Summary
Denne studien viser etableringen av tre forskjellige lungedonasjonsmodeller (donasjon etter hjernedød, dødsdonasjon etter sirkulasjon og posthemoragisk sjokkdonasjon). Det sammenligner de inflammatoriske prosessene og patologiske forstyrrelsene forbundet med disse hendelsene.
Abstract
Eksperimentelle modeller er viktige verktøy for å forstå de etiologiske fenomenene som er involvert i ulike patofysiologiske hendelser. I denne sammenheng brukes forskjellige dyremodeller for å studere elementene som utløser patofysiologien til primær transplantatdysfunksjon etter transplantasjon for å evaluere potensielle behandlinger. I dag kan vi dele eksperimentelle donasjonsmodeller inn i to store grupper: donasjon etter hjernedød og donasjon etter sirkulasjonsstans. I tillegg bør de skadelige effektene forbundet med hemorragisk sjokk vurderes når man vurderer dyremodeller for organdonasjon. Her beskriver vi etableringen av tre forskjellige lungedonasjonsmodeller (post-brain death donation, post-circulatory death donation, og post-hemorragic shock donation) og sammenligner inflammatoriske prosesser og patologiske lidelser forbundet med disse hendelsene. Målet er å gi det vitenskapelige samfunnet pålitelige dyremodeller for lungedonasjon for å studere de tilknyttede patologiske mekanismene og søke etter nye terapeutiske mål for å optimalisere antall levedyktige transplantater for transplantasjon.
Introduction
Klinisk relevans
Organtransplantasjon er et veletablert terapeutisk alternativ for flere alvorlige patologier. I de senere år har mange fremskritt blitt oppnådd i de kliniske og eksperimentelle feltene organtransplantasjon, for eksempel større kunnskap om patofysiologien ved primær transplantatdysfunksjon (PGD) og fremskritt innen intensivbehandling, immunologi og farmakologi 1,2,3. Til tross for prestasjoner og forbedringer i kvaliteten på de relaterte kirurgiske og farmakologiske prosedyrene, er forholdet mellom antall tilgjengelige organer og antall mottakere på venteliste fortsatt en av hovedutfordringene 2,4. I denne forbindelse har den vitenskapelige litteraturen foreslått dyremodeller for å studere terapier som kan brukes på organdonorer for å behandle og / eller bevare organene til transplantasjonstidspunktet 5,6,7,8.
Ved å etterligne de forskjellige hendelsene observert i klinisk praksis, tillater dyremodeller studiet av de tilknyttede patologiske mekanismene og deres respektive terapeutiske tilnærminger. Den eksperimentelle induksjonen av disse hendelsene, i de fleste isolerte tilfeller, har generert eksperimentelle modeller av organ- og vevsdonasjon som er mye undersøkt i den vitenskapelige litteraturen om organtransplantasjon 6,7,8,9. Disse studiene benytter forskjellige metodologiske strategier, for eksempel de som induserer hjernedød (BD), hemorragisk sjokk (HS) og sirkulasjonsdød (CD), siden disse hendelsene er forbundet med forskjellige skadelige prosesser som kompromitterer funksjonaliteten til de donerte organene og vevene.
Hjernedød (BD)
BD er assosiert med en rekke hendelser som fører til den progressive forverringen av forskjellige systemer. Det oppstår vanligvis når en akutt eller gradvis økning i intrakranielt trykk (ICP) skjer på grunn av hjerne traumer eller blødning. Denne økningen i ICP fremmer en økning i blodtrykket i et forsøk på å opprettholde en stabil cerebral blodstrøm i en prosess kjent som Cushings refleks10,11. Disse akutte endringene kan resultere i kardiovaskulære, endokrine og nevrologiske dysfunksjoner som kompromitterer mengden og kvaliteten på de donerte organene, i tillegg til å påvirke sykelighet og dødelighet etter transplantasjon 10,11,12,13.
Hemoragisk sjokk (HS)
HS er i sin tur ofte forbundet med organdonorer, da de fleste av dem er ofre for traumer med betydelig tap av blodvolum. Noen organer, som lunger og hjerte, er spesielt utsatt for HS på grunn av hypovolemi og påfølgende vevshypoperfusjon14. HS induserer lungeskade gjennom økt kapillær permeabilitet, ødem og infiltrasjon av inflammatoriske celler, mekanismer som sammen kompromitterer gassutveksling og fører til progressiv organforringelse, og følgelig avsporer donasjonsprosessen 6,14.
Sirkulatorisk død (CD)
Bruken av donasjon etter CD har vokst eksponentielt i store verdenssentre, og bidrar dermed til økningen i antall innsamlede organer. Organer gjenfunnet fra post-CD-donorer er sårbare for effektene av varm iskemi, som oppstår etter et intervall med lav (agonisk fase) eller ingen blodtilførsel (asystolisk fase)8,15. Hypoperfusjon eller fravær av blodstrøm vil føre til vevshypoksi assosiert med abrupt tap av ATP og akkumulering av metabolske toksiner i vev15. Til tross for dagens bruk for transplantasjon i klinisk praksis, er det fortsatt mye tvil om virkningen av bruken av disse organene på kvaliteten på transplantatet etter transplantasjonen og på pasientens overlevelse15. Dermed vokser bruken av eksperimentelle modeller for en bedre forståelse av de etiologiske faktorene forbundet med CD også 8,15,16,17.
Eksperimentelle modeller
Det finnes ulike eksperimentelle organdonasjonsmodeller (BD, HS og CD). Imidlertid fokuserer studier ofte på bare én strategi om gangen. Det er et merkbart gap i studier som kombinerer eller sammenligner to eller flere strategier. Disse modellene er svært nyttige i utviklingen av terapier som søker å øke antall donasjoner og dermed redusere ventelisten over potensielle mottakere. Dyreartene som brukes til dette formålet varierer fra studie til studie, med svinemodeller som blir mer vanlig valgt når målet er en mer direkte oversettelse med human morphofysiologi og mindre tekniske vanskeligheter i den kirurgiske prosedyren på grunn av dyrets størrelse. Til tross for fordelene er logistiske vanskeligheter og høye kostnader forbundet med svinemodellen. På den annen side favoriserer lavprisen og muligheten for biologisk manipulasjon bruken av gnagermodeller, slik at forskeren kan starte fra en pålitelig modell for å reprodusere og behandle lesjoner, samt å integrere kunnskapen som er oppnådd innen organtransplantasjon.
Her presenterer vi en gnagermodell for hjernedød, sirkulasjonsdød og hemoragisk sjokkdonasjon. Vi beskriver inflammatoriske prosesser og patologiske tilstander knyttet til hver av disse modellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøk overholdt etisk komité for bruk og stell av forsøksdyr ved Det medisinske fakultet ved Universitetet i São Paulo (protokollnummer 112/16).
1. Dyr gruppering
- Tilfeldig tilordne tolv mannlige Sprague Dawley-rotter (250-300 g) til en av tre eksperimentelle grupper (n = 4) for å analysere og sammenligne effektene forbundet med dyremodellene.
- Tilordne dyr til hemorragisk sjokkgruppe (HS, n = 4): dyr utsatt for vaskulær kateterisering med hemorragisk sjokkinduksjon + vedlikehold i 360 min + kardiopulmonal blokkekstraksjon + prøvepreparering for analyse.
- Tilordne dyr til hjernedødsgruppe (BD, n = 4): dyr utsatt for hjernedød + vedlikehold i 360 min + kardiopulmonal blokkekstraksjon + prøveforberedelse for analyse.
- Tilordne dyr til sirkulasjonsdødsgruppe (CD, n = 4): dyr utsatt for vaskulær kateterisering + induksjon av sirkulasjonsdød + suspensjon av ventilasjon + iskemi ved romtemperatur i 180 min + prøvepreparering for analyse.
2. Anestesi og prekirurgisk forberedelse
- Plasser rotta i et lukket kammer med 5% isofluran i 1 - 4 min. Bekreft riktig bedøvelse ved å sjekke tåklemmerefleksen. I fravær av refleksreaksjoner (ingen poteretraksjon), utfør orotracheal intubasjon (14-G angiocath) ved hjelp av et pediatrisk laryngoskop.
- Med en tidligere justert mekanisk ventilator (FiO2 100 %, tidalvolum 10 ml / kg, 90 sykluser / min og PEEP 3,0 cmH2O), koble trakealkateteret til ventilatoren og juster anestesikonsentrasjonen til 2%.
MERK: Alle prosedyrer relatert til dyremodeller fulgte den samme bedøvelsesprotokollen som er beskrevet i dette avsnittet. - Fjern pels fra interesseområdene (hode, nakke, bryst og mage). Deretter desinfiserer du det kirurgiske feltet og dyrets hale ved hjelp av gasbind. Desinfeksjon utføres med tre alternerende runder av en alkoholholdig løsning av klorhexidindiglukonatskrubbe.
- Klipp spissen av dyrets hale, plasser tommelen og pekefingeren over bunnen av halen, og trykk og skyv dem bort fra basen. Ta en perifer blodprøve (20 μL) gjennom halen for totalt antall leukocytter8.
MERK: Denne prosedyren må utføres før trakeostomien starter og umiddelbart på slutten av hver protokoll (BD og HS - etter 360 minutter). - Bruk en presisjonspipette til å fortynne det oppsamlede blodet i 380 μL (1:20) av Turks løsning (iseddik 99%). Når den er fortynnet, pipetter du blodprøven inn i et Neubauer-kammer og plasserer den under et mikroskop (40x). Utfør det totale leukocyttallet i kammerets fire laterale kvadranter.
3. Trakeostomi
- Ved hjelp av passende saks og tang, utfør langsgående disseksjon av livmorhalsrøret, fra den midterste tredjedel av nakken til det suprasternale hakket (
1,5 cm snitt). Etter snittet av huden og subkutant vev, dissekere livmorhalsmusklene til luftrøret blir utsatt. - Plasser en 2-0 silke ligatur under luftrøret.
- Bruk mikrosaks til å trakeostomisere den øvre tredjedelen av luftrøret for å oppnå jevn ventilasjon. Klipp luftrøret horisontalt mellom to bruskringer for å imøtekomme diameteren på en metallkanyle (3,5 cm).
- Sett inn ventilasjonsrøret og fest det med forberedte ligaturer.
- Koble ventilasjonsrøret til ventilasjonssystemet for små dyr.
- Luft rotta med et tidalvolum på 10 ml/kg, hastighet på 70 sykluser/min og PEEP på 3 cmH2O.
1,5 cm snitt). Etter snittet av huden og subkutant vev, dissekere livmorhalsmusklene til luftrøret blir utsatt.4. Lårarterie og venekateterisering
- Eksponer lårbentrekanten gjennom et lite snitt (1,5 cm) i inngangsregionen. Identifiser og isoler lårbenene. For denne prosedyren, bruk et stereomikroskop (3,2x forstørrelse).
- Plasser to 4-0 silke ligaturer under blodkarene (vene eller arterie), en distalt og den andre proksimalt. Lukk den mest distale ligaturen, legg deretter en forhåndsjustert knute i den proksimale ligaturen og trekk.
- Sett inn kateteret gjennom et lite, forhåndsformet snitt i karene. Fest kanylen for å unngå dislokasjon.
MERK: Lag katetrene fra en 20 cm neonatal forlenger sveiset ved oppvarming til et perifert intravenøst kateter egnet for kaliber av dyrets venøse nettverk, og dermed forhindre oppstøt av blodinnhold. Smør kanylen med heparin, unngå dannelse av tromber og komplikasjoner under gjennomsnittlig arterielt trykk (MAP) måling. - Koble arteriekateteret til en trykkmåler og et overvåkingssystem for vitale tegn for å registrere gjennomsnittlig arterielt trykk (MAP). Transduseren skal plasseres på nivået av dyrets hjerte. Ta opp MAP hver 10-min periode.
- Plasser sprøytekateteret (3 ml) i venen, med sikte på hydrering og ekssanguinering når det er nødvendig.
5. Hemorragisk sjokk induksjon
- Gjennom venøs tilgang og med en heparinisert sprøyte, fjern små mengder blod til MAP-verdier på 50 mmHg er nådd, og dermed etablere hemorragisk sjokk.
MERK: Samle en 2 ml aliquot blod hvert 10. minutt i den første timen av forsøket og hvert 30. minutt i de påfølgende timene. - Hold trykket stabilt på ca. 50 mmHg i en periode på 360 min. For å gjøre det, fjern eller legg til aliquots av blod hvis trykket øker eller synker, henholdsvis.
- Sett en varmekilde i nærheten for å unngå hypotermi.
MERK: Her brukes en varmelampe. - På slutten av protokollen, høst lungeblokken ved total lungekapasitet (TLC) og enten flashfryse i flytende nitrogen eller legg den i en fikseringsløsning for videre studier.
MERK: Ved hjelp av en ventilator for små dyr kan ventilasjonsparametrene nås under protokollen. I denne studien ble disse parametrene evaluert umiddelbart før HS-induksjon (baseline) og 360 minutter senere (endelig).
6. Induksjon av sirkulatorisk død
- For å indusere sirkulatorisk død, administrer 150 mg/kg natriumtiopental gjennom veneslangen. Slå deretter av ventilasjonssystemet.
- Legg merke til den progressive reduksjonen i MAP til den når 0 mmHg. Fra dette punktet, vurder starten på den varme iskemiperioden og begynn tidstellingen. Dyret skal oppbevares i romtemperatur (ca. 22 °C) i 180 minutter.
- På slutten av protokollen, koble lungene til den mekaniske ventilatoren og høst lungeblokken ved TLC for innsamling. Enten flashfryse ved hjelp av flytende nitrogen eller legg den i fikseringsløsningen for videre studier.
7. Induksjon av hjernedød
- Plasser rotta i utsatt stilling.
- Fjern huden fra skallen ved hjelp av kirurgisk saks. Bor et 1 mm kaliber borehull 2,80 mm fremre og 10,0 mm ventrale til bregma og 1,5 mm lateralt til sagittalsuturen.
- Sett hele ballongkateteret inn i kranialhulen og sørg for at ballongen er forhåndsfylt med saltvann (500 μL).
- Ved hjelp av en sprøyte, oppblås kateteret raskt.
- Bekreft hjernedød ved å observere en brå MAP-høyde (Cushings refleks), fravær av reflekser, bilateral mydriasis og apné. Etter bekreftelse, avbryt anestesi og hold dyret på mekanisk ventilasjon i 360 minutter.
- Plasser en varmekilde i nærheten for å unngå hypotermi.
- På slutten av protokollen, høst lungeblokken ved TLC for innsamling og enten flashfryse i flytende nitrogen eller legg den i en fikseringsløsning for videre studier.
MERK: Ved hjelp av en ventilator for små dyr kan ventilasjonsparametrene nås under protokollen. I denne studien evaluerte vi disse parametrene umiddelbart før BD-induksjon (baseline) og etter 360 minutter (endelig).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gjennomsnittlig arterielt trykk (MAP)
For å bestemme de hemodynamiske konsekvensene av BD og HS, ble MAP evaluert over protokollens 360 minutter. Basismålingen ble samlet inn etter hudfjerning og skalleboring og før blodallikotinnsamling for dyr utsatt for henholdsvis BD eller HS. Før BD- og HS-induksjon var baseline MAP for de to gruppene lik (BD: 110,5 ± 6,1 vs. HS: 105,8 ± 2,3 mmHg; p = 0,5; toveis ANOVA). Etter kateterinsufflasjon opplevde BD-gruppen en brå økning i blodtrykksnivået (138. 7 ± 10,1 mmHg). Den hypertensive toppen er en merkelig hendelse relatert til økt intrakranielt trykk og kan betraktes som det første beviset på etableringen av BD. I tillegg observerte vi fraværet av reflekser, bilateral mydriasis og post-inflasjonsapné hos alle dyr. Dette topptrykket ble etterfulgt av en rask reduksjon i MAP (10 min - 81,2 ± 10 mmHg). Hypotensjon vedvarte i ca. 50 minutter, hvoretter MAP-nivåene gikk tilbake til verdier nær verdiene ved baseline (120 min - 120,7 ± 7,5 mmHg) (figur 1).
I motsetning til i BD-gruppen er reduksjonen i MAP i HS-gruppen forbundet med uttak av blodalikoter i de første 10 minuttene av forsøket. Hypovolemisk sjokk ble opprettholdt i 360 minutter (gjennomsnittlig variasjon gjennom protokollen 52,3 ± 1,2 mmHg). Etter slutten av protokollen viste BD-gruppen et signifikant annet MAP-mønster over 6-timers oppfølging fra HS-gruppen (BD: 93,7 ± 4,5 vs. HS: 52,3 ± 0,5 mmHg; s<0,0001; Studentens ikke test).
Lungemekanikk
For å evaluere de elastiske og resistive parametrene i luftveiene ble det utført en analyse av lungemekanikken til dyrene utsatt for BD og HS. 360 minutter etter debut og etter vedlikeholdsbehandling med hypotensjon viste HS-gruppen økt lungevevsresistens (G) (HS: baseline - 0,26 ± 0,02 vs. endelig - 0,51 ± 0,05 cmH2O.ml-1; p=0,03; toveis ANOVA), etterfulgt av redusert etterlevelse av respirasjonssystemet (Crs) (HS: baseline - 0,64 ± 0,05 vs. endelig - 0,23 ± 0,004 cmH2O / ml; p = 0,001; toveis ANOVA) (figur 2A,B).
Lungeødem
På slutten av protokollen ble midtlappen av høyre lunge samlet for alle grupper, og vekten ble målt for å analysere våt / tørrvektforholdet, som ble brukt som lungeødemindeks. Våtvekten ble vurdert umiddelbart etter uttak av organet, og tørrvekten ble målt etter 24 timer i en ovn på 80 °C. Ifølge dette forholdet viste BD-gruppen (2,32 ± 0,1) større ødem enn HS-gruppene (1,97 ± 0,03) og CD-gruppene (2,04 ± 0,02) (figur 3).
Systemiske og vevsinflammasjonsparametere
På slutten av protokollen var det en signifikant økning i det totale antall systemiske leukocytter i gruppen som gjennomgikk HS (baseline - 13888 ± 887,3 vs. endelig - 35263 ± 4076 mm3; p = 0,0189); toveis ANOVA) (figur 4). HS-gruppen viste også en økning i antall leukocytter både sammenlignet med utgangsverdiene og i forhold til BD-gruppen (p = 0,0132).
Vevsinflammasjon ble vurdert ved å kvantifisere betennelsesmarkører i lungevevet. Til dette formål ble lungevevsbiopsiprøver homogenisert i fosfatbuffer og deretter sendt til analyse for tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) og interleukin 1 beta (IL1-β) uttrykk. IL1-β-ekspresjonsnivåene var høyere i BD-gruppen (304,4 ± 91 pg/mg) og HS-gruppen (327,5 ± 25,2 pg/mg) enn i CD-gruppen (8 ± 2,3 pg/mg; p=0,004; Enveis ANOVA) (figur 5B). HS-gruppen viste også høyere nivåer av TNF-α (4,7 ± 0,3 pg / mg; p<0,0001; Enveis ANOVA) enn BD-gruppen (1,3 ± 0,3 pg/mg) og CD-gruppen (0,4 ± 0,2 pg/mg) (figur 5B).
Figur 1 Tidsforløp av gjennomsnittlig arterielt trykk (MAP) i gruppene hjernedød (BD) og hemoragisk sjokk (HS). Verdiene for alle målingene uttrykkes som middels ± standardfeil av middelet (SEM). MAP, gjennomsnittlig arterielt trykk; BD, hjernedød; HS, hemorragisk sjokk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Lungemekanikk. Lungemekanikk som bestemt av (A) etterlevelse av respirasjonssystemet og (B) vevsresistens i gruppen hjernedød (BD) og gruppen med hemoragisk sjokk (HS). * indikerer signifikante forskjeller mellom utgangsverdien og sluttverdien i HS-gruppen (p<0,05). Verdiene for alle målingene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM), og toveis ANOVA ble brukt til sammenligninger. Crs, overholdelse av luftveiene; G, vevsresistens; BD, hjernedød; HS, hemorragisk sjokk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Lungeødem påvist ved forholdet mellom våt og tørr lunge i gruppen med hjernedød (BD) og gruppen med hemoragisk sjokk (HS). Verdiene for alle målingene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM), og det ble gjort sammenligninger med enveis ANOVA. BD, hjernedød; HS, hemorragisk sjokk; CD, sirkulasjonsdød. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Leukogram for gruppen med hemoragisk sjokk (HS) og hjernedød (BD). * indikerer signifikante forskjeller mellom baseline og endelige verdier i HS-gruppen (p<0,05). Verdiene for alle målingene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM), og det er gjort sammenligninger med toveis ANOVA. BD, hjernedød; HS, hemorragisk sjokk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Lokal inflammatorisk respons var mindre fremtredende i gruppen som fikk sirkulatorisk død (CD). (A) Lungevevsuttrykk av IL-1β; (B) Lungevevsuttrykk av TNF-α. Verdiene for alle målingene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM), og det er gjort sammenligninger med enveis ANOVA. BD, hjernedød; HS, hemorragisk sjokk; CD, sirkulasjonsdød. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de senere år har det økende antall diagnoser av hjernedød ført til at den har blitt den største leverandøren av organer og vev beregnet for transplantasjon. Denne veksten har imidlertid blitt ledsaget av en utrolig økning i donasjoner etter sirkulasjonsdød. Til tross for sin multifaktorielle natur begynner de fleste utløsende mekanismer for dødsårsakene etter eller ledsager traumer med omfattende tap av blodinnhold 4,18.
I denne sammenheng er eksperimentelle modeller av hjernedød, sirkulasjonsstans og hemorragisk sjokk viktige verktøy for den prospektive studien av komplikasjoner forbundet med årsaken til donordød og deres innvirkning på levedyktigheten til potensielle organer beregnet for transplantasjon 6,8,10. Flere dyrelinjer har blitt foreslått for modelletablering, for eksempel svin, kanin, rotte og mus. Rotte- og musemodeller er vanligere i litteraturen fordi de ikke er veldig dyre og involverer lave logistiske vanskeligheter mens de tilfredsstillende gjengir de patofysiologiske hendelsene som studeres 8,13,14,15.
Vi vil understreke at nyere retningslinjer og studier har godkjent bruk av preanestetisk analgesi som en integrert del av kirurgiske protokoller, selv i akutte situasjoner, med sikte på mer omfattende styring av perioperativ smerte og dyrevelferd. Vi anbefaler at forskere vurderer en slik tilnærming i fremtidige studier.
Hjernedød (BD)
BD-modellen ble funnet å være reproduserbar ved hjelp av en brå økning i ICP. Bruk av passende instrumenter og trent personell tillater kirurgisk suksess og reproduksjon av teknikken med noen ukers trening. Under utviklingen av BD-teknikken bør trepanering utføres med en passende motorisert bor slik at det ikke er slakk i kateteret, og dermed forhindre projeksjon av hjernevev ut av hullet. I tillegg, under boring, bør borets fremoverbevegelse stoppes så snart den første motstanden som tilbys av skallen er overvunnet.
Forskere bør være våken og sikre rask inflasjon av kateteret, da gradvis inflasjon fremmer tydelige inflammatoriske og hemodynamiske responser21. Blodtrykksendringer bør i sin tur overvåkes kontinuerlig gjennom hele protokollen, spesielt under kateterinsufflasjon, som bør ledsages av en brå økning i MAP og i løpet av den første timen etter BD-etablering (hypotensjonsperiode etter inflasjon). Disse resultatene er i samsvar med litteraturen, som viser etablering av en hypertensiv topp umiddelbart etter kateterinsufflasjon, etterfulgt av en reduksjon i trykknivåer, i en sannsynlig respons på den forbigående økningen i sirkulerende katekolaminnivåer22.
Opprettholdelse av dyret i BD i lengre perioder kan føre til hypotensjon etterfulgt av sirkulasjonsdød, noe som gjør forsøket umulig. Følgelig etablerer de fleste protokoller som brukes i litteraturen en oppfølgingsperiode som varierer fra 4 til 6 timer, hvoretter vasoaktive legemidler må administreres 12,13,21,22,23.
I tillegg til hemodynamiske forandringer fremmer hjerneinfarkt og iskemi en økning i systemisk sirkulasjon av proinflammatoriske faktorer, som, når de når lungene, bidrar til lungeparenkymskade 24,25,26.
I vår studie ble BD ledsaget av en signifikant økning i vev IL-1β-uttrykk (over CD) og våt / tørrvektforhold, en indeks for lungeødem. Tidligere studier har indikert en økning i sirkulerende nivåer av proinflammatoriske cytokiner etter en BD-hendelse, noe som til slutt kan favorisere moduleringen av ekspresjonen av adhesjonsmolekyler, økt vaskulær permeabilitet og påfølgende leukocyttmigrasjon 27,28,29,30.
Hemoragisk sjokk (HS)
Etablert gjennom tilbaketrekking eller reinfusjon av blodalikoter med sikte på langvarig hypotensjonsvedlikehold (≤ 50 mmHg), har den faste trykkmodellen av HS som mål å etterligne reduksjonen i blodvolum forårsaket av hemorragisk prosess og følgelig demping av systemisk fyllingstrykk. Disse hendelsene fører til en reduksjon i MAP, ledsaget av en reduksjon i pulmonalt perfusjonstrykk 31,32.
Blant fordelene med denne HS-modellen er muligheten for å kontrollere graden og varigheten av hypotensjon, i tillegg til teknikkens større reproduserbarhet sammenlignet med modeller basert på et prefiksert blodvolum. Følgelig etablerer de fleste protokoller som brukes i litteraturen en protokollperiode som varierer fra 15 minutter til mer enn 180 minutter, med gjennomsnittlige blodtrykksnivåer fra 20-55 mmHg, avhengig av analysen valgt i studien 6,32. I denne studien ble hypotensjon opprettholdt i 3 timer, noe som førte til økt vevsresistens, etterfulgt av redusert lungecompliance hos dyr utsatt for HS. For å bekrefte dette har forskjellige studier i litteraturen indikert et proporsjonalt forhold mellom tiden brukt i HS og virkningen av hypovolemi på luftveismotstand og lungeetterlevelse 6,33,34.
I tillegg ble HS i denne studien ledsaget av signifikant leukocytose og økt vevsuttrykk av IL-1β (med hensyn til CD) og TNF-α. Skade på endotelet i lungemikrovaskulaturen, indusert ved frigjøring av reaktive oksygenarter fra den primære prosessen med hypoksi og etablert iskemi, vil øke vaskulær permeabilitet, som sammen med økningen i lungearterietrykket vil fungere som en kjemotaktisk faktor for leukocytter og den påfølgende frigjøringen av inflammatoriske mediatorer 6,20,31,35,36, 37,38.
Sirkulatorisk død (CD)
Hovedforskjellen mellom de marginale transplantatene som stammer fra BD- og CD-prosessene er den varme iskemitiden (WIT) som transplantatet vil bli utsatt for, definert av noen forskere som tiden mellom fravær av perifere pulser og avbrudd av blodstrømmen på grunn av fjerning av livsstøtteutstyr til kald eller regional perfusjon av organet17, 39,40.
I denne studien ble organer og vev av dyr avledet fra CD-modellen utsatt for en WIT-periode på 180 min. Flere studier i litteraturen har avslørt et proporsjonalt forhold mellom WIT og posttransplantasjonsdysfunksjon, noe som tyder på at iskemitiden bør variere i henhold til hvert organs særegenheter og integritet. I denne sammenheng har lungetransplantater fra rotter vist seg å tolerere opptil 3-timers perioder med varm iskemi 41,42.
Med bevis på vevsskade forårsaket av den dominerende sympatiske fasen, hemodynamisk ustabilitet og systemisk betennelse som følge av BD-prosessen, har donasjoner etter sirkulasjonsstans blitt revurdert som en potensiell strategi for å redusere komplikasjoner forbundet med transplantasjon 41,42,43. I denne forstand indikerer våre data en dramatisk reduksjon i IL-1β og TNF-α nivåer i CD-modellen i forhold til de to andre modellene som er studert. Iskender et al.4 bekreftet dette og bemerket de lave nivåene av vevscytokiner i en modell av lungereperfusjon hos rotter med vev donert etter WIT gjennom mekanismer som fortsatt er dårlig forstått.
Basert på ovenstående bør valg av metodikk og tilpasninger avhenge av målene utviklet av forskeren. Når disse målene er bestemt, bør de være retningsgivende for typen donasjonsmodell, protokolltidspunktet og analysene som skal utføres. Det er også mulig å relatere typen donasjon med dyremodeller av lungerekondisjonering og reperfusjon.
Konklusjoner
Avslutningsvis er organdonormodellene beskrevet her potensielle verktøy i studiet av endringene knyttet til forskjellige metoder for transplantathøsting, og kan gi en full forståelse av virkningen av kvaliteten på disse organene på resultatene etter transplantasjon, gitt reproduserbarheten og påliteligheten til metodene som presenteres her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi ønsker å bekrefte at det ikke er noen kjente interessekonflikter knyttet til denne publikasjonen, og at det ikke har vært noen betydelig økonomisk støtte til dette arbeidet som kunne ha påvirket utfallet.
Acknowledgments
Vi takker FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) for å gi økonomisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge angiocath | DB | 38186714 | Orotracheal intubation |
| 2.0-silk | Brasuture | AA553 | Tracheal tube fixation |
| 24-gauge angiocath | DB | 38181214 | Arterial and venous access |
| 4.0-silk | Brasuture | AA551 | Fixation of arterial and venous cannulas |
| Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%). | Vic Pharma | Y/N | Asepsis |
| Trichotomy apparatus | Oster | Y/N | Clipping device |
| Precision balance | Shimadzu | D314800051 | Analysis of the wet/dry weight ratio |
| Barbiturate (Thiopental) | Cristália | 18080003 | DC induction |
| Balloon catheter (Fogarty-4F) | Edwards Life Since | 120804 | BD induction |
| Neonatal extender | Embramed | 497267 | Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath |
| FlexiVent | Scireq | 1142254 | Analysis of ventilatory parameters |
| Heparin | Blau Farmaceutica SA | 7000982-06 | Anticoagulant |
| Isoflurane | Cristália | 10,29,80,130 | Inhalation anesthesia |
| Micropipette (1000 µL) | Eppendorf | 347765Z | Handling of small- volume liquids |
| Micropipette (20 µL) | Eppendorf | H19385F | Handling of small- volume liquids |
| Microscope | Zeiss | 1601004545 | Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure |
| Multiparameter monitor | Dixtal | 101503775 | MAP registration |
| Motorized drill | Midetronic | MCA0439 | Used to drill a 1 mm caliber borehole |
| Neubauer chamber | Kasvi | D15-BL | Cell count |
| Pediatric laryngoscope | Oxygel | Y/N | Assistance during tracheal intubation |
| Syringe (3 mL) | SR | 3330N4 | Hydration and exsanguination during HS protocol |
| Pressure transducer | Edwards Life Since | P23XL | MAP registration |
| Metallic tracheal tube | Biomedical | 006316/12 | Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator |
| Isoflurane vaporizer | Harvard Bioscience | 1,02,698 | Anesthesia system |
| Mechanical ventilator for small animals (683) | Harvard Apparatus | MA1 55-0000 | Mechanical ventilation |
| xMap methodology | Millipore | RECYTMAG-65K-04 | Analysis of inflammatory markers |
References
- Paterno, F., et al. Clinical implications of donor warm and cold ischemia time in donor after circulatory death liver transplantation. Liver Transplantation. 25 (9), 1342-1352 (2019).
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for heart and lung transplantation: thirty-third adult lung and heart-lung transplant report-2016; focus theme: primary diagnostic indications for transplant. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1170-1184 (2016).
- Jung, H. Y., et al. Comparison of transplant outcomes for low-level and standard-level tacrolimus at different time points after kidney transplantation. Journal of Korean Medical Science. 34 (12), e103 (2019).
- Cypel, M., et al. The International Society for heart and lung transplantation donation after circulatory death registry report. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 34 (10), 1278-1282 (2015).
- Drake, M., Bernard, A., Hessel, E.
- Nepomuceno, N. A., et al. Effect of hypertonic saline in the pretreatment of lung donors with hemorrhagic shock. Journal of Surgical Research. 225, 181-188 (2018).
- Menegat, L., et al. Evidence of bone marrow downregulation in brain-dead rats. International Journal of Experimental Pathology. (3), 158-165 (2017).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. (5), 760-768 (2018).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (10), 2262-2269 (2009).
- Wauters, S., et al. Evaluating lung injury at increasing time intervals in a murine brain death model. Journal of Surgical Research. 183 (1), 419-426 (2013).
- Smith, M. Physiologic changes during brain stem death--lessons for management of the organ donor. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 23 (9), S217-S222 (2004).
- Belhaj, A., et al. Mechanical versus humoral determinants of brain death-induced lung injury. PLoS One. 12 (7), e0181899 (2017).
- Kolkert, J. L., et al. The gradual onset brain death model: a relevant model to study organ donation and its consequences on the outcome after transplantation. Laboratory Animals. 41 (3), 363-371 (2007).
- Rocha-E-Silva, M. Cardiovascular effects of shock and trauma in experimental models: A review. Revista Brasileira de Cirurgia Cardiovascular. 31 (1), 45-51 (2016).
- Manara, A. R., Murphy, P. G., O'Callaghan, G.
- Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. The Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
- Boucek, M. M., et al. Pediatric heart transplantation after declaration of cardiocirculatory death. The New England Journal of Medicine. 359 (7), 709-714 (2008).
- Kramer, A. H., Baht, R., Doig, C. J. Time trends in organ donation after neurologic determination of death: a cohort study. CMAJ Open. 5 (1), E19-E27 (2017).
- Reino, D. C., et al. Trauma hemorrhagic shock-induced lung injury involves a gut-lymph-induced TLR4 pathway in mice. PLoS One. 6 (8), e14829 (2011).
- Pascual, J. L., et al. Hypertonic saline resuscitation of hemorrhagic shock diminishes neutrophil rolling and adherence to endothelium and reduces in vivo vascular leakage. Annals of Surgery. 236 (5), 634-642 (2002).
- Van Zanden, J. E., et al. Rat donor lung quality deteriorates more after fast than slow brain death induction. PLoS One. 15 (11), e0242827 (2020).
- Shivalkar, B., et al. Variable effects of explosive or gradual increase of intracranial pressure on myocardial structure and function. Circulation. 87 (1), 230-239 (1993).
- López-Aguilar, J., et al. Massive brain injury enhances lung damage in an isolated lung model of ventilator-induced lung injury. Critical Care Medicine. 33 (5), 1077-1083 (2005).
- Catania, A., Lonati, C., Sordi, A., Gatti, S. Detrimental consequences of brain injury on peripheral cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 877-884 (2009).
- McKeating, E. G., Andrews, P. J., Mascia, L. Leukocyte adhesion molecule profiles and outcome after traumatic brain injury. Acta Neurochirurgica Supplement. 71, 200-202 (1998).
- Ott, L., McClain, C. J., Gillespie, M., Young, B. Cytokines and metabolic dysfunction after severe head injury. Journal of Neurotrauma. 11 (5), 447-472 (1994).
- Avlonitis, V. S., Wigfield, C. H., Kirby, J. A., Dark, J. H. The hemodynamic mechanisms of lung injury and systemic inflammatory response following brain death in the transplant donor. American Journal of Transplantation. 5 (4), 684-693 (2005).
- De Jesus Correia, C., et al. Hypertonic saline reduces cell infiltration into the lungs after brain death in rats. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 61, 101901 (2020).
- Kalsotra, A., Zhao, J., Anakk, S., Dash, P. K., Strobel, H. W. Brain trauma leads to enhanced lung inflammation and injury: evidence for role of P4504Fs in resolution. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27 (5), 963-974 (2007).
- Simas, R., Zanoni, F. L., Silva, R., Moreira, L. F. P. Brain death effects on lung microvasculature in an experimental model of lung donor. Journal Brasileiro de Pneumologia. 46 (2), e20180299 (2020).
- Moore, K. The physiological response to hemorrhagic shock. Journal of Emergency Nursing. 40 (6), 629-631 (2014).
- Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: a review. European Surgical Research. 50 (2), 57-70 (2013).
- Hillen, G. P., Gaisford, W. D., Jensen, C. G. Pulmonary changes in treated and untreated hemorrhagic shock. I. Early functional and ultrastructural alterations after moderate shock. The American Journal of Surgery. 122 (5), 639-649 (1971).
- Sprung, J., Mackenzie, C. F., Green, M. D., O'Dwyer, J., Barnas, G. M. Chest wall and lung mechanics during acute hemorrhage in anesthetized dogs. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 11 (5), 608-612 (1997).
- Liu, X., et al. Inhibition of BTK protects lungs from trauma-hemorrhagic shock-induced injury in rats. Molecular Medicine Reports. 16 (1), 192-200 (2017).
- Maeshima, K., et al. Prevention of hemorrhagic shock-induced lung injury by heme arginate treatment in rats. Biochemical Pharmacology. 69 (11), 1667-1680 (2005).
- Gao, J., et al. Effects of different resuscitation fluids on acute lung injury in a rat model of uncontrolled hemorrhagic shock and infection. The Journal of Trauma. 67 (6), 1213-1219 (2009).
- Wohlauer, M., et al. Nebulized hypertonic saline attenuates acute lung injury following trauma and hemorrhagic shock via inhibition of matrix metalloproteinase-13. Critical Care Medicine. 40 (9), 2647-2653 (2012).
- Morrissey, P. E., Monaco, A. P. Donation after circulatory death: current practices, ongoing challenges, and potential improvements. Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).
- Snell, G. I., Levvey, B. J., Levin, K., Paraskeva, M., Westall, G. Donation after brain death versus donation after circulatory death: lung donor management issues. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 39 (2), 138-147 (2018).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Yamamoto, S., et al. Activations of mitogen-activated protein kinases and regulation of their downstream molecules after rat lung transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 43 (10), 3628-3633 (2011).
- Kang, C. H., et al. Transcriptional signatures in donor lungs from donation after cardiac death vs after brain death: a functional pathway analysis. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 30 (3), 289-298 (2011).
