
通过量化肺组织中的炎症标志物来评估组织炎症。为此，将肺组织活检样本在磷酸盐缓冲液中匀浆，然后送去分析肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL1-β）表达。BD组（304.4±91 pg/mg）和HS组（327.5 ± 25.2 pg/mg）的IL1-β表达水平高于CD组（8 ± 2.3 pg/mg;p=0.004; 单向 方差分析）（图5B）。HS组的TNF-α水平也较高（4.7±0.3pg/mg;p<0.0001; 单向 方差分析）优于BD组（1.3±0.3pg / mg）和CD组（0.4±0.2pg / mg）（图5B）。
图 1：脑死亡 （BD） 和失血性休克 （HS） 组的平均动脉压 （MAP） 的时程。 所有测量值均值±均值标准误差表示为 SEM。MAP， 平均动脉压;BD，脑死亡;HS，失血性休克。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：肺力学。 脑死亡 （BD） 组和失血性休克 （HS） 组的肺力学由 （A） 呼吸系统顺应性和 （B） 组织抵抗决定。* 表示 HS 组的基线值和最终值之间存在显着差异 （p<0.05）。所有测量值均表示为均值±均值标准误差（SEM），并使用 双因素 方差分析进行比较。Crs，呼吸系统的顺应性;G， 组织抗性;BD，脑死亡;HS，失血性休克。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：脑死亡 （BD） 组和失血性休克 （HS） 组由肺干湿体重比确定的肺水肿。 所有测量值均表示为均值±均值标准误差 （SEM），并与 单因素 方差分析进行比较。BD，脑死亡;HS， 失血性休克;CD，循环死亡。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：失血性休克（HS）组和脑死亡（BD）组的白细胞图。 *表示HS组基线值和终值之间存在显著差异（p<0.05）。所有测量值均表示为均值±均值标准误差 （SEM），并与 双因素 方差分析进行比较。BD，脑死亡;HS，失血性休克。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：循环死亡（CD）组的局部炎症反应不太明显。 （A）肺组织中IL-1β的表达;（B）肺组织中TNF-α的表达。所有测量值均表示为均值±均值标准误差（SEMs），并与 单因素 方差分析进行比较。BD，脑死亡;HS， 失血性休克;CD，循环死亡。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
近年来，脑死亡诊断数量的增加导致它成为用于移植的器官和组织的最大提供者。然而，这种增长伴随着循环死亡后捐赠的惊人增长。尽管具有多因素性质，但大多数死亡原因的触发机制始于或伴随大量血源流失的创伤之后4,18。
在这种情况下，脑死亡、循环停止和失血性休克的实验模型是前瞻性研究与供体死亡原因相关的并发症及其对移植潜在器官活力的影响的重要工具6,8,10。已经提出了几种动物谱系用于模型建立，例如猪、兔、大鼠和小鼠。大鼠和小鼠模型在文献中更为常见，因为它们不是很昂贵，并且涉及低逻辑难度，同时令人满意地再现了研究中的病理生理事件 8,13,14,15。
我们想强调的是，最近的指南和研究已经认可使用麻醉前镇痛作为手术方案的一个组成部分，即使在急性情况下也是如此，旨在更全面地管理围手术期疼痛和动物健康。我们建议研究人员在未来的研究中评估这种方法。
脑死亡 （BD）
BD模型被发现可以通过ICP的突然增加来重现。使用适当的器械和训练有素的人员，只需几周的培训即可成功并复制该技术。在BD技术的发展过程中，应使用适当的电动钻头进行钻孔，以使导管没有松弛，从而防止脑组织从孔中伸出。此外，在钻孔过程中，一旦克服了头骨提供的初始阻力，就应停止钻头的向前运动。
研究人员应保持警惕并确保导管快速充气，因为逐渐充气会促进明显的炎症和血流动力学反应21。反过来，应在整个方案中持续监测血压变化，尤其是在导管吹气期间，应伴有 MAP 的突然增加和 BD 建立后的第一个小时（充气后低血压期）。这些结果与文献一致，文献显示导管吹气后立即建立高血压峰值，随后压力水平降低，这可能是对循环儿茶酚胺水平短暂增加的反应22。
将动物长时间维持在BD中可能导致低血压，然后循环死亡，使实验不可行。因此，文献中使用的大多数方案都建立了一个随访期，随访期从4小时到6小时不等，之后必须给予血管活性药物12,13,21,22,23。
除了血流动力学变化外，脑梗塞和缺血还促进促炎因子的体循环增加，当它们到达肺部时，导致肺实质损伤24,25,26。
在我们的研究中，BD 伴随着组织 IL-1β 表达（超过 CD）和干湿体重比（肺水肿指标）的显着增加。先前的研究表明，BD 事件后促炎细胞因子的循环水平增加，这最终可能有利于调节粘附分子的表达，增加血管通透性，以及随之而来的白细胞迁移 27,28,29,30。
失血性休克 （HS）
HS 的固定压力模型通过抽血或回输血样建立，目的是延长低血压维持 （≤ 50 mmHg），旨在模拟出血过程引起的血容量减少，从而减弱全身充盈压力。这些事件导致MAP降低，伴随着肺灌注压31,32的降低。
与基于前缀血容量的模型相比，该 HS 模型的优点之一是可以控制低血压的程度和持续时间，此外该技术具有更大的可重复性。因此，文献中使用的大多数方案都建立了一个从 15 分钟到超过 180 分钟不等的方案周期，平均血压水平范围为 20-55 mmHg，具体取决于研究中选择的分析 6,32。在本研究中，低血压维持 3 小时，导致组织抵抗增加，随后接受 HS 的动物的肺顺应性降低。为了证实这一点，文献中的不同研究表明，在 HS 中花费的时间与低血容量对气道阻力和肺部顺应性的影响之间存在成比例关系 6,33,34。
此外，在本研究中，HS 伴有显着的白细胞增多和 IL-1β（相对于 CD）和 TNF-α 的组织表达增加。由缺氧和已建立的缺血过程释放活性氧引起的肺微血管系统内皮损伤将增加血管通透性，这与肺动脉压力的增加一起，将作为白细胞的趋化因子和随后炎症介质的释放6,20,31,35,36，37,38.
循环死亡 （CD）
源自 BD 和 CD 过程的边缘移植物之间的主要区别在于移植物将经历的温缺血时间 （WIT），一些研究人员将其定义为从没有外周脉冲到由于移除生命支持设备直到器官冷灌注或区域灌注而导致血流中断之间的时间17，39,40.
在本研究中，对来自CD模型的动物器官和组织进行了180 min的WIT周期。文献中的几项研究表明，WIT 与移植后功能障碍之间存在比例关系，这表明缺血时间应根据每个器官的特殊性和完整性而变化。在这种情况下，大鼠的肺移植物已被证明可以耐受长达 3 小时的热缺血期 41,42。
有证据表明，主要交感神经期、血流动力学不稳定和 BD 过程导致全身炎症导致组织损伤，循环停滞后捐献已被重新考虑作为减少移植相关并发症的潜在策略 41,42,43。从这个意义上说，我们的数据表明，相对于所研究的其他两种模型，CD模型中的IL-1β和TNF-α水平急剧下降。为了证实这一点，Iskender 等人 4 指出，在 WIT 后捐献组织的大鼠肺再灌注模型中，组织细胞因子水平较低，但机制仍然知之甚少。
综上所述，方法的选择及其调整应取决于研究人员制定的目标。一旦确定，这些目标应指导捐赠模型的类型、方案时间和要执行的分析。也可以将捐赠类型与肺修复和再灌注的动物模型联系起来。
结论
总之，这里描述的器官供体模型是研究与不同移植物采集方法相关的变化的潜在工具，并且可以提供充分了解这些器官质量对移植后结果的影响的方法，鉴于这里介绍的方法的可重复性和可靠性。
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Disclosures
我们希望确认，与本出版物没有已知的利益冲突，并且这项工作没有可能影响其结果的重大财政支持。
Acknowledgments
我们感谢FAPESP（Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo）提供财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge angiocath | DB | 38186714 | Orotracheal intubation |
| 2.0-silk | Brasuture | AA553 | Tracheal tube fixation |
| 24-gauge angiocath | DB | 38181214 | Arterial and venous access |
| 4.0-silk | Brasuture | AA551 | Fixation of arterial and venous cannulas |
| Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%). | Vic Pharma | Y/N | Asepsis |
| Trichotomy apparatus | Oster | Y/N | Clipping device |
| Precision balance | Shimadzu | D314800051 | Analysis of the wet/dry weight ratio |
| Barbiturate (Thiopental) | Cristália | 18080003 | DC induction |
| Balloon catheter (Fogarty-4F) | Edwards Life Since | 120804 | BD induction |
| Neonatal extender | Embramed | 497267 | Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath |
| FlexiVent | Scireq | 1142254 | Analysis of ventilatory parameters |
| Heparin | Blau Farmaceutica SA | 7000982-06 | Anticoagulant |
| Isoflurane | Cristália | 10,29,80,130 | Inhalation anesthesia |
| Micropipette (1000 µL) | Eppendorf | 347765Z | Handling of small- volume liquids |
| Micropipette (20 µL) | Eppendorf | H19385F | Handling of small- volume liquids |
| Microscope | Zeiss | 1601004545 | Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure |
| Multiparameter monitor | Dixtal | 101503775 | MAP registration |
| Motorized drill | Midetronic | MCA0439 | Used to drill a 1 mm caliber borehole |
| Neubauer chamber | Kasvi | D15-BL | Cell count |
| Pediatric laryngoscope | Oxygel | Y/N | Assistance during tracheal intubation |
| Syringe (3 mL) | SR | 3330N4 | Hydration and exsanguination during HS protocol |
| Pressure transducer | Edwards Life Since | P23XL | MAP registration |
| Metallic tracheal tube | Biomedical | 006316/12 | Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator |
| Isoflurane vaporizer | Harvard Bioscience | 1,02,698 | Anesthesia system |
| Mechanical ventilator for small animals (683) | Harvard Apparatus | MA1 55-0000 | Mechanical ventilation |
| xMap methodology | Millipore | RECYTMAG-65K-04 | Analysis of inflammatory markers |
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